一种快速培养结核分枝杆菌的培养基及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于培养基技术领域，具体涉及一种快速培养结核分枝杆菌的培养基及其制备方法和应用。


背景技术：

2.结核分枝杆菌，俗称结核杆菌(tubercle bacillus)，是引起结核病的病原菌。结核杆菌培养在结核病诊断、观察化疗效果、流行病学指标、研究抗结核药物作用等方面都有决定性意义。长期以来，现有技术中一直采用罗氏培养基进行培养，然而结核分枝杆菌生长缓慢，常规培养方法的培养周期一般为30天左右，严重影响了结核病的检测及相关药物研究。
3.现有技术常通过优化培养基来缩短结核分枝杆菌的的生长周期。谭立等发现植物激素对结核杆菌有明显促进增殖作用，使用含有植物激素的培养基对痰标本中结核杆菌进行培养，获得痰标本阳性培养结果的时间平均为15天，但其成本较高。黄其文等以新鲜椰子汁和马血清为基础成分，研制一种快速培养结核分枝杆菌的新型液体培养基，但其成本较高，且主要用于结核杆菌检测，难以实现高密度培养。
4.综上所述，现有技术中的结核杆菌培养基中，仍存在成本高，难以实现高密度培养，无法满足开发结核分枝杆菌疫苗的需求等问题。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种价格低廉、适用于快速、高密度培养结核分枝杆菌的培养基及其制备方法和应用。
6.本发明所采用的技术方案为：
7.一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，所述培养基的原料包括牛血清白蛋白、葡萄糖、dubos肉汤基础、甘油和吐温。
8.所述牛血清白蛋白、葡萄糖和dubos肉汤基础的质量比为(3
‑
7)：(5.5
‑
9.5)：(1.0
‑
1.6)，包括但不限于4:6:1.2、5:7:1.4、5.5:8:1.5、6:8.5:1.5或6.5:9:1.4。
9.所述甘油在所述培养基中的体积百分比为0.03％
‑
0.07％，包括但不限于0.04％、0.05％或0.06％；
10.所述吐温在所述培养基中的体积百分数为0.06％
‑
0.1％，包括但不限于0.07％、0.08％或0.09％；
11.所述吐温为吐温80。
12.所述快速培养结核分枝杆菌的培养基的制备方法，包括如下步骤：
13.(1)按照上述重量取血清白蛋白溶液和葡萄糖，溶于生理盐水中，除菌，得到牛血清白蛋白溶液；
14.(2)按照上述重量取dubos肉汤基础，溶于去离子水中，加热至沸腾后，降温至50
‑
60℃，灭菌，得到dubos肉汤基础溶液；
15.(3)向步骤(2)所得dubos肉汤基础溶液中加入所述牛血清白蛋白溶液、甘油和吐温，即得所述快速培养结核分枝杆菌的培养基。
16.步骤(1)中，所述除菌为使用无菌滤器过滤进行除菌；优选为使用0.22
‑
0.4μm(例如0.22μm、0.3μm或0.35μm)无菌滤器过滤除菌。
17.步骤(2)中，所述灭菌为采用高压蒸汽进行灭菌，优选为采用115
‑
121℃高压蒸汽进行灭菌15
‑
30min；灭菌后，降温至50
‑
60℃，得到所述dubos肉汤基础溶液。
18.所述的培养基在快速培养结核分枝杆菌中的应用。
19.应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下：
20.(s1)配制sauton培养基，将结核分枝杆菌的菌落或冻干粉溶解于所述sauton培养基进行活化，得到活化后的结核分枝杆菌；
21.(s2)将步骤(s1)活化后的结核分枝杆菌加入到所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养，实现结核分枝杆菌的快速培养。
22.本发明中，采用sauton培养基活化结核分枝杆菌，能够进一步加快结核分枝杆菌的增殖速度。
23.步骤(s2)中，培养温度为25
‑
30℃，包括但不限于26℃、27℃、28℃或29℃；培养周期为15
‑
16天。
24.本发明具体如下有益效果：
25.(1)本发明所述的快速培养结核分枝杆菌的培养基，通过采用牛血清白蛋白、葡萄糖、dubos肉汤基础、甘油和吐温为原料并进行适当重量配比，其中牛血清白蛋白对结核分枝杆菌可起到生理和机械保护作用，葡萄糖和dubos肉汤基础为结核杆菌提供快速生长所需的碳源和营养物质，而甘油和吐温能够有效防止结核分枝杆菌在增殖过程中聚集成团，配合碳源和营养物质，从而避免了细胞生长接触抑制，有利于结核分枝杆菌快速、高密度增殖以及应用于结核病的研究。
26.(2)本发明所述的快速培养结核分枝杆菌的方法，通过先利用sauton培养基对结核分枝杆菌进行活化，之后将活化后的结核分枝杆菌加入所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养，能够实现快速、高密度培养结核分枝杆菌，将培养周期缩短为15
