一种红曲黄色素类化合物及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于天然产物技术领域，具体涉及一种红曲黄色素类化合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.红曲属真菌(monascussp.)作为世界上能产食用色素的最重要微生物之一，将其接种于蒸熟的大米，经过固态发酵后可得到红曲。在古代，人们称之为“丹曲”或“神曲”，在我国已有1000多年的使用历史，在日本等亚洲国家也有100多年的历史。红曲“味甘性平，健脾益气，温中”，现代研究证明红曲属真菌可产生多种次生代谢产物，包括红曲色素、monacolink、麦角固醇、淀粉酶、糖化酶和桔霉素等，其中研究最多的是红曲色素。
3.红曲色素是目前世界上唯一利用微生物发酵法生产的天然色素，常用于食品着色，已有上千年的应用历史，相关产业在朝着“天然、营养、多功能”的方向不断发展。红曲色素由黄、橙、红三类色素成分组成，通常将其混合物作为红色素被使用。红曲色素具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抑制肥胖、降血糖以及调节胆固醇等多种生物活性，具有极高的食品和药用价值。目前，市场对黄色素需求量最大，而红曲中的黄色素成分通过微生物发酵获得，较其它来源黄色素具有生产方便、稳定性高、着色能力强和多种生物活性的优点。
4.现有技术中红曲黄色素产品的开发并无具体的化学指标成分，仅仅以提高色价为目标，而且组成化学成分尚未明确，导致其质量难以控制。另外，由于由于烹饪和保存的需要，食用色素类产品需要在高温和光照下需要较好的稳定性，而目前现有技术对于这方面产品的设计和加工也尚属空白。


