一类CDK激酶抑制剂及其应用的制作方法

一类cdk激酶抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明属于医药化学领域，具体涉及一类cdk7激酶抑制剂或其异构体、药学上可接受的盐，它们的制备方法以及含有这些化合物的药物组合物和这些化合物或组合物用于治疗cdk7介导的疾病的用途。


背景技术：

2.乳腺癌(breast cancer)是严重危害人类健康的常见的恶性肿瘤。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布的2020年全球最新癌症数据，2020年全球新发乳腺癌达到226万例，首次超过肺癌(221万例)成为全球第一大癌症。而中国是乳腺癌大国，2020年新发乳腺癌约42万例，并导致近12万人死亡。
3.目前，乳腺癌临床治疗的选择非常有限，特别是针对乳腺癌的有效治疗药物总体偏少。因此，临床迫切需要开发对乳腺癌有效的新型小分子靶向药物，这也是当前乳腺癌治疗领域的研究热点，具有重要的研究意义。
4.随着对乳腺癌致病机制以及基因组学研究的不断深入，发现乳腺癌的发生、发展过程高度依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin
‑
dependent kinase 7,cdk7)的调控，并且具有特异性，因而乳腺癌细胞中常会出现cdk7的过表达、持续激活或者扩增的现象，如果将乳腺癌细胞中cdk7抑制、基因沉默或者敲除后，可以诱导乳腺癌细胞死亡。因此，研究cdk7激酶的选择性抑制剂，可能成为治疗乳腺癌的一种新选择。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是提供以下通式i所示的一类具有cdk7抑制活性的化合物或其药学上可接受的盐。
6.本发明的另一个目的是提供制备本发明的通式i的化合物或其药学上可接受的盐的方法。
7.本发明的再一个目的是提供包含本发明的通式i的化合物或其药学上可接受的盐和药学可接受的载体的组合物，以及包含本发明的通式i的化合物或其药学上可接受的盐和另一种或多种药物的组合物。
8.本发明的还一个目的是提供本发明的通式i的化合物或其药学上可接受的盐治疗和/或预防cdk7相关的疾病的方法，以及本发明的通式i的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防cdk7相关的疾病的药物中的应用。
9.针对上述目的，本发明提供以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供通式i所示的化合物或其异构体、药学上可接受的盐，
11.32.i
‑733.i
‑834.第二方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的化合物或其异构体、药学上可接受的盐。
35.在一些实施方案中，本发明提供本发明的化合物或其异构体、药学上可接受的盐及包含本发明的化合物或其异构体、药学上可接受的盐的药物组合物，所述化合物或药物组合物用于治疗cdk7介导的疾病。
36.在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的化合物或其异构体、药学上可接受的盐和可药用载体。
37.可以将本发明的化合物或其异构体、药学上可接受的盐与可药用载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。
38.第三方面，本发明提供本发明式i所示的化合物或其异构体、药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物用于治疗cdk7介导的疾病的方法以及在制备治疗cdk7介导的疾病的药物中的用途。
39.在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明式i所示的化合物或其异构体、药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物用于治疗cdk7介导的疾病的方法以及在制备治疗cdk7介导的疾病的药物中的用途，其中所述的cdk7介导的疾病包括但不限于肿瘤。在一些实施方案中，本发明所述的cdk7介导的疾病为乳癌如乳房腺癌、乳房乳头状癌、乳腺癌、乳房髓样癌、三阴性乳腺癌。
40.术语定义
41.除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
42.本发明的“卤素”是指氟、氯、溴、碘。本发明的“卤代”是指被氟、氯、溴或碘取代。
43.本发明的“烷基”指直链或支链的饱和脂肪烃基团，优选含1至6个碳原子的直链或支链基团，进一步优选含有1至3个碳原子的直链或支链基团，非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1
‑
二甲基丙基、1,2
‑
二甲基丙基、2,2
‑
二甲基丙基、1
‑
乙基丙基、2
‑
甲基丁基、3
‑
甲基丁基、正己基等。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上。
44.本发明的“磺酰基”是指
‑
s(o)2‑
。
45.本发明的“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内
时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。
46.本发明的“药物组合物”是指包含任何一种本发明所述的化合物，包括对应的异构体、前药、溶剂化物、药学上可接受的盐或其化学的保护形式，和一种或多种可药用载体和/或另一种或多种药物的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。所述组合物通常用于制备治疗和/或预防由一种或多种激酶介导的疾病的药物。