‑
16天。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为实施例1中结核分枝杆菌的生长曲线；
29.图2为实施例1中培养前培养液染色镜检图；
30.图3为实施例1中培养结束后培养液染色镜检图；
31.图4为实施例2中结核分枝杆菌的生长曲线；
32.图5为实施例3中结核分枝杆菌的生长曲线；
33.图6为实施例4中结核分枝杆菌的生长曲线；
34.图7为对比例1中结核分枝杆菌的生长曲线。
具体实施方式
35.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施病例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
36.以下实施例中试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
37.实施例1
38.本实施例提供一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，采用如下方法制得：
39.(1)称取5g牛血清白蛋白(bsa)粉末及7.5g无水d
‑
葡萄糖粉末，并溶解于100g生理盐水中，待完全溶解后使用0.22μm的无菌滤器过滤，得到bsa溶液；
40.(2)称取1.3gdubos肉汤基础粉末(美国bd公司difco基础培养基)，将其溶解于180ml去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，并用微波炉高火加热至沸腾，降温至55℃，进行高压蒸汽灭菌(121℃，30min)，降温至55℃，得到dubos肉汤基础溶液；
41.(3)向所得dubos肉汤基础溶液中加入20ml所述bsa溶液，并按体积百分比为0.05％及0.08％的比例分别加入甘油及吐温80(tween
‑
80)，即得所述快速培养结核分枝杆菌的培养基。
42.进一步，应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下
43.(s1)配制sauton培养基：将2g柠檬酸、0.05g柠檬酸铁铵、0.5g mgso4、0.5g k2hpo4、4.0g l
‑
天门冬氨酸、60ml甘油和800ml去离子水充分混合，各组分充分溶解后，使用6mol/l naoh调节溶液的ph为7.2，继续加入去离子水补充至1000ml，于121℃高压灭菌20min，得到sauton培养基；
44.将结核分枝杆菌的菌落加入装有所述sauton培养基的离心管(eppendorf，ep管)中的进行活化，待菌落溶解成均一、稳定的液体后低温保存，得到活化后的结核分枝杆菌；
45.(s2)于25℃，将500μl步骤(s1)活化后的结核分枝杆菌加入到200ml所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养；检测600nm下培养液的吸光度值，记录数据结果，并对培养前和培养结束后的培养液进行染色观察。
46.根据吸光度值制得的结核分枝杆菌的生长曲线如图1所示，结核分枝杆菌快速增殖，培养周期缩短为15天；染色结果如图2和图3所示，图2为培养前培养液染色镜检图，可见细胞密度较低，图3为培养结束后培养液染色镜检图，可见细胞细胞密度显著增加。
47.实施例2
48.本实施例提供一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，采用如下方法制得：
49.(1)称取3g牛血清白蛋白(bsa)粉末及5.5g无水d
‑
葡萄糖粉末，并溶解于100g生理盐水中，待完全溶解后使用0.22μm的无菌滤器过滤，得到bsa溶液；
50.(2)称取1.0gdubos肉汤基础粉末(美国bd公司difco基础培养基)，将其溶解于180ml去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，并用微波炉高火加热至沸腾，降温至55℃，进行高压蒸汽灭菌(121℃，30min)，降温至55℃，得到dubos肉汤基础溶液；
51.(3)向所得dubos肉汤基础溶液中加入20ml所述bsa溶液，并按体积百分比为0.03％及0.1％的比例分别加入甘油及吐温80(tween
‑
80)，即得所述快速培养结核分枝杆
菌的培养基。
52.进一步，应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下
53.(s1)配制sauton培养基：将2g柠檬酸、0.05g柠檬酸铁铵、0.5g mgso4、0.5g k2hpo4、4.0g l
‑
天门冬氨酸、60ml甘油和800ml去离子水充分混合，各组分充分溶解后，使用6n naoh调节溶液的ph为7.2，继续加入去离子水补充至1000ml，于121℃高压灭菌20min，得到sauton培养基；