技术实现要素：

5.发明目的
6.本发明的目的在于对红曲属真菌的发酵提取物进行系统制备和分离并鉴定，得到5个新的红曲黄色素类单体化合物，并在高温和光照条件下对这些单体化合物进行了稳定性评价。
7.技术方案
8.本发明的第一方面，提供了一种如式(i)所示的红曲黄色素类化合物或其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其代谢产物，其特征在于，所述式(i)为，
[0009][0010]
其中，r1、r2或r3为h、任选取代的c
1-c4烷基、任选取代的c
1-c4烷氧基、-oh中的任意
一种或几种；优选的，r1、r2、或r3为h、-och3或-oh；进一步优选的，r1为-oh且r2、r3中至少有一个为-oh；
[0011]
r4为且r5为任选取代c
1-c4烷基、任选取代的c
1-c4烷氧基或r4和r5成六元环为
[0012]
进一步的，所述化合物具有以下结构：
[0013][0014]
本发明的第二方面提供了一种上述任一种红曲黄色素类化合物或其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其代谢产物的制备方法，包括：由红曲属monascussp.真菌经微生物发酵后获得提取物，再采用色谱法将所述提取物分离后得到；
[0015]
进一步的，所述红曲黄色素类化合物或其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
s1：将红曲属真菌的菌株，接种于液体培养基中进行活化后制备成种子液，将种子液接种至大米固体培养基中进行发酵10～15天，得到红曲提取物；优选的，所述发酵时间为14天；
[0017]
s2：将s1所得红曲提取物经乙酸乙酯萃取得萃取液，将所述萃取液经减压浓缩后，得乙酸乙酯粗提物；
[0018]
s3：将s2所得乙酸乙酯粗提物经硅胶柱色谱、中低压ods柱色谱以及制备高效液相色谱分离并鉴定，即得；
[0019]
本发明的第三方面提供了一种色素组合物，包括上述任一项所述的红曲黄色素类化合物或其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其代谢产物以及可接受的载体；
[0020]
本发明的第四方面提供了一种如上述任一项所述的红曲黄色素类化合物或其药学上可接受的盐、其溶剂化物或其代谢产物或所述色素组合物在制备色素类产品中的应用；优选的，所述色素类产品为食品、药品、化妆品或其它化工产品。
附图说明
[0021]
图1温度对红曲黄色素类化学成分稳定性的影响
[0022]
图2光照对红曲黄色素类化学成分稳定性的影响
[0023]
有益效果
[0024]
本发明通过对红曲提取物的分离和结构鉴定，获得了5个新化合物，并且经过测试，并对这五个新化合物进行性能测试，发现其在高温和光照下均具有良好的稳定性，上述新化合物具作为色素添加剂具有良好的应用前景。
具体实施方式
[0025]
下面将详细举例说明本发明。需要指出的是，所述实施例说明了一些制备或使用方法，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
[0026]
1.菌株来源
[0027]
来自于红曲属真菌(monascussp.)。
[0028]
2.实验仪器
[0029]
eyela旋转蒸发仪n-1001(东京rikakikai公司)；dionex分析型和制备型高效液相色谱仪(美国thermo fisher scientific公司)；phenomenex gemini c18分析(4.6
×
250mm，5μm)、半制备(10.0
×
250mm，5μm)和制备(20.0
×
250mm，5μm)色谱柱(美国phenomenex公司)；jascov-550紫外测定仪购自日本jasco international公司；jascoft/ir-480plus红外测定仪购自日本jasco international公司；jascop-1020旋光测定仪购自日本jasco international公司；bruker av-400/600mhz核磁共振仪购自瑞士bruker biospin公司；waters synapt g2 tof高分辨质谱仪购自美国waters公司；
[0030]
3.实验材料
[0031]
分析纯环己烷、乙酸乙酯、乙醇购自天津市富宇精细化工有限公司；氘代二甲基亚砜购自德国sigma-aldrich公司；色谱级甲醇购自山东禹王实业有限公司；ods(50μm)购自日本ymc公司；硅胶购自青岛海洋化工有限公司；
[0032]
以下缩写贯穿整个说明书：
[0033]
t
r
：保留时间
[0034]
dmso-d6：氘代二甲基亚砜
[0035]
δ
h
：氢的化学位移
[0036]
δ
c
：碳的化合物位移
[0037]
如无其他说明，本发明中色谱分析的检测波长均为208nm,色谱柱柱温均为28℃。
[0038]
实施例1：红曲(红曲属真菌发酵物)中黄色素富集馏分(mrg-mri)的分离制备
[0039]
将红曲属真菌的菌株，接种于液体培养基中进行活化后制备成种子液，然后将种子液接种至100瓶500ml的锥形瓶(每瓶装有70g大米)中进行发酵，首先在30℃下发酵3天，再降低温度至25℃发酵11天后，获得红曲提取物，然后用乙酸乙酯浸泡萃取三次得到萃取液，再经过减压浓缩后得到乙酸乙酯粗提物202.3g。将乙酸乙酯粗提物进行等体积环己烷
–
甲醇液相萃取，分别得到环己烷层(c,56.2g)和甲醇层(w,100.0g)。将总样、环乙烷层和甲醇层进行hplc-dad-elsd分析，发现主要代谢物成分集中于甲醇层(w,100.0g)，因此我们将甲醇层(w,100.0g)用甲醇
–
水(5:95,10:90,20:80,30:70,40:60,50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,and100:0,v/v)系统在ods中低压柱层析下洗脱，得到11个子馏分mr
a
～mr
k
。对该11个子馏分mr
a
～mr
k
进行hplc-dad-ms分析，发现mr
g
～mr
i
三个馏分为黄色素富集馏分。
[0040]
实施例2：红曲(红曲属真菌发酵物)中黄色素富集馏分中单体化合物1、2、3、4、5的分离鉴定
[0041]
采用制备高效液相色谱仪，将馏分mr
h
(3.5g)分离[色谱条件：甲醇-水-甲酸,60:40:0.1,v/v/v,8ml/min,phenomenex biphenyl column(21.2
×
250mm,5μm)]得到4个子馏分(mr
h1-mr
h4
),其中mr
h3
即为化合物3(817.7mg,t
r
＝32.0min)；其中子馏分mr
h2
(1.1g)经制备hplc[色谱条件：甲醇-水-甲酸,60:40:0.1,v/v/v,8ml/min,phenomenex gemini c18column(21.2
×
250mm,5μm)]分离得到9个子馏分(mr
h21-mr
h29
),其中子馏分mr
h23
(58.3mg)经半制备hplc[色谱条件：乙腈-水-甲酸,40:60:0.1,v/v/v,3ml/min,phenomenex gemini c18column(10
×
250mm,5μm)]分离得到化合物2(mr
h231
,3.0mg,t
r
＝47min)；子馏分mr
h22
(66.1mg)经hplc半制备[色谱条件：乙腈-水-甲酸,40:60:0.1,v/v/v,3ml/min,phenomenex gemini c18 column(10
×
250mm,5μm)]分离得到化合物1(mr
h221
,5.0mg,t
r
＝45min)。
[0042]
采用制备高效液相色谱仪，馏分mr
g
(3.4g)经制备hplc[色谱条件：甲醇-水,55:45,v/v,8ml/min,phenomenex biphenyl column(21.2
×
250mm,5μm)]分离得到5个子馏分(mr
g1-mr
g5
),其中子馏分mr
g3
(1.0g)经hplc制备[色谱条件：甲醇-水,50:50,v/v,8ml/min,phenomenex gemini c18 column(21.2
×
250mm,5μm)]得到5个子馏分(mr
g31-mr
g35
),其中子馏分mr
g31
(16mg)经半制备hplc[色谱条件：乙腈-水,33:67,v/v,3ml/min,phenomenex gemini c18 column(10
×
250mm,5μm)]分离得到化合物5(mr
g312
,5.3mg,t
r
＝40min)；其中子馏分mr
g32
(15mg)经半制备hplc[色谱条件：乙腈-水,33:66,v/v,3ml/min,phenomenex gemini c18 column(10
×
250mm,5μm)]分离得到化合物4(mr
g322
,2.4mg,t
r
＝46min)。
[0043]
其中化合物1、2、3、4和5的结构及鉴定数据如下所示：
[0044]
化合物1：
[0045][0046]
淡黄色油状物；[α]28d 162.4(c0.5,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)196(3.50),248(3.98),324(2.47)nm；ir(kbr)v
max
3276,2805,2720,1776,1558,1066cm-1
；esi-ms
(positive)m/z365[m h]

