新型冠状病毒的串联表位多肽疫苗及其应用的制作方法

1.本发明涉及多肽药物和多肽疫苗领域，具体地，涉及新型冠状病毒的串联表 位多肽疫苗及其应用。


背景技术：

2.由冠状病毒sars-cov-2引起的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease2019,covid-19)具有极高的传染性。然而，目前尚缺乏针对covid-19的明确有效 的预防和治疗药物及措施，临床上暂以支持治疗和对症治疗为主。
3.通过疫苗建立起对sars-cov-2的群体免疫，是控制和阻断covid-19疫情的 最终途径。目前已有多种类型的covid-19疫苗处于临床前和临床试验中，包括减 毒活疫苗、灭活病毒疫苗、重组病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、dna疫苗、rna疫 苗和多肽疫苗等。
4.然而，目前开发的疫苗所产生的免疫保护作用有限，例如存在免疫原性低、 安全性风险、人群响应率低和难以克服病毒免疫逃逸等问题。
5.因此，本领域迫切需要开发新的高人群响应率且可高效激发人体产生针对 sars-cov-2的免疫应答的疫苗，以便在接种者中产生阻断型的抗sars-cov-2抗体， 从而提供有力的免疫保护作用。


技术实现要素：

6.本发明目的就是提供一种新的高人群响应率且能高效激发人体产生针对 sars-cov-2的免疫应答的疫苗，进而在接种者中产生阻断型的抗sars-cov-2抗体， 从而提供有力的免疫保护作用。
7.在本发明的第一方面，提供了一种新型冠状病毒的疫苗多肽，所述的疫苗多 肽包括串联在一起的以下元件：通用型th表位序列、b细胞表位序列和t细胞表 位序列，其中所述的b细胞表位和t细胞表位具有来自sars-cov-2的s蛋白的rbm 区域的氨基酸序列。
8.在另一优选例中，所述的通用型th表位序列包括padre序列。
9.在另一优选例中，所述的padre序列包括akfvaawtlkaaa(seq id no:1中第 1-13位)。
10.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物和啮齿动物产生阻断rbd 与ace2结合的中和抗体。
11.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。
12.在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物。
13.在另一优选例中，所述抗原多肽的长度为40-100个氨基酸，较佳地45-80个 氨基酸。
14.在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有式i结构或包含式i结构的寡聚体：
15.z1-z2-z3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(i)
16.式中，
17.z1、z2和z3各自独立地为通用型th表位序列、所述的b细胞表位序列、所 述的t细胞表位或其组合；
18.“-”
为化学键或连接子；
19.并且z1、z2和z3中至少一个为通用型th表位序列；至少一个为所述的b细 胞表位序列；以及至少一个为所述的t细胞表位。
20.在另一优选例中，z2为b细胞表位，而z3为t细胞表位。
21.在另一优选例中，z2为t细胞表位，而z3为b细胞表位。
22.在另一优选例中，所述的通用型th表位序列包括padre序列。
23.在另一优选例中，所述的
“-”
为肽键或连接肽。
24.在另一优选例中，所述的连接肽为3-6个甘氨酸形成的多聚甘氨酸。
25.在另一优选例中，所述的连接肽为柔性的。
26.在另一优选例中，所述的连接肽为gggg(即g4)。
27.在另一优选例中，所述的b细胞表位序列和t细胞表位的长度各自独立为 10-20个氨基酸，较佳地为12-18个氨基酸。
28.在另一优选例，所述抗原多肽中，除了parde序列和连接肽之外，其他的序 列衍生自s蛋白的rbm区域的氨基酸序列。
29.在另一优选例中，所述的抗原多肽中的b细胞表位和/或t细胞表位具有衍生 自新型冠状病毒s蛋白的rbd区域的氨基酸序列。
30.在另一优选例中，所述的抗原多肽中的z2和/或z3具有衍生自rbd区域的rbm 区域的氨基酸序列。
31.在另一优选例中，所述的rbm区域指新型冠状病毒rbd蛋白的第438-506位 氨基酸。
32.在另一优选例中，所述的抗原多肽“具有衍生自rbd蛋白的rbm区域的氨基 酸序列”指所述抗原多肽的氨基酸序列与rbm区域的具有同源性(或同一性)，且所 述同源性≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥90％，最佳地≥95％。
33.在另一优选例中，所述的抗原多肽与新型冠状病毒的s蛋白竞争性结合人 ace2蛋白。
34.在另一优选例中，所述的“竞争性结合”指所述的抗原多肽(或其中的b细胞 表位和/或t细胞表位)参与新型冠状病毒的s蛋白与人ace2蛋白的结合。
35.在另一优选例中，所述的竞争性结合包括阻断性或非阻断性的竞争性结合。
36.在另一优选例中，所述的抗原多肽为人工合成的或重组的抗原多肽。
