一种细胞薄片培养添加剂及其应用的制作方法

1.本发明属于细胞薄片技术领域，具体涉及一种细胞薄片培养添加剂及其应用。


背景技术：

2.近年来，以细胞/组织为基础的治疗手段在临床上应用越来越广泛。然而，传统的将悬浮细胞直接注射到机体受损部位的方法，由于细胞在靶部位的滞留和存活较差，治疗效果有限。传统的生物支架与细胞结合的组织工程方法需要找到细胞形成组织的速率与支架降解速率的临界平衡点，同时支架材料作为异源物质容易引起过敏反应。“细胞薄片组织工程”是一种无支架的组织工程技术，在组织工程和再生医学领域具有广泛的应用前景。这种无支架的细胞/组织生成系统可以有效地生成细胞密集的组织结构，维持细胞间的相互作用，保留了细胞与细胞之间的结合蛋白以及基侧的粘合蛋白。
3.细胞薄片在组织工程治疗领域主要有三个方面，一是将细胞薄片移植到有缺陷的组织或器官，保护创面，加速伤口愈合；二是从移植的细胞薄片中持续输送细胞因子和生长因子，以治愈功能失调的组织或器官；三是融合多种技术，包括快速和精确的细胞薄片叠层和血管诱导等，构建三维组织或器官，以实现部分或完全替代缺陷部位。
4.目前，细胞薄片的制作主要依赖温度敏感型培养皿，培养皿表面涂有聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pipaam)，当温度由37℃降到20℃时，pipaam由疏水性变为亲水性，此时细胞自行分离。但使用温度敏感型培养皿培养细胞存在两个主要问题。首先，从培养皿中分离细胞薄片需要降低温度，导致细胞活力下降和一些脆弱细胞功能的变化。其次，这种专门的细胞培养皿比一般的培养皿昂贵许多(如表1所示)。因此，开发一种使用普通细胞培养皿，不需要任何涂层或温度调节的简单的细胞薄片制造方法，可使细胞薄片技术更广泛地运用到组织工程和再生医学领域。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种添加剂。
6.本发明的第二个目的在于提供上述添加剂的应用。
7.本发明的第三个目的在于提供一种细胞薄片培养基。
8.本发明的第四个目的在于提供一种细胞薄片培养方法。
9.本发明所采取的技术方案是：
10.本发明的第一方面，提供一种添加剂，包含大分子化合物和维生素c。
11.在本发明的一些实施方式中，所述大分子化合物和维生素c的质量比为(1～100000):1。
12.在本发明的一些实施方式中，所述大分子化合物和维生素c的质量比为(500～1250):1。
13.在本发明的一些优选实施方式中，所述大分子化合物和维生素c的质量比为500:1。
14.在本发明的一些实施方式中，所述大分子化合物为聚蔗糖，主要利用大分子拥挤现象，其中大分子拥挤试剂通过发挥“排除体积效应”而达到改善微环境的作用，可促进细胞外基质的形成和重塑。由于分子固有的不可穿透性，被排除的体积引起空间位阻，从而形成一个高浓度的大分子微环境。大分子拥挤模拟了细胞在体内生存的微环境，被证实会引起蛋白质聚集和沉积，有助于细胞在体外形成自己的基质微环境，并影响酶反应速率、细胞骨架的形成、细胞粘附和迁移等。其余大分子化合物卡拉胶(carrageenan)、葡萄聚糖(dextran)、聚苯乙烯磺酸盐(polystyrene sulphonate)也可以一定程度促进细胞外基质蛋白的沉淀，促进形成细胞薄片。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所述聚蔗糖的浓度为0～100mg/ml，所述维生素c的浓度为0～1000μg/ml，但均不为0。
16.在本发明的一些优选实施方式中，所述聚蔗糖的浓度为25mg/ml，所述维生素c的浓度为50μg/ml。
17.在本发明的一些实施方式中，所述聚蔗糖为聚蔗糖400，还可以为聚蔗糖70。
18.本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述添加剂在细胞培养中的应用。
19.在本发明的一些实施方式中，所述细胞培养包含以下(i)～(
ⅹ
)中的至少一项：
20.(i)制备细胞薄片；
21.(ii)制备细胞层；
22.(iii)制备细胞外基质；
23.(iv)细胞培养；
24.(
ⅴ
)细胞增值；
25.(
ⅵ
)干细胞分化；
26.(
ⅶ
)制备体外仿生微环境；
27.(
ⅷ
)胶原蛋白沉积；
28.(
ⅸ
)制备抗氧化环境；
29.(
ⅹ
)防止细胞凋亡。
30.在本发明的一些实施方式中，所述细胞为哺乳类动物的成纤维细胞、骨髓间充质干细胞或肝星状细胞。
31.在本发明的一些优选实施方式中，所述细胞为哺乳类动物的成纤维细胞。
32.本发明的第三个方面，提供一种细胞薄片培养基，包含本发明第一方面所述添加剂。
33.在本发明的一些实施方式中，还包含基础培养基。
34.在本发明的一些优选实施方式中，所述基础培养基为dmem培养基。
35.在本发明的一些实施方式中，所述dmem培养基为高糖dmem培养基或低糖dmem培养基。
36.本发明的第四个方面，提供一种诱导培养细胞薄片的方法，将细胞混合于本发明第三方面所述培养体系中诱导培养。
