光诱导型基因启动子、重组载体及其构建方法、重组细菌与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及光诱导型基因启动子、重组载体及其构建方法、重组细菌。


背景技术：

2.植物的生长发育和生长周期是不同基因在时间和空间上有序表达的结果。基因表达调控的关键环节之一是转录水平的调控，由顺式作用元件和反式作用因子相互作用实现。植物基因启动子是位于结构基因5’端转录起始位点上游区的重要顺式作用元件，转录因子识别启动子的一段特异dna序列，并进一步招募rna聚合酶开启基因转录过程，因此启动子是基因表达调控的一个重要元件。
3.根据启动子的转录模式可以分为组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子驱动目的基因在植物各组织中持续表达，会过度消耗受体细胞内的物质和能量，打破植物自身的自然规律，往往不能很好的调控基因的表达，因此在应用中存在一定的缺陷。组织或器官特异性启动子在异源转基因植物中表达强度和组织特异性存在差异，在不同物种中(如水稻、玉米和小麦等)的发掘多数处于起步阶段，且具体机制尚不清楚。诱导型启动子在受外源物理、化学因素等的诱导下，能快速诱导基因转录的“开”与“关”，因此可根据实验需要调控转基因在植物中的表达。目前应用较为广泛的诱导表达系统有四环素类诱导表达系统、类固醇类诱导系统、地塞米松诱导系统、激素类诱导表达系统以及杀虫剂和乙醇表达系统。这些化学诱导启动子的反应条件需要人为添加化学诱导物质才能激活目的基因的表达，控制较难且效率低，在一定程度上可能对植物产生毒害。因此，开发天然诱导型启动子已成为当前基因工程的必要需求。
4.在高等植物的生长发育过程中，光除了参与光合作用积累生物量，还作为一种重要的信号调控相关基因的表达。大量研究表明，植物体内存在一系列受光诱导表达的内源基因。因此，对这些基因的启动子进行研究，开发光诱导型启动子诱导基因表达系统，对植物基因工程研究和应用具有不可估量的作用，其应用前景十分广阔。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供光诱导型基因启动子、重组载体及其构建方法、重组细菌。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种光诱导型基因启动子，其中，所述光诱导型基因启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.所述的光诱导型基因启动子，其中，所述光诱导型基因启动子来源于拟南芥。
9.一种制备光诱导型基因启动子的上、下游扩增引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游扩增引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
10.一种重组载体，其中，包含本发明所述的光诱导型基因启动子。
11.所述的重组载体，其中，所述重组载体为融合光诱导型基因启动子ntp2和gus报告基因的质粒pntp2
‑
gus。
12.一种重组载体的构建方法，其中，包括步骤：
13.以野生型拟南芥col的基因组dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物进行pcr扩增，得到光诱导型基因启动子ntp2；
14.对融合有gus报告基因的pmdc162质粒载体和所述光诱导型基因启动子ntp2进行kpn1和sac1双酶切，并通过凝胶电泳对酶切产物进行胶回收纯化，得到酶切后ntp2片段和酶切后pmdc162质粒载体；
15.采用t4连接酶将所述酶切后ntp2片段连接入所述酶切后pmdc162质粒载体中，构建成重组载体pntp2
‑
gus。
16.一种重组细菌，其中，采用本发明所述的重组载体转化农杆菌gv3101得到。
17.一种重组细菌的应用，其中，基于花苞浸泡法采用含有所述重组细菌的培养基培养拟南芥，筛选得到稳定遗传的拟南芥纯合突变体。
18.有益效果：本发明利用光诱导型基因启动子代替组成型基因启动子，提供一种含特异性光诱导型启动子的重组载体，使用融合gus报告基因的pmdc162质粒作为基础载体，使用光诱导型基因启动子ntp2作为靶序列，组成重组载体。本发明构建的重组载体具有具有特异性好、高效稳定表达、易于筛选等优点，完全可以在保证光照的基础上，快速地获得光诱导表达目的基因的转基因材料，有望在调控目的基因的表达中发挥重要作用。
