靶向CD38的单链抗体、全人源嵌合抗原受体、制备方法和应用与流程

靶向cd38的单链抗体、全人源嵌合抗原受体、制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及细胞免疫学领域，具体涉及一种靶向cd38的单链抗体、全人源嵌合抗原受体、制备方法和应用。


背景技术：

2.过继细胞治疗(adoptive cell therapy，act)是生物治疗技术的一种，对自体免疫细胞(主要是t细胞)进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患者以达到治疗目的方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种治疗方式，在临床治疗中受到广泛应用。过继细胞治疗广泛应用的主要是：淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，lak)与il-2联合治疗晚期恶性肿瘤取得了一定疗效；肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，til)临床试验中治疗转移性黑色素瘤取得了较好的效果；细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，cik)，目前国内开展较多的临床试验，对肝癌、肺癌等肿瘤取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化t细胞，t细胞活化需要两种活化信号，即t细胞表面的tcr-cd3与mhc
-ⅰ
分子结合为活化的第一信号，决定t细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；t细胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号，决定t细胞增殖。但肿瘤细胞、肿瘤微环境可下调mhc、配体分子，从而抑制t细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。因此需要进行基因改造，主要有两种方式：基因转导tcr(t cell receptor，tcr)和嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)。
3.嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)简称car，是模拟tcr功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，胞内信号域通常为cd3ζ链，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1bb，cd28。肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。虽然car-t治疗肿瘤已经显现出了一定的肿瘤清除能力，尤其是cd19-car在血液系统肿瘤方面的治疗取得了突破性的进展，但是car-t治疗仍然还存在一系列问题仍需进一步探索解决：1、缺少理想的肿瘤抗原作为靶点；2、肿瘤介导的免疫抑制；3、car-t疗法的严重毒副作用。
4.多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，简称mm，是浆细胞异常增生的恶性肿瘤，一种无法治愈的血液恶性肿瘤，可影响骨髓中白细胞、红细胞和干细胞的生成。骨髓中发生癌变的浆细胞称为骨髓瘤细胞，它在骨髓中大量增殖，替代了骨髓中正常的细胞，破坏正常的免疫系统，并抑制正常的造血功能，进一步损伤骨骼及软组织(神经和肌肉等)等的功能。在美国，多发性骨髓瘤是继非霍奇金淋巴瘤的血液系统第二大恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的1％，占血液系统恶性肿瘤的13％，占因恶性肿瘤死亡的2％。平均发病年龄男性62岁，女性61岁，40岁以下患者仅占2％。
5.cd38在多发性骨髓瘤细胞上均一性地高表达，而在正常淋巴细胞和骨髓细胞以及一些非造血起源的组织上低表达，是多发性骨髓瘤的特异性抗原。由于cd38在mm上的高表达，理论上以cd38为靶标的免疫治疗具有更安全有效的治疗效果，国外也已经在进行以
cd38为靶标的靶向药物如(如daratumumab、isatuximab、mor202)的研发，但是功效均很有限并且仍有安全性问题的发生；因此需要寻找特异性更好、更有效的靶向cd38的新疗法，目前虽然有一些靶点的car正在试验正在进行，但是用于治疗mm的car相对较少，在car性能的稳定性和安全性上仍需进一步的改造试验，如何选择更稳定适合的scfv(单链抗体)也是car研究中未能解决的关键问题，所以一种更安全有效的以cd38为靶点的cd38-car的研发制备是极有必要的。


