一株经航天育种技术选育的酿酒酵母及其突变位点应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株经航天育种技术选育的酿酒酵母及其突变位点应用。


背景技术：

2.类胡萝卜素是一大类有颜色的天然色素，由于其具有很强的抗氧化性，可以用于化妆品、营养品、抗氧化剂等。当前，化学合成和天然提取是制备类胡萝卜素的主要方式。由于结构的复杂性和原料供应不稳定、有毒物质残留、得率低等因素限制了类胡萝卜素的规模化生产。酿酒酵母本身并不能合成类胡萝卜素，但是通过基因工程改造酿酒酵母用于类胡萝卜素合成已经取得了长足的进步，很多报道已经达到很高的生产水平。
3.实验室适应性进化(ale)是一种经过长期驯化，不断适应筛选压力进而累积有益突变的一种技术。ale可以提高菌株生长速率、提高产物产量、利用非天然底物、提高对环境胁迫的抗性等。并且可以通过基因组测序，揭示表型性状与基因改变的关系。例如，在重组酿酒酵母中，通过过氧化氢介导的适应性进化显著提高了类胡萝卜素的合成，并揭示了相关突变。相比较紫外诱变等诱变形式，ale突变率较低，更容易揭示潜在的突变基因。
4.申请人在前期申请的专利(申请号为：2019103999462)中，构建了酿酒酵母bl03
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e
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10(bl03，cit1
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thmg1，δald6，eute
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2a
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atob)菌株。其表现出较高的类胡萝卜素合成能力，但其存在严重的生长迟滞现象，大幅度降低了其类胡萝卜素合成效率。本发明的目的就是通过航天育种技术对其进行适应性进化，以期获得生长获得恢复，并能保持较类胡萝卜素能力的菌株。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供两株高产类胡萝卜素的酿酒酵母变菌株
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酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)w2，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmcc no:61335。以及酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)w2
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a
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5，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmcc no:61337。
6.本发明以申请人已申请专利(申请号为：2019103999462)中酿酒酵母bl03
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e
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10(bl03，cit1
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thmg1，δald6，eute
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2a
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atob)菌株为出发菌株，通过微重力诱变获得类胡萝卜素合成能力明显提升的酿酒酵母变菌株w2，并确定了cho2基因的缺失失活是促进类胡萝卜素合成的主要因素，为类胡萝卜素合成提供了新的改造靶点。
7.本发明的第二个目的是提供上述酿酒酵母w2和w2
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a
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5在类胡萝卜素生产中的应用。
8.优选是将酿酒酵母w2和w2
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a
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5接种到ypd或ypm培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。
9.本发明的第三个目的是提供一种提高酿酒酵母类胡萝卜素产量的方法，其是将酿酒酵母基因组中的cho2基因突变失活。
10.优选是将酿酒酵母基因组中的cho2基因突变失活的突变株接种到ypd或ypm培养基中进行发酵培养，产类胡萝卜素。
11.本发明的第四个目的是提供将酿酒酵母基因组中的cho2基因突变失活在提高酿酒酵母产类胡萝卜素中的应用。
12.本发明的第五个目的是提供一种突变菌株，是将酿酒酵母基因组中的cho2基因突变失活获得的菌株。
13.本发明通过微重力诱变筛选获得一株酿酒酵母突变菌株w2，并在此菌株基础上进一步改造获得菌株w2
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a
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5。在摇瓶发酵条件下，两株菌株类胡萝卜素含量分别可以达到45mg/g和68mg/g细胞干重。
14.saccharomyces cerevisiae w2，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmcc no:61335。
15.saccharomyces cerevisiae w2
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a
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5，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmcc no:61337。
附图说明
16.图1是微重力诱变示意图(a)和各菌株类胡萝卜素含量(b)及筛选获得菌株的生长曲线(c)和生产曲线(d)，其中w1和w2是诱变菌株，bl03
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e
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10为出发菌株。
17.图2是w2进一步改造菌株w2
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a
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5性能表征。a，代谢途径改造示意图；b,各菌株类胡萝卜素含量；c，w2
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a
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5菌株生长曲线；d，w2
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a
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5菌株发酵曲线；e，w2
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a
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5菌株发酵罐发酵后发酵液形态；f，w2
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a