附图说明
19.图1为本发明一种重组载体的构建方法的流程图。
20.图2为融合ntp2基因启动子和gus蛋白质粒pntp2
‑
gus的载体图谱。
21.图3为无光和有光条件下ntp2的诱导表达情况。
22.图4为pntp2
‑
gus的组织特异表达。
具体实施方式
23.本发明提供光诱导型基因启动子、重组载体及其构建方法、重组细菌，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
24.本发明提供一种光诱导型基因启动子，其中，所述光诱导型基因启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
25.在本实施例中，所述光诱导型基因启动子来源于拟南芥。
26.另一方面，本发明还提供一种制备光诱导型基因启动子的上、下游扩增引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游扩增引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
27.在一些实施方式中，本发明还提供一种重组载体，其包含本发明所述的光诱导型基因启动子，其中，所述重组载体为融合光诱导型基因启动子ntp2和gus报告基因的质粒pntp2
‑
gus。
28.本发明构建的重组载体具有具有特异性好、高效稳定表达、易于筛选等优点，完全可以在保证光照的基础上，快速地获得光诱导表达目的基因的转基因材料，有望在调控目的基因的表达中发挥重要作用。
29.在一些实施方式中，还提供一种重组载体的制备方法，如图1所示，其包括步骤：
30.s10、以野生型拟南芥col的基因组dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的下游引物进行pcr扩增，得到光诱导型基因启动子ntp2；
31.s20、对融合有gus报告基因的pmdc162质粒载体和所述光诱导型基因启动子ntp2进行kpn1和sac1双酶切，并通过凝胶电泳对酶切产物进行胶回收纯化，得到酶切后ntp2片段和酶切后pmdc162质粒载体；
32.s30、采用t4连接酶将所述酶切后ntp2片段连接入所述酶切后pmdc162质粒载体中，构建成重组载体pntp2
‑
gus。
33.本实施例利用光诱导型启动子代替组成型启动子，提供一种含特异性光诱导型启动子的重组载体，使用融合gus报告基因的质粒pmdc162载体作为基础载体，使用光诱导型基因启动子作为靶序列，组成重组载体。
34.在一些实施方式中，还提供一种重组细菌，其采用本发明所述的重组载体转化农杆菌gv3101得到。
35.在一些实施方式中，还提供一种重组细菌的应用，其中，基于花苞浸泡法采用含有所述重组细菌的培养基培养拟南芥，筛选得到稳定遗传的拟南芥纯合突变体。
36.下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
37.实施例1
38.1)、登录拟南芥tair数据库(http:www.arabidopsis.org/)，根据公布的拟南芥ntp2(ntp2：at2g40520)基因序列上游约1.5kb左右的启动子区域设计光诱导型基因启动子ntp2的上、下游扩增引物；
39.2)、设计光诱导型基因启动子ntp2的上、下游扩增引物如下所示：
40.所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列具体为p15’caccaaacaatttggtatttggtt3’；
41.所述下游扩增引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，其核苷酸序列具体为p2：5’ttgaacaaaaaacaaagagaatcac3’。
42.3)、以野生型拟南芥col的基因组dna为模板，利用上述双引物进行pcr扩增，得到的pcr产物为光诱导型基因启动子ntp2，并对其进行琼脂糖电泳回收目的片段1540bp，其pcr反应体系如表1所示。
43.表1 pcr反应体系：
[0044][0045][0046]
