一种米酵菌酸复合抗原、米酵菌酸抗体及其制备方法和酶联免疫试剂盒与流程

1.本发明涉及食品毒素检测技术领域，尤其涉及一种米酵菌酸复合抗原、米酵菌酸抗体及其制备方法和试剂盒。


背景技术：

2.米酵菌酸(bongkrekicacid，ba)是椰毒假单胞菌(pseudomonascocovenenans)及其酵米面亚种(p.co
‑
covenenanssubsp.farinofermentans，简称椰酵假单胞菌)在适宜条件下产生的有毒代谢物之一。米酵菌酸的化学结构不同于一般细胞毒素的主要特点在于其化学本质不是大分子蛋白质，而是多不饱和脂肪二酸衍生物，其分子式为c
28
h
2807
,分子量为486，结构式为：
[0003][0004]
食入该毒素污染的食物可引起人或动物中毒，重者可致死亡。米酵菌酸是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品引起中毒的主要原因。因此，对食品中的米酵菌酸的检测越来越受到重视。但是目前市面上暂未出现高效的米酵菌酸抗体及相应的高效检测方法。
[0005]
因此，现有技术有待进一步改进。


技术实现要素：

[0006]
针对上述问题，本发明提供了一种米酵菌酸复合抗原、米酵菌酸抗体及其制备方法和酶联免疫试剂盒，该米酵菌酸复合抗原的免疫原性强，该单克隆抗体的效价高，对米酵菌酸的检测灵敏度高，可利用其制备米酵菌酸的检测试剂盒，广泛用于米酵菌酸的检测。
[0007]
为解决上述问题，本技术提供以下技术方案：
[0008]
第一方面，本技术提供一种米酵菌酸复合抗原，其连接方式如下：载体蛋白
‑
nh
‑
coo
‑
peg6
‑
nh
‑
coo
‑
ba，载体蛋白与氨基
‑
六聚乙二醇
‑
羧酸上的羧基偶联，然后氨基
‑
六聚乙二醇
‑
羧酸上的氨基与米酵菌酸上的羧基偶联。
[0009]
采用聚乙二醇作为连接臂，可以保证米酵菌酸不受蛋白大分子的空间位阻影响，从而更好的暴露米酵菌酸，产生免疫反应，从而显著提高抗原的免疫原性。
[0010]
第二方面，本技术提供一种上述米酵菌酸复合抗原的制备方法，该制备方法为：
采用氨基
‑
六聚乙二醇
‑
羧酸作为连接臂，将该连接臂、米酵菌酸与载体 蛋白进行偶联，得到米酵菌酸复合抗原。
[0011]
优选地，所述米酵菌酸复合抗原的制备方法包括以下步骤：
[0012]
连接臂的活化：取edc、nhs和氨基
‑
peg6
‑
羧酸混合，室温孵育，得到 混合物；优选地，edc、nhs和氨基
‑
peg6
‑
羧酸采用相同的物质的量；
[0013]
连接臂与载体蛋白的连接：将上述混合物缓慢加入到载体蛋白溶液中，室 温孵育；通过超滤除去未结合的载体蛋白以及氨基
‑
peg6
‑
羧酸，形成氨基
ꢀ‑
peg6
‑
载体蛋白复合物。
[0014]
米酵菌酸的活化：将edc、nhs和米酵菌酸混合，室温孵育1h，得到活 化的米酵菌酸；优选地，edc、nhs和米酵菌酸为相同物质的量；
[0015]
米酵菌酸与载体蛋白的连接：将活化的米酵菌酸加入到前述制备得到的氨 基
‑
peg6
‑
载体蛋白复合物中，室温孵育；超滤除去未结合的米酵菌酸后，最 终得到米酵菌酸复合抗原。
[0016]
其中，edc为1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐，其作为羧基 活化试剂；nhs为n
‑
羟基琥珀酰亚胺，作为保护剂使用。
[0017]
优选地，所述载体蛋白为血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)或人 血清白蛋白。其他实施方式中载体蛋白也不限于这三种载体蛋白。
[0018]
优选地，所述超滤过程中采用分子量为3～10kd的超滤管。
[0019]
第三方面，本技术还提供一种米酵菌酸单克隆抗体，其是利用上述的米酵 菌酸复合抗原制备而成。
[0020]