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5菌株发酵罐发酵后稀释涂板考察菌株稳定性。
18.图3是反向代谢工程改造。a，各菌株生长曲线；b,各菌株类胡萝卜素生产曲线；c，各菌株最大类胡萝卜素生产效率(黑色)和含量(白色)。w2代表酿酒酵母w2；bl03
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e
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10代表出发菌株；bl03
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2a
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1代表敲除cho2基因的酿酒酵母。
19.图4是比较转录组分析；(a)显著表达基因，(b)go富集分析，(c)kegg富集分析。
20.图5是cho2基因通用性测试；a，各菌株生长曲线；b,各菌株类胡萝卜素生产曲线；c，各菌株最大类胡萝卜素生产效率(黑色)和含量(白色)。bl03
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d
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5代表酿酒酵母bl03
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d
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4基础上敲除cho2基因；sc03
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d
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2代表酿酒酵母sc03
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d
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1基础上敲除cho2基因。
具体实施方式
21.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
22.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
23.实施例1微重力诱变
24.本实施例的酿酒酵母发酵培养基为：ypd培养基：酵母提取物10g/l(oxoid公司)，
蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，溶剂为水；或ypm培养基：酵母提取物10g/l(安琪酵母股份有限公司)，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾10g/l，七水硫酸镁5g/l，硫酸钾3.5g/l，磷酸钠2.5g/，tms溶液1ml/l(六水氯化镁250mg/l，二水氯化钙104.5mg/l，mg/l，五水合硫酸铜0.4mg/l，碘化钠0.08mg/l，四水合氯化锰0.1mg/l，二水合钼酸钠0.5mg/l，硼酸1mg/l，六水合氯化钴0.3mg/l，七水硫酸锌6.25mg/l，七水合硫酸亚铁3.5mg/l)，溶剂为水。其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。固体培养基是在液体培养基的基础上加入质量分数2％的琼脂。
25.由于申请人申请的申请号为：cn2019103999462专利中酿酒酵母bl03
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e
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10(bl03，cit1
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thmg1，δald6，eute
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2a
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atob)菌株存在严重的生长迟滞现象，我们推测这种现象是由于有毒代谢中间产物积累造成的。但我们还无法确定是何种物质造成这种生长迟滞。基于已报道的微重力诱变原理，我们推测在模拟微重力的情况下，可以增加细胞膜的流动性，进而抵抗有毒物质的毒害作用，而细胞膜流动性增加可以提高类胡萝卜素的合成能力。所以我们设计了微重力诱变筛选(如图1)，基本原理是：以申请号为：cn2019103999462中酿酒酵母bl03
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e
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10(bl03，cit1
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thmg1，δald6，eute
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2a
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atob)菌株为出发菌株，使用模拟微重力三维旋转实验装置(航天神舟生物科技集团有限公司)在20度、9转/分钟条件下，固体培养基上培养72小时，以ypd培养基进行复苏孵育，涂布于新鲜的ypd固体平板30℃培养，并观察平板中菌株菌落形态变化。经过48小时培养，成功筛选到一株颜色明显变红的菌株(此时其它菌株都还为浅黄色)，命名为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)w2，其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmcc no:61335。
26.菌株(酿酒酵母w2和出发菌株酿酒酵母bl03
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e
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10(bl03，cit1
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thmg1，δald6，eute
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2a
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atob))分别划线于新鲜ypd固体培养基中，48小时后，挑取单菌落接种于5ml ypd液体培养基中，过夜培养后，按体积比2％接种量接种到50ml ypm液体培养基中。于30℃，200rpm条件下培养96小时。培养过程中取样，按标准的测定方法，分别测定各培养条件下细胞干重、类胡萝卜素含量和生长曲线。从图1可以看出，酿酒酵母w2在摇瓶发酵条件下，类胡萝卜素含量可以达到45mg/g细胞干重，相比出发菌株有显著提升；并且生产效率提高10倍。
27.实施例2：w2菌株进一步改造
28.为了进一步提升酿酒酵母w2菌株类胡萝卜素的合成能力，我们在酿酒酵母w2菌株基础上将acc1基因启动子(其核苷酸序列如seq id no.1所示)替换成pdc1(其核苷酸序列如seq id no.2所示)，参考文献(xie zx,et al.rapid and efficient crispr/cas9
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based mating
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type switching of saccharomyces cerevisiae.8,173
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183(2018).)并构建双倍体细胞得到菌株w2