37.在本发明的一些实施方式中，所述培养条件为37℃、5％co2恒温培养。
38.在本发明的一些实施方式中，所述培养方法还包括每隔2～3天对细胞进行补液的步骤。
39.在本发明的一些实施方式中，所述细胞的添加量为25万～37.5万个/ml。
40.本发明的有益效果是：
41.本发明提供了一种添加剂，包含大分子化合物聚蔗糖和维生素c，以及一种包含上述添加剂的培养体系。本发明发现与传统的利用温度敏感型培养皿制作的细胞薄片相比，加入大分子试剂聚蔗糖和维生素c培养得到的细胞薄片可以使用普通的细胞培养皿来进行高效培养，其中普通细胞培养皿、聚蔗糖以及维生素c价格低廉，能够很大程度上降低制作细胞薄片的经济成本，为实现大规模制备细胞薄片提供有效解决方案。
42.相对于温度敏感型培养皿，本发明在降低成本的基础上，取得了更加高效的培养效果，成功率达到100％，而且具有更丰富的细胞外基质，其中细胞外基质具有精密有序的网络结构，富含各种活性分子如生长因子、外泌体等，可指导细胞活动、信号传递，具有一定诱导再生功能和改善炎症反应的功能，在组织再生与修复中具有独特的优势，可有效支持组织再生并指导组织重建。
43.在细胞活性方面，利用温度敏感型培养皿制作细胞薄片需要在低温下孵育0.5～1小时，这个过程将一定程度上使细胞活力下降和导致一些脆弱细胞的功能发生变化。而本方法在获得细胞薄片的过程中不需要降低温度，细胞维持正常的功能和活力。
附图说明
44.图1为nih
‑
3t3细胞在培养第5天剥离后的白光照。其中a图为实施例1的培养结果；b图为对比例1的培养结果；c图为对比例2的培养结果；d图为对比例4的培养结果；e图为对比例3的培养结果。
45.图2为细胞外基质相关基因的表达情况。
具体实施方式
46.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
47.实施例所用耗材详情见表1。
48.表1实施例使用耗材详情
[0049][0050]
实施例1普通细胞培养皿/ficoll 400/维生素c/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0051]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的普通培养皿(购自康宁)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养24小时。
[0052]
称取ficoll 400粉末(购自ge healthcare)2g，溶解于10ml dmem高糖培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤混合溶液，制备成浓度为0.2g/ml的ficoll 400母液。吸取ficoll 400母液6.25ml、血清5ml、双抗500μl到38.25ml的deme高糖培养基中混合，制备成ficoll 400浓度为25mg/ml的完全培养基。称取维生素c粉末(购自solarbio life science)0.1g，溶于2ml纯水中，使用0.22μm无菌滤头过滤混合溶液，制备成浓度为0.05g/ml的维生素c母液。
[0053]
nih
‑
3t3细胞培养24小时后换液，倒掉培养基，用pbs清洗2遍后，加入2ml ficoll 400浓度为25mg/ml的完全培养基，再加入2μl浓度为0.05g/ml的维生素c母液，轻轻来回摇晃，使ficoll 400完全培养基和维生素c母液充分混匀，置于37℃、5％co2培养箱内培养4天，每2天换液一次。
[0054]
nih
‑
3t3细胞培养4天后，从培养箱中取出，使用移液枪吸取培养基约500～1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，使细胞成片状剥离培养皿，如图1a所示，形成nih
‑
3t3细胞薄片。
[0055]
实施例2普通细胞培养皿/ficoll 70/维生素c/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0056]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的普通培养皿(购自康宁)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养24小时。
[0057]
称取ficoll 70粉末(购自ge healthcare)2g，溶解于10ml dmem高糖培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤混合溶液，制备成浓度为0.2g/ml的ficoll 70母液。吸取ficoll 70母液9.375ml、血清5ml、双抗500μl到35.125ml的deme高糖培养基中混合，制备成ficoll 70浓度为37.5mg/ml的完全培养基。称取维生素c粉末(购自solarbio life science)0.1g，溶于2ml纯水中，使用0.22μm无菌滤头过滤混合溶液，制备成浓度为0.05g/ml的维生素c母液。
