一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法与流程

diarrhea virus，bvdv）、甲型肝炎病毒 （hepatitis a virus, hav）、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, hiv)等，不影响制品质量，蛋白回收率高，且未引入其他病毒灭活方法相关的有机试剂杂质，无需去除有机物的步骤。但是，膜过滤法去除病毒的纳米膜成本非常高，1平方米的纳米膜需数万元，需要摸索一个最优条件，提高纳米膜的过滤通量，即提高单位膜面积可有效过滤蛋白的总量，最大程度降低生产成本。《一种从血浆分离组分ⅰ ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法》（cn102250240b），《一种静注免疫球蛋白的生产工艺》（cn108101981b），均为人来源血液制品igg病毒去除相关专利，其工艺为低温乙醇沉淀法，且其为待除病毒的目标蛋白为igg（150kd）。目前，国内外还没有见到马血来源的抗血清（f (ab’)2）约（100kd）用纳米膜的方法除病毒的报道。
8.纳米膜过滤可同时除去脂包膜和非脂包膜病毒，且不影响制品的质量，但是成本高昂。本领域亟需研发一种低成本的抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法。
9.

技术实现要素：

10.本发明要解决的技术问题是提供一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法，为了解决上述纳米膜成本高昂的问题，通过大量试验，得到一个最优的条件，提高纳米膜对抗蛇毒血清工艺样品的过滤通量，即提高单位膜面积可有效过滤蛋白的总量，大大降低生产成本，对提高抗海蛇毒血清制品去除病毒效率，加快纳米膜过滤在抗海蛇毒血清生产中的应用具有重要意义。
11.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤的最优条件，包括如下步骤：（1）制备抗海蛇毒血清层析流穿液，包括：获得血浆；胃蛋白酶消化；硫酸铵第一次沉淀；硫酸铵第二次沉淀；板框压滤；明矾吸附；板框压滤；上清液超滤浓缩脱盐；离子交换柱层析；收集层析流穿液；（2）控制纳米膜过滤的环境温度为20-28℃，将层析流穿液配制成一定浓度、一定处方的溶液，该溶液组成为8-12mm 磷酸盐缓冲液，1.5-4.5g/l 甘氨酸，2-10mm 氯化钠；所述溶液的ph值为6.5-7.5；控制蛋白浓度为20-40g/l；（3）按照步骤（2）的条件进行纳米膜过滤。
12.作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述上清液超滤浓缩脱盐所用超滤溶液的溶液构成为8-12mm 磷酸盐缓冲液，ph 6.5-7.5，更优选为9-11mm 磷酸盐缓冲液，ph 6.8-7.2。超滤是将蛋白的溶液组成置换成为超滤的溶液一致的成分，可去除溶液组分中其他有机试剂和无机试剂，以及部分小分子蛋白。另外层析后收集流穿液，流穿液组成基本和超滤溶液一致。因此，控制超滤溶液和层析平衡液保持一致，直接影响纳米膜过滤的溶液构成。
13.作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述离子交换柱层析采用的层析平衡液的溶液构成为8-12mm 磷酸盐缓冲液，ph 6.5-7.5，更优选为9-11mm 磷酸盐缓冲液，ph 6.8-7.2。
14.作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述胃蛋白酶消化的ph值为3.0-4.0。
15.作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述硫酸铵第一次沉淀采用的硫酸铵浓
度为3~15%；所述硫酸铵第二次沉淀采用的硫酸铵浓度为20~40%。
16.作为本发明优选的技术方案，步骤（1）中，所述明矾吸附采用的明矾浓度为0.2~10%。
17.作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述的纳米膜过滤的最佳环境温度为21-23℃。温度对纳米膜过滤有较大影响，温度过低，样品粘度高，过滤速度减慢，温度过高，可能影响蛋白的结构，容易形成大分子多聚体，影响纳米膜过滤效率。
18.作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述蛋白浓度更优选为25-35 g/l。蛋白浓度在纳米膜过滤参数中是重要因素，蛋白浓度过低，可能过滤速度衰减较慢，但纳米膜过滤的时间将很长（一般控制在10小时内），可能长达20-30小时，对于工业化生产来说时间成本较高，且有细菌等微生物污染的风险。若蛋白浓度过高，可能导致高浓度蛋白将纳米膜孔堵塞，影响过滤速度。
19.作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述的溶液组成更优选为9-11mm 磷酸盐缓冲液，2-3g/l 甘氨酸，5-8mm 氯化钠。甘氨酸可以起到稳定蛋白结构的作用，磷酸盐为溶液提供一定的缓冲能力，适量的磷酸盐缓冲液和氯化钠可以提供一定的离子强度，有利于蛋白维持其构象，能够提高纳米膜的过滤速率。
20.作为本发明优选的技术方案，步骤（2）中，所述溶液ph值更优选为6.8-7.2。在磷酸盐提供缓冲能力的前提下，控制ph值，可使蛋白保持较天然的空间结构，保持蛋白的抗海蛇毒素功能（中和毒素），并有利于提升纳米膜过滤的效率。
