从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法与流程

1.本发明涉及从人多能干细胞(hpsc)有效获得眼野(eye field)祖细胞的方法，其中所述眼野祖细胞可用于进一步提供用于治疗眼部状况的分化细胞。本发明还涉及眼野祖细胞的体外细胞群体及其在治疗眼部状况中的用途。该方案提供了简单、有效的方法，同时也有助于转化为良好生产规范(gmp)合规性。
2.序列表的援引并入
3.本技术与电子形式的序列表一起提交。该序列表的全部内容通过引用并入本文。
4.背景
5.世界卫生组织估计全世界有3.14亿人有视力损害，其中2.69亿人视力低下，4500万人失明(resnikoff s.,2008)。这些眼科病症中的一些是白内障、年龄相关性黄斑变性(amd)、青光眼、角膜失明和色素性视网膜炎(rp)。
6.amd是一种影响视网膜黄斑区的疾病，其导致中央视力的进行性丧失。amd的确切发病机理尚未完全阐明，但似乎已经确定，视网膜色素上皮发生萎缩，随后是重要的视网膜结构如神经视网膜细胞的变性，从而导致严重的视力损害。目前，可用的治疗方法有限，而且它们都不能再生丧失的视网膜细胞和修复视力。
7.例如用于替代疗法的健康视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的细胞植入被认为是例如amd的可行的治疗方法，以通过延缓或抑制视网膜变性、再生变性的视网膜以及增强视网膜功能来防止失明，甚至恢复有缺陷的视力。
8.干细胞是为这样的细胞植入提供有用的细胞疗法的有希望的候选者。多能干细胞的可塑性为研究人眼的发育和再生以应用于包括但不限于amd和rp的不同类型的视网膜病变提供了新的可能性。然而，获得用于替代疗法的细胞如视网膜色素上皮(rpe)细胞和神经视网膜(nr)细胞仍然是一个挑战。在过去的几年里，已经开发了许多用于hpsc分化的方案，这些方案要么重现了完整的视杯形态发生，要么旨在最大限度地生成特定视网膜细胞亚型。已经描述了用于不同细胞亚型(包括rpe细胞)和特定nr细胞亚型如光感受器(pr)和视网膜神经节细胞(rgc)的方案。向后期眼祖细胞发育是常见的，而分化中的中间细胞类型可被称为视杯祖细胞。大多数可用的方案需要长分化期，部分原因是为了到达视杯祖细胞。更大范围的祖细胞在此被称为早期眼野祖细胞，其包括能够生成不同类型的眼细胞的细胞，这些眼细胞包括但不限于nr细胞，如pr和rgc，rpe细胞、晶状体细胞和角膜细胞，如角膜缘干细胞。在许多情况下，分化方案还依赖于多种成分，如生长因子，这些成分可能是昂贵的和/或难以符合gmp。此外，许多方案受到有限的细胞规格和可重复性的影响。
9.本发明的一个目的是克服这些挑战中的一些挑战，特别是提供更短、更有效且稳定的方案，所述方案用于在二维设置中获得早期眼野祖细胞，并具有进一步分化为多种后期更成熟的眼祖细胞的能力。本发明的另一个目的是提供一种简单的方案，其可以有助于转化为gmp合规性。


技术实现要素：

10.上述目的通过本发明的方面来实现。另外，本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
11.本发明的一个方面涉及从hpsc获得眼野祖细胞的改进方法，其包括以下步骤：培养hpsc，将所述hpsc接种在用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，使所述分化细胞与small mothers against decapentaplegic(smad)蛋白信号通路抑制剂接触，并使所述分化细胞与bmp5接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。
12.这种改进的方法促进了大量适合进一步分化为后期眼祖细胞的细胞。因此，本发明的另一方面涉及可根据本发明方法获得的眼野祖细胞的体外细胞群体，其中高百分比的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，以及由vsx2和mitf组成的组中的至少一种。
13.本发明人已经表明，激活干细胞中的骨形态发生蛋白(bmp)信号通路可以有效地将分化细胞成熟为具有进一步分化为多种更成熟的眼祖细胞的潜力的早期眼野祖细胞。特别是，本发明人已经发现用bmp5激活bmp信号通路在分化细胞方面非常有效。可以进一步分化为更成熟的细胞的这类眼野祖细胞的实例包括但不限于rpe、nr细胞如pr和rgc、晶状体细胞和角膜细胞如角膜缘干细胞(lsc)。
14.在本发明的一个方面，所述眼野祖细胞是rpe祖细胞。因此，本发明还涉及从hpsc获得rpe祖细胞的改进方法，其包括以下步骤：培养hpsc，将hpsc接种到用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，使所述分化细胞与bmp5接触，以及使所述分化细胞与gsk3抑制剂接触，其中让所述分化细胞分化为rpe祖细胞。
15.在本发明的一个方面，所述眼野祖细胞是神经视网膜(nr)祖细胞。因此，本发明还涉及从hpsc获得nr祖细胞的改进方法，其包括以下步骤：培养hpsc，将hpsc接种到用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，使所述分化细胞与bmp5接触，其中让所述分化细胞分化为rpe祖细胞。
16.本发明人已经进一步表明，本发明的方案提供了在二维设置中在短时间段内获得早期眼野祖细胞的稳定且有效的方法。该方案提供了目的细胞的高产量，并且该方法有助于转化为gmp合规性。
17.附图简述
18.图1显示了不同层粘连蛋白在12小时后对人胚胎干细胞(hesc)初始附着的影响。亮视野照片显示了在ln
‑
521上生长并维持的hesc如何表现出与ln
‑
332的良好附着，与ln
‑
111进行对比。单细胞接种后，ln
‑
332层粘连蛋白显示出对hesc附着的正面影响。ln
‑
332可用于进一步分化。
19.图2a和图2b显示了人bmp5和激活蛋白a对hesc向vsx2和mitf阳性细胞分化的影响。免疫荧光显示条件1和2，无bmp5或激活蛋白a，具有较低水平的mitf或vsx2。相比之下，从第12天起添加bmp5(条件3和4)增加了mitf和vsx2阳性细胞的数目。从第15天起添加激活蛋白a，与bmp5相组合，没有明显的额外效果。相比之下，从第12天起单独使用激活蛋白a，或从第15天起与bmp5相组合(条件5和6)，生成了数目较低的mitf和vsx2阳性细胞。总之，只有bmp5对生成mitf/vsx2阳性细胞显示出强烈的正面影响。ihh(indian hedgehog)和dkk2
(dickkopf信号通路抑制剂2)的组合可能有助于生成mitf/vsx2阳性细胞。
20.图3显示，bmp5诱导双pax6/otx2阳性细胞的生成。用小分子gw788388、noggin和endo iwr1初始处理12天，随后用bmp5、ihh和dkk2处理，生成了大量pax6/otx2双阳性细胞，它们通过免疫荧光进行显示。dapi用于所有细胞的核染色。
21.图4显示了bmp5以及bmp5与gsk3抑制剂的组合的效果。bmp5的使用诱导mitf和vsx2阳性细胞(第二行)的生成，它们通过免疫荧光进行显示，表明神经视网膜祖细胞的生成。相比之下，gsk3抑制剂chir99021的添加(下行)显著阻断了vsx2的表达，并增强了mitf的表达和具有鹅卵石形态的mitf阳性细胞的生成。这指示rpe祖细胞。第一行，无bmp5的对照。dapi用于所有细胞的核染色。
22.图5显示了rna表达分析。图中显示了来自实时聚合酶链反应(pcr)的循环阈值(ct)。在第21天收集用bmp5分化的细胞，提取rna，转化为cdna，并进行rna表达分析。使用hesc进行比较，ct值与mrna水平成反比。与hesc相比，bmp5分化的细胞中的mitf、pax6和vsx2表达上调。
23.图6显示了bmp5分化的细胞与bmp5/chir99021之间的细胞核比较。注意到bmp5/chir99021处理的细胞的不同核组织，示出上皮形态和典型的鹅卵石形态，指示rpe祖细胞。dapi用于所有细胞的核染色。
24.图7显示，bmp5/chir99021组合生成了大量mitf阳性细胞。该图显示了当bmp5和chir99021组合使用时，mitf阳性细胞的高数目和高纯度(超过80％，免疫荧光)。左侧示出了具有鹅卵石形态的mitf阳性细胞的高纯度和均匀性，指示rpe祖细胞。
25.图8显示，通过使用smad抑制剂repsox与noggin的组合，随后用bmp5和chir99021处理，我们基于bmp5的方案生成了具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞。pax6、six3和mitf的基因表达增加以及otx2和pax6阳性细胞的免疫荧光表明了这一点。
26.图9显示了通过流式细胞术对gw788388、chir99021和bmp5诱导的hesc衍生的rpe祖细胞的蛋白质表达的分析。超过40％的细胞显示出标志物pax6/mitf的共表达。
27.图10显示了通过流式细胞术对gw788388和bmp5诱导的hesc衍生的神经视网膜祖细胞的蛋白质表达的分析。超过50％的细胞显示出标志物pax6/vsx2的共表达。
28.图11显示了通过单细胞rna测序分析的，表达所示标志物基因的具有rpe祖细胞身份的hesc衍生的眼野祖细胞的百分比(表格)。在该表中可以看到指示rpe和视杯的基因的诱导，而细胞不表达其他胚层(内胚层和中胚层)的标志物。每个维恩(venn)图显示了共表达rpe祖细胞的特征性基因pax6/mitf/pmel和pax6/pmel/serpinf1基因的细胞的表达模式。
29.图12显示了表达角膜和lsc标志物的细胞的数目的维恩图。tp63/tfap2b/s100a14三阳性细胞的百分比为0.8％。
30.图13显示了在分化的第7
‑
21天不同浓度(0、0.1、200和1000ng/ml)的bmp5处理连同第12
‑
21天的chir99021的效果。对rpe祖细胞相关基因的rna表达进行定量。注意到200ng/ml和1000ng/ml的bmp5处理促进了rpe祖基因的表达。
31.图14显示了在第7
‑
21天不同浓度(0、0.1、200和1000ng/ml)的bmp5处理的效果。对神经视网膜祖细胞基因的rna表达进行定量。200ng/ml和1000ng/ml bmp5处理促进了神经视网膜祖细胞基因的表达。
32.图15显示了不同bmp同种型对rpe祖细胞基因表达的比较。将bmp5的效果与bmp4、bmp7和bmp4/7异二聚体的效果进行比较。bmp5在诱导rpe祖基因方面优于其他bmp，如条形图所示。
33.描述
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
35.需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
36.除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。说明书中的任何用语均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。
37.在整个本技术中，当提及分化细胞的过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。
38.如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个或多于一个。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
39.同样如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。
40.如本文所用的术语“约”在提及可测量的值如本发明的细胞、化合物或药剂的量、剂量、温度等时，意在涵盖指定量的5％、1％、0.5％、甚至0.1％的变化。
41.如本文所用的，关于方案的术语“天”是指用于执行某些步骤的特定时间。一般而言，除非另有说明，“第0天”是指方案的起始，例如但不限于将干细胞涂布或将干细胞转移到培养箱，或在转移干细胞之前使干细胞在其当前的细胞培养基中与化合物接触。通常，方案的起始是通过将未分化的干细胞转移到不同的细胞培养基和/或容器，例如但不限于通过涂布或孵育，和/或首先以启动分化过程的方式使未分化的干细胞与影响未分化干细胞的化合物接触。
42.当提及“第x天”，如第1天、第2天等时，它是相对于第0天的方案起始而言的。本领域普通技术人员将会认识到，除非另有指定，否则执行该步骤的天数的确切时间可能会有所不同。因此，“第x天”旨在涵盖诸如 /
‑
10小时、 /
‑
8小时、 /
‑
6小时、 /
‑
4小时、 /
‑
2小时或 /
‑
1小时的时间跨度。
43.如本文所用的，短语“从大约第x天至大约第y天起”是指事件开始的那一天。该短语提供了事件可能开始的天数间隔。例如，如果“细胞从大约第3天至大约第5天起与分化因子接触”，那么这将被解释为包含以下所有选项：“细胞从大约第3天起与分化因子接触”，“细胞从大约第4天起与分化因子接触”，以及“细胞从大约第5天起与分化因子接触”。因此，不应将该短语解释为仅在第3天至第5天的时间间隔内发生的事件。这在必要的变通后适用于短语“到大约第x天至大约第y天”。
44.在下文中，通过非限制性实施方案和实施例更详细地描述了本发明的方法。提供了获得眼野祖细胞的方法，其中获得的细胞被认为是从hpsc向诸如成熟rpe细胞、nr细胞、
晶状体细胞和角膜细胞等细胞进一步分化的中间体，这些细胞也被认为可用于提供诸如白内障、amd、角膜失明、青光眼和rp等眼部状况的治疗。
45.根据本发明，所述方法补充了干细胞的使用。
46.干细胞
[0047]“干细胞”应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的未分化细胞。根据分化潜能，干细胞包括诸如全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、单能干细胞等亚群。干细胞按其发育潜力分类为：(1)全能的，意思是能够产生所有胚胎细胞类型和胚胎外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意思是能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的(multi
‑