本发明还提供上述米酵菌酸单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步 骤：
[0021]
米酵菌酸复合抗原注射小鼠腹腔、足底以及背部皮下，间隔两周免疫一次， 总共免疫三次，第三次免疫1周后取小鼠尾血测效价，并于融合前三天，腹 腔加强注射；接着取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，筛选出 阳性杂交瘤细胞株，进一步制备得到米酵菌酸单克隆抗体。
[0022]
第四方面，本技术还提供一种米酵菌酸的酶联免疫试剂盒，其包括：如前 述的米酵菌酸单克隆抗体。
[0023]
优选地，所述酶联免疫试剂盒包括米酵菌酸单克隆抗体、米酵菌酸标准品、 酶标抗体(如山羊抗小鼠igg
‑
hrp)、洗液、底物显色液、终止液；优选地， 该试剂盒还包括包被有包被原的酶标板。
[0024]
第五方面，本技术还提供一种米酵菌酸的检测方法，其包括以下步骤：
[0025]
s1、将待测样品进行前处理；
[0026]
s2、使用前述的米酵菌酸酶联免疫试剂盒对经过前处理的待测样本进行酶 联免疫法检测；以及
[0027]
s3、分析检测结果，判断样品中是否含有米酵菌酸。
[0028]
优选地，检测方法具体包括以下步骤：
[0029]
①
取适量的酶标板，分别加入米酵菌酸标准品和样品，然后每个孔中分别 加入米酵菌酸抗体，室温孵育20～40min。
[0030]
②
采用洗液洗板，共洗三遍，然后加入酶标抗体，室温孵育20～40min。
[0031]
③
采用洗液洗板，共洗三遍，然后加入显色底物液，室温孵育5～20min。
[0032]
④
每孔加入终止液，然后用酶标仪在450nm下读数。
[0033]
⑤
根据读数，建立标准曲线，然后对照标准曲线计算样本中米酵菌酸浓度。
[0034]
本发明具有以下有益效果：
[0035]
1、本发明抗原制备采用聚乙二醇作为连接臂，可以保证米酵菌酸不受蛋 白大分子的空间位阻影响，从而更好的暴露米酵菌酸，产生免疫反应，从而 显著提高抗原的免疫原性。与不加连接臂的抗原相比，本技术提供的米酵菌 酸复合抗原的免疫原性更强，其免疫小鼠尾血效价提高了4倍，其免疫小鼠 灵敏度也得到显著提升。
[0036]
2、由上述米酵菌酸复合抗原制备的单克隆抗体的效价和检测灵敏度都得 到很大提升，其效价可高达128000，而该抗体对米酵菌酸检测灵敏度达到 10μg/l，因此，利用该抗体的酶联免疫试剂盒具有很好的应用前景和市场竞 争力。
具体实施方式
[0037]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明 中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设 备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无 特别说明，均为本领域的常规方法。
[0038]
实施例1米酵菌酸复合抗原的制备
[0039]
1、实验方法：
[0040]
(1)：连接臂的活化：取等物质的量(各1～5
×
10
‑4mm)的edc、nhs 和氨基
‑
peg6
‑
羧酸混合，室温孵育1h；
[0041]
(2)：连接臂与klh(血蓝蛋白)连接：将上一步得到的混合物缓慢加入到 5
‑
10mg的klh溶液(1
‑
5mg/ml)中，室温孵育2h；采用分子量为3kd的超滤 管进行超滤，除去未结合的连接臂以及氨基
‑
peg6
‑
羧酸，形成氨基
‑
peg6
‑
klh 复合物。
[0042]
(3)米酵菌酸活化：取等物质的量(各1～5
×
10
‑3mm)的edc、nhs和 米酵菌酸混合，室温孵育1h，得到活化的米酵菌酸；
[0043]
(4)米酵菌酸与klh连接：将活化的米酵菌酸加入到5
‑
10mg(1
‑
5mg/ml) 的氨基