技术实现要素：

6.本发明的目的是解决现有技术中以cd38为靶标的靶向药物的稳定性和安全性的问题。
7.为了达到上述目的，本发明提供了一种适中性且特异性识别cd38抗原的单链抗体，所述的单链抗体包含：重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区包括三个互补决定区：hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述的hcdr1的氨基酸序列包括seq id no：2所示的序列；所述的hcdr2的氨基酸序列包括seq id no：3所示的序列；所述的hcdr3的氨基酸序列包括seq id no：4所示的序列；所述的轻链可变区包括三个互补决定区：lcdr1、lcdr2、lcdr3，所述的lcdr1的氨基酸序列包括seq id no：5所示的序列；所述的lcdr2的氨基酸序列包括seq id no：6所示的序列；所述的lcdr3的氨基酸序列包括seq id no：7所示的序列。
8.本发明还提供了一种靶向cd38的全人源嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包含特异性识别cd38抗原的单链抗体，所述的单链抗体的氨基酸序列包括seq id no：1，或与seq id no：1具有95-99％同一性的同功能序列。
9.较佳地，所述的嵌合抗原受体包含：依次连接的启动子、前导肽、所述的特异性识别cd38抗原的单链抗体、标签肽段、铰链区、跨膜区及胞内信号域。
10.较佳地，所述的启动子为ef1α来源的启动子，核酸序列如seq id no：8所示；所述的前导肽为gm-csf来源的前导肽，氨基酸序列如seq id no：9所示；所述的标签肽段的氨基酸序列如seq id no：10所示；所述的铰链区和所述的跨膜区为cd8来源铰链区和跨膜区，氨基酸序列分别如seq id no：11和seq id no：12所示；所述的胞内信号域包含：cd28、4-1bb和cd3ζ，氨基酸序列分别如seq id no：13、seq id no：14和seq id no：15所示。
11.较佳地，所述的嵌合抗原受体还连接有自切割肽t2a和嘌呤霉素基因，所述的自切割肽t2a的氨基酸序列如seq id no：16所示；所述的嘌呤霉素基因的氨基酸序列如seq id no：17所示。
12.本发明还提供了一种编码上述的靶向cd38的全人源嵌合抗原受体的多核苷酸，所述的嵌合抗原受体包含特异性识别cd38抗原的单链抗体，所述的单链抗体的核酸序列包括seq id no：18，或与seq id no：18具有95-99％同一性的同功能序列。
13.本发明还提供了上述的靶向cd38的全人源嵌合抗原受体基于pmd19-t载体的制备方法，其包含以下步骤：
14.(1)合成用于编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列，得到ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro基因片段；所述的基因片段包含启动子、前导肽、特异性识别cd38抗原的单链抗体、标签肽段、铰链区、跨膜区、胞内信号域、t2a和嘌呤霉素基因；
15.(2)将所述的ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro基因片段用限制性内切酶bamh-i和
sali双酶切，得到目的片段；用限制性内切酶bamh-i和sali酶切pmd19-t载体，然后将酶切后的目的片段和pmd19-t载体通过t4连接酶进行连接，获得能够表达所述的嵌合抗原受体的pmd19-t质粒。
16.本发明还提供了一种能够表达所述的嵌合抗原受体的pmd19-t质粒，所述的pmd19-t质粒通过上述的靶向cd38的全人源嵌合抗原受体基于pmd19-t载体的制备方法制备得到。
17.本发明还提供了一种表达上述的靶向cd38的全人源嵌合抗原受体的t细胞。
18.本发明还提供了上述的靶向cd38的全人源嵌合抗原受体在制备抑制或治疗能够表达cd38的恶性血液病或实体瘤的药物中的应用。
19.相对于现有技术，本发明的有益效果是：
20.(1)本发明选择了适中亲和性识别cd38的scfv序列，能够特异性地高效识别高表达cd38的靶细胞的同时，对低表达cd38的细胞和组织没有明显的毒副作用，具有较好的免疫容忍度，安全性较高。
21.(2)在传统制备过程中，用于治疗的car-t细胞往往处于终末分化阶段，生存时间较短、难以发挥长效杀伤功能，因而治疗效果较差。而本发明采取的cd28和41bb共刺激信号显著抑制t细胞终末分化，促进具备更长生存时间的记忆型t细胞生成。此类转基因修饰的car-t细胞具备更强、更持久的杀伤能力，有望提高实体瘤治疗效果。
22.(3)本发明利用cd8铰链区与跨膜区序列保证胞外识别区与胞内信号区之间有了很好的结合，保证了car-t细胞的功能。
23.(4)采用非病毒类载体pmd19-t电转转染系统，避免了使用病毒载体存在的安全隐患，具有更高的安全性和有效性，更加适用于临床治疗。
附图说明
24.图1为全人源cd38-car(hcd38 car)的结构图。
25.图2为全人源cd38-car-t细胞的转染效率流式检测图。
26.图3为全人源cd38-car-t细胞对过表达cd38的rpmi-8226肿瘤细胞和daudi肿瘤细胞的细胞毒性的检测结果。
27.图4为全人源cd38-car-t细胞对天然表达cd38的正常pbmc细胞的细胞毒性检测结果。
28.图5为全人源cd38-car-t细胞控制小鼠肿瘤生长情况。
具体实施方式
29.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
30.以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
31.术语定义
[0032]“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。抗体包括单链抗体。
[0033]“重链”由重链可变区(vh)和重链恒定区组成。
[0034]“轻链”由轻链可变区(vl)和轻链恒定区组成。
[0035]
单链抗体(single—chain antibody fragment,scfv)：由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。