potent)，意思是能够产生细胞谱系的子集，但是全部都在特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(hsc)可以产生包括hsc(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和元素(例如血小板)在内的子代)；(4)寡能的，意思是能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子集；以及(5)单能的，意思是能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。多能干细胞可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。多能干细胞的实例包括胚胎干细胞(es细胞)、eg细胞(胚胎生殖细胞)、诱导多能干细胞(ips细胞)等。在文献中，“胚泡衍生的干细胞”通常被称为胚胎干细胞，更具体地称为人胚胎干细胞(hesc)。因此，本发明中使用的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如在例如wo 03/055992和wo 2007/042225中所述，或者是可商购获得的细胞或细胞系。es细胞系还可以源自单个分裂球，而不会破坏子宫外胚胎，也不会影响临床结果(chung等人(2006)和klimanskaya等人(2006))。然而，进一步想到任何hpsc均可用于本发明，包括通过例如用某些转录因子(例如但不限于yu等人(2007)、takahashi等人(2007)以及yu等人(2009)所公开的oct4、sox2、nanog和lin28)处理成体细胞而重新编程为多能细胞的分化成体细胞。
[0048]
从间充质干细胞(msc)获得的muse细胞(多谱系分化应激耐受细胞)和从生殖细胞(例如睾丸)产生的gs细胞也包含在多能干细胞中。诱导多能干细胞(也称为ips细胞或ipsc)是一种类型的多能干细胞，其可以直接从成体细胞生成。通过引入特定组的多能性相关基因的产物，可以将成体细胞转化为多能干细胞。胚胎干细胞可以通过培养在不破坏胚胎的情况下获得的内细胞团来产生。胚胎干细胞可从给定的组织获得，也可以商购获得。
[0049]
在本发明最一般的方面，提供了从hpsc获得眼野祖细胞的方法，其包括培养hpsc以获得分化细胞，并使分化细胞与bmp5接触的步骤，其中让分化细胞分化为眼野祖细胞。更具体的方面涉及从hpsc获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：培养hpsc，将hpsc接种在用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养hpsc以获得分化细胞，使分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，并使分化细胞与bmp5接触，其中让分化细胞分化为眼野祖细胞。
[0050]
本发明人发现，通过根据该方面的方法获得的细胞的质量和产量很高，并且该方案可以基于容易转化为gmp合规性的化合物。
[0051]
分化
[0052]
如本文所用的，“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态、从未成熟状态进展至较成熟状态或从未成熟状态进展至成熟状态的过程。
[0053]
眼野祖细胞
[0054]
向后期眼祖细胞发育是常见的，而分化中的中间细胞类型可被称为眼野祖细胞。
如本文所用的通用术语“眼野祖细胞”是指发育早期的中间且短暂的一组祖细胞，其包括眼睛的不同细胞谱系的多种祖细胞，包括但不限于
[0055]
a)视杯祖细胞，其包括rpe祖细胞和nr祖细胞，
[0056]
b)晶状体祖细胞，以及
[0057]
c)角膜祖细胞，其包括角膜缘干细胞(lsc)
[0058]
眼野祖细胞具有分化为多种眼细胞的潜力，这些眼细胞包括但不限于rpe细胞、nr的所有不同细胞类型、晶状体的所有不同细胞类型和角膜的所有不同细胞类型。眼野祖细胞由otx2和pax6的时间表达以及每个细胞谱系的更具特异性的其他标志物来定义。
[0059]
如本文所用的，“视杯祖细胞”是指被特化为进一步分化为nr细胞和rpe的祖细胞。
[0060]
如本文所用的，“角膜祖细胞”是指被特化为进一步分化为三个细胞层(上皮、基质和内皮)和lsc的祖细胞。
[0061]
如本文所用的，“晶状体祖细胞”是指被特化为进一步分化为形成人晶状体的任何细胞类型的祖细胞。
[0062]
如本文所用的，“角膜缘干细胞(lsc)”是指具有再生整个角膜上皮的能力的干细胞。lsc又称角膜上皮干细胞。
[0063]
如本文所用的，“神经视网膜祖细胞”由otx2、pax6和vsx2和mitf的时间表达来定义。mitf在nr祖细胞中的表达仅限于分化过程的极早期阶段。
[0064]
如本文所用的，“视网膜色素上皮(rpe)祖细胞”由otx2、pax6和mitf的时间表达、鹅卵石形态以及vsx2的缺失来定义。
[0065]
如本文所用的“otx2”是指orthodenticle同源框2基因、转录物或蛋白质，它是胚胎发育过程中包括眼野祖细胞在内的前脑结构的标志物。
[0066]
如本文所用的“pax6”是指“成对盒6”基因、转录物或蛋白质，它是胚胎发育过程中包括眼野祖细胞在内的前脑结构的标志物。
[0067]
如本文所用的“six3”是指“six同源框3”基因、转录物或蛋白质，它是眼野祖细胞的标志物。
[0068]
如本文所用的“six6”是指“six同源框6”基因、转录物或蛋白质，它是眼野祖细胞的标志物。
[0069]
如本文所用的“mitf”是指“黑素细胞诱导转录因子”基因、转录物或蛋白质，它是rpe祖细胞的标志物。
[0070]
如本文所用的“pmel17”或“pmel”是指“前黑素体蛋白”基因、转录物或蛋白质，它是rpe祖细胞和rpe成熟细胞的标志物。
[0071]
如本文所用的“serpinf1”是指“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)家族f成员1”基因、转录物或蛋白质，它是rpe祖细胞和rpe成熟细胞的标志物。
[0072]
如本文所用的“tyr”是指“酪氨酸酶”基因、转录物或蛋白质，它是rpe祖细胞和rpe成熟细胞的标志物。
[0073]
如本文所用的“vsx2”是指“视觉系统同源框2”基因、转录物或蛋白质，也称为chx10，它是神经视网膜祖细胞的标志物。
[0074]
如本文所用的“tp63”是指“肿瘤蛋白p63”基因、转录物或蛋白质，它是lsc的标志物。
[0075]
如本文所用的“s100a14”是指“s100钙结合蛋白a14”基因、转录物或蛋白质，它是lsc的标志物。
[0076]
如本文所用的“tfap2b”是指“转录因子ap
‑
2β”基因、转录物或蛋白质，它是lsc的标志物。
[0077]
如本文所用的“abcg2”是指“atp结合盒亚家族g成员2”基因、转录物或蛋白质，它是lsc的标志物。
[0078]
如本文所用的“nanog”是指“nanog同源框”基因、转录物或蛋白质，它是多能细胞的标志物。
[0079]
如本文所用的“pou5f1”是指“pou类别5同源框1”基因、转录物或蛋白质，它是多能细胞的标志物。
[0080]
如本文所用的“zscan10”是指“含有锌指和scan结构域的蛋白10”的基因、转录物或蛋白质，它是多能细胞的标志物。
[0081]
如本文所用的“eomes”是指“脱中胚蛋白(eomesodermin)”基因、转录物或蛋白质，它是中胚层谱系的标志物。
[0082]
如本文所用的“sox17”是指“sry
‑
box转录因子17”基因、转录物或蛋白质，它是内胚层谱系的标志物。
[0083]
技术人员将会认识到，随着细胞进一步分化，这些标志物中的一种或多种可能发生变化，例如但不限于被上调或下调。技术人员还将认识到，所讨论的细胞不限于仅表达上述标志物，还可以表达眼野祖细胞共同的其他标志物。
[0084]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少80％的眼野祖细胞表达pax6。
[0085]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中约90％的眼野祖细胞表达pax6。
[0086]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中约95％的眼野祖细胞表达pax6。
[0087]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少40％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2。
[0088]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少40％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2以及vsx2和/或mitf中的至少一种。
[0089]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少50％、60％、70％、80％或90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，并且至少10％、20％、30％、40％、50％的眼野祖细胞进一步共表达vsx2和/或mitf。
[0090]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少50％的眼野祖细胞共表达pax6和vsx2。
[0091]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少50％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，并且至少20％的眼野祖细胞进一步共表达vsx2和/或mitf。
[0092]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少56％的眼野祖细胞共表达pax6、otx2和six3。
[0093]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少29％的眼野祖
细胞共表达mitf、pmel和serpinf。
[0094]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中约69％的眼野祖细胞共表达pmel和serpinf。
[0095]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中约73％的眼野祖细胞表达pmel。
[0096]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中约69％的眼野祖细胞表达serpinf。
[0097]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中至少0.8％的所述眼野祖细胞共表达tp63、s100a14和tfap2b。
[0098]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少80％的眼野祖细胞表达pax6。
[0099]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中约90％的眼野祖细胞表达pax6。
[0100]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中约95％的眼野祖细胞表达pax6。
[0101]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少40％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2。
[0102]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少40％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2以及vsx2和/或mitf中的至少一种。
[0103]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少50％、60％、70％、80％或90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，并且至少10％、20％、30％、40％、50％的眼野祖细胞进一步共表达vsx2和/或mitf。
[0104]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少50％的眼野祖细胞共表达pax6和vsx2。
[0105]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少50％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，并且至少20％的眼野祖细胞进一步共表达vsx2和/或mitf。
[0106]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少56％的眼野祖细胞表达six3。
[0107]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中约73％的眼野祖细胞表达pmel。
[0108]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中约69％的眼野祖细胞表达serpinf。
[0109]
在一个实施方案中，本发明涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少0.8％的所述眼野祖细胞共表达tp63、s100a14和tfap2b。
[0110]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述细胞是rpe祖细胞、nr细胞或角膜细胞。
[0111]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述细胞是rpe祖细胞。
[0112]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述细胞是神经视
网膜细胞。
[0113]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述细胞是角膜细胞。
[0114]
本文使用的术语“基因的时间表达”是指在发育或分化过程中的特定时间，特定组织或细胞内的基因的激活。
[0115]