4)、对融合有gus报告基因的pmdc162质粒载体和步骤3)所制得的pcr产物光诱导型基因启动子ntp2进行kpn1和sac1双酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行胶回收纯化得到酶切后ntp2片段和酶切后pmdc162质粒载体，其中，双酶切反应体系如表2所示。
[0047]
表2双酶切反应体系
[0048]
pcr回收产物/载体22μlkpn11μlsac11μlcutsmart4μlddh2o12μltotal40μl
[0049]
5)、利用t4连接酶将所述酶切后ntp2片段连接入所述酶切后pmdc162质粒载体中，构建成如图2所示的重组载体pntp2
‑
gus，连接体系如表3所示。
[0050]
表3连接体系
[0051]
[0052][0053]
将所述连接体系置于pcr仪中，16℃过夜以提高连接效率。
[0054]
6)、对构建成的重组载体pntp2
‑
gus进行大肠杆菌转化：
[0055]
①
将6μl连接产物接入50μl大肠杆菌dh5α感受态，混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上5min。
[0056]
②
加入约1ml无抗的液体lb，200rpm，37℃培养箱培养1h。
[0057]
③
培养好的菌液8000rpm，离心1min，去部分上清，留200μl。将留下的200μl菌液涂在卡那霉素抗性板上。置于37℃培养箱倒置培养生长约16小时。
[0058]
④
挑取菌落至1ml lb液体培养基(含卡那霉素)中，37℃振荡培养2h。进行菌落pcr鉴定，鉴定为阳性的菌液送至公司进行测序，从而获得测序正确的pntp2
‑
gus重组质粒。
[0059]
7)、将测序正确的pntp2
‑
gus重组质粒转化至农杆菌gv3101：
[0060]
1、取
‑
80℃保存的50μl农杆菌感受态gv3101，冰上完全解冻后加入5
‑
10μl质粒。
[0061]
2、混匀，依次于冰上静置5min、液氮3min、37℃水浴5min、冰浴5min。
[0062]
3、加入1ml无抗lb液体培养基，28℃、180
‑
200rpm预培养1
‑
2小时。
[0063]
4、将上述菌液涂布于lb固体培养基(含kan卡那霉素、rif利福平、genta庆大霉素)，28℃倒置培养36
‑
40h至形成单菌落。
[0064]
5、对阳性菌落进行扩繁，收集菌体，即得到重组细菌。
[0065]
实施例2
[0066]
1)、利用花苞浸泡法稳定转化col
‑
0生态型的拟南芥；
[0067]
①
转化采用花苞浸泡法(文献yhq65)，取生长一个月左右，生长状况良好的植株，转化前可以提前一个周将拟南芥做去顶处理，以使植物产生较多的花苞，提高转化的效率。
[0068]
②
将含有转基因载体的农杆菌加三抗液体培养基小摇后吸取200μl加到200ml三抗液体培养基摇至od 600约1.5
‑
2.0之间。
[0069]
③
将菌液8000rpm离心10min，倒掉上清留下底部的菌体。
[0070]
④
用4.4g/l murashige&skoog(ms)basal mediumw/vitamins溶液(含5％蔗糖溶液)重悬菌液，加入0.5μl/ml silwet表面活性剂，做成活化液，光下活化2
‑
3h。
[0071]
⑤
将拟南芥花序浸入溶液3min左右，黑暗培养24h，取出放培养室培养直至收取t1代种子。
[0072]
2)、在含潮霉素的1/2ms固体培养基中培养t1代种子，春化后光照培养，转移培养基中正常生长的t1代阳性植株至营养土，于温室中22℃生长，待t1代阳性植株生长至完全成熟后收取t2代种子；
[0073]
3)、正常种植t2代种子，对长势情况良好的t2代植株进行基因型鉴定，分析t2代基因型，筛选稳定遗传的纯合突变体t3代。
[0074]
实施例3
[0075]
1)、植物总rna提取及浓度测定
[0076]
①
准备工作：提前准备10μl，200μl，1ml的rnase free枪头，1.5ml和2ml rnase free离心管。研磨棒洗净烘干，所有操作均在通风橱内进行。冷冻离心机提前预冷。
[0077]
②
将收集的材料先放入2ml离心管立即放入液氮中，用预冷的研磨棒研磨至粉状。
[0078]