；hresims(positive)m/z365.2334[m h]

(calcd.forc
21
h
33
o5,365.2328).1h和
13
c nmr见表1。
[0047]
化合物2：
[0048][0049]
淡黄色油状物；[α]28d 139.0(c0.5,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)200(3.63),247(3.99),333(2.75)nm；ir(kbr)v
max
3275,2808,2728,1698,1541,1395,1066cm-1
；esi-ms(positive)m/z365[m h]

；hresims(positive)m/z365.2335[m h]

(calcd.forc
21
h
33
o5,365.2328).1h和
13
cnmr见表1。
[0050]
化合物3：
[0051][0052]
淡黄色油状物；[α]28d-391.2(c0.5,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)208(4.05),385(3.73),494(3.37)nm；ir(kbr)v
max
3277,2922,2850,1641,1538,1466,1079cm-1
；esi-ms(positive)m/z361[m h]

；hresims(positive)m/z361.2006[m h]

(calcd.forc
21
h
29
o5,361.2015).1h和
13
cnmr见表2。
[0053]
化合物4：
[0054][0055]
淡黄色油状物；[α]28d 144.6(c0.5,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)223(3.63),381(3.75)nm；ir(kbr)v
max
3282,2920,2875,1885,1403,1388cm-1
；esi-ms(positive)m/z377[m h]

；hresims(positive)m/z377.1989[m h]

(calcd.forc
21
h
29
o6,377.1964).1h和
13
cnmr见表2。
[0056]
化合物5：
[0057][0058]
淡黄色油状物；[α]28d 140.8(c0.5,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)226(3.82),380(3.75)nm；ir(kbr)v
max
3285,2920,2870,1880,1400,1100cm-1
；esi-ms(positive)m/z377[m h]

；hresims(positive)m/z377.1984[m h]