这些方法由一系列步骤来限定。如本文所用的，与方法相关的术语“步骤”应理解为阶段，在该阶段中进行某事和/或执行动作。本领域普通技术人员将会理解待执行的步骤和/或进行的步骤何时是同时的和/或相继的和/或连续的。
[0116]
在培养hesc的步骤中，可以从上文提到的任何合适的来源获得细胞。根据该方法将hpsc接种到用基质包被的基底上的步骤需要转移所提供的hpsc。术语“接种”应被理解为将hpsc分配到合适的容器。术语“涂布(plating)”是指将细胞分布到带有基底的合适的容器中。本领域技术人员将会知道将未分化细胞转移到基底上的适当技术。在本发明的实施方案中，hpsc以约10,000个细胞/cm2至约100,000个细胞/cm2，优选约20,000个细胞/cm2至约80,000个细胞/cm2，更优选约30,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2，甚至更优选约40,000个细胞/cm2的密度进行涂布。
[0117]
基底
[0118]
如本文所用的，术语“基底”应被理解为可在其上提供涂层的表面。这可以是但不限于孔板和珠子。典型的基底包括但不限于细胞培养处理的多孔板，如scientifictmnunctm细胞培养处理的多孔板。本领域技术人员将容易地知道用于培养细胞的合适的基底。根据本发明，将所提供的hpsc涂布到用基质包被的基底上。
[0119]
术语“基质”是指负责与细胞表面受体的相互作用，从而调节细胞行为，如粘附、增殖、迁移和分化，或发挥机械支持功能的细胞外分子。在一个实施方案中，包被的板上的涂层包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白和/或玻连蛋白和/或胶原蛋白。
[0120]
如本文所用的，关于包被在板上的术语“层粘连蛋白”或“ln”是指由被称为α、β和γ链的三个亚单位组成的异源三聚体分子。本文提及人层粘连蛋白。已知五种α链(α1至α5)、三种β链(β1至β3)和三种γ链(γ1至γ3)，这些链的各种组合至少产生12种层粘连蛋白同种型。例如，“层粘连蛋白α5β1γ1”在本文中被称为“层粘连蛋白
‑
511”或“ln
‑
511”。这同样适用于其他同种型。当提及层粘连蛋白时，“其片段”是指完整层粘连蛋白的一部分。例如，已经发现层粘连蛋白
‑
511的e8片段强烈粘附在人类胚胎干细胞上。层粘连蛋白及其片段可从诸如biolamina ab或nippi inc.等公司商购获得。层粘连蛋白的非限制性实例包括ln
‑
111、ln
‑
423、ln
‑
523、ln
‑
511、ln
‑
521和ln
‑
332或其片段。
[0121]
在一个实施方案中，本发明方法中使用的基质是选自ln
‑
111、ln
‑
423、ln
‑
523、ln
‑
511、ln
‑
521和ln
‑
332的层粘连蛋白或其片段。
[0122]
在一个实施方案中，本发明方法中使用的基质是ln
‑
423或其片段。
[0123]
在一个实施方案中，本发明方法中使用的基质是ln
‑
511或其片段。
[0124]
在一个实施方案中，本发明方法中使用的基质是ln
‑
521或其片段。
[0125]
在一个实施方案中，本发明方法中使用的基质是ln
‑
332或其片段。
[0126]
如本文所用的，关于包被在板上的术语“纤连蛋白”是指与被称为整联蛋白的跨膜受体蛋白结合的细胞外基质的高分子量(～440kda)糖蛋白。与整联蛋白类似，纤连蛋白与
诸如胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如黏结蛋白聚糖(syndecans))等细胞外基质成分结合。如本文所用的，关于包被在板上的术语“玻连蛋白”是指血红素结合蛋白家族的糖蛋白，其丰富地存在于血清、细胞外基质和骨中。如本文所用的，涉及包被在板上的术语“胶原蛋白”是指动物体内各种结缔组织的细胞外间隙中的结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，它是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占全身蛋白质含量的25％至35％。胶原蛋白由缠绕在一起形成三重螺旋的氨基酸组成，从而形成细长的原纤维。
[0127]
在优选的实施方案中，包被到基底上的基质包含层粘连蛋白或其片段，优选选自层粘连蛋白
‑
511和层粘连蛋白
‑
332。
[0128]
在另一个实施方案中，层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白
‑
511和层粘连蛋白
‑
332的组合。
[0129]
在一个实施方案中，基质包含层粘连蛋白
‑
511和/或层粘连蛋白
‑
332和一种或多种其他层粘连蛋白。
[0130]
在另一个实施方案中，层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白
‑
332。在一个实施方案中，层粘连蛋白是完整的层粘连蛋白。
[0131]
在另一个实施方案中，层粘连蛋白是完整层粘连蛋白的片段。在进一步的实施方案中，层粘连蛋白的浓度为约0.01μg/cm2至约50μg/cm2，优选约0.1μg/cm2至约25μg/cm2，更优选约0.1μg/cm2至10μg/cm2，更优选约0.1μg/cm2至约5，更优选约0.25μg/cm2至约1μg/cm2，甚至更优选约0.5μg/cm2。
[0132]
培养步骤应被理解为干细胞在受控条件下生长的过程，通常在其自然环境之外。术语“培养”应被理解为连续过程，在整个方法中采用该过程以保持细胞在其各个阶段的活力。在从例如但不限于活组织或胚胎中分离出目的细胞后，将它们维持在仔细控制的条件下。这些条件因每种细胞类型而异，但通常由合适的容器组成，该容器具有提供必需营养成分(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(co2、o2)以及调节理化环境(ph缓冲液、渗透压、温度)的基底或培养基。
[0133]
在一个实施方案中，接种和培养的步骤同时发生，即，将hpsc涂布在包含细胞培养基的基底上。在实施方案中，分化过程在接种和培养时立即开始。单独的培养步骤不应被解释为培养分化细胞的步骤，而仅仅是，培养干细胞是进一步获得分化细胞的步骤的前提。尽管如此，培养的hpsc现在被称为分化细胞。如本文所用的，术语“分化细胞”是指经历或正在经历细胞从一种细胞类型(例如多潜能、全能或多能可分化细胞)向另一种细胞类型如目标分化细胞分化的过程的细胞，根据本发明，目标分化细胞是眼野祖细胞。即使细胞可能已经发展成可以分类的细胞类型，仍然可以使用术语“分化细胞”。
[0134]
在一个实施方案中，培养步骤中的细胞培养基是第一细胞培养基，并且其中至少一部分细胞培养基随后被第二细胞培养基替换。因此，在一个实施方案中，第0天的细胞培养基是第一细胞培养基，并且其中至少一部分细胞培养基从大约第1天起被第二细胞培养基替换。在优选的实施方案中，在第0天接种步骤中的细胞培养基是第一细胞培养基，并且其中第一细胞培养基从大约第1天起基本上被第二细胞培养基替换。
[0135]
rock抑制剂
[0136]
rho相关的含卷曲螺旋的激酶(rock)是rhoa小gtp酶的效应物，并且属于丝氨酸/苏氨酸激酶的ago家族。rock激酶具有许多功能，包括细胞收缩、迁移、凋亡、存活和增殖。
irho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶rock抑制剂是一系列靶向并抑制rho激酶的化合物。如本文所用的，“y
‑
27632”是指cas编号为129830
‑
38
‑
2的反式
‑4‑
(1
‑
氨基乙基)
‑
n
‑
(4
‑
吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐。
[0137]
在一个实施方案中，第一细胞培养基包含rock抑制剂。在一个实施方案中，该rock抑制剂是y
‑
27632或tiger。
[0138]
在一个实施方案中，第一细胞培养基包含浓度范围为0.1
‑
30μm的所述rock抑制剂。
[0139]
在一个实施方案中，第一细胞培养基包含浓度范围为1
‑
20μm的所述rock抑制剂。
[0140]
在一个实施方案中，第一细胞培养基包含浓度为约10μm的所述rock抑制剂。
[0141]
培养基
[0142]
通常，干细胞将在细胞培养基中提供，该细胞培养基适合在其当前发育状态下的活力。提供干细胞以供培养通常意味着将干细胞转移到不同的环境中，例如通过接种到新的基底上或悬浮在培养箱中。本领域普通技术人员将容易地认识到，干细胞对于这样的转移是脆弱的，因而该过程需要谨慎，并且将干细胞维持在原始细胞培养基中可以促进在将细胞培养基替换为另一种更适合分化过程的细胞培养基之前更可持续的细胞转移。在该方法的一个实施方案中，在第0天接种步骤中的细胞培养基是第一细胞培养基，并且至少一部分细胞培养基从第1天起被第二细胞培养基替换。如本文所用的，关于细胞培养基、第一细胞培养基和第二细胞培养基的术语“替换”是指一种程序，其中通过合适的手段取出一定量的细胞培养基，并且任选地，加入基本上等量的细胞培养基，使得细胞培养基的总体积基本保持不变。“去除第一细胞培养基”应被理解为在第一次去除和添加第二细胞培养基之后，任何随后的替换将是第一和第二细胞培养基的混合物的替换，该混合物的比率对应于去除和添加的量。因此，在连续去除中，第一细胞培养基将被第二细胞培养基连续稀释，并且通过重复该过程，细胞培养基最终将基本上不含第一细胞培养基。在优选的实施方案中，第一细胞培养基在大约第1天基本上被第二细胞培养基替换。
[0143]
在进一步的实施方案中，第一细胞培养基是化学成分确定的并且无xeno。如本文所用的，关于细胞培养基的术语“化学成分确定的”是指适合人类或动物细胞的体外细胞培养的生长培养基，其中所有化学成分都是已知的。化学成分确定的培养基要求必须确定所有成分并了解其确切的浓度。如本文所用的，术语“无xeno”和“无动物成分”可以互换使用，并且根据本发明，是指优选地完全不含任何动物来源的成分。在优选的实施方案中，细胞培养基也是无饲养物的。术语“无饲养物”和“无饲养细胞”可以互换使用，是指不含人和动物细胞的培养系统，为了滋养所培养的干细胞，这些细胞可能以其他方式存在，即饲养细胞为它们所支持的干细胞提供代谢物，但不是打算用于生长或分裂的细胞。
[0144]
尽管本发明人更喜欢化学成分确定的、“无xeno”和“无饲养细胞”的细胞培养环境，但监管机构可能会批准基于本发明方法的医药产品和治疗，而无需完全遵守这样的标准。本发明人努力遵守gmp和良好组织规范(gtp)的最高标准。然而，本发明不应被解释为局限于这样的标准。本领域技术人员将容易地认识到，本发明可以在不遵守此类高标准的情况下实施。
[0145]
在一个实施方案中，第一细胞培养基可以是任何合适的细胞培养基，其在干细胞转移至基底时支持干细胞的活力。这样的细胞培养基是可商购获得的，并且可以是例如
例如用于ips和es干细胞的hpsc xf培养基。因此，在一个实施方案中，例如用于ips和es干细胞的hpsc xf培养基。
[0146]
在一个实施方案中，第二细胞培养基是化学成分确定的并且无xeno。在进一步的实施方案中，第二细胞培养基也是无饲养物的。在一个实施方案中，第二细胞培养基包含gmem(格拉斯哥改良必需培养基)或dmem/f12(dulbecco改良eagle培养基/ham's f
‑
12培养基)。类似的培养基可能同样有效并且易于购买获得。在进一步的实施方案中，gmem或dmem/f12补充有n2和/或b27。在一个实施方案中，b27的浓度为约0.1％(v/v)至约5％(v/v)，优选约0.5％(v/v)至约2.5％(v/v)，甚至更优选约2％(v/v)。在一个实施方案中，n2的浓度为约0.1％(v/v)至约5％(v/v)，优选约0.5％(v/v)至约2.5％(v/v)，甚至更优选约1％(v/v)。
[0147]
在一个实施方案中，分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0148]
如本文所用的，关于培养细胞的术语“接触”是指通过将特定化合物放置在允许其接触细胞的位置而使细胞暴露于例如特定化合物，以便产生“接触的”细胞。接触可以使用任何合适的手段来完成。接触的非限制性实例是通过将化合物添加到细胞的细胞培养基中。只要细胞和特定化合物接近，例如，化合物以合适的浓度存在于细胞培养基中，就假定发生细胞的接触。
[0149]
如本文所用的，关于抑制信号传导靶标或信号传导靶标通路的术语“抑制剂”是指与未处理的细胞或用不抑制被处理的细胞或组织的化合物处理的细胞相比，干扰(即减少或消除或抑制)所得靶分子或靶化合物或靶过程如特定分化结果(例如，抑制促进默认细胞类型分化的活性信号通路，从而诱导分化为非默认细胞类型)的化合物。
[0150]
smallmothers against decapentaplegic(smad)蛋白信号通路的抑制剂
[0151]
如本文所用的，“small mothers against decapentaplegic(smad)蛋白信号通路抑制剂”是指特异性抑制small mothers against decapentaplegic(smad)蛋白信号通路的化合物。small mothers against decapentaplegic(smad)蛋白信号传导抑制剂的实例可选自gw788388、ldn
‑
193189、ly2157299、ly364947、noggin、repsox、sb431542和tew
‑
7197。
[0152]
如本文所用的，“gw788388”表示化学名称为n
‑
(环氧乙烷
‑4‑
基)
‑4‑
[4
‑
(5
‑
吡啶
‑2‑
基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)吡啶
‑2‑
基]苯甲酰胺且cas编号为452342
‑
67
‑
5的小分子。
[0153]
如本文所用的，“ldn
‑
193189”表示iupac名称为4
‑
(6
‑
(4
‑
(哌嗪
‑1‑
基)苯基)吡唑并[1,5
‑
a]嘧啶
‑3‑
基)喹啉且cas编号为1062368
‑
24
‑
4的化合物。
[0154]
如本文所用的，“ly2157299”表示一种小分子，它是有效的tgfβ受体i(tgfβri)抑制剂，别名为galunisertib，化学名称为4
‑
[2
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑2‑
基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
4h
‑
吡咯并[1,2
‑
b]吡唑
‑3‑
基]喹啉
‑6‑
