一种基于微生物标记鉴识唾液与阴道分泌物的试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种基于微生物标记鉴识唾液与阴 道分泌物的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.明确生物物证体液的组织来源，对于案件定性、犯罪现场重建尤为重要。性 侵案件生物检材类型主要包括面部或隐私部位擦拭子，以及内裤、床单等，主要 涉及人体唾液、阴道分泌物和精液等相关体液。
3.目前法医实验室对人体组织体液类型的识别主要基于免疫学反应或酶促反 应，但仅对人体血液、人体精液的溯源鉴识形成行业标准。对于唾液的识别方法 包括唾液淀粉酶实验和上皮细胞显微镜检测，但唾液淀粉酶实验特异性差，传统 的上皮细胞显微镜检测法不仅需要的样本量大，而且可能对检材造成破坏导致无 法进行后续检测。阴道分泌物则没有用于识别的特异蛋白质，采用组织学检测方 法容易误判。因此国内外的研究一直致力于寻找阴道分泌物和唾液的各种分子标 记，包括mrna、microrna(mirna)、circular rna(circrna)以及dna甲 基化标记，但尚未形成有效的方法用于法医实践。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种基于微生物标记的唾液与阴道分泌物鉴识试剂盒 及其应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益 的选择或创造条件。
5.本发明的第一目的在于提供一种多重扩增引物组合，包括如表1所述的特异 性扩增目的核苷酸片段的引物对。
6.表1多重扩增引物
7.[0008][0009]
所述多重扩增引物组合能够通过一次反应鉴别出样本是否含有三种唾液优 势菌种及六种阴道分泌物优势菌种，帮助鉴识唾液和阴道分泌物。
[0010]
进一步每对上游引物和下游引物中的任意一条引物的5’端标记有荧光发光 基团。
[0011]
进一步，所述荧光发光基团选自fam、hex、tamra或rox中的至少一 种。
[0012]
本发明的第二目的在于提供一种微生物标记鉴识试剂盒，其中的多重扩增体 系包括上述的多重扩增引物组合。
[0013]
进一步，所述多重扩增体系的反应总体积为10μl，包括2
×
master mix(反 应混合物)5μl，10
×
primermix(多重扩增引物组合)1μl，余量由水补足。 所述master mix包含反应必需组分pcr缓冲液、mgcl2、dntps、taqdna聚 合酶等。
[0014]
进一步，基于微生物标记的唾液与阴道分泌物鉴识鉴识试剂盒还包括阳性质 控品，所述阳性质控品含有唾液链球菌、浅黄色奈瑟菌、变形链球菌、惰性乳杆 菌、加氏乳酸杆菌、詹式乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、阴道加德纳氏菌和阴道阿托 波菌的特异性dna片段以及如seq id no.1至seq id no.18所示引物所特异 性扩增的核苷酸序列。
[0015]
进一步，所述多重扩增体系的扩增程序为：95℃持续2min；94℃持续30s， 58℃持续1min，72℃持续50s，共30个循环；72℃持续10min。
[0016]
所述微生物标记鉴识试剂盒的使用方法：首先采用qiagen公司的dneasypowersoil kit提取样本总dna，采用荧光分光光度计在260nm和280nm处分 别测定dna的吸光值，确定dna浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna 的质量；对符合要求的dna样本，加入多重扩增体系，获得扩增产物后利用毛 细管电泳、3500dna测序仪或genemapper id v3.2进行分析检测。
[0017]
本发明包括以下有益效果：
[0018]
本发明提供的试剂盒不仅可以鉴识唾液和阴道分泌物，还可实现从多种体液 构成的混合斑样本和陈旧斑中对唾液和阴道分泌物进行鉴识。当样本dna量低 至0.1ng时仍能得到唾液和阴道分泌物优势细菌的分析结果。可实现对复杂混合 斑中的唾液和阴道分
泌物进行溯源，利用分析结果可协助案件定性，为司法案件 提供有力证据。
附图说明
[0019]
图1是唾液的三个微生物标记的标准检测图谱；
[0020]
图2是阴道分泌物的六个微生物标记的标准检测图谱；
[0021]
图3是唾液样本和模拟案件的微生物标记检测结果，其中(a)为唾液样本微 生物标记检测图谱，(b)为模拟案件中混合样本含有唾液的复杂斑微生物标记检 测图谱；
[0022]
图4是阴道分泌物样本和模拟案件的微生物标记检测结果，其中(a)为阴道 分泌物样本微生物标记检测图谱，(b)为模拟案件中混合样本含有阴道分泌物的 复杂斑微生物标记检测图谱；
[0023]
图5是室温保存6个月的唾液样本的微生物标记检测结果；
[0024]
图6是室温保存6个月的阴道分泌物样本的微生物标记检测结果；
[0025]
图7是人体不同来源体液的微生物标记检测结果，其中(a)为外周血，(b)为 唾液，(c)为皮肤擦拭物，(d)为泪液，(e)为阴道分泌液。
具体实施方式
[0026]