37.在另一优选例中，式i中，z1为akfvaawtlkaaa(seq id no:1中第1-13位)； z2为ygfqptngvgyqp(seq id no:1中第18-30位)；z3为nylyrlfrksnlkpf(seqid no:1中第18-30位)。
38.在另一优选例中，式i中，z1为akfvaawtlkaaa(seq id no:1中第1-13位)； z2为nylyrlfrksnlkpf(seq id no:1中第18-30位)；z3为ygfqptngvgyqp(seqid no:1中第18-30位)。
39.在另一优选例中，所述的抗原多肽选自下组：
40.(a)具有seq id no:1所示的氨基酸序列的多肽；
41.(b)对(a)中多肽的氨基酸序列中的连接肽部分进行一个或多个氨基酸添加、 一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与 衍生前的seq id no:1所示多肽具有相同或基本相同的功能；
42.(c)对(a)中多肽的氨基酸序列中的z1、z2和/或z3部分进行一个或多个氨 基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述 衍生多肽与衍生前的seq id no:1所示多肽具有相同或基本相同的功能。
43.在另一优选例中，所述的“基本相同的功能”指所述的衍生多肽具有基本相 同的激发免疫反应的免疫原性，并且所产生的抗体(包括抗血清)有阻断新型冠状病 毒的s蛋白与人ace2蛋白结合的活性。
44.在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有seq id no:1所示的氨基酸序列。
45.在另一优选例中，所述的抗原多肽的结构如式ii所示：
46.x1-x-x2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ii)，
47.式中，
48.(a)x为核心片段(即式i结构或包含式i结构的寡聚体)；优选地，所述的核 心片段的序列如seq id no:1所示；
49.(b)x1、x2各自独立地为无、1、2或3个氨基酸，且x1和x2的氨基酸个数 总和≤4，较佳地，3、2、1，更佳地为0或1；
50.(c)
“-”
表示肽键、肽接头、或其他连接子(即x1与x之间和/或x与x2之 间，以肽键、肽接头(如1-15个氨基酸构成的柔性接头)或其他连接子相连)。
51.在另一优选例中，x1、x2各自独立地为无、k、c、g、l、a。
52.在另一优选例中，x1为无、k、或c。
53.在另一优选例中，x2为无、k、或c。
54.在另一优选例中，所述抗原多肽具有新型冠状病毒s蛋白rbd区的至少一个t 细胞表位和至少一个b细胞表位。
55.在另一优选例中，所述抗原多肽具有新型冠状病毒s蛋白rbm区的至少一个t 细胞表位和/或至少一个b细胞表位。
56.在另一优选例中，所述的抗原多肽具有至少一个t细胞表位，较佳地1、2、3 或4个t细胞表位，更佳地1或2个t细胞表位。
57.在另一优选例中，所述的抗原多肽具有至少一个b细胞表位，较佳地1、2、3 或4个b细胞表位，更佳地1或2个b细胞表位。
58.在另一优选例中，所述的抗原多肽具有1-2个t细胞表位和1-2个b细胞表 位，较佳地1个t细胞表位和1个b细胞表位。
59.在另一优选例中，t细胞表位包括cd4 t细胞表位和cd8 t细胞表位。
60.在另一优选例中，所述的cd4 t细胞表位主要激活辅助性t细胞去活化b细 胞产生抗体；ctl表位(或称cd8 t细胞表位)可激活杀伤性cd8 t细胞来发挥抗病 毒作用。
61.在另一优选例中，所述的b细胞表位包括线性和构象b细胞表位。
62.在本发明的第二方面，提供了一种分离的肽集合，所述的肽集合包括至少两 种的本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽。
63.在另一优选例中，所述的肽集合中至少含有2-20种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12种)所述的疫苗多肽。
64.在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发 明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第二方面所述的肽集合和药 学上可接受的载体。
65.在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
66.在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。
67.在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂,首选各种铝佐剂。组合物中 活性肽和佐剂(如铝)的摩尔数或重量比在1:100之间，优选为1:40到1:60之间。
68.在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
69.在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