甲酰胺，cas编号：700874
‑
72
‑
2。
[0155]
如本文所用的，“ly364947”表示iupac名称为4
‑
[3
‑
(2
‑
吡啶基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基]
‑
喹啉且cas编号为396129
‑
53
‑
6的化合物。
[0156]
如本文所用的，“noggin”表示分泌的同型二聚体糖蛋白，其结合并灭活信号蛋白的转化生长因子
‑
β(tgf
‑
β)超家族的成员，如骨形态发生蛋白
‑
4(bmp4)。noggin通常是在人类细胞中以糖基化、二硫键连接的二聚体形式表达的65kda蛋白质。
[0157]
如本文所用的，“repsox”表示一种小分子，其为tgf
‑
βri的有效且选择性抑制剂，别名为e
‑
616452、sjn 2511、alk5抑制剂ii，化学名称为2
‑
(3
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吡
唑
‑4‑
基)
‑
1,5
‑
萘啶，cas编号：446859
‑
33
‑
2。
[0158]
如本文所用的，“sb431542”表示化学名称为4
‑
[4
‑
(1,3
‑
苯并二氧戊环
‑5‑
基)
‑5‑
(2
‑
吡啶基)
‑
1h
‑
咪唑
‑2‑
基]苯甲酰胺且cas编号为301836
‑
41
‑
9的化合物。
[0159]
如本文所用的，“tew
‑
7197”表示别名为vactosertib、化学名称为2
‑
氟
‑
n
‑
[[5
‑
(6
‑
甲基吡啶
‑2‑
基)
‑4‑
([1,2,4]三唑并[1,5
‑
a]吡啶
‑6‑
基)
‑
1h
‑
咪唑
‑2‑
基]甲基]苯胺且cas编号为1352608
‑
82
‑
2的小分子。
[0160]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述方法包括至少一种smad抑制剂。
[0161]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述方法包括两种smad抑制剂。
[0162]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述方法包括单一smad抑制剂。
[0163]
在一个实施方案中，使分化细胞与选自gw788388、ldn
‑
193189、ly2157299、ly364947、noggin、repsox、sb431542和tew
‑
7197的small mothers against decapentaplegic(smad)蛋白信号传导抑制剂接触。
[0164]
在另一个实施方案中，使分化细胞与选自gw788388和/或repsox的smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0165]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述方法包括gw788388和/或repsox。
[0166]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述方法包括gw788388。
[0167]
在一个实施方案中，本发明涉及获得眼野祖细胞的方法，其中所述方法包括repsox。
[0168]
本发明人将这些smad蛋白信号传导抑制剂确定为提供向眼野祖细胞的分化的有效且稳定的起始。这些小分子还有助于转化为gmp合规性。
[0169]
在一个实施方案中，smad蛋白信号传导抑制剂是gw788388。
[0170]
在其进一步的实施方案中，smad蛋白信号传导抑制剂是gw788388，其浓度为约0.1ng/ml至约1,000ng/ml，优选约5ng/ml至约1,000ng/ml，更优选约5ng/ml至约500ng/ml，更优选约5ng/ml至约250ng/ml，更优选约5ng/ml至约100ng/ml，更优选约5ng/ml至约50ng/ml。在一个实施方案中，浓度为约5ng/ml至约20ng/ml，如约10ng/ml。
[0171]
在一个实施方案中，smad蛋白信号传导抑制剂是repsox。
[0172]
在另一个实施方案中，smad蛋白信号传导抑制剂是repsox，其浓度为约0.25μm至约200μm，优选约10μm至约150μm，更优选约15μm至约100μm，甚至更优选自约20μm至约75μm。
[0173]
在一个实施方案中，从第0天起，分化细胞与smad蛋白信号通路抑制剂接触。因此，在这样的实施方案中，将smad蛋白信号通路抑制剂加入到第一细胞培养基中。
[0174]
在优选的实施方案中，从第0天至第15天、第14天、第13天、第12天、第11天或第10天起，优选从第0天至第12天起，分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触。因此，在这样的实施方案中，也将smad蛋白信号通路抑制剂加入到第二细胞培养基中。
[0175]
在一个实施方案中，smad蛋白信号传导抑制剂仅包含一种化合物。
[0176]
在一个实施方案中，smad蛋白信号传导抑制剂包含多于一种化合物，例如但不限于上述smad蛋白信号传导抑制剂的组合。本领域技术人员将会认识到，可能需要相应地调整单独的smad蛋白信号传导抑制剂的浓度，以获得与单独的抑制剂类似的效果。
[0177]
本发明人已经发现，可以采用将细胞暴露于仅一种smad蛋白信号传导抑制剂的方案，使hpsc分化为眼野祖细胞。
[0178]
在一个实施方案中，分化细胞仅与一种smad蛋白信号传导抑制剂接触。这简化了分化方案，降低了成本，并进一步有助于转化为gmp合规性。
[0179]
分化细胞与bmp5或其类似物接触。如本文所用的，术语“类似物”和“变体”可以互换使用，并且用于定义由于一个或多个氨基酸变化而不同于天然或参考肽或蛋白质的肽或蛋白质。
[0180]
bmp5
[0181]
如本文所用的，“bmp5”是指人骨形态发生蛋白5或其类似物。bmp5是bmp信号通路的激活剂，在人类中是由bmp5基因编码的蛋白质，并且是tgfβ超家族的成员。人bmp5(骨形态发生蛋白5)同种型1前原蛋白由seq id no:1表示。本领域技术人员将容易地认识到，该序列的变体可以存在于例如但不限于蛋白质合成和成熟的各个阶段，并且此类变体可以与由seq id no:1表示的bmp5同样地发挥作用。
[0182]
在一个实施方案中，bmp5由seq id no:1表示。
[0183]
在一个实施方案中，分化细胞与bmp5(seq id no:1)或其类似物接触，其中其类似物是骨形态发生蛋白(bmp)信号通路的有效激活剂。本发明人发现，bmp5是骨形态发生蛋白(bmp)信号通路的有效激活剂，其允许快速有效地分化为眼野祖细胞。
[0184]
在一个实施方案中，分化细胞与bmp5(seq id no:1)或其类似物接触，其中该类似物与由seq id no:1表示的bmp5具有至少50％的同一性。
[0185]
在一个实施方案中，bmp5的类似物与由seq id no:1表示的bmp5具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0186]
在优选的实施方案中，分化细胞与有效量的bmp5(seq id no:1)或其类似物接触。术语“有效量”是指使分化细胞与一定浓度的bmp5或其类似物接触，其中bmp5或其类似物的活性高到足以促进分化细胞向眼野祖细胞命运进一步分化。本领域技术人员将会认识到，bmp5及其类似物的活性可能会有所不同。对于由不同供应商提供的看似相同的产品，甚至也可能如此。因此，在一个实施方案中，bmp5的活性(ed
50
)为约0.1μg/ml至约2μg/ml，优选约0.15μg/ml至约1.5μg/ml，更优选约0.2μg/ml至约1.3μg/ml，甚至更优选约0.21μg/ml至约1.2μg/ml。在一个实施方案中，该活性可以与bmp5的浓度相关。所指的活性可以如“activity measured by its ability to induce alkaline phosphatase production by atdc5 mouse chondrogenic cells”,nakamura,k.等人(1999)exp.cell res.250:351所述进行测量。
[0187]
在一个实施方案中，bmp5的浓度为至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、1000、2000或2500ng/ml，优选至少约150ng/ml，更优选至少约180ng/ml。
[0188]
在一个实施方案中，bmp5的浓度低于约1000、900、800、700、600或500ng/ml，优选低于约450ng/ml。
[0189]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约0.1ng/ml至约2000ng/ml的范围内。
[0190]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约0.1ng/ml至约1000ng/ml的范围内。
[0191]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约10ng/ml至约300ng/ml的范围内。
[0192]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约100ng/ml至约300ng/ml的范围内。
[0193]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约150ng/ml至约250ng/ml的范围内。
[0194]
在一个实施方案中，bmp5的浓度为约200ng/ml。
[0195]
在一个实施方案中，bmp5的浓度为约1000ng/ml。
[0196]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约200ng/ml至约1000ng/ml的范围内。
[0197]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约150ng/ml至约1100ng/ml的范围内。
[0198]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约150ng/ml至约500ng/ml的范围内。
[0199]
在一个实施方案中，bmp5的浓度在约150ng/ml至约250ng/ml的范围内。
[0200]
在一个实施方案中，在使分化细胞与bmp5接触的步骤中，bmp5的浓度为约100ng/ml至约600ng/ml，优选约150ng/ml至约550ng/ml，更优选约200ng/ml至约500ng/ml，更优选约200ng/ml至约400ng/ml。
[0201]
在进一步的实施方案中，bmp5的浓度为约350ng/ml至约450ng/ml，优选约360ng/ml至约440ng/ml，更优选约370ng/ml至约430ng/ml，更优选约380ng/ml至约420ng/ml，更优选约390ng/ml至约410ng/ml，甚至更优选约400ng/ml。
[0202]
在一个实施方案中，从大约第5天至大约第14天起，优选地从大约第6天至大约第13天起，更优选地从大约第6天至大约第12天起，更优选地从大约第6天至大约第11天起，更优选地从大约第6天至大约第10天起，更优选地从大约第6天至大约第9天起，更优选地从大约第6天至大约第8天起，甚至更优选地从大约第7天起，使分化细胞与bmp5接触。
[0203]
在一个实施方案中，分化细胞与bmp5接触，其中让分化细胞分化为眼野祖细胞，直到大约第30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19天，优选地直到大约第20天至第22天，甚至更优选地直到大约第21天。
[0204]
在一个实施方案中，从大约第5天至大约第30天起、从大约第5天至大约第29天起、从大约第5天至大约第28天起、从大约第5天至大约第27天起，优选地从大约第6天至约26天起，更优选地从大约第6天至大约第25天起，更优选地从大约第6天至大约第24天起，更优选地从大约第6天至大约第23天起，更优选地从大约第6天至大约第22天起，更优选地从大约第6天至大约第21天起，甚至更优选地从大约第7天至大约第21天起，使分化细胞与bmp5接触。
[0205]
让分化细胞分化不应被解释为要进行的单独的最终步骤。本领域普通技术人员将容易理解，如本文所用的，术语“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态、从未成熟状态进展至较成熟状态或从未成熟状态进展至成熟状态的过程，其随着方法的进行而不断发生。这例如但不限于分化为眼野祖细胞的hpsc。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。
[0206]
本领域普通技术人员将能够基于特定标志物确定分化细胞何时成熟为眼野祖细胞。因此，在一些实施方案中，从第0天开始，让分化细胞分化为眼野祖细胞约17天至40天，优选约18天至30天，更优选约19天至25天，更优选约19天至23天，更优选约20天至22天，甚
至更优选约21天。
[0207]
在一个实施方案中，从大约第0天至大约第12天起使分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，并且从大约第7天起使分化细胞与bmp5接触，其中让分化细胞分化为眼野祖细胞，直到大约第21天。
[0208]
虽然分化细胞可以被认为完全分化为眼野祖细胞，但进一步分化可朝着进一步特化或成熟的祖细胞进行，例如但不限于rpe细胞和nr细胞，其中可以使用额外的因素和/或条件。具体而言，本发明的一个目的是提供可以进一步分化为更成熟的祖细胞或完全成熟的细胞的细胞，用于例如眼部状况的治疗。
[0209]
让hpsc分化为眼野祖细胞。在一个实施方案中，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，以及vsx2和mitf中的一种或多种。在进一步的实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，并且至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％的眼野祖细胞进一步共表达vsx2和mitf中的一种或多种。
[0210]
在一个实施方案中，所述方法包括进一步的步骤，其中使分化细胞与wnt/β