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
实施例1、唾液和阴道分泌物微生物标记的标准dna检测
[0028]
1、制备模板。
[0029]
使用qiagen公司的dneasy powersoil kit(微生物dna提取试剂盒)分别 提取唾液链球菌(streptococcus salivarius)、浅黄色奈瑟菌(neisseria subflava)、 变形链球菌(streptococcus mutans)、惰性乳杆菌(lactobacillus iners)、加氏乳 酸杆菌(lactobacillus gasseri)、詹式乳酸杆菌(lactobacillusjensenii)、卷曲乳 酸杆菌(lactobacillus crispatus)、阴道加德纳氏菌(gardnerella vaginalis)和阴 道阿托波菌(atopobium vaginae)的标准微生物菌株培养样本的总dna。
[0030]
2、荧光复合扩增。
[0031]
分别取适量唾液三个微生物标记dna混合物、阴道分泌物六个微生物标记 dna混合物加入10μl反应体系：2
×
mastermix 5μl；10
×
primer mix 1μl，用水 将反应体系补至10μl。pcr热循环条件如下：95℃持续2min；94℃持续30s， 58℃持续1min，72℃持续50s，共30个循环；72℃持续10min。
[0032]
3、毛细管电泳及分析。
[0033]
1)电泳前变性处理体系：1.5μl纯化产物、0.3μl内标siz
‑
500、10μl甲酰 胺(hi
‑
di formamide)；处理条件：95℃维持5min，0℃维持3min。
[0034]
2)通过3500测序仪完成对扩增产物的检测，数据分析利用 genemapper id软件完成。图1为唾液三个微生物标记的标准检测结果，图2为阴 道分泌物六个微生物标记的标准检测结果。序号和微生物标记对应见表1。
[0035]
实施例2、唾液样本及模拟案件中含有唾液混合样本的检测
[0036]
收集健康志愿者的唾液样本5份，每份样本用无菌棉签采集，室温条件下阴 干。随机抽取其中一份唾液样本混合皮肤擦拭物样本制备成模拟案件中的唾液皮 肤混合迹样本检材。
[0037]
采用chelex
‑
100法进行dna提取。取适量唾液样本，加入80μl浓度为5％的 chelex
‑
100溶液，56℃孵育30min，充分震荡后，95℃保温8min，震荡混匀， 12000rpm离心3min取上清。
[0038]
扩增与检测分析按照实施例1所述的检测条件进行。
[0039]
结果见图3，图3(a)表示唾液样本的微生物标记检测结果，能够从图谱鉴别 出该样本类型为唾液。图3(b)表示模拟案件中含有唾液混合样本的复杂斑微生物 标记检测结果，能够从唾液优势菌种类型鉴别出该混合斑样本含有唾液成分。
[0040]
实施例3、阴道分泌物样本及模拟案件中含有阴道分泌物混合样本的检测
[0041]
收集健康女性阴道分泌物样本5份；每份样本用无菌棉签采集，室温条件下 阴干。随机抽取其中一份阴道分泌物样本，混合其他血液样本，制备成模拟案件 中含有阴道分泌物混合样本检材。
[0042]
样本dna提取与检测步骤参考实施例2进行。
[0043]
结果见图4，图4(a)表示阴道分泌物样本的微生物标记检测结果，能够从图 谱鉴别出该样本类型为阴道分泌物。图4(b)表示模拟案件中含有阴道分泌物混合 样本的复杂斑微生物标记检测结果，能够从阴道分泌物优势菌种类型鉴别出该混 合斑样本含有阴道分泌物成分。
[0044]
实施例4、陈旧斑样本的检测
[0045]
采集制备唾液斑及阴道分泌物样本。取200μl新鲜样本于采集卡或棉签上， 在室温条件下晾干保存6个月。
[0046]
样本dna提取与检测步骤参考实施例2进行。
[0047]
结果见图5与图6。其中，图5表示室温保存6个月的唾液样本的微生物标记检 测结果，图6表示室温保存6个月的阴道分泌物样本的微生物标记检测结果。
[0048]
实施例5、试剂盒对人体不同来源体液的区分效果验证
[0049]
收集人体不同来源体液类型，包括外周血、唾液、皮肤擦拭物、泪液以及阴 道分泌液样本。
[0050]
样本dna提取与检测步骤参考实施例2进行。
[0051]
结果见图7，其中图7(a)为外周血，图7(b)为唾液，图7(c)为皮肤擦拭物， 图7(d)为泪液，图7(e)为阴道分泌液的微生物标记检测图谱。结果证明，本研 究建立的基于微生物标记用于唾液与阴道分泌物鉴识的试剂盒能够有效将唾液、 阴道分泌液与其他法医常见体液进行区分，实现唾液与阴道分泌液的高效快速鉴 识。
[0052]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发 明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性 的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要 求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。