[0058]
nih
‑
3t3细胞培养24小时后换液，倒掉培养基，用pbs清洗2遍后，加入2ml ficoll 70浓度为37.5mg/ml的完全培养基，再加入2μl浓度为0.05g/ml的维生素c母液，轻轻来回摇晃，使ficoll 70完全培养基和维生素c母液充分混匀，置于37℃、5％co2培养箱内培养4天，每2天换液一次。
[0059]
nih
‑
3t3细胞培养4天后，从培养箱中取出，使用移液枪吸取培养基约500
‑
1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，使细胞成片状剥离培养皿。
[0060]
实施例3普通细胞培养皿/ficoll 400/维生素c/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0061]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的普通培养皿(购自康宁)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养24小时。
[0062]
称取ficoll 400粉末(购自ge healthcare)2g，溶解于10ml dmem高糖培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤混合溶液，制备成浓度为0.2g/ml的ficoll 400母液。吸取ficoll 400母液6.25ml、血清5ml、双抗500μl到38.25ml的deme高糖培养基中混合，
制备成ficoll 400浓度为25mg/ml的完全培养基。称取维生素c粉末(购自solarbio life science)0.1g，溶于2ml纯水中，使用0.22μm无菌滤头过滤混合溶液，制备成浓度为0.05g/ml的维生素c母液。
[0063]
nih
‑
3t3细胞培养24小时后换液，倒掉培养基，用pbs清洗2遍后，加入2ml ficoll 400浓度为25mg/ml的完全培养基，再加入0.8μl浓度为0.05g/ml的维生素c母液，轻轻来回摇晃，使ficoll 400完全培养基和维生素c母液充分混匀，置于37℃、5％co2培养箱内培养4天，每2天换液一次。
[0064]
nih
‑
3t3细胞培养4天后，从培养箱中取出，使用移液枪吸取培养基约500
‑
1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，使细胞成片状剥离培养皿。
[0065]
对比例1温度敏感型培养皿/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0066]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的温度敏感型培养皿(购自upcell)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养5天，每2天换液一次。
[0067]
nih
‑
3t3细胞培养5天后，从37℃、5％co2培养箱内取出，置于20℃培养箱内0.5小时，使用移液枪吸取培养基约500～1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，使细胞成片状剥离培养皿，如图1b所示，形成nih
‑
3t3细胞薄片。
[0068]
对比例2普通培养皿/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0069]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的普通细胞培养皿(购自康宁)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养5天，每2天换液一次。
[0070]
nih
‑
3t3细胞培养5天后，从37℃、5％co2培养箱内取出，使用移液枪吸取培养基约500
‑
1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，培养皿底部细胞不能形成片状，如图1c所示，经吹打后破裂。
[0071]
对比例3普通细胞培养皿/ficoll 400/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0072]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的普通培养皿(购自康宁)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养24小时。
[0073]