‑
联蛋白通路的抑制剂接触。如本文所用的，术语“wnt/β
‑
联蛋白通路”是指以通过细胞表面受体将信号传递到细胞内的蛋白质开始的一组信号转导通路。wnt是遗传学领域的首字母缩写词，代表“无翼/整合(wingless/integrated)”。
[0211]
在一个实施方案中，从大约第2天至大约第15天起，优选地从大约第3天至大约第14天起，更优选地从大约第3天至大约第13天起，甚至更优选地从大约第3天至大约第12天起，使分化细胞与wnt/β
‑
联蛋白通路抑制剂接触。在一个实施方案中，该wnt/β
‑
联蛋白通路抑制剂是endo iwr 1。在进一步的实施方案中，endo iwr 1的浓度为约0.1μm至约10μm，优选约0.5μm至约5μm，甚至更优选约1μm至约3μm。如本文所用的，“endo iwr1”表示化学名称为[(3ar*,4s*,7r*,7as)
‑
1,3,3a,4,7,7a
‑
六氢
‑
1,3
‑
二氧代
‑
4,7
‑
甲桥
‑
2h
‑
异吲哚
‑2‑
基]
‑
n
‑8‑
喹啉基苯甲酰胺并且cas编号为1127442
‑
82
‑
3的小分子。
[0212]
本发明的另一方面涉及眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，以及vsx2和mitf中的一种或多种。因此，在特定的实施方案中，眼野祖细胞的体外细胞群体是通过根据本发明第一方面的方法获得的。所谓“体外细胞群体”是指人体外的细胞群体，例如，容纳在合适的容器中。在特定实施方案中，眼野祖细胞是非天然的。术语“非天然”应被理解为不存在于自然界中的细胞，例如在人体或动物体内不存在的细胞。尽管干细胞疗法的目的通常是获得与人体内的细胞相同或接近相同的细胞，但目前的细胞分化和成熟方法不提供与这些细胞完全相同的细胞产物。
[0213]
在一个实施方案中，眼野祖细胞分化为神经视网膜祖细胞。因此，本发明的另一方面涉及从hpsc获得神经视网膜祖细胞的方法。根据该方面的方法与用于获得眼野祖细胞的方案直接相关。因此，与获得眼野祖细胞的方法有关的实施方案可能同样适用于该方面。该方面的一个实施方案涉及获得神经视网膜祖细胞的方法，其包括以下步骤：培养hpsc，将hpsc接种在用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养hpsc以获得分化细胞，使分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，并使分化细胞与bmp5接触，其中让分化细胞分化为神经视网膜祖细胞。
[0214]
在另一个实施方案中，眼野祖细胞分化为rpe祖细胞。
[0215]
因此，本发明的另一方面还涉及获得rpe细胞的方法。根据该方面的方法与用于获得眼野祖细胞的方案直接相关。因此，与获得眼野祖细胞的方法有关的实施方案可能同样适用于该方面。该方面的一个实施方案涉及从hpsc获得rpe祖细胞的方法，其包括以下步骤：培养hpsc以获得分化细胞，使分化细胞与bmp5接触，使分化细胞与gsk3抑制剂接触，其中让分化细胞分化为rpe祖细胞。在更具体的实施方案中，从hpsc获得rpe祖细胞的方法包括以下步骤：培养hpsc，将hpsc接种在用基质包被的基质上，在细胞培养基中培养hpsc以获得分化细胞，使分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，使分化细胞与bmp5接触，并使分化细胞与gsk3抑制剂接触，其中让分化细胞分化为rpe祖细胞。
[0216]
gsk3
[0217]
如本文所用的，“gsk3”是指糖原合酶激酶3。gsk3是参与许多信号通路的丝氨酸苏氨酸激酶，这些通路在胚胎大脑发育过程中控制细胞功能，如神经祖细胞的增殖和细胞极性。gsk3充当众多信号通路的下游调节开关，包括对wnt、生长因子、胰岛素、受体酪氨酸激酶(rtk)、hedgehog通路和g蛋白偶联受体(gpcr)的细胞响应。gsk3抑制剂的非限制性实例是chir99021或chir、sb216763、sb415286、chir98014、ara014418、1
‑
氮杂坎帕罗酮(1
‑
azakenpaullone)和双
‑7‑
吲哚基马来酰亚胺。
[0218]
如本文所用的，“chir99021”和“ct99021”可以互换使用，是指6
‑
[[2
‑
[[4
‑
(2,4
‑
二氯苯基)
‑5‑
(5
‑
甲基
‑
1h
‑
咪唑
‑2‑
基)
‑2‑
嘧啶基]氨基]乙基]氨基]
‑3‑
吡啶甲腈，cas编号为252917
‑
06
‑
9。
[0219]
在一个实施方案中，gsk3抑制剂是chir99021。
[0220]
在一个实施方案中，从大约第5天至大约第40天起，优选地从大约第5天至大约第25天起，更优选地从大约第6天至大约第26天起，更优选地从大约第6天至大约第25天起，更优选地从大约第6天至大约第24天起，更优选地从大约第6天至大约第23天起，更优选地从大约第6天至大约第22天起，更优选地从大约第6天至大约第21天起，甚至更优选地从大约第7天至大约第21天起，使分化细胞与gsk3抑制剂接触。
[0221]
在一个实施方案中，在分化细胞与bmp5或其类似物接触后约2天，优选3天，更优选4天，甚至更优选5天，使分化细胞与gsk3抑制剂接触。
[0222]
在一个实施方案中，使分化细胞与浓度为约0.25μm至约5μm，优选约1μm至约4μm，更优选约2μm至约3μm的gsk3抑制剂接触。
[0223]
本发明人确定，gsk3抑制剂提供了向rpe细胞分化的有效且稳定的起始。小分子chir99021还有助于转化为gmp合规性。
[0224]
本发明人设想，作为使用gsk3抑制剂的替代方案，可以使用wnt配体，如wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11和wnt16。在一个实施方案中，该wnt配体是wnt3a。
[0225]
如本文所用的，wnt1、wnt2、wnt2b、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11和wnt16被包含在分泌型脂质修饰的信号糖蛋白的不同家族中，长度为350
‑
400个氨基酸。在这些蛋白质上发生的脂质修饰类型是在丝氨酸残基的保守模式中丝氨酸的棕榈油酰化(palmitoleoylation)。棕榈油酰化是必需的，因为它启动wnt蛋白靶向质膜以供分泌，并且由于脂肪酸的共价连接，它允许
wnt蛋白结合其受体。wnt蛋白也经历糖基化，这会附着碳水化合物以确保正确分泌。在wnt信号传导中，这些蛋白质充当配体，以通过旁分泌和自分泌途径激活不同的wnt通路。
[0226]
本发明的另一方面涉及通过根据本发明第一实施方案的方法获得的眼野祖细胞的体外细胞群体。
[0227]
在一个实施方案中，本发明的眼野祖细胞是非天然的。
[0228]
在一个实施方案中，包括rpe祖细胞、视杯祖细胞、角膜祖细胞和nr祖细胞在内的眼野祖细胞是非天然的。
[0229]
本发明的另一方面涉及眼野祖细胞的体外细胞群体用于获得nr祖细胞、早期眼祖细胞和/或rpe细胞的用途。
[0230]
本发明的另一方面涉及rpe祖细胞的体外细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的rpe祖细胞共表达pax6、otx2和mitf。
[0231]
本发明的另一方面涉及神经视网膜祖细胞的体外细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的神经视网膜祖细胞共表达pax6、otx2和vsx2。
[0232]
特定的实施方案
[0233]
现在通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明的方面：
[0234]
1.从hpsc获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0235]
‑
培养所述hpsc以获得分化细胞，以及
[0236]
‑
使所述分化细胞与bmp5接触，
[0237]
其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。
[0238]
2.从hpsc获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0239]
‑
培养所述hpsc，
[0240]
‑
在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，以及
[0241]
‑
使所述分化细胞与bmp5接触，
[0242]
其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。
[0243]
3.从hpsc获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0244]
‑
培养所述hpsc，
[0245]
‑
在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，
[0246]
‑
使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，以及
[0247]
‑
使所述分化细胞与bmp5接触，
[0248]
其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。
[0249]
4.从hpsc获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0250]
‑
培养所述hpsc，
[0251]
‑
将所述hpsc接种到用基质包被的基底上，
[0252]
‑
在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，
[0253]
‑
使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，以及
[0254]
‑
使所述分化细胞与bmp5接触，
[0255]
其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。
[0256]
5.根据前述实施方案所述的方法，其中使所述分化细胞与bmp5或其类似物接触，其中其类似物是骨形态发生蛋白(bmp)信号通路的有效激活剂。
[0257]
6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与bmp5(seq id no:1)接触，其中所述类似物与seq id no:1所示的bmp5具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，其中所述类似物是骨形态发生蛋白(bmp)信号通路的有效激活剂。
[0258]
7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与有效量的bmp5或其类似物接触。
[0259]
8.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与bmp5(seq id no:1)接触。
[0260]
9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中bmp5的浓度为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/ml，优选至少约150ng/ml，更优选至少约180ng/ml。
[0261]
10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中bmp5的浓度低于约1000、900、800、700、600或500ng/ml，优选低于约450ng/ml。
[0262]
11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中bmp5的浓度为约100ng/ml至约600ng/ml，优选约150ng/ml至约550ng/ml，更优选约200ng/ml至约500ng/ml，更优选约200ng/ml至约400ng/ml。
[0263]
12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中bmp5的浓度为约350ng/ml至约450ng/ml，优选约360ng/ml至约440ng/ml，更优选约370ng/ml至约430ng/ml，更优选约380ng/ml至约420ng/ml，更优选约390ng/ml至约410ng/ml，甚至更优选约400ng/ml。
[0264]
13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中bmp5的活性(ed
50
)为约0.1μg/ml至约2μg/ml，优选约0.15μg/ml至约1.5μg/ml，更优选约0.2μg/ml至约1.3μg/ml，甚至更优选约0.21μg/ml至约1.2μg/ml。
[0265]
14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中从大约第5天至大约第14天起，优选地从大约第6天至大约第13天起，更优选地从大约第6天至大约第12天起，更优选地从大约第6天至大约第11天起，更优选地从大约第6天至大约第10天起，更优选地从大约第6天至大约第9天起，更优选地从大约第6天至大约第8天起，甚至更优选地从大约第7天起，使所述分化细胞与bmp5接触。
[0266]
15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与bmp5或其类似物接触，并且其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞，直到大约第30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19天，优选地直到大约第20天至第22天，甚至更优选地直到大约第21天。
[0267]
16.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中从大约第5天至大约第30天起、从大约第5天至大约第29天起、从大约第5天至大约第28天起、从大约第5天至大约第27天起，优选地从大约第6天至大约第26天起，更优选地从大约第6天至大约第25天起，更优选地从大约第6天至大约第24天起，更优选地从大约第6天至大约第23天起，更优选地从大约第6天至大约第22天起，更优选地从大约第6天至大约第21天起，甚至更优选地从大约第7天至大约第21天起，使所述分化细胞与bmp5接触。