54.将结核分枝杆菌的菌落加入装有所述sauton培养基的离心管(eppendorf，ep管)中的进行活化，待菌落溶解成均一、稳定的液体后低温保存，得到活化后的结核分枝杆菌；
55.(s2)于30℃，将500μl步骤(s1)活化后的结核分枝杆菌加入到200ml所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养；检测600nm下培养液的吸光度值，记录数据结果，制得的结核分枝杆菌的生长曲线如图4所示，可以看出结核分枝杆菌快速增殖，培养周期缩短为16天。
56.实施例3
57.本实施例提供一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，采用如下方法制得：
58.(1)称取7g牛血清白蛋白(bsa)粉末及9.5g无水d
‑
葡萄糖粉末，并溶解于100g生理盐水中，待完全溶解后使用0.22μm的无菌滤器过滤，得到bsa溶液；
59.(2)称取1.6g dubos肉汤基础粉末(美国bd公司difco基础培养基)，将其溶解于180ml去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，并用微波炉高火加热至沸腾，降温至55℃，进行高压蒸汽灭菌(121℃，30min)，降温至55℃，得到dubos肉汤基础溶液；
60.(3)向所得dubos肉汤基础溶液中加入20ml所述bsa溶液，并按体积百分比为0.07％及0.06％的比例分别加入甘油及吐温80(tween
‑
80)，即得所述快速培养结核分枝杆菌的培养基。
61.进一步，应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下
62.(s1)配制sauton培养基：将2g柠檬酸、0.05g柠檬酸铁铵、0.5g mgso4、0.5g k2hpo4、4.0g l
‑
天门冬氨酸、60ml甘油和800ml去离子水充分混合，各组分充分溶解后，使用6n naoh调节溶液的ph为7.2，继续加入去离子水补充至1000ml，于121℃高压灭菌20min，得到sauton培养基；
63.将结核分枝杆菌的菌落加入装有所述sauton培养基的离心管(eppendorf，ep管)中的进行活化，待菌落溶解成均一、稳定的液体后低温保存，得到活化后的结核分枝杆菌；
64.(s2)于25℃，将500μl步骤(s1)活化后的结核分枝杆菌加入到200ml所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养；检测600nm下培养液的吸光度值，记录数据结果，制得的结核分枝杆菌的生长曲线如图5所示，可以看出结核分枝杆菌快速增殖，培养周期缩短为15
‑
16天。
65.实施例4
66.本实施例提供一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，采用如下方法制得：
67.(1)称取5g牛血清白蛋白(bsa)粉末及7.5g无水d
‑
葡萄糖粉末，并溶解于100g生理盐水中，待完全溶解后使用0.22μm的无菌滤器过滤，得到bsa溶液；
68.(2)称取1.3g dubos肉汤基础粉末(美国bd公司difco基础培养基)，将其溶解于180ml去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，并用微波炉高火加热至沸腾，降温至55℃，进行高压
蒸汽灭菌(121℃，30min)，降温至55℃，得到dubos肉汤基础溶液；
69.(3)向所得dubos肉汤基础溶液中加入20ml所述bsa溶液，并按体积百分比为0.07％及0.06％的比例分别加入甘油及吐温80(tween
‑
80)，即得所述快速培养结核分枝杆菌的培养基。
70.进一步，应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下
71.于25℃，将500μlsauton培养基溶解的结核分枝杆菌加入到200ml所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养；检测600nm下培养液的吸光度值，记录数据结果，制得的结核分枝杆菌的生长曲线如图6所示，可以看出结核分枝杆菌快速增殖，培养周期缩短为18
‑
20天。
72.实施例5
73.本实施例提供一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，采用如下方法制得：
74.(1)称取2g牛血清白蛋白(bsa)粉末及4g无水d
‑
葡萄糖粉末，并溶解于100g生理盐水中，待完全溶解后使用0.22μm的无菌滤器过滤，得到bsa溶液；