称取ficoll 400粉末(购自ge healthcare)2g，溶解于10ml dmem高糖培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤混合溶液，制备成浓度为0.2g/ml的ficoll 400母液。吸取ficoll 400母液6.25ml、血清5ml、双抗500μl到38.25ml的deme高糖培养基中混合，制备成ficoll 400浓度为25mg/ml的完全培养基。
[0074]
nih
‑
3t3细胞培养24小时后换液，倒掉培养基，用pbs清洗2遍后，加入2ml ficoll 400浓度为25mg/ml的完全培养基，再轻轻来回摇晃，置于37℃、5％co2培养箱内培养4天，每2天换液一次。
[0075]
nih
‑
3t3细胞培养4天后，从培养箱中取出，使用移液枪吸取培养基约500～1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，使细胞成片状剥离培养皿，如图1e所示，形成不完整的nih
‑
3t3细胞薄片。
[0076]
对比例4普通细胞培养皿/维生素c/nih
‑
3t3细胞培养体系
[0077]
将nih
‑
3t3细胞(购自atcc)正常复苏或传代，接种到直径为35mm的普通培养皿(购
自康宁)上，培养基2ml，培养基配伍为89％高糖dmem、10％血清、1％双抗，接种细胞数为50万～75万，置于37℃、5％co2培养箱内培养24小时。
[0078]
称取维生素c粉末(购自solarbio life science)0.1g，溶于2ml纯水中，使用0.22μm无菌滤头过滤混合溶液，制备成浓度为0.05g/ml的维生素c母液。
[0079]
nih
‑
3t3细胞培养24小时后换液，倒掉培养基，用pbs清洗2遍后，加入2μl浓度为0.05g/ml的维生素c母液，轻轻来回摇晃，置于37℃、5％co2培养箱内培养4天，每2天换液一次。
[0080]
nih
‑
3t3细胞培养4天后，从培养箱中取出，使用移液枪吸取培养基约500～1000μl，轻轻吹打培养皿底部边缘处，使细胞成片状剥离培养皿，如图1d所示，形成不完整的nih
‑
3t3细胞薄片。
[0081]
效果例
[0082]
1)根据实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4培养nih
‑
3t3细胞的培养条件，除去五种方法使用的相同耗材，分别计算五种方法制备nih
‑
3t3细胞薄片的成本。如表2所示。并且根据图1，统计五种不同培养方法获得细胞薄片的成功率，如表2所示。
[0083]
表2成本及制作细胞薄片的成功率
[0084] 实施例1对比例1对比例2对比例3对比例4成功率(％)100％100％0％20％20％成本(元)3.423443461.413.4181.41544
[0085]
可以看出，本实施例1中采用普通培养皿辅以ficoll 400和维生素c已经达到了100％的成功率，但采用温度敏感型培养皿/nih
‑
3t3细胞培养体系(对比例1)获得nih
‑
3t3细胞薄片所产生的费用是普通培养皿/ficoll 400/维生素c/nih
‑
3t3细胞培养体系(实施例1)的101倍。而且也可以看到对比例2中采用普通培养皿但不添加ficoll 400和维生素c，就不能成功地制备细胞薄片。
[0086]
2)实施例1和对比例1～4在细胞培养第5天时，用pbs清洗细胞2遍，往培养皿中分别加入1ml trizol reagent(购自invitrogen)裂解液，根据rna提取试剂盒(购自康为世纪)说明书提取5个实验组的总rna，再根据逆转录试剂盒(购自thermo fisher)说明书将总rna反转录成cdna。设计并合成小鼠胶原ⅰ、胶原ⅲ、胶原ⅳ、胶原
ⅴ
、胶原
ⅵ
、基质金属蛋白酶2(mmp
‑
2)、纤连蛋白(fibronectin)和内参基因gapdh的引物。然后根据实时荧光定量pcr试剂盒(购自索莱宝)说明书进行荧光定量pcr检测，结果如图2所示，检测不同处理下nih
‑
3t3细胞在基因水平上细胞外基质相关基因的表达情况。
[0087]
从图2可以看出，实施例1组的胶原ⅳ、胶原
ⅴ
、胶原
ⅵ
、基质金属蛋白酶2和纤连蛋白基因表达量均显著高于对比例1～4组(p＜0.05)，而且实施例1组的胶原ⅲ、胶原ⅳ、胶原
ⅴ
、胶原
ⅵ
、基质金属蛋白酶2和纤连蛋白基因表达量也比对比例1组高。因此，说明了实施例1组相对于对比例1～4组具有更为丰富的细胞外基质，而丰富的细胞外基质又能促进细胞形成完整的细胞薄片。
[0088]
综上所述，实施例1中的利用普通细胞培养皿加入ficoll 400和vc的方法可促进包括nih3t3细胞在内的哺乳类动物的成纤维细胞在短期内形成丰富的细胞外基质，进而促进细胞薄片的形成和剥离。
[0089]
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所
属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。