‑
peg6
‑
klh中，室温孵育2h；采用分子量为3kd的超滤管进行超滤， 除去未结合的米酵菌酸，最终形成ba
‑
peg6
‑
klh复合物，即米酵菌酸复合 抗原。
[0044]
该抗原结构为：klh
‑
nh
‑
coo
‑
peg6
‑
nh
‑
coo
‑
ba；klh与氨基
‑
六聚乙 二醇
‑
羧酸上的羧基偶联，然后氨基
‑
六聚乙二醇
‑
羧酸上的氨基与米酵菌酸上 的羧基偶联
[0045]
其他实施例中，可将bsa替换klh，按照上述相同方法制备对应的米酵 菌酸复合抗原(ba
‑
peg6
‑
bsa复合物)。
[0046]
实施例2米酵菌酸单克隆抗体的制备
[0047]
1、免疫
[0048]
取实施例1制备的米酵菌酸复合抗原注射小鼠腹腔、足底以及背部皮下， 间隔两周免疫一次，总共免疫三次，第三次免疫1周后，取尾血测效价，并 于融合前三天，腹腔加强注射。具体免疫操作和田间见下表1。
[0049]
表1免疫条件
[0050][0051]
2、细胞融合
[0052]
取上述经过免疫操作后的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)进行融 合，筛选出阳性杂交瘤细胞株，得到米酵菌酸单克隆抗体，具体操作如下：
[0053]
1)取一支小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行复苏后传代，计数后按比例传代生 长3天；
[0054]
2)将状态良好的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0细胞轻轻地从培养皿上吹打下来， 并将其转移至50ml离心管中；将小鼠摘眼球取血后拉颈处死，放入75％的酒 精中浸泡5min：
[0055]
3)在平皿中倒入少量不含血清的dmem培养基，将细胞筛及注射器内芯 放平皿中：
[0056]
4)在无菌状态下取出小鼠脾脏，置于细胞筛上，用注射器内芯轻轻地将 脾脏充分碾碎，再将碾好的细胞吸到装有sp2/0细胞的离心管中，室温1200rpm 离心5min；
[0057]
5)取小鼠的胸腺并碾碎，转移至15ml离心管中，再加入1mlhat培养基， 于培养箱中(37℃，5％co2)进行培养(所述胸腺细胞作为饲养细胞)；
[0058]
6)将步骤4)离心好的细胞丢弃上清液，用不含血清的dmem培养基将 细胞小心轻柔地吹匀，再次于室温1200rpm离心5min；
[0059]
7)将步骤6)离心好的细胞弃上清液，轻拍离心管底使细胞充分悬浮，再 将离心管置于37℃温水浴中，并在1min内缓慢加入1ml聚乙二醇(peg4000)， 静置1min后，在2min内缓慢加入2ml不含血清的dmem培养基，接着在 2min内缓慢加入8ml不含血清的dmem培养基，室温1000rpm离心5min；
[0060]
8)步骤7)离心细胞弃上清，加入10ml血清，并小心地将细胞吹匀，加 入步骤5)已制备好的胸腺细胞，再加入25ml无菌的半固体培养基(mc)， 充分混匀后倒入20个细胞培养皿中，2ml一皿并置于湿盒中，于培养箱中 (37℃，5％co2)培养。
[0061]
9)在第10天左右，开始挑克隆，此时细胞团大小肉眼可见，在显微镜下 能够很好的分辨。培养过程中，注意防止培养基颜色变黄，导致营养不够， 细胞团出现死亡。若细胞融合团较多，可提前挑克隆。
[0062]
挑选单克隆细胞团于96孔细胞培养板中培养(事先用含小鼠胸腺细胞的25％ht培养基进行铺板，50μl/孔)，第2天换液一次，第4天细胞已铺满96 孔板。
[0063]
3、阳性杂交瘤细胞株的筛选
[0064]
此步骤是采用间接elisa方法对上一步骤的细胞培养板中的细胞株上清 液中的抗体进行检测，从而实现对阳性杂交瘤细胞的筛选。具体步骤如下：
[0065]
(1)实验方法：
[0066]
a、用包被液(cbs)稀释ba