70.在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮 内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、口鼻腔喷入或雾化吸 入。
71.在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多 肽或第二方面所述的肽集合或第三方面所述的药物组合物的用途，它们被用于制备 预防冠状病毒sars-cov-2感染或其相关疾病的药物。
72.在另一优选例中，所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病选自下组：呼吸道感 染、肺炎及其并发症、或其组合。
73.在另一优选例中，所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病为新型冠状病毒肺炎 (covid-19)。
74.在本发明的第五方面，提供了一种细胞制剂，所述的细胞制剂包括(a)用本发 明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第二方面所述的肽集合免疫 激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
75.在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：树突状细胞、自然杀伤细胞nk、 淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、或其组合。
76.在另一优选例中，所述的激活为体外激活。
77.在另一优选例中，所述的体外激活包括：在所述的疫苗多肽存在下，培养所 述的免疫细胞一段时间(如6-48小时)，从而获得经免疫激活的免疫细胞。
78.在另一优选例中，所述的细胞制剂为含活细胞的液态制剂。
79.在另一优选例中，所述的细胞制剂通过静脉给药方式回输。
80.在本发明的第六方面，提供了一种产生针对冠状病毒sars-cov-2的免疫反应 的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的新型冠状病毒的疫苗 多肽、第二方面所述的肽集合或第三方面所述的药物组合物。
81.在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
82.在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。
83.在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对冠状病毒sars-cov-2 的中和抗体。
84.在另一优选例中，所述中和抗体阻断冠状病毒sars-cov-2与人ace2蛋白的 结合。
85.在本发明的第七方面，提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括载体蛋白 以及与所述融合蛋白融合的本发明第一方面所述的疫苗多肽。
86.在另一优选例中，所述的融合蛋白具有式ⅲa或ⅲb结构：
87.p1-p2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ⅲa)
88.p2-p1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ⅲb)
89.式中，p1为本发明第一方面所述的疫苗多肽，p2为载体蛋白。
90.在另一优选例中，所述的p1可以是单个疫苗多肽，也可以是串联的多个相同 或不同的疫苗多肽(或抗原多肽)。
91.在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，它包括(a)用本发明第七方面 所述的融合蛋白或被其免疫激活的免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。
92.在本发明的第九方面，提供了本发明第七方面所述的融合蛋白或第八方面所 述的药物组合物的用途，它们被用于制备预防冠状病毒sars-cov-2感染或其相关 疾病的药物。
93.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
94.图1为sars-cov-2的s蛋白rbd区与人ace2的相互作用结构与关键作用位点 图。
95.图2为netmhcii软件预测的s蛋白主要的cd4 t抗原表位区域图。
96.图3为netctl软件预测的s蛋白主要的cd8 t抗原表位区域图。
97.图4为bepipred软件预测的s蛋白rbd所含线性b细胞表位区域图。
98.图5为discotope软件预测的s蛋白rbd所含构象b细胞表位图。
99.图6为lp2的表位串联结构组成模式图。
100.图7显示了lp2所含b细胞表位和t细胞表位在s蛋白rbd区域中的相对空间 位置。
101.图8显示了lp2免疫食蟹猴后产生了高滴度的抗rbd抗体。
102.图9显示了lp2免疫食蟹猴所产生的抗rbd抗体，可阻断rbd与ace2结合。
103.图10显示了lp2可与人ace2蛋白在体外较好地结合。