(calcd.forc
21
h
29
o6,377.1964).1h和
13
cnmr见表2。
[0059]
表1化合物1和2核磁数据归属(600mhz,indmso-d6)
[0060][0061]
[0062]
表2化合物3、4和5核磁数据归属(600mhz,indmso-d6)
[0063][0064][0065]
实施例3：化合物1～5的稳定性评价
[0066]
3.1样品溶液的配制
[0067]
利用20μldmso分别溶解1.0mg样品化合物1、2、3、4、5配置成浓度为50mg/ml的母液，然后加水稀释至1mg/ml得到稀释液，放入冰箱冷藏待用。
[0068]
以最低样品量进行如下表3的计算：
[0069]
表3
[0070]
样品浓度(mg/ml)体积(μl)溶剂母液5080dmso稀释液14000水 dmso
[0071]
3.2化合物的分析条件
[0072]
利用高效液相色谱仪，针对不同化合物采用不同的分析条件进行液相分析，对色
谱峰进行积分，计算出化合物在不同温度下或不同光照条件下不同取样点的峰面积，其中，色谱条件如下：色谱柱：phenomenex5μ-c18,4.6x250mm，流动相：乙腈-水(0.1％甲酸)，流速：1ml/min；检测波长：330nm；流动相比例与时间的关系如下表4所示：
[0073]
表4
[0074]
样品流动相比例和时间关系进样量化合物155％v/vhcn(0min)～55％v/vhcn(20min)20μl化合物255％v/vhcn(0min)～55％v/vhcn(20min)20μl化合物360％v/vhcn(0min)～60％v/vhcn(20min)20μl化合物440％v/vhcn(0min)～40％v/vhcn(20min)20μl化合物540％v/vhcn(0min)～40％v/vhcn(20min)20μl
[0075]
3.3温度对色素稳定性的考察
[0076]
操作步骤：
[0077]
(1)每个ep管中分别放入500μl稀释液(化合物1、2、3、4、5)，用封口膜将其封上；
[0078]
(2)将ep管在不同温度下进行加热(温度一：水浴加热(80℃)、温度二：油浴加热(120℃))6h，每隔2h进行一次取样，取样时间点分别为0h、2h、4h、6h，共取样4次，每次取样量为50μl；
[0079]
(3)取样后加入50μl甲醇使其澄清，此时样品浓度为0.5mg/ml；
[0080]
(4)离心处理后以步骤3.2下方法进行hplc分析，比对保留时间，并对色谱峰进行积分，计算峰面积。
[0081]
3.4光照对色素稳定性的考察
[0082]
操作步骤：
[0083]
(1)每个ep管中放入750μl稀释液(化合物1、2、3、4、5)，用封口膜将其封上；
[0084]
(2)将ep管在不同光照(避光或1000lux)条件下进行光照24h，取样时间点分别为0h、2h、4h、8h、16h、24h进行一次取样，共取样6次，每次取样量为50μl；
[0085]
(3)取样后加入50μl甲醇使其澄清，此时样品浓度为0.5mg/ml；
[0086]
(4)离心处理后液取样时间点分别为，比对保留时间，并对色谱峰进行积分，计算峰面积。
[0087]
3.5实验结果
[0088]
3.5.1温度对红曲黄色素类化学成分稳定性的影响
[0089]
实验结果显示：(1)在常温下化合物1～5均具有较好的稳定性；(2)温度越高，化合物越不稳定：在80℃下的变化较小，而在120℃下则变化较大，但是化合物1、2在高温下稳定性较好，温度对这两个化合物的稳定性基本没有影响；(3)120℃条件下，化合物4和化合物5比化合物3更稳定，说明c-6'或c-7'羟基的引入有利于化合物的稳定，具体参见图1a)和图1b)，温度对化合物1-5稳定性结果，其中，每个值表示为mean
±
sd，n＝2；图1a)表示80℃下，化合物1-5的剩余率；图1b)表示120℃下，化合物1-5的剩余率(剩余率为不同时间点下色谱峰的峰面积与0h下色谱峰的峰面积之比)。
[0090]
3.5.2光照对红曲黄色素类化学成分稳定性的影响
[0091]
实验结果显示：(1)在避光条件下，化合物1～5均具有较好的稳定性；(2)而1000lux条件下4小时后变化较大，但是化合物1、2在高温下稳定性较好，温度对这两个化合
物的稳定性基本没有影响；(3)1000lux条件下，化合物4和化合物5比化合物3更稳定，说明c-6'或c-7'羟基的引入有利于化合物的稳定，具体参见图2a)和图2b)，光照对化合物1-5稳定性结果，其中，每个值表示为mean
±
sd，n＝2；图2a)表示避光条件下，化合物1-5的剩余率；(b)表示，1000lux条件下，化合物1-5的剩余率(剩余率：不同时间点下色谱峰的峰面积与0h下色谱峰的峰面积之比)。
[0092]
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“一些实施方案”或“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围内。