[0268]
17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中从第0天开始，让所述分化细胞
分化为眼野祖细胞约15至40天，优选约17天至25天，优选约18天至24天，更优选约19天至23天，更优选约19天至23天，更优选约20天至22天，甚至更优选约21天。
[0269]
18.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
[0270]
‑
使所述分化细胞与wnt/β
‑
联蛋白通路的抑制剂接触。
[0271]
19.根据实施方案18所述的方法，其中从大约第2天至大约第15天起，优选地从大约第3天至大约第14天起，更优选地从大约第3天至大约第13天起，甚至更优选地从大约第3天至大约第12天起，使所述细胞与所述wnt/β
‑
联蛋白通路抑制剂接触。
[0272]
20.根据实施方案18和19中任一项所述的方法，其中所述wnt/β
‑
联蛋白通路抑制剂为endo iwr 1。
[0273]
21.根据实施方案20所述的方法，其中endo iwr 1的浓度为约0.1μm至约10μm，优选约0.5μm至约5μm，甚至更优选约1μm至约3μm。
[0274]
22.根据实施方案4至21中任一项所述的方法，其中所述基质包含层粘连蛋白或其片段。
[0275]
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段选自层粘连蛋白
‑
511和层粘连蛋白
‑
332。
[0276]
24.根据实施方案22所述的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白
‑
511和层粘连蛋白
‑
332的组合。
[0277]
25.根据实施方案23所述的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白
‑
332。
[0278]
26.根据实施方案22至25中任一项所述的方法，其中所述层粘连蛋白是完整的层粘连蛋白。
[0279]
27.根据实施方案22至25中任一项所述的方法，其中所述层粘连蛋白是完整层粘连蛋白的片段。
[0280]
28.根据实施方案22至27中任一项所述的方法，其中所述层粘连蛋白的浓度为约0.01μg/cm2至约50μg/cm2，优选约0.1μg/cm2至约25μg/cm2，更优选约0.1μg/cm2至10μg/cm2，更优选约0.1μg/cm2至约5，更优选约0.25μg/cm2至约1μg/cm2，甚至更优选约0.5μg/cm2。
[0281]
29.根据实施方案3至28中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与选自gw788388、ldn
‑
193189、ly2157299、ly364947、noggin、repsox、sb431542和tew
‑
7197的smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0282]
30.根据实施方案29所述的方法，其中使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂的组合接触，其中至少一种smad蛋白信号传导抑制剂选自gw788388、ldn
‑
193189、ly2157299、ly364947、noggin、repsox、sb431542和tew
‑
7197。
[0283]
31.根据实施方案3至30中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与选自gw788388和/或repsox的smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0284]
32.根据实施方案29和31中任一项所述的方法，其中所述smad蛋白信号传导抑制剂为gw788388。
[0285]
33.根据实施方案32所述的方法，其中所述smad蛋白信号传导抑制剂为gw788388，其浓度为0.1ng/ml至1000ng/ml，优选约5ng/ml至约1000ng/ml，更优选约10ng/ml至约500ng/ml。
[0286]
34.根据实施方案29和31中任一项所述的方法，其中所述smad蛋白信号传导抑制剂为repsox。
[0287]
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述smad蛋白信号传导抑制剂为repsox，其浓度为0.25μm至200μm，优选约10μm至约150μm，更优选约15μm至约100μm，甚至更优选约20μm至约75μm。
[0288]
36.根据实施方案3至35中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞仅与一种smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0289]
37.根据实施方案3至36中任一项所述的方法，其中从大约第0天起，使所述分化细胞与所述smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0290]
38.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与bmp5或其类似物接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞，直到大约第40天或更长、第39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19天，优选地直到大约第20天至第22天，甚至更优选地直到大约第21天。
[0291]
39.根据实施方案3至38中任一项所述的方法，其中从大约第0天至大约第15天起，优选地至大约第14天起，更优选地至大约第13天起，甚至更优选地至大约第12天起，使所述分化细胞与所述smad蛋白信号传导抑制剂接触。
[0292]
40.根据实施方案3至39中任一项所述的方法，其中从大约第0天至大约第12天起使所述分化细胞与所述smad蛋白信号传导抑制剂接触，并且从大约第7天起使所述分化细胞与bmp5接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞，直到大约第21天。
[0293]
41.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，以及vsx2和mitf中的一种或多种。
[0294]
42.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，并且至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％的眼野祖细胞进一步共表达vsx2和mitf中的一种或多种。
[0295]
43.根据实施方案2至42中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是化学成分确定的并且无xeno。
[0296]
44.根据实施方案2至43中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基无饲养细胞。
[0297]
45.根据实施方案2至44中任一项所述的方法，其中所述hpsc以约10,000个细胞/cm2至约100,000个细胞/cm2，优选约20,000个细胞/cm2至约80,000个细胞/cm2，更优选约30,000个细胞/cm2至约50,000个细胞/cm2，甚至更优选约40,000个细胞/cm2的密度进行涂布。
[0298]
46.根据实施方案2至45中任一项所述的方法，其中第0天的细胞培养基是第一细胞培养基，并且其中从大约第1天起，将至少一部分所述细胞培养基替换为第二细胞培养基。
[0299]
47.根据实施方案2至46中任一项所述的方法，其中第0天的细胞培养基是第一细胞培养基，并且其中从大约第1天起，将第一细胞培养基基本上替换为第二细胞培养基。
[0300]
48.根据实施方案46和47中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基是如用于ips和es干细胞的hpsc xf培养基。
[0301]
49.根据实施方案46至48中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基进一步包含rock抑制剂，优选地所述rock抑制剂为y
‑
27632。
[0302]
50.根据实施方案46至49中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基包括补充有n2和b27的gmem或dmem/f12。
[0303]
51.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述眼野祖细胞进一步分化为nr细胞。
[0304]
52.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述眼野祖细胞分化为rpe细胞。
[0305]
53.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述眼野祖细胞是rpe祖细胞，并且其中所述方法进一步包括使所述分化细胞与gsk3抑制剂接触的步骤。
[0306]
54.根据实施方案53所述的方法，其中所述gsk3抑制剂为chir99021。
[0307]
55.根据实施方案54所述的方法，其中chir99021的浓度为约0.25μm至约5μm，优选约1μm至约4μm，更优选约2μm至约3μm。
[0308]
56.根据实施方案53至55中任一项所述的方法，其中从大约第5天至大约第40天起，优选地从大约第5天至大约第25天起，更优选地从大约第6天至大约第26天起，更优选地从大约第6天至大约第25天起，更优选地从大约第6天至大约第24天起，更优选地从大约第6天至大约第23天起，更优选地从大约第6天至大约第22天起，更优选地从大约第6天至大约第21天起，甚至更优选地从大约第7天至大约第21天起，使所述分化细胞与所述gsk3抑制剂接触。
[0309]
57.根据实施方案53至56中任一项所述的方法，其中从大约第7天至大约第15天起，优选地从大约第12天起，使所述分化细胞与所述gsk3抑制剂接触。
[0310]
58.根据实施方案53至57中任一项所述的方法，其中在所述分化细胞与bmp5接触后约2天，优选3天，更优选4天，甚至更优选5天，使所述分化细胞与所述gsk3抑制剂接触。
[0311]
59.眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的眼野祖细胞共表达pax6和otx2，以及vsx2和mitf中的一种或多种。
[0312]
60.根据实施方案59所述的眼野祖细胞的体外细胞群体，其中所述眼野祖细胞是非天然的。
[0313]
61.根据实施方案59和60中任一项所述的体外细胞群体，其中所述眼野祖细胞是rpe祖细胞。
[0314]
62.根据实施方案59和60中任一项所述的体外细胞群体，其中所述眼野祖细胞是nr祖细胞。
[0315]
63.通过根据实施方案1至58中任一项所述的方法获得的眼野祖细胞的体外细胞群体。
[0316]
64.根据实施方案59至63中任一项所述的眼野祖细胞的体外细胞群体用于获得nr祖细胞、早期眼祖细胞和/或rpe祖细胞的用途。
[0317]
65.根据实施方案64所述的用途，其用于治疗眼部状况，如年龄相关性黄斑变性、白内障、角膜失明、青光眼和rp。
[0318]
66.从hpsc获得rpe祖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0319]
‑
培养所述hpsc，
[0320]
‑
将所述hpsc接种到用基质包被的基底上，
[0321]
‑
在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，
[0322]
‑
使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，
[0323]
‑
使所述分化细胞与bmp5或其类似物接触，以及
[0324]
‑
使所述分化细胞与gsk3抑制剂接触，
[0325]
其中让所述分化细胞分化为rpe祖细胞。
[0326]
67.rpe祖细胞的体外细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的rpe祖细胞共表达pax6、otx2和mitf。
[0327]
68.根据实施方案67所述的rpe祖细胞的体外细胞群体，其中所述rpe祖细胞是非天然的。
[0328]
69.从hpsc获得神经视网膜祖细胞的方法，其包括以下步骤：
[0329]
‑
培养所述hpsc，
[0330]
‑
将所述hpsc接种到用基质包被的基底上，
[0331]
‑
在细胞培养基中培养所述hpsc以获得分化细胞，
[0332]
‑
使所述分化细胞与smad蛋白信号传导抑制剂接触，以及
[0333]
‑
使所述分化细胞与bmp5接触，
[0334]
其中让所述分化细胞分化为神经视网膜祖细胞。
[0335]
70.神经视网膜祖细胞的体外细胞群体，其中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的神经视网膜祖细胞共表达pax6、otx2和vsx2。
[0336]
71.根据实施方案70所述的神经视网膜祖细胞的体外细胞群体，其中所述神经视网膜祖细胞是非天然的。
实施例
[0337]
以下是用于实施本发明的方案的非限制性示例。
[0338]
通用制备方法
[0339]
hesc的培养
[0340]
内部生成的hesc系在37℃的5％co2培养箱中，在人重组层粘连蛋白(hrln)包被的板(biolaminin 521ln，biolamina)上在nutristem hpsc xf培养基(biological industries)中维持，并且每3
‑
5天以1:10
–
1:20的比例酶促传代。对于传代，将汇合的培养物用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤一次，并在37℃下与tryple select(gibco，thermo fisher scientific)一起孵育5分钟。然后小心地去除酶，并通过轻轻移液将细胞收集在新鲜的nutristem hpsc xf培养基中以获得单细胞悬液，并将所需体积接种在新鲜的hrln