具体实施方式
104.本发明人通过广泛而深入的研究，基于对sars-cov-2的s蛋白rbd的序列和 结构解析研究，分析了s蛋白的t/b细胞表位、相互作用关键位点、表面特征及多 肽理化性质等特征，首次筛选并确定可有效诱导哺乳动物机体产生针对冠状病毒 sars-cov-2的免疫反应的疫苗多肽。实验表明，本发明的疫苗多肽可有效地在灵 长类动物(如食蟹猴)中引发针对sars-cov-2的细胞免疫和体液免疫，从而产生阻 断rbd与ace2结合的较高滴度中和抗体，因而本发明在新型冠状病毒肺炎的预防 或治疗有潜在的应用前景。在此基础上完成了本发明。
105.具体地，本发明人基于对sars-cov-2的s蛋白的rbd序列和结构信息的解析， 通过确定s蛋白的cd4 t/cd8 t细胞表位、线性/构象b细胞表位，并综合考虑s 蛋白的结构表面特征、与ace2的相互作用关键位点以及多肽理化性质等，筛选确 定了rbd区域特定的b细胞表位序列和t细胞表位序列，并将这些表位与通用型 th表位(如padre序列)串联，形成新颖
的串联表位多肽，改进了普通多肽免疫 原性较低和受mhc限制性影响的人群响应率低的问题，并兼顾普通多肽的高特异 性、高安全性和易于合成生产的优势。实验表明，本发明的串联表位多肽可使食 蟹猴启动较强的细胞和体液免疫作用，产生阻断rbd与ace2结合的较高滴度中和 抗体。同时，本发明的串联表位多肽具有优化的结构，其所含t/b细胞表位序列位 于rbd与人ace2的作用界面上，串接后出乎意料地仍旧可以和人ace2较好地结合， 显示出直接阻断rbd和ace2相互作用的潜能。
106.术语
107.冠状病毒sars-cov-2
108.冠状病毒(coronavirus，cov)属于套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科 (coronaviridae)，是一种有包膜的正链rna病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。
109.目前已知的感染人的冠状病毒中，hcov-229e和hcov-nl63属于α属冠状病 毒，hcov-oc43、sars-cov、hcov-hku1、mers-cov和sars-cov-2均为β属冠状病 毒。
110.2019年年底爆发的新型冠状病毒(sars-cov-2)与sars-cov有约80％相似性、 与mers-cov有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。
111.该类病毒的基因组是一条单股正链rna，是基因组最大的rna病毒之一，编码 包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶 段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(polyprotein)， 随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如rna聚合酶和解旋酶)和结构蛋白 (如刺突蛋白)及辅助蛋白。
112.s蛋白是冠状病毒sars-cov-2的一种主要的结构蛋白，其结构示意图如图1 所示，其中，rbd负责与人ace2受体结构，而rbm区域含有与人ace2结合的基序 (motif)。一种典型的s蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
113.mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfh aihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcn dpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskht pinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllky nengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasv yawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiady nyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfpl qsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfq qfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwr vystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensv aysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdk ntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaar dlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlye nqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkvea evqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgv vflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvig ivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqe lgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt (seq id no:2)