21.作为本发明优选的技术方案，步骤（3）具体为：经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤。更优选为，所述纳米膜过滤采用20nm纳米膜过滤9小时。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过大量试验，尝试不同溶液条件组合，筛选得到一个最优的处方和环境温度，提高纳米膜的对抗蛇毒血清工艺样品的过滤通量，即提高单位膜面积可有效过滤蛋白的总量，10小时内，每平方米膜面积可以过滤5.5kg以上蛋白量，蛋白回收率达到98%以上。
23.本发明创新点在于：（1）通过纳米膜过滤去除病毒的方法应用于马血浆制品抗海蛇毒血清，既可去除病毒也不会引入多余的有机物等杂质，不影响制品的质量。
24.（2）通过试验得到最佳的纳米膜过滤的样品温度。
25.（3）由于纳米膜过滤的影响因素复杂，试验的数量较多，我们通过大量试验摸索获得一个最优条件，大幅度提高可过滤的蛋白量，降低生产的成本，加快纳米膜技术用于抗海蛇毒血清的产业化。
附图说明
26.图1为本发明实施例中工艺流程图。
具体实施方式
27.本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
28.实施例1 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法步骤如下：一、按照本发明图1中工艺流程，进行抗海蛇毒血清层析流穿液的制备，具体包括如下步骤;1、获得血浆；2、胃蛋白酶消化（ph3.5）；3、硫酸铵第一次沉淀（硫酸铵浓度为7%（质量体积比w/v））；4、硫酸铵第二次沉淀（硫酸铵浓度为30%（w/v））；5、板框压滤；6、明矾吸附（明矾浓度为6%（w/v））；7、板框压滤；8、上清液超滤浓缩脱盐；该超滤步骤中，超滤溶液为9.5mm 磷酸盐缓冲液，ph 值为7.1；9、离子交换柱层析；该层析步骤中，层析平衡液为9.5mm 磷酸盐缓冲液，ph值为 7.1；10、收集流穿液。
29.二、控制纳米膜过滤温度为23℃，将层析流穿液配制成一定浓度，一定处方的溶液，该溶液组成为9.5mm磷酸盐缓冲液，2.5 g/l 甘氨酸，7.5mm 氯化钠，控制ph 值为7.1；控制蛋白浓度为30g/l。
30.三、按照步骤二的优化条件进行纳米膜过滤1、经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤；2、样品经20nm纳米膜过滤9小时后，样品过滤通量为每平方米的纳米膜，可过滤蛋白190l，即过滤通量190 l/m2膜，折合蛋白5.7kg/m2膜，通过测定纳米膜过滤前后蛋白浓度和体积，蛋白回收率为98.5%。生产规模层析流穿液约150l，蛋白浓度30g/l，折合蛋白4.5kg，仅用1平方米的纳米膜即可，且可有28.9%的过滤余量。
31.实施例2 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法步骤如下：一、按照本发明图1中工艺流程，进行抗海蛇毒血清层析流穿液的制备，具体包括如下步骤;1、获得血浆；2、胃蛋白酶消化（ph4.0）；3、硫酸铵第一次沉淀（硫酸铵浓度为15%（w/v））；4、硫酸铵第二次沉淀（硫酸铵浓度为40%（w/v））；5、板框压滤；6、明矾吸附（明矾浓度为10%（w/v））；7、板框压滤；8、上清液超滤浓缩脱盐；该超滤步骤中，超滤溶液为9.5mm 磷酸盐缓冲液，ph 值为7.1；9、离子交换柱层析；该层析步骤中，层析平衡液为9.5mm 磷酸盐缓冲液，ph值为 7.1；
10、收集流穿液。
32.二、控制纳米膜过滤温度为20℃，将层析流穿液配制成一定浓度，一定处方的溶液，该溶液组成为8mm 磷酸盐缓冲液，1.5g/l 甘氨酸，2mm 氯化钠，控制ph 值为6.5；控制蛋白浓度为20g/l。
33.三、按照步骤二的优化条件进行纳米膜过滤1、经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤；2、样品经20nm纳米膜过滤9小时后，样品过滤通量为每平方米的纳米膜，可过滤蛋白190l，即过滤通量190 l/m2膜，折合蛋白5.7kg/m2膜，通过测定纳米膜过滤前后蛋白浓度和体积，蛋白回收率为98.5%。生产规模层析流穿液约150l，蛋白浓度30g/l，折合蛋白4.5kg，仅用1平方米的纳米膜即可，且可有28.9%的过滤余量。
34.实施例3 一种抗海蛇毒血清纳米膜过滤方法步骤如下：一、按照本发明图1中工艺流程，进行抗海蛇毒血清层析流穿液的制备，具体包括如下步骤;1、获得血浆；2、胃蛋白酶消化（ph3.0）；3、硫酸铵第一次沉淀（硫酸铵浓度为3%（w/v））；4、硫酸铵第二次沉淀（硫酸铵浓度为20%（w/v））；5、板框压滤；6、明矾吸附（明矾浓度为0.2%（w/v））；7、板框压滤；8、上清液超滤浓缩脱盐；该超滤步骤中，超滤溶液为9.5mm 磷酸盐缓冲液，ph 值为7.1；9、离子交换柱层析；该层析步骤中，层析平衡液为9.5mm 磷酸盐缓冲液，ph值为 7.1；10、收集流穿液。
35.二、控制纳米膜过滤温度为28℃，将层析流穿液配制成一定浓度，一定处方的溶液，该溶液组成为12mm 磷酸盐缓冲液，4.5g/l 甘氨酸，10mm 氯化钠，控制ph 值为7.5；控制蛋白浓度为40g/l。
36.三、按照步骤二的优化条件进行纳米膜过滤1、经0.1微米预过滤器预过滤后，将样品加至纳米膜过滤的容器中，通过氮气控制容器压力3bar，进行纳米膜过滤；2、 样品经20nm纳米膜过滤9小时后，样品过滤通量为每平方米的纳米膜，可过滤蛋白190l，即过滤通量190 l/m2膜，折合蛋白5.7kg/m2膜，通过测定纳米膜过滤前后蛋白浓度和体积，蛋白回收率为98.5%。生产规模层析流穿液约150l，蛋白浓度30g/l，折合蛋白4.5kg，仅用1平方米的纳米膜即可，且可有28.9%的过滤余量。