‑
521包被的培养皿上。传代后，将培养基替换为新鲜预温的nutristem hpsc xf培养基并每天更换。
[0341]
hesc向眼野祖细胞的分化
[0342]
使用nutristem hpsc xf培养基，将hesc
‑
rpe单层分化hesc以5.5x104个细胞/cm2的细胞密度接种在以10μg/ml用hrln
‑
332层粘连蛋白包被的培养皿(biolaminin 332ln，
biolamina)上。在最初24小时加入浓度为10μm的rho
‑
激酶抑制剂(y
‑
27632，millipore)，同时将细胞保持在37℃、5％co2。24小时后，将培养基替换为根据实施例的分化培养基。在以下实施例中，分化培养基“gmem”始终补充有青霉素
‑
链霉素溶液(20单位/ml；thermo fisher)、β
‑
巯基乙醇(0.5mm；thermo fisher)、丙酮酸钠(1mm；thermo fisher)、非必需氨基酸(1x；thermo fisher)。
[0343]
浓度
[0344]
表1中列出的以下浓度可以在实施例1至11中提供的方案中使用。这些浓度也在进行的实验中使用，并在图1至15中提及。
[0345]
表1
[0346][0347]
实施例1
[0348]
使用双重smad抑制和wnt抑制与bmp5的组合获得眼野祖细胞的方案
[0349]
为了将hesc分化为眼祖细胞，我们测试了bmp5与模拟发育线索的小分子和重组蛋白组合在不同条件下的效果。我们依赖于顺序激活和/或抑制我们的分化方案中与眼睛发育相关的共同发育途径，并组合用bmp5激活bmp通路。细胞解离后，在ln
‑
521上扩充的hesc系被解离为单细胞，并接种在ln
‑
332上进行分化。这些细胞很好地适应了这种层粘连蛋白。ln
‑
521、ln
‑
111和ln
‑
332之间在12小时后细胞粘附的比较在图1中示出。
[0350]
在此，我们总结了图2中所示的针对分化测试的6种不同条件。
[0351]
条件1：使用双重smad抑制、wnt抑制、无bmp5的对照条件
[0352]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0353]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0354]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0355]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0356]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27)
[0357]
条件2：使用双重smad抑制、顺序wnt抑制、无bmp5的条件
[0358]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0359]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0360]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0361]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0362]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2
[0363]
条件3：使用双重smad抑制、顺序wnt抑制、具有bmp5的条件
[0364]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0365]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0366]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0367]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0368]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2 bmp5
[0369]
条件4：使用双重smad抑制、顺序wnt抑制、具有bmp5和激活蛋白a的条件
[0370]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0371]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0372]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0373]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0374]
第12
‑
14天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2 bmp5
[0375]
第15
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2 bmp5 激活蛋白a
[0376]
条件5：使用双重smad抑制、顺序wnt抑制、具有激活蛋白a、无bmp5的条件
[0377]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0378]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0379]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0380]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0381]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2 激活蛋白a
[0382]
条件6：使用双重smad抑制、顺序wnt抑制、无bmp5的对照条件
[0383]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0384]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0385]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0386]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0387]
第12
‑
14天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2
[0388]
第15
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) ihh dkk2 激活蛋白a
[0389]
如图2a和图2b所示，在条件3中使用bmp5生成了mitf和vsx2阳性细胞。ihh对hedgehog通路的刺激和wnt抑制剂dkk2的使用不足以生成mitf或vsx2阳性细胞，如条件2所示，其显示出与对照(条件1)相似的模式。如条件4所示，用激活蛋白a以及bmp5处理并没有增加mitf或vsx2的水平。相比之下，如条件5和6所示，用激活蛋白a代替bmp5或在用激活蛋白a初始处理后用bmp5处理对mitf和vsx2阳性细胞的生成具有负面影响。如图3所示，这些细胞显示出前脑身份，对pax6和otx2标志物呈阳性，与眼野祖细胞身份相符。
[0390]
这些结果表明，bmp5强烈生成对rpe祖细胞标志物mitf和nr祖细胞标志物vsx2呈阳性的眼野祖细胞。ihh、dkk2和激活蛋白a的添加并没有在这些标志物的表达上显示出与bmp5处理的任何累加效应(图2a和图2b)。
[0391]
实施例2
[0392]
使用双重smad抑制与bmp5和chir99021的组合获得眼野祖细胞的方案
[0393]
我们决定用小分子chir99021与bmp5的组合来探索gsk3的抑制，并从方案中去除wnt抑制剂endo iwr1，因为gsk3抑制可能会激活经典(β
‑
联蛋白依赖性)wnt信号传导。由于bmp5对mitf和vsx2阳性细胞的生成显示正面影响，因此我们从第7天开始，测试了bmp5治疗的较早时间点。
[0394]
在此，我们总结了图4中测试并显示并在图5、6和7中补充的3种不同条件。
[0395]
条件2：使用双重smad抑制、无bmp5的对照条件
[0396]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0397]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0398]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0399]
第3
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0400]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27)
[0401]
条件2：使用双重smad抑制、具有bmp5的条件
[0402]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0403]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0404]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0405]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0406]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 bmp5
[0407]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5
[0408]
条件3：使用双重smad抑制、具有bmp5和chir99021的条件
[0409]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0410]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0411]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0412]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0413]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 bmp5
[0414]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0415]
如图4中的条件2所示，bmp5强烈生成mitf和vsx2阳性细胞。与hesc相比，mitf、pax6和vsx2 mrna水平也增加，因为ct值显著降低(图5)。当bmp5与chir99021组合时，vsx2阳性细胞的数目急剧减少(条件3，图4)。令人惊讶的是，与只有bmp5的条件相比，bmp5/chir99021处理下的mitf阳性细胞采取了组织良好的鹅卵石形态，这是rpe祖细胞的特征(图6)。
[0416]
bmp5与chir99021的组合在21天后生成了非常均匀的mitf阳性细胞群体，如图7所示。
[0417]
总之，我们基于bmp5的顺序方案将hesc分化为眼野祖细胞(mitf/vsx2)，并且添加chir99021可以将这些细胞重定向到更多的rpe祖细胞身份，呈mitf阳性和vsx2阴性，具有鹅卵石形态。
[0418]
实施例3
[0419]
使用repsox和noggin作为双重smad抑制剂、采用bmp5和chir99021获得眼祖细胞的方案
[0420]
我们决定探索另一种smad抑制剂repsox与noggin组合的效果，并与bmp5和chir99021组合，以获得mitf阳性的rpe祖细胞。这将表明是否可以在我们基于bmp5的方案中使用不同的smad抑制剂。
[0421]
在此，我们总结了如图8所示测试的条件。
[0422]
条件repsox：双重smad抑制与bmp5和chir99021
[0423]
第0天：100％nutristem repsox noggin y
‑
27632
[0424]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) repsox noggin
[0425]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) repsox noggin
[0426]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0427]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) repsox noggin bmp5
[0428]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0429]
如图8所示，在21天后有明显的pax6、six3和mitf基因表达的诱导，表明生成了具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞。在蛋白质水平上，repsox与bmp5和chir99021组合还生成了otx2和pax6(眼野祖细胞的标志物)阳性细胞，其通过免疫染色进行评估。
[0430]
总之，这些结果表明，不同的smad抑制剂可以在我们基于bmp5的方案中使用，以生成眼野祖细胞。
[0431]
实施例4
[0432]
使用单一smad抑制和bmp5或bmp5与chir99021获得眼野祖细胞的方案
[0433]
为了提供使用我们基于bmp5的方案生成的细胞的定量数据，我们通过流式细胞术分析了在对于nr祖细胞用bmp5处理或对于rpe祖细胞用bmp5和chir99021处理下生成的眼野祖细胞。此外，我们通过从方案中去除noggin测试了单一smad抑制。
[0434]
在此，我们总结了图9和图10中测试并显示的2种不同条件。
[0435]
对于rpe的条件(图9)：单一smad抑制与bmp5和chir99021