114.冠状病毒sars-cov-2的rbd区域位于s蛋白的第333-527位，一种代表性的 氨基酸序列如seq id no:2中第333-527位所示。
115.>rbd(333-527)
116.tnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyad sfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdis teiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgp(seq id no:2 中第333-527位)
117.冠状病毒sars-cov-2的rbm区域位于s蛋白的第438-506位，一种代表性的 氨基酸序列如seq id no:2中第438-506位所示。
118.>rbm(438-506)
119.snnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngv gyq(seq id no:2中第438-506位)
120.应理解，在本发明中，s蛋白、rbd区域和rbm区域均包括野生型和突变型。
121.疫苗多肽
122.在本发明中，“本发明表位肽”、“本发明疫苗多肽”、“本发明多肽”、
ꢀ“
本发明的串联表位多肽”可互换使用，指符合本发明第一方面中所述的疫苗多肽， 尤其是具有式i结构的多肽。应理解，所述术语不仅包括一种本发明疫苗多肽，还 包括多种本发明的疫苗多肽所形成的肽集合(或肽组合)。
123.优选地，本发明疫苗多肽包括至少一个t细胞表位和至少一个b细胞表位。 优选地，在本发明的疫苗多肽中，cd4 t细胞表位主要激活辅助性t细胞去活化 b细胞产生抗体，ctl表位可激活杀伤性cd8 t细胞来发挥抗病毒作用。线性和 构象b细胞表位可作用于bcr直接激活b细胞产生抗体。
124.在本发明中，疫苗多肽还包括其他形式，例如药学上可接受的盐、偶联物、 或融合蛋白。
125.此外，在本发明中，优选的疫苗多肽具有式ii所示结构：
126.x1-x-x2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(ii)
127.(a)x为核心片段,其中，所述的核心片段的序列如seq id no:1所示；
128.(b)x1、x2各自独立地为无、1、2或3个氨基酸，且x1和x2的氨基酸个数 总和≤4，较佳地，3、2、1，更佳地为0或1；
129.其中，x1与x之间、x与x2之间以肽键、肽接头(如1-15个氨基酸构成的柔 性接头)或其他连接子相连。
130.在本发明中，核心片段或疫苗多肽包括对seq id no:1中任一序列进行一个 或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸添加、一个或多个(如1-5个，优选地1-3 个)氨基酸的取代和/或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生 前的原始多肽具有基本相同的功能。
131.优选地，核心片段或疫苗多肽包括对seq id no:1经过1-3个氨基酸添加(优 选添加在n端或c端)、和/或1-2个氨基酸的取代(优选保守性氨基酸替换)并仍具 有与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
132.优选地，所述的保守性氨基酸替换根据表a进行氨基酸替换。
133.表a
[0134][0135][0136]
如本文所用，术语“肽集合”所述的肽集合由至少两种本发明疫苗多肽或其 衍生多肽构成。
[0137]
优选地，本发明所述的肽集合中至少含有2、3、4、5、6、7、8、9或10种 选自本发明第一方面所述的疫苗多肽或其衍生多肽(包括偶联肽)；更优选地，所述 肽集合至少含有一种选自seq id no.:1的疫苗多肽或其衍生多肽。此外，所述的 肽集合还包括可以除seq id no.:1以外的其他冠状病毒sars-cov-2的抗原肽或 蛋白。
[0138]
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物 质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化 的，但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0139]