75.(2)称取0.8g dubos肉汤基础粉末(美国bd公司difco基础培养基)，将其溶解于180ml去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，并用微波炉高火加热至沸腾，降温至55℃，进行高压蒸汽灭菌(121℃，30min)，降温至55℃，得到dubos肉汤基础溶液；
76.(3)向所得dubos肉汤基础溶液中加入20ml所述bsa溶液，并按体积百分比为0.05％及0.08％的比例分别加入甘油及吐温80(tween
‑
80)，即得所述快速培养结核分枝杆菌的培养基。
77.进一步，应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下
78.(s1)按照实施例1完全相同的方法配制得到sauton培养基；
79.将结核分枝杆菌的菌落加入装有所述sauton培养基的离心管(eppendorf，ep管)中的进行活化，待菌落溶解成均一、稳定的液体后低温保存，得到活化后的结核分枝杆菌；
80.(s2)于25℃，将500μl步骤(s1)活化后的结核分枝杆菌加入到200ml所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养，培养周期缩短为15
‑
16天。
81.实施例6
82.本实施例提供一种快速培养结核分枝杆菌的培养基，采用如下方法制得：
83.(1)称取9g牛血清白蛋白(bsa)粉末及12g无水d
‑
葡萄糖粉末，并溶解于100g生理盐水中，待完全溶解后使用0.22μm的无菌滤器过滤，得到bsa溶液；
84.(2)称取2g dubos肉汤基础粉末(美国bd公司difco基础培养基)，将其溶解于180ml去离子水中，用玻璃棒搅拌均匀，并用微波炉高火加热至沸腾，降温至55℃，进行高压蒸汽灭菌(121℃，30min)，降温至55℃，得到dubos肉汤基础溶液；
85.(3)向所得dubos肉汤基础溶液中加入20ml所述bsa溶液，并按体积百分比为0.05％及0.08％的比例分别加入甘油及吐温80(tween
‑
80)，即得所述快速培养结核分枝杆菌的培养基。
86.进一步，应用所述培养基快速培养结核分枝杆菌的方法，步骤如下
87.(s1)按照实施例1完全相同的方法配制得到sauton培养基；
88.将结核分枝杆菌的菌落加入装有所述sauton培养基的离心管(eppendorf，ep管)中的进行活化，待菌落溶解成均一、稳定的液体后低温保存，得到活化后的结核分枝杆菌；
89.(s2)于25℃，将500μl步骤(s1)活化后的结核分枝杆菌加入到200ml所述快速培养结核分枝杆菌的培养基中进行培养，培养周期缩短为15
‑
16天。
90.对比例1
91.本对比例与实施例1相比，区别仅在于：制备所述快速培养结核分枝杆菌的培养基时，将步骤(3)中添加的甘油和吐温80替换为等量的无菌水，其它均与实施例1相同。
92.本对比例培养结核分枝杆菌的生长曲线如图7所示，结核分枝杆菌增殖缓慢，培养周期达30天以上。
93.对比例2
94.本对比例与实施例1相比，区别仅在于：制备所述快速培养结核分枝杆菌的培养基时，将步骤(3)中添加的甘油替换为等量的无菌水，其它均与实施例1相同。培养周期达30天以上。
95.对比例3
96.本对比例与实施例1相比，区别仅在于：制备所述快速培养结核分枝杆菌的培养基时，将步骤(3)中添加的吐温80替换为等量的无菌水，其它均与实施例1相同。培养周期达30天以上。
97.对比例4
98.本对比例与实施例1相比，区别仅在于：制备所述快速培养结核分枝杆菌的培养基时，将步骤(3)中添加的吐温80替换为等量的吐温20，其它均与实施例1相同。培养周期达20天以上。
99.对比例5
100.本对比例与实施例1相比，区别仅在于：制备所述快速培养结核分枝杆菌的培养基时，将步骤(3)中添加的吐温80替换为等量的乙二醇，其它均与实施例1相同。培养周期达30天以上。
101.由上述结果可知，实施例1
‑
6采用本发明的快速培养结核分枝杆菌的培养基，能够快速、高密度培养结核分支杆菌；与实施例1
‑
3相比，实施例4中未采用sauton培养基对结核分支杆菌进行活化，培养周期略长，为30天；实施例5和实施例6中未控制牛血清白蛋白、葡萄糖和dubos肉汤基础的质量比在(3
‑
7)：(5.5
‑
9.5)：(1.0
‑
1.6)数据范围内，结核分枝杆菌的培养周期略长，为25天；与实施例1相比，对比例1中未在快速培养结核分枝杆菌的培养基中添加甘油和吐温，无法使结核分支杆菌快速增殖，培养周期达30天以上，对比例2
‑
3中未同时采用甘油和吐温80，结核杆菌生长较慢，培养周期达30天。对比例4
‑
5中采用吐温20、乙二醇替换吐温80，结核杆菌生长较慢，培养周期达20
‑
30天，从而说明只有同时采用甘油和吐温80才能实现快速培养结核分枝杆菌的效果。
102.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。