[0436]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0437]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0438]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0439]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0440]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 bmp5
[0441]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0442]
对于nr的条件(图10)：单一smad抑制和bmp5
[0443]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0444]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0445]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0446]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0447]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 bmp5
[0448]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5
[0449]
如图9所示，pax6阳性细胞占分化细胞的90％以上，当细胞暴露于bmp5和chir99021时在21天后，超过40％对于pax6/mitf均呈阳性。这表明眼野祖细胞在暴露于单一smad抑制剂(gw788388)并随后用bmp5和chir99021处理后采用rpe祖细胞身份。当细胞单
独暴露于bmp5时，pax6阳性细胞数占95％以上，pax6/vsx2双阳性细胞数超过50％，如图10所示。这表明单一smad抑制与bmp5组合生成了具有nr祖细胞身份的眼野祖细胞，它们对pax6和vsx2呈阳性。
[0450]
总之，我们基于bmp5的方案中的单一smad抑制生成了超过50％的具有nr祖细胞身份(pax6/vsx2)的眼野祖细胞，并且添加chir99021可以将这些细胞重定向到rpe祖细胞(mitf)身份。令人惊讶的是，在我们基于bmp5的方案中使用单一smad抑制剂(gw788388)可以代替双重smad抑制的使用。
[0451]
实施例5
[0452]
对于使用单一smad抑制与bmp5和chir99021获得具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞的方案的单细胞rna测序分析
[0453]
为了在转录组水平上评价我们基于bmp5的方案中单一smad抑制与chir99021的组合对于生成具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞的效果，我们在第21天对使用以下方案生成的细胞进行了单细胞rna测序(scrnaseq)。
[0454]
在此，我们总结了图11和图12测试的条件。
[0455]
条件：单一smad抑制和bmp5 chir99021处理：
[0456]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0457]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0458]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0459]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0460]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 bmp5
[0461]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0462]
图11中的表格显示了通过scrnaseq分析的，表达指定基因的hesc衍生的眼野祖细胞的百分比。如表中所示，多能性标志物(nanog、pou5f1和zscan10)在分化21天后代表不到1％的细胞，未检测到nanog/pou5f1/zscan10三重阳性细胞，表明不存在多能细胞。检测到rpe祖细胞特异性标志物呈阳性的细胞，mitf占29％，pmel占73％，serpinf1占69％。还检测到对视杯标志物如pax6、otx2和six3呈阳性的细胞(分别为86％、64％和56％)。值得注意的是，没有检测到对其他生殖细胞谱系如中胚层和内胚层谱系呈阳性的细胞。每个维恩图显示了共表达rpe祖细胞的特征性基因pax6/mitf/pmel和pax6/pmel/serpinf1基因的细胞的表达模式。
[0463]
令人惊讶的是，我们鉴定出一小簇对lsc(也称为角膜干细胞)标志物如tp63(8％)、s100a14(4％)、tfap2b(4％)和abcg2(1％)呈阳性的细胞。在图12中，我们呈现了维恩图，其显示lsc(tp63/tfap2b/s100a14)三重阳性细胞，占细胞的0.8％。
[0464]
总之，我们基于bmp5的方案与chir99021和单一smad抑制的组合生成了具有rpe祖细胞身份(mitf/pmel/serpinf1)的眼野祖细胞。不存在未分化的细胞或来自中胚层或内胚层谱系的细胞。令人惊讶的是，我们基于bmp5的方案还能够生成具有lsc(也称为角膜干细胞)身份的眼野祖细胞。
[0465]
实施例6
[0466]
使用不同浓度的bmp5获得眼野祖细胞的方案
[0467]
为了确定哪个浓度范围的bmp5最有效地生成眼野祖细胞，我们测试了三种不同的
浓度(0.1、200和1000ng/ml)并与没有bmp5的对照条件进行比较。我们在第21天对使用以下方案生成的细胞分析了基因表达。
[0468]
在此，我们总结了图13和图14测试的条件。
[0469]
条件：单一smad抑制和bmp5 chir99021处理(图13)
[0470]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0471]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0472]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0473]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0474]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 bmp5
[0475]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0476]
条件：单一smad抑制和bmp5处理(图14)
[0477]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0478]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0479]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0480]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0481]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 bmp5
[0482]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5
[0483]
如图13所示，诱导具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞的最佳条件是200ng/ml。如图14所示，生成具有nr祖细胞身份的眼野祖细胞的最佳条件对于nr祖细胞也是200ng/ml，如通过vsx2(也称为chx10)基因表达的诱导所证明的。
[0484]
总之，在测试的浓度中，200ng/ml似乎是生成眼野祖细胞的最佳bmp5浓度，而1000ng/ml也显示出正面但较温和的效果。
[0485]
实施例7
[0486]
用于比较不同bmp的获得眼野祖细胞的方案
[0487]
为了研究bmp5是否比bmp家族的其他成员在生成眼野祖细胞方面具有更好的效果，我们将bmp5与bmp4、bmp7和由bmp4
‑
bmp7形成的bmp异二聚体进行了比较，与chir99021组合以生成具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞。
[0488]
在此，我们总结了图15测试的条件。
[0489]
条件：单一smad抑制和不同的bmp与chir99021
[0490]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0491]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0492]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0493]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0494]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 bmp
[0495]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp chir99021
[0496]
如图15所示，bmp5在诱导具有rpe祖细胞身份的眼野祖细胞标志物的基因表达方面具有优异的效果。bmp4显示出诱导这些标志物的能力最低，而虽然bmp7和异二聚体bmp4
‑
bmp7好于bmp4，但bmp5的效果对这里显示的所有标志物都更好。
[0497]
总之，与其他bmp家族成员如bmp4、bmp7和异二聚体bmp4
‑
bmp7相比，bmp5在生成眼
野祖细胞方面具有更好的效果。
[0498]
实施例8：使用双重smad抑制和wnt通路的初始抑制获得视网膜色素上皮(rpe)祖细胞的方案
[0499]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0500]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0501]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0502]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0503]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1 bmp5
[0504]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0505]
实施例9：使用单一smad抑制和wnt通路的初始抑制获得视网膜色素上皮(rpe)祖细胞的方案
[0506]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0507]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0508]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0509]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 endo iwr1
[0510]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 endo iwr1 bmp5
[0511]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5 chir99021
[0512]
实施例10：使用双重smad抑制和wnt通路的初始抑制获得神经视网膜祖细胞的方案
[0513]
第0天：100％nutristem noggin gw788388 y
‑
27632
[0514]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0515]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388
[0516]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1
[0517]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) noggin gw788388 endo iwr1 bmp5
[0518]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5
[0519]
实施例11：使用单一smad抑制和wnt通路的初始抑制获得神经视网膜祖细胞的方案
[0520]
第0天：100％nutristem gw788388 y
‑
27632
[0521]
第1天：50％nutristem 50％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0522]
第2天：75％nutristem 25％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388
[0523]
第3
‑
6天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 endo iwr1
[0524]
第7
‑
11天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) gw788388 endo iwr1 bmp5
[0525]
第12
‑
21天：100％(gmem 1％(v/v)n2 2％(v/v)b27) bmp5
[0526]
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这些修改和变化。