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a
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5。其于2020年12月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：gdmcc no:61337。
29.将所得菌株分别划线于新鲜ypd固体培养基中，48小时后，挑取单菌落接种于5ml ypd液体培养基中，过夜培养后，按体积比2％接种量分别接种到50ml ypm液体培养基中。于30℃，200rpm条件下培养96小时。培养期间，按标准的测定方法，分别测定各培养条件下细胞的生物量、类胡萝卜素含量和生长曲线。同时，在发酵罐发酵条件下(温度30℃，通气量控制在1.5vvm，溶氧控制在30％以上，ph保持自然状态，转速与溶氧偶联在300
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1000转之间进
行控制，接种量为10％，基础培养基为10g/l酵母提取物,20g/l蛋白胨和20g/l蔗糖，补料培养基为600g/l蔗糖和0.3l培养基含50g酵母提取物,9gkh2po4,2.5g mgso4,3.5g k2so4,0.28g na2so4)，对菌株w2
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a
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5发酵性能进行测试。
30.从图2可以看出，只对acc1基因进行启动子替换的菌株(w2
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a
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4)已有明显促进作用，进一步构建双倍的酿酒酵母w2
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a
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5在摇瓶发酵条件下，类胡萝卜素含量可以达到68mg/g细胞干重，在发酵罐条件下产量可以达到2.6g/l。
31.w2
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a
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5菌株改造所用引物
32.[0033][0034]
实施例3 w2菌株突变位点的确定
[0035]
为了确定突变菌株w2的突变位点，我们对出发菌株
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酿酒酵母bl03
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e
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10(bl03，cit1
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thmg1，δald6，eute
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2a
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atob)和突变菌株
‑
酿酒酵母w2进行了基因组重测序，发现了4个单核苷酸突变，其中有1个有意义突变，并且在cho2基因内部产生终止密码子，导致基因失活。随后，我们对出发菌株进行反向代谢工程研究，利用crispr/cas9系统对bl03
‑
e
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10菌株cho2基因(gene id:853061)进行敲除，获得cho2基因敲除的突变菌株bl03
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2a
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1。
[0036]
bl03
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2a
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1和bl03
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d
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5菌株构建所用引物
[0037][0038]
将bl03
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e
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10、酿酒酵母w2、改造菌株bl03
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2a
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1按照实施例1的方法分别接种到ypm培养基中，30℃，200rpm条件下培养96小时，测定细胞类胡萝卜素含量，计算占干重比，结果如图3所示，从图3可以看出cho2基因的敲除，可以显著提升出发菌株类胡萝卜素合成能力，说明cho2基因是本发明所获得的新的改造靶点。
[0039]
为了了解cho2失活促进类胡萝卜素合成的潜在机理，我们将出发菌株bl03
‑
e
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10和突变菌株w2菌株进行转录组测序，进行比较转录组分析。从图4可以看出，kegg和go富集分析发现，显著变化基因主要富集于核糖体合成和细胞结构合成相关基因。暗示了cho2的失活可能改变了细胞膜结构，影响了类胡萝卜素的积累。
[0040]
实施例4 cho2突变通用性测试
[0041]
为了考察cho2突变对酿酒酵母类胡萝卜素合成促进作用是否具有通用性，我们选择两种没有生长迟滞现象的酿酒酵母重组菌株进行测试。分别对酿酒酵母菌株bl03
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d
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4和sc03
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1(s288c,δgal80：：p
hsp26
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δ416d：：p
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ohmgr
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)的cho2基因进行敲除，获得突变菌株bl03
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5和sc03
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d
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2。按照实施例1的方法分别接种到ypm培养基中，30℃，200rpm条件下培养96小时，测定细胞类胡萝卜素含量，计算占干重比，结果如图5所示，可以看出cho2基因的敲除，可以显著提升不同类型菌株类胡萝卜素合成能力，说明cho2基因作为新的改造靶点具有较好的通用性，可以应用于多种菌株的改造，用以提高菌株类胡萝卜素合成能力。
[0042]
sc03
‑
d
‑
2菌株构建所用引物
[0043][0044][0045]
以上对本发明所提供的高产类胡萝卜素的酿酒酵母突变菌株及其微重力诱变筛选方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。