47.本发明的“可药用载体”是指对有机体不引起明显刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体，包含所有的溶剂、稀释剂或其它赋形剂、分散剂、表面活性剂等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容。可以作为药学上可接受的载体的一些实例包括，但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、以及纤维素和乙酸纤维素；麦芽、明胶等。
48.本发明的“赋形剂”指加入到药用组合物中以进一步促进给予化合物的惰性物质。赋形剂可以包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇。
具体实施方式
49.下面结合实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。
50.具体实施例
51.实施例1(e)
‑
n
‑
(4
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((2
‑
(异丙磺酰基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
1)的制备
52.步骤1：2,5
‑
二氯
‑
n
‑
(2
‑
((1
‑
甲基乙基)磺酰基)苯基)
‑4‑
嘧啶胺的制备
53.称取2
‑
异丙磺酰基苯胺(1.0g，10.75mmol)，2，4，5
‑
三氯嘧啶(1.79g，9.78mmol)，diea(n,n
‑
二异丙基乙胺)(1.5g，11.6mmol)于100ml茄形瓶中，加入15ml异丙醇溶解，升温反应3h后，停止反应，减压浓缩除去反应液中的异丙醇，后将反应液倒入分液漏斗中，加入25ml冷水及30ml乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，减压旋干有机层，得到固体目标产物，计算所得产率55％。步骤2：n2‑
(4
‑
氨基苯基)
‑5‑
氯
‑
n4‑
(2
‑
异丙磺酰基)苯基)嘧啶
‑
2,4
‑
二胺的制备
54.称取2,5
‑
二氯
‑
n
‑
(2
‑
((1
‑
甲基乙基)磺酰基)苯基)
‑4‑
嘧啶胺(2.0g，5.8mmol)和对苯二胺(0.7g，6.5mmol)于100ml茄型瓶中，用50ml甲醇溶解，再滴加0.8ml浓盐酸，置于80℃条件下回流反应6h。反应完成后，将反应液倒入250ml烧杯中，加入100ml水，此时析出大量固体，抽滤，滤液用饱和na2co3水溶液调ph至9
‑
10，有大量白色固体析出，抽滤，滤饼烘干得白色固体，收率58％。
55.步骤3：4
‑
氨基
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((2
‑
(异丙磺酰基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)苯甲酰胺的制备
56.称取boc保护的对氨基苯甲酸(0.6mmol)于100ml茄型瓶中，hobt(1
‑
羟基苯并三唑，0.08g，0.6mmol)、edci(1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，0.11g，0.6mmol)和diea(0.13g，1.0mmol)于50ml茄型瓶中，加入5ml dmf溶解，置于室温条件下搅拌30min。再将n2‑
(4
‑
氨基苯基)
‑5‑
氯
‑
n4‑
(2
‑
异丙磺酰基)苯基)嘧啶
‑
2,4
‑
二胺(0.6mmol)
加入到反应瓶中，继续室温搅拌6h。反应完成后，用50ml水稀释反应液，再用50ml乙酸乙酯萃取两次，合并所得有机相，用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，抽滤并减压浓缩，加入tfa(三氟乙酸)的二氯甲烷溶液(3.0mmol)，搅拌30min，直接旋干后硅胶柱层析法纯化。得到白色固体，收率43％。
57.步骤4：(e)
‑
n
‑
(4
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((2
‑
(异丙磺酰基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
1)的制备
58.称取4
‑
氨基
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((2
‑
(异丙磺酰基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)苯甲酰胺(3.6g，24mmol)于100ml茄型瓶中，加入20ml乙腈和diea(48mmol)并置于0℃条件下搅拌，缓慢将n,n
‑
二甲基巴豆酰氯滴加至茄形瓶中，加毕室温条件下搅拌2h。反应完成后减压浓缩除去反应液中的乙腈，将反应液倒入250ml烧杯中并加入100ml冷水，用na2co3调ph至9
‑
10，随后再将反应液倒入分液漏斗中，用150ml乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，抽滤并减压浓缩，得到黄色固体，收率48％。1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)(δ,ppm):10.30(s,1h),10.24(s,1h),9.83(s,1h),9.55(s,1h),8.65(s,1h),8.31(s,1h),8.26(s,1h),8.06(s,1h),7.82
‑
7.75(m,2h),7.70
‑
7.55(m,2h),7.41
‑
7.20(m,5h),6.82
‑
6.75(m,1h),6.25
‑
6.20(m,1h),3.45
‑
3.50(m,1h),3.12(d,2h),2.22(s,6h),1.18(d,j＝15.6hz,6h).