如本文所用，“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它 蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化 本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一 的主带。
[0140]
本发明的多肽可以是重组多肽、或合成多肽，优选合成多肽。
[0141]
在本发明中，当疫苗多肽的序列较短(如≤70aa，更佳地≤60aa时)，可用化 学方法直接合成相关肽序列。
[0142]
当疫苗多肽的序列较长或以融合蛋白形式提供疫苗多肽时，也可以用重组法 来
大批量地获得相关肽序列。这通常是将编码所述抗原多肽或其融合蛋白的编码序 列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相 关的抗原多肽或融合蛋白。
[0143]
通用型th表位
[0144]
在本发明的疫苗多肽中，可含有一个或多个通用型th表位。
[0145]
在本发明中，通过引入通用型th表位，意外地发现可以有助于提高人群响应 率和免疫原性，并保留安全性、表位特异性等特点。
[0146]
优选地，在本发明中的通用型th表位序列是在人体中起作用和有高响应率的 通用型th表位序列。
[0147]
实验筛选的结果表明，一种优选的通用型th表位序列包括padre序列。
[0148]
更优选地，所述的padre序列包括akfvaawtlkaaa(seq id no:1中第1-13 位)。
[0149]
b细胞表位序列和t细胞表位
[0150]
在本发明的疫苗多肽中，可以含有至少一个b细胞表位序列和/或至少一个t 细胞表位。
[0151]
在本发明中，所述的b细胞表位序列和t细胞表位的长度没有特别限制，可 各自独立为10-20个氨基酸，较佳地为12-18个氨基酸。
[0152]
在另一优选例，所述抗原多肽中，除了parde序列和连接肽之外，其他的序 列衍生自s蛋白的rbm区域的氨基酸序列。
[0153]
在另一优选例中，所述的抗原多肽中的b细胞表位和/或t细胞表位具有衍生 自新型冠状病毒s蛋白的rbd区域的氨基酸序列，即抗原多肽中的z2和/或z3具 有衍生自rbd区域的rbm区域的氨基酸序列。
[0154]
药物组合物和给药方式
[0155]
本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防 性的(如疫苗)。本发明的药物组合物包括有效量的本发明的疫苗多肽或肽集合、或 用该疫苗多肽激活的免疫细胞(例如用本发明疫苗多肽致敏的树突状细胞或用树突 状细胞诱导的t细胞)，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0156]
在另一优选例中，所述由新型冠状病毒sars-cov-2引起的相关疾病选自下组： 呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
[0157]
在本发明中，这些(疫苗)组合物包含免疫性抗原(包括本发明疫苗多肽、肽集 合或其衍生物)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不 诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体的例子包括 (但并不限于)蛋白质、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技 术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
[0158]
此外，本发明的(疫苗)组合物还可含有额外的佐剂。代表性的疫苗佐剂包括 (但并不限于)以下种类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；合成佐剂，如人工合成 的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如 弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。
[0159]
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬 液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可 乳化或包封
在脂质体中，以增强佐剂效果。
[0160]
组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算 出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
[0161]
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静 脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、口服、或局部给药。
[0162]