‑
peg6
‑
bsa，使得浓度为1μg/ml，100μl/ 孔加入到96孔酶标板中进行包被，于4℃包被过夜后用pbst洗涤液洗涤3 次。
[0067]
b、用封闭液(5％脱脂奶粉/pbs)封闭，200μl/孔，37℃孵育2h后用洗 涤液洗涤3次。
[0068]
c、分别于相应孔中加入一抗(即上一步骤的96孔板中的杂交瘤细胞培养 上清液)，阴性对照(sp2/0细胞的培养上清液)，空白对照(pbs溶液)，阳 性对照(pbs稀释1000倍阳性血清)，均为100μl/孔，37℃孵育45min后用 洗板液洗涤3次。
[0069]
d、加入pbs稀释1000倍的酶标二抗(山羊抗小鼠igg
‑
hrp)100μl/孔， 37℃孵育45min后用洗板液洗涤3次。
[0070]
e、加显色液(tmb)100μl/孔显色时间为10
‑
15min左右。
[0071]
f、加入终止液(2m浓硫酸)50μl/孔，终止反应。
[0072]
g、酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
[0073]
(2)实验结果及分析
[0074]
将a
450
值为阴性对照的2.1倍的细胞株判定为阳性杂交瘤细胞株，对于一 筛呈阳性的8株克隆株进行进一步培养后，按照上述同样的方法进行第二次 筛选，最终得到2株阳性杂交瘤细胞株。
[0075]
4、阳性克隆株亚类的鉴定
[0076]
对上述筛选得到的2株阳性杂交瘤细胞株进行进一步的亚类的鉴定，采用 现有的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行鉴定，具体鉴定方法如下：
[0077]
1)用包被液(cbs)稀释包被抗体至0.5μg/ml，100μl/孔，4℃孵育过夜。
[0078]
2)pbst洗2次，加入封闭液，200μl/孔，37℃孵育1h。
[0079]
3)pbst洗3次，加入阳性杂交瘤上清液，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0080]
4)pbst洗3次，相应孔中分别加入封闭液(2％bsa 3％蔗糖于pbs中) 1:1000(轻链：κ，λ)或1:2000(重链：m,g1,g2a,g2b,a)稀释的各亚类酶 标二抗，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0081]
5)pbst洗3次，加入显色溶液，100μl/孔，5min后加入终止液，50μl/ 孔，10
‑
20min内用酶标仪测450nm处吸光值。
[0082]
(2)鉴定结果
[0083]
检测鉴定两株细胞分泌的mcab均为igg1，将这两株细胞分别命名为1c3 和5d8。
[0084]
5、单克隆抗体的制备
[0085]
取上述2种杂交瘤细胞株1c3和5d8分别制备单克隆抗体，并将杂交瘤 细胞株1c3分泌的单克隆抗体命名为抗体1c3，杂交瘤细胞株5d8分泌的单 克隆抗体命名为抗体5d8。具体方法如下：
[0086]
5.1腹水制备
[0087]
1)将恒温水浴锅的温度调节至37℃
‑
40℃。
[0088]
2)将液氮罐中取出冻存的细胞株，立即放入37℃
‑
40℃温水中迅速晃动， 直至完全溶解。
[0089]
3)将细胞冻存悬液转移到离心管中，加入10ml培养基(dmem 20％新 生牛血清)，轻轻吹打混匀。
[0090]
4)将细胞悬浮液于室温1000rpm/min下离心5min，弃上清液。
[0091]
5)向细胞沉淀内加入培养基，轻轻吹打混匀后，转移到细胞培养皿内。 置于37℃细胞培养箱中培养。
[0092]
6)将细胞培养到对数生长期，pbs溶液洗涤并对细胞计数。
[0093]
7)小鼠腹腔在接种一周前采用腹腔注射方式打蜡油，500μl/balb/c小鼠。
[0094]
8)采用腹腔注射方式接种细胞，每只小鼠注射1ml(细胞量5*105‑