13
c nmr(150mhz,dmso
‑
d6)(δ,ppm):165.2,164.0,158.2,155.7,155.2,142.6,142.6,140.5,139.7,138.4,135.2,131.3,129.8,129.1,128.8,126.1,124.4,123.8,118.8,116.0,115.3,113.1,105.3,60.1,55.4,45.6,15.3.
59.实施例2(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
(苯基氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
2)的制备
60.以苯胺和n,n
‑
二甲氨基巴豆酸为原料，操作同i
‑
1，经柱层析分离得到白色固体，收率38％。1h nmr(600mhz,dmso)δ10.34(s,1h),10.00(s,1h),9.36(s,1h),8.77(s,1h),8.15(s,1h),7.93(d,j＝8.7hz,3h),7.79(d,j＝8.7hz,2h),7.72(d,j＝7.9hz,2h),7.40(d,j＝8.0hz,1h),7.28(t,j＝7.8hz,3h),7.14(t,j＝8.0hz,1h),7.00(d,j＝7.4hz,1h),6.78(d,j＝15.4hz,2h),6.31(d,j＝15.4hz,1h),3.10(s,2h),2.21(s,6h).
13
c nmr(150mhz,dmso
‑
d6)(δ,ppm):165.1,163.9,158.3,156.2,155.0,142.5,140.9,139.5,139.1,129.8,129.1,128.7,128.6,124.0,123.1,118.8,115.0,112.9,104.5,60.1,45.5。
61.实施例3(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((2
‑
(异丙磺酰基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
3)的制备
62.以2
‑
异丙磺酰基苯胺、间氨基苯甲酸和n,n
‑
二甲氨基巴豆酸为原料，操作同i
‑
1，经柱层析分离得到白色固体，收率33.2％。h nmr(600mhz,dmso
‑
d6)(δ,ppm):10.40(s,1h),10.08(s,1h),9.63(s,1h),9.55(s,1h),8.70(s,1h),8.31(s,1h),8.06(s,1h),7.93(d,j＝8.6hz,2h),7.82(dd,j＝25.2,8.6hz,3h),7.66(m,1h),7.38(d,j＝7.8hz,1h),7.31(t,j＝11.7hz,1h),7.21
‑
7.23(m,2h),6.65
‑
6.79(m,1h),6.23
‑
6.33(m,1h),3.45
‑
3.50(m,1h),3.12(s,2h),2.22(s,6h),1.18(d,j＝15.3hz,6h).