③
加入1ml trizol，充分混匀，室温静置10min。
[0079]
④
加入500μl氯仿，充分振荡，室温静置10min。4℃，12000rpm，离心10min。
[0080]
⑤
吸取上清转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，
‑
20℃静置至少10min。
[0081]
⑥
4℃，12000rpm，离心10min，去除上清。加入1ml 75％乙醇清洗，轻轻弹离心管壁，此时可看到沉淀处于悬浮状态，充分清洗。
[0082]
⑦
4℃，12000rpm，离心5min，去除上清，室温静置至晾干。
[0083]
⑧
加入适量depc水，充分溶解，用nanodrop2000超微量分光光度计(thermo)测定浓度，
‑
80℃保存。
[0084]
2)、实时荧光定量pcr
[0085]
1、提供如表3所示的去除基因组dna体系
[0086]
表3
[0087]
试剂使用量5
×
gdna eraser buffer2μlgdna eraser1μltotal rna＜1μgrnase free dh2oup to 10μl
[0088]
将表3所示的去除基因组dna体系置于pcr仪中，42℃反应2min。
[0089]
2、提供如表4所示的反转录体系
[0090]
表4
[0091][0092]
[0093]
将表4所示的反转录体系置于pcr仪中，37℃15min，85℃5sec；根据real time pcr所需要的cdna的量进行稀释。
[0094]
3)、设计荧光定量检测引物，其中，
[0095]
pcr正向检测引物如seq id no.4所示，其核苷酸序列具体为aagggctcaggagatactatgt；
[0096]
pcr反向检测引物如seq id no.5所示，其核苷酸序列具体为ttcaagcacacaacacactg。
[0097]
4)、real time pcr
[0098]
提供如表5所示的real time pcr反应体系
[0099]
表5
[0100][0101][0102]
将表5所示的real time pcr反应体系按照表6所示的两步法pcr扩增标准程序进行扩增。
[0103]
表6
[0104][0105]
实施例4
[0106]
1)、拟南芥的培养及表型观察方法
[0107]
①
种子的清洗：取适量数目的种子于1.5ml离心管中，加入1ml75％酒精，灭菌10min，在超净工作台内将75％酒精吸出，立即用1ml无水乙醇重悬。用1ml枪头将种子吸出打到定性滤纸上，待完全干透。
[0108]
②
点种(用于观察幼根表型)：用牙签将消毒后的种子，点到含1/2ms的方形表型培养基(可根据需要添加抗生素或激素)。尽量保持所有种子均点在同一条直线上以便观察。
[0109]
③
拟南芥培养方法(用于观察幼根表型)：点好的种子春化三天后，竖直放置于光照培养箱中，保证根不进入培养皿里影响后期观察。光照强度8000lux，温度22℃，光周期16/8h(白天/黑夜)。
[0110]
2)、ntp2的诱导表达情况
[0111]
将col
‑
0生态型的拟南芥置于光照强度8000lux，温度22℃，长日照光周期5d/5d(白天/黑夜)培养。在无光和有光条件下，利用real time pcr分别检测拟南芥中ntp2的诱导表达情况，结果如图3所示。从图三可以看出，在黑暗条件下，col
‑
0生态型拟南芥中的ntp2表达量低。相反在光照条件下，col
‑
0生态型拟南芥中的ntp2表达量大幅度增加。当光照时间从0小时逐渐递增至1小时、3小时、6小时，col
‑
0生态型拟南芥中的ntp2表达量随着光照时间的递增而增加。由此说明ntp2为光诱导型基因启动子，受光诱导产生。
[0112]
3)、组织特异表达情况
[0113]
将筛选得到的稳定遗传纯合突变体t3代阳性苗进行gus组织化学染色，结果如图4所示。从图4可以看出，在有光条件(4d)下，ntp2的组织特异表达比在无光条件下呈现更深的蓝色，表明在有光条件下ntp2的表达量更高。当光照时间从0小时递增至6小时，ntp2的表达量也随之增加。由此也说明ntp2为光诱导型基因启动子，受光诱导产生。
[0114]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。