使用(疫苗)组合物时，是将安全有效量的本发明疫苗多肽或肽集合施用于人， 其中该安全有效量通常至少约1微克肽/千克体重，而且在大多数情况下不超过约 8毫克肽/千克体重，较佳地该剂量是约1微克-1毫克肽/千克体重。当然，具体剂 量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0163]
本发明的主要优点包括：
[0164]
(a)本发明所采用的疫苗多肽能够在灵长动物等哺乳动物的机体内产生抗 sars-cov-2的s蛋白rbd(受体结合区域)的中和抗体，所述中和抗体可有效阻断 rbd与人ace2结合。
[0165]
(b)本发明的串联表位多肽具有优化的结构，出乎意料地本发明的串联表位多 肽具有和人ace2较高的结合能力，具有直接阻断sars-cov-2病毒的s蛋白和ace2 结合的潜能。
[0166]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:coldspring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0167]
实施例1基于s蛋白rbd的序列和结构解析的t/b细胞表位筛选及串联表 位多肽设计
[0168]
本发明人通过分析sars-cov-2的s蛋白rbd的序列和结构，通过多种计 算机辅助疫苗设计软件工具预测和分析了s蛋白的cd4 t/cd8 t细胞表位、线 性/构象b细胞表位、结构特征和相互作用关键位点。综合分析结果，经过筛 选并确定合适的t/b细胞抗原表位，并将这些表位与通用型th表位padre序 列串接，其中，表位之间通过四个甘氨酸连接保证互不干扰。
[0169]
具体地，本发明人以sars-cov-2病毒s蛋白中与人ace2相互作用的rbd 区域作为分析对象，确定rbd中与ace2发生相互作用的关键位点，如图1所 示。
[0170]
本发明人还利用allele frequency net database数据库统计分析获得世 界人群主要的hlaii类分子等位基因类型，并进一步预测分析了rbd序列中的 hlaii类分子结合肽，以此作为预测的cd4 t细胞表位，如图2所示。
[0171]
本发明人还进一步预测分析了rbd序列中的cd8 t细胞表位，如图3所示。
[0172]
本发明还利用discotope和bepipred软件，预测了rbd序列中的构象和 线性b细胞表位，如图4和图5所示。
[0173]
综合上述信息和分析，本发明人最终设计了多肽lp2。lp2引入了通用型 th表位padre序列并通过四个甘氨酸(gggg)串接了rbd区域的b细胞表位和t 细胞表位，t/b细胞表位根据其理化性质优劣筛选自上述预测的t/b细胞表位 区域。lp2的结构组成如图6所示，
所含b细胞表位和t细胞表位在sars-cov-2 的s蛋白rbd区域中的相对空间位置如图7所示，其氨基酸序列如下：
[0174]
lp2:akfvaawtlkaaaggggygfqptngvgyqpggggnylyrlfrksnlkpf(49个氨基 酸)(seq id no:1)
[0175]
lp2含有cd8

t细胞表位，提示有较好激发杀伤性t细胞抗病毒反应的潜 能；lp2含有与人群中24种主要的hlaii类分子类型高亲和力结合的cd4

t细 胞表位，提示可被人群中主要的hlaii分子提呈出来，为进一步克服表位受mhc 限制性的影响，引入通用型th表位padre序列，确保高的人群响应率和足够 的免疫原性，从而激发广泛的cd4

t细胞效应，并促进b细胞产生抗病毒中和 抗体；lp2含有线性和构象b细胞表位，提示可有效激活b细胞免疫反应。
[0176]
另外，lp2中所采用的padre序列(akfvaawtlkaaa)，利用blastp软件 比对其与人体蛋白氨基酸序列的相似度，设定e-threshold为10，未比对出任 何相似序列，这提示，所引入的padre序列用于免疫后诱发体内抗内源性蛋白 的抗体的风险较低。
[0177]
因此，从疫苗设计角度来看，本发明人的针对sars-cov-2的串联表位多 肽有助于克服传统多肽疫苗免疫原性低和人群响应率低的问题，并兼顾传统多 肽疫苗高特异性、高安全性和易于快速生产合成的优势。
[0178]
实施例2多肽的制备
[0179]
在本实施例中，应用全自动固相多肽合成仪，制备多肽lp2。
[0180]
实施例3 lp2多肽疫苗的免疫作用
[0181]
在本实施例中，采用实施例2制备的多肽lp2，在食蟹猴中进行接种免疫， 并评估lp2的免疫效果。
[0182]
将多肽lp2与佐剂(如titermax)混合制备免疫制剂，食蟹猴皮下多点注射 免疫，在第二次免疫后14天，采用bridging-elisa方法进行抗体滴度测定， 并进行测定抗血清对rbd与ace2结合的阻断能力。
[0183]
中和抗体采用竞争elisa方法检测，具体测定方法如下：10μg/ml的ace2 过夜包被酶标板，封闭后待用。以样品稀释缓冲液不同程度地稀释抗肽血清(1:128， 1:64，1:32，1:16、1:8和1:4)，其后将不同程度稀释后的抗血清与12μg/ml 的bio-rbd在37℃温育1小时，随后将100μl的反应混合液加入到上述封闭好 的ace2包被酶标板上的孔中，37℃温育1小时后，洗板，再加入1:10000稀释 的hrp-streptavidin a，37℃温育1小时，洗板后，加入tmb显色，终止后在 450nm波长下读板。