[0036]“重链可变区”和“轻链可变区”可进一步再分为高变区，称为“互补决定区”(cdr)，cdr散布在被称为“构架区”(fr)的更加保守的区域中。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：fri、cdrl、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4，重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。本发明中，重链可变区的cdrl、cdr2、cdr3分别表示为hcdr1、hcdr2和hcdr3；轻链可变区的cdrl、cdr2、cdr3分别表示为lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0037]“car-t”指嵌合抗原受体t细胞。通过将识别肿瘤相关抗原的scfv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的t细胞，使患者t细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的t细胞，称之为嵌合抗原受体t细胞。
[0038]“95-99％同一性”是指95％以上(最佳地98％以上)的同源性或相似性。本领域技术人员可知，对序列中一个或少数几个氨基酸或核苷酸进行突变，有时候并不会使序列的生物学功能产生本质变化。对氨基酸或核苷酸进行突变的形式还包括修饰，对氨基酸或核苷酸进行修饰得到的序列，生物学功能与本发明提供的序列相同或等价，这种类型的序列应在本发明的保护范围内。
[0039]
本发明提供的编码scfv的核酸序列如seq id no：18所示，对应的scfv的氨基酸序列如seq id no：1所示。seq id no：2至seq id no：7所示的序列为seq id no：1的可变区序列。
[0040]
本发明的序列的具体筛选方法可参阅专利文献cn201911234429.6(发明名称：针对cd19的全人源抗体或抗体片段、嵌合抗原受体及应用)中的方法。以下实施例为对包含seq id no：1所示单链抗体(scfv)的嵌合抗原受体进行验证的实验结果。
[0041]
一、car结构
[0042]
cd38-car(靶向cd38的人源嵌合抗原受体)基本结构由ef1α启动子(promoter)、前导肽(sp)、特异性识别cd38抗原的单链抗体(scfv)、标签肽段(myc-tag)、人cd8a分子铰链区(cd8 hinge)与跨膜区(cd8 tm)、人cd28分子胞内区(cd28)、人4-1bb分子胞内区(4-1bb)、人cd3ζ分子胞内区(cd3ζ)、2a自切割肽(t2a)和嘌呤霉素(puromycin)基因依次串联构成，串联形成的结构如图1的hcd38 car所示。下文中以ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro表示串联形成的结构。
[0043]
二、car序列合成及载体构建
[0044]
car编码序列由江苏金斯瑞合成，获得的ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro结构的dna序列(如图1所示)通过酶切连接插入到pmd19-t质粒中，构建非病毒的电转表达质粒pmd19-t-ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro，即能够表达嵌合抗原受体的pmd19-t质粒。
[0045]
三、电转表达质粒提取
[0046]
将pmd19-t-ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro转入大肠杆菌中，使其在大肠杆菌中大量扩增。然后采用无内毒素质粒大抽试剂盒提取大肠杆菌的质粒dna。
[0047]
四、t细胞转染与纯化
[0048]
从人血清中分离淋巴细胞，并加入t淋巴细胞培养液[cts
tm aim v
tm
sfm(ruo)，thermo，货号：a3021002]、辐照后的pbmc细胞、okt-3、hil-2和无内毒素的质粒dna进行扩展培养，采用电转的转染方式将质粒pmd19-t-ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro转入t细胞中，得到带有ef1α-sp-cd38-car-t2a-puro基因的t淋巴细胞，即car-t细胞。
[0049]
五、t细胞car表达效率
[0050]
t细胞转染7天后，向t淋巴细胞培养液加入一定浓度的puromycin。t细胞转染20天后，利用流式细胞术对t细胞表面car的表达情况进行检测。结果如图2所示。图2显示car表达阳性率到达约100％，证明car表达质粒构建及电转质粒的成功。
[0051]
六、car-t细胞对过表达相关抗原肿瘤细胞的长效杀伤作用
[0052]
为了确定cd38-car-t细胞具有更好的持续杀伤能力，实验使用了携带有luciference荧光信号的靶细胞进行杀伤试验。按照效靶比(效应细胞：靶细胞，e：t)4：1和1：1的比例，将t细胞(效应细胞)分别与cd38阳性靶细胞(daudi-fluc、rpmi-8226-fluc)或cd38阴性靶细胞(k562-fluc)共孵育72小时(如图3所示)。共孵育结束后，添加luciference荧光信号的底物(perkinelmer,货号：122799)，然后通过酶标仪分析靶细胞凋亡情况。结果显示，car-t细胞对过表达cd38的肿瘤细胞(cd38 cells)具有很强的杀伤能力，而对cd38阴性细胞的影响很小，说明该car-t细胞具有很强的特异性杀伤能力。
[0053]
七、car-t细胞对低表达相关抗原的正常细胞的毒副作用
[0054]
为了更进一步确定cd38-car-t细胞(图4中的pmd-t-cd38-scfv-003-car t cells)对低表达cd38的正常细胞的毒副作用，我们使用了celltracetm violet cell proliferation kit(thermo，货号：c34571)试剂盒，预先对人外周血单核细胞(pbmc)进行了染色。然后按照效靶比(效应细胞：靶细胞，e：t)4：1、1：1将t细胞(效应细胞)与低表达cd38的正常pbmc细胞孵育72小时(如图4所示)。共孵育结束后，离心收集细胞，并使用抗cd3的抗体和抗cd38的抗体共孵育，最后利用流式细胞术分析pbmc细胞中cd38阳性细胞凋亡情况。结果显示，car-t细胞对低表达cd38的正常细胞具有很低的毒副作用。
[0055]
八、动物实验验证car-t细胞功能
[0056]
免疫缺陷小鼠经尾静脉接种5
×
105个daudi细胞7天后，经尾静脉分别注射1
×
107个car-t细胞进行治疗。治疗0，7天时，利用小动物活体成像设备，观察肿瘤信号。如图5所示，在car-t细胞注射后7天，肿瘤信号明显减少，提示car-t细胞具有良好的肿瘤杀伤能力。
[0057]
综上所述，本发明提供的scfv序列或嵌合抗原受体，具有适中亲和性识别cd38的能力，在能够高效识别靶细胞的同时，对低表达cd38的细胞具有很低的毒副作用，安全性高。
[0058]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。