63.实施例4(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((3
‑
(甲基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
4)的制备
64.以3
‑
甲基苯胺、对氨基苯甲酸和n,n
‑
二甲氨基巴豆酰氯为原料，制得标题化合物。
65.实施例5(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((2
‑
(甲氧基)苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑
4
‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
5)的制备
66.以2
‑
甲氧基苯胺、对氨基苯甲酸和n,n
‑
二甲氨基巴豆酰氯为原料，制得标题化合物。
67.实施例6(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
((3
‑
溴苯基)氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
6)的制备
68.以2
‑
甲氧基苯胺、对氨基苯甲酸和n,n
‑
二甲氨基巴豆酰氯为原料，制得标题化合物。
69.实施例7(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
(苯基氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑2‑
甲基
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
7)的制备
70.以2
‑
甲氧基苯胺、2
‑
甲基
‑4‑
氨基苯甲酸和n,n
‑
二甲氨基巴豆酰氯为原料，制得标题化合物。
71.实施例8(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
(苯基氨基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基))
‑3‑
甲氧基基
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺(i
‑
8)的制备
72.以2
‑
甲氧基苯胺、3
‑
甲氧基
‑4‑
氨基苯甲酸和n,n
‑
二甲氨基巴豆酰氯为原料，制得标题化合物。
73.实验例1 cdk7酶抑制活性测试
74.在384孔反应板中，设阳性对照孔和阴性对照孔，其余每孔加入不同浓度的化合物及cdk7激酶/cyclin h/mat，离心后室温孵育15min，加入荧光底物和终止液，使用synergy连续读取荧光信号并使用synergy选取线性反应段得到斜率(slope)。进而计算百分比抑制率，计算公式如下：酶抑制率＝mean(最大)
‑
样品信号/mean(最大)
‑
空白乘以100％，以化合物浓度的log值作为x轴，对应的百分比抑制率为y轴，用分析软件graphpad prism 5拟合量效曲线，从而得出各个化合物抑制率。实验结果见表1
75.表1
[0076][0077]
化合物i
‑
1～i
‑
8均在200nm浓度下对cdk7激酶的抑制活性均达到了100％左右。
[0078]
本发明使用的阳性对照thz1为(e)
‑
n
‑
(3
‑
((5
‑
氯
‑4‑
(1h
‑
吲哚
‑3‑
基)嘧啶
‑2‑
基)氨基)苯基)
‑4‑
(4
‑
(二甲氨基)
‑2‑
丁烯酰胺)苯甲酰胺，购自百灵威。
[0079]
结果显示，本发明的化合物对cdk7均有强效抑制活性。在200nm浓度下对cdk7激酶的抑制活性均达到了97％以上，与阳性对照thz1相当。
[0080]
实验例2细胞增殖抑制活性测试
[0081]
实验设溶剂对照组及药物实验组，药物实验组每组设5个浓度，每个浓度下设3个
平行孔。每个实验重复三次。在96孔板中，每孔加入细胞浓度为1
×
105个/ml的细胞悬液100μl，即每孔含细胞3
×
103个，接种时注意使细胞均匀分布在各孔中。为防止液体蒸发，96孔板周围一圈孔不接种细胞，加入pbs保湿。细胞贴壁后，药物实验组中每孔中加入浓度为0、4、8、12和16μg/ml的目标化合物100μl，使其终浓度分别0、2、4、6和8μg/ml。将96孔板置于37℃、5％co2孵箱内继续培养，于72h后终止培养。分别于药物处理细胞72h后，取出96孔板，每孔中加入cck
‑
8溶液20μl，在细胞培养箱内继续孵育0.5
‑
4小时后，在自动酶标仪上450nm处测定每孔吸光度值(a)。预实验时在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，选取吸光度范围比较适宜的一个时间点(2h)用于后续实验。
[0082]
不同药物浓度对肿瘤细胞的生长抑制作用按下式计算：
[0083][0084]
以抑制率对药物浓度作直线回归分析，用直线方程求算ic
50
值。检测所得结果以均数
±
标准偏差表示，实验结果采用spss15.0软件进行统计分析，以p<0.05表示有显著性差异。结果表明化合物i
‑
1～i
‑
8对人乳腺癌细胞mda
‑
mb
‑
231和肺癌a549细胞的ic
50
均小于0.025μm，与thz1(ic
50
小于0.025μm)相当，并优于阳性对照seliciclib(ic
50
大于1μm)(麦克林公司购买)。