[0184]
结果
[0185]
如图8所示，采用lp2多肽疫苗免疫动物后，产生了较高滴度针对rbd的 抗体，显示lp2具备良好的免疫原性，可较好启动机体产生免疫应答。
[0186]
此外，采用lp2多肽疫苗所产生的抗血清具有阻断rbd与ace2结合的能 力，即具有阻断sars-cov-2病毒的感染作用(图9)。
[0187]
出乎意料的是，采用lp2多肽疫苗所制备的抗血清，在8-64倍的稀释倍 数下，可观察到显著地对rbd与ace2结合的阻断作用(如在8倍的稀释倍数下 的抑制率，略大于60％；在16倍的稀释倍数下的抑制率，大于40％)。
[0188]
与此相反，采用rbd免疫所产生的抗血清，在8-64倍的稀释倍数下，则 没有观察到
对rbd与ace2结合的阻断作用。一种合理的解释是，rbd免疫食蟹 猴后，并非没有产生中和抗体，但却产生了更多的可结合rbd的非中和抗体， 此类抗体在体外elisa检测实验中反而促进rbd形成网格结构与ace2的结合。 这提示，不具备表位特异性的rbd用于免疫会产生较多的非中和抗体，反而存 在促进sars-cov-2入侵的风险，而高表位特异性的lp2产生的主要为中和抗 体，可更为有效阻断sars-cov-2入侵，明显优于rbd免疫方案。
[0189]
实施例4 lp2与ace2体外结合实验
[0190]
在本实施例中，将lp2标记生物素，通过elisa法检测其与人ace2的结合能 力。
[0191]
具体测定方法如下：10ug/ml的ace2过夜包被酶标板，封闭后加入不同浓度 (1、0.5和0.25μg/ml)的生物素标记的多肽，37℃温育1.5小时后，加入1:5000 稀释的hrp-streptavidin a，37℃温育1小时，洗板后，加入tmb显色，终止后 在450nm波长下读板。
[0192]
结果表明，多肽lp2与ace2存在较强的结合能力(图10)，提示多肽lp2本身 即具有潜在的阻断作用。
[0193]
讨论
[0194]
多肽疫苗是从高免疫原性的蛋白中选取一个或多个抗原表位片段用于免疫。由 于多肽疫苗的氨基酸链较短，得益于多肽合成技术的成熟，其便于快速且大量的体 外合成和纯化，并易于确保每批产品的纯度和重复性。
[0195]
同时，基于计算机辅助疫苗设计可快速对新型病毒等引起的突发公共卫生问题 进行响应，预测并筛选合适的候选肽段用于疫苗开发。
[0196]
另外，多肽疫苗相较于其他种类疫苗表位明确、稳定性好、纯度高且具有较好 的安全性。然而，多肽疫苗由于氨基酸链长度较短，往往是10-30个氨基酸左右， 其也面临免疫原性较低的问题，往往需要进行修饰或辅以佐剂以产生较好的免疫反 应。
[0197]
多肽疫苗的设计需借助计算机辅助疫苗设计技术，往往需要综合分析靶蛋白的 t/b细胞表位以及结构和修饰信息。其中，cd8 t细胞表位可激活杀伤性t细胞来 发挥抗病毒作用，cd4 t细胞表位主要激活辅助性t细胞去激活b细胞产生抗病毒 抗体。线性和构象b细胞表位可直接激活b细胞产生抗体。
[0198]
sars-cov-2通过其表面spike glycoprotein(s蛋白)与人血管紧张素转换酶 2(angiotensin-convertion enzyme 2,ace2)蛋白结合，实现侵入宿主细胞。因此， s蛋白是covid-19疫苗设计的首选靶蛋白，以希望诱发体内产生具有阻断病毒入 侵作用的中和抗体。然而，目前已知的疫苗难以有效引发机体产生针对冠状病毒 sars-cov-2的保护性免疫反应。
[0199]
本发明人通过研究，意外地发现，基于筛选和序列优化后的冠状病毒 sars-cov-2的s蛋白的抗原多肽，设计了串联b细胞表位和t细胞表位以及padre 序列的疫苗多肽(如lp2)，可在包括灵长类动物的机体内有效诱导产生针对s蛋白 rbd区且有阻断作用的抗病毒抗体。此外，本发明的疫苗多肽(如lp2)具有优化的 结构，仍然保留和人ace2较好的结合作用，提示具有直接阻断s蛋白和ace2作用 的潜能。
[0200]
以lp2为例，本发明的抗原多肽通过表位串联延长到49个氨基酸，从而 增强了多肽的免疫原性。同时，通过将s蛋白中的cd4

t/cd8

t细胞表位和b 细胞表位串联，可较好诱发机体产生针对s蛋白rbd区且有阻断作用的抗病毒 抗体且激发杀伤性t细胞的抗病毒细胞免疫。此外，lp2中引入了padre序列， 该序列与绝大多数hlaii类分子有高亲和力，可使
绝大多数人群产生响应，并 提高免疫原性以及疫苗的接种响应率。
[0201]
本发明的串联表位多肽疫苗克服了传统多肽疫苗免疫原性低和人群响应 率低的问题，同时保留其安全性好、表位特异性高和易于合成的突出优势，表 现出优于普通短肽免疫方案和直接免疫rbd的作用和前景。
[0202]
因此，本发明的疫苗多肽可用于开发新型冠状病毒多肽疫苗。在人体引发细胞 免疫和体液免疫，从而用于预防和治疗冠状病毒sars-cov-2感染以及相关疾病， 包括新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,covid-19)。
[0203]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权 利要求书所限定的范围。