10*105个/ml)。
[0095]
9)一周后取腹水，5000rpm/min下离心后10min，取上清液，于
‑
20度保 存。
[0096]
5.2抗体纯化
[0097]
1)腹水样本预处理：用偶联缓冲液(20mm磷酸钠溶液，ph7.0)将解冻 后的腹水上清液稀释3倍，1200rpm/min，4℃离心10min，再用0.22um滤膜 过滤，以除去脂肪，细胞残渣及小颗粒物质，作为样品进行后续步骤。
[0098]
2)平衡：用10倍抗体亲和预装柱体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速 为1ml/min。
[0099]
3)上样：柱中加入样品，收集流出液，保持流速为1ml/min。
[0100]
4)洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为1ml/min
[0101]
5)洗脱：用5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸钠溶液，ph3.5)洗脱 抗体，收集于离心管中，保持流速为1ml/min，之后立即用1m ph9.0的tris
‑
hcl缓冲液将收集液的ph调整至7.0.
[0102]
6)透析：使用0.01m pbs缓冲液将抗体透析过夜，换液3次。
[0103]
5.3对纯化后的抗体效价的检测
[0104]
采用间接elisa方法检测纯化抗体的效价，具体操作步骤如下：
[0105]
1)用包被液稀释ba
‑
peg6
‑
bsa使其浓度为1μg/ml，100μl/孔加入到 96孔酶标板中进行包被，于4℃过夜后用pbst洗涤液洗涤3次。
[0106]
2)用封闭液(2％bsa/pbs)封闭，200μl/孔，37℃孵育2
‑
4h后用洗涤液 3次。
[0107]
3)将纯化后的2株抗体(1c3、5d8)，用pbs分别稀释成2000倍，再作 2倍梯度稀释，分别为1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，共8个梯度。分别于相应孔中加入一抗(上述各浓度梯度的抗体)， 和pbs溶液，均为50μl/孔，37℃孵育1
‑
4h后用洗液洗涤3次。
[0108]
4)加入pbs稀释1000倍的酶标抗体(山羊抗小鼠igg
‑
hrp)，100μl/孔， 37℃孵育1
‑
4h后用洗液洗涤3次。
[0109]
5)加入显色液，100μl/孔，显色时间为5
‑
15min左右。
[0110]
6)加入终止液(2m浓硫酸)，50μl/孔，终止反应。
[0111]
7)酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
[0112]
表2间接法测抗体效价数据
[0113][0114]
实验结果及分析：
[0115]
从表2的检测结果可知，1c3抗体的效价为128000，5d8抗体的效价为 64000。
[0116]
实施例3米酵菌酸单克隆抗体的灵敏度检测
[0117]
本实施例采用1c3抗体建立米酵菌酸检测曲线，具体实验方法如下：
[0118]
1)用包被液稀释ba
‑
peg6
‑
bsa使其浓度为1μg/ml，100μl/孔加入到 96孔酶标板中进行包被，于4℃过夜后用pbst洗涤液洗涤3次。
[0119]
2)用封闭液(2％bsa/pbs)封闭，200μl/孔，37℃孵育2
‑
4h后用洗涤液 3次。
[0120]
3)将纯化后的5d8抗体，用pbs分别稀释128000倍。米酵菌酸标准品 用pbs分别稀释到浓度0,10,30,90,270,810μg/l。分别于相应孔中加入一抗， 米酵菌酸标准品溶液，均为50μl/孔，37℃孵育1
‑
4h后用洗液洗涤3次。
[0121]
4)加入pbs稀释1000倍的酶标抗体(山羊抗小鼠igg
‑
hrp),100μl/孔， 37℃孵育1
‑
4h后用洗液洗涤3次。
[0122]
5)加入显色液，100μl/孔，显色时间为5
‑
15min左右。
[0123]
6)加入终止液(2m浓硫酸)，50μl/孔，终止反应。
[0124]
7)酶标仪测450nm处吸光值，记录保存数据。
[0125]
表3间接竞争elisa测试不同浓度米酵菌酸标准品od值以及b/b0
[0126][0127]
其中，b/b0是指不同浓度标准品测试孔od值与含量为0的标准品测试孔 od值得比值。
[0128]
实验结果及分析
[0129]
从上表3可看出，当米酵菌酸含量为10μg/l时，其b/b0值为82.13％，其 检测od与含0μg/l浓度的米酵菌酸测试孔od值有明显差异，因此该抗体 对米酵菌酸检测灵敏度可达10μg/l。
[0130]
实施例4无peg间隔臂抗原与本技术的复合抗原的免疫效果对比实验
[0131]
1、实验方法：
[0132]
本实施例中，以实施例1制备的米酵菌酸复合抗原ba
‑
peg6
‑
klh作为实 验组，以无
peg6间隔臂的抗原作为对照组。
[0133]
其中，无peg6间隔臂的抗原的制备方法与间隔臂类似，采用等物质的量 的edc、nhs直接活化米酵菌酸的羧基，然后与klh蛋白质耦合，形成 ba
‑
klh免疫原，条件参照实施例1，制备得到的抗原为ba
‑
klh。
[0134]
将对照组的ba
‑
klh免疫小鼠，免疫过程与本技术的ba
‑
peg6
‑
klh的免 疫过程相同，具体方法参照实施例2。免疫三周后，分别采实验组和对照组 的小鼠尾血进行效价和灵敏度检测，方法参照前述实施例。
[0135]
两种抗原的血清效价和灵敏度见下表4和表5。
[0136]
表4两种抗原免疫小鼠血清效价对比
[0137][0138]
表5两种抗原免疫小鼠血清灵敏度对比
[0139][0140]
2、实验结果与分析
[0141]
从表4可以看出，对照组的ba
‑
klh免疫小鼠的尾血效价为16000，而本 申请的实验组ba
‑
peg6
‑
klh免疫小鼠尾血的效价为64000。从表5可以看出， 对照组的ba
‑
klh免疫小鼠灵敏度为90μg/l，而实验组的ba
‑
peg6
‑
klh免 疫小鼠灵敏度为10μg/l。
[0142]
从上述结果可知，本技术提供的米酵菌酸复合抗原的免疫原性更强，其效 价提高了4倍，其免疫小鼠灵敏度也得到显著提升，具有很好的商业价值和 应用前景。
[0143]
实施例5米酵菌酸的酶联免疫试剂盒及应用方法
[0144]
本实施例提供一种米酵菌酸的酶联免疫试剂盒及米酵菌酸的检测方法，方 案如下：
[0145]
1、米酵菌酸的酶联免疫试剂盒：
[0146]
包括酶标抗体试剂、前述实施例制备的米酵菌酸单克隆抗体、米酵菌酸标 准品、
洗液、底物显色液、终止液；优选地，还包括包被有包被原的酶标板。
[0147]
2、利用上述试剂盒进行米酵菌酸的检测，检测方法如下：
[0148]
①
取适量的酶标板，分别加入50μl的米酵菌酸标准品和样品，然后每个 孔中分别加入50μl米酵菌酸单克隆抗体，室温孵育30min。
[0149]
②
采用洗液洗板，每孔300μl洗液，共洗三遍，然后加入酶标抗体，每 孔加入100μl，室温孵育30min。
[0150]
③
采用洗液洗板，每孔300μl洗液，共洗三遍，然后加入显色底物液， 每孔加入100μl，室温孵育10min。
[0151]
④
每孔加入50μl终止液，然后用酶标仪在450nm下读数。
[0152]
⑤
根据读数，建立标准曲线，然后对照标准曲线计算样本中米酵菌酸浓度。
[0153]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案 及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明 所附的权利要求的保护范围。