稻瘟病菌MoSpc2基因及其应用的制作方法

稻瘟病菌mospc2基因及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及稻瘟病菌mospc2基因及其应用。


背景技术：

2.水稻是重要的粮食作物，全球接近半数的人口以水稻为主粮。稻瘟病菌（magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是世界水稻生产上严重的真菌病害，在我国各个稻区均有发生，暴发成灾时可导致绝收，每年造成10%
‑
30%的水稻收成损失，这些损失的水稻足够养活6000千万人。目前，防控稻瘟病的方式主要有布局抗病品种和施用化学药剂。虽然抗病品种、氮肥的有效施用和杀菌剂的有效结合在一定程度上达到了控制稻瘟病的效果，但由于田间稻瘟病菌种群复杂多样，抗病品种往往在推行几年内便逐渐失去原有的抗瘟性；而化学农药单一或过量使用则极易使致病菌产生耐药性，给稻瘟病的有效防控带来严峻挑战。
3.信号肽对于引导蛋白靶向内质网分泌途径具有关键作用。这些信号肽的结构特征随其输出位置的不同而变化，并且通常是通过与靶膜上的受体相互作用来实现它的特异性。信号肽酶作为信号肽加工的主要元件对蛋白的释放、成熟与分泌具有至关重要的作用。一旦信号肽酶无法切割信号肽，将导致分泌底物滞留在胞内，无法完成分泌过程。关于信号肽酶的功能研究，目前主要集中在细菌、酵母及动物中，在真菌和植物中鲜有研究。因此研究信号肽酶的致病机理可以为稻瘟病菌靶向药物的设计与筛选提供重要的药物靶点，这对稻瘟病菌的综合防治具有重要的理论意义和应用价值。


技术实现要素：

4.本发明目的在于针对目前存在的稻瘟病危害严重，缺少有效防治方法的问题，提供一种稻瘟病菌mospc2基因及其应用。 稻瘟病菌mospc2基因对稻瘟病菌的菌丝营养生长、分生孢子产生、附着胞形成及致病性有重要作用。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种稻瘟病菌mospc2基因，其基因全长序列如seq id no:1所示。
6.进一步的，上述稻瘟病菌mospc2基因，具有如下核苷酸序列：(a)具有与seq id no:1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(b)具有与seq id no:1所示的核苷酸序列有90%以上同一性的核苷酸序列。进一步的，上述稻瘟病菌mospc2基因，其cdna序列如seq id no:2所示。
7.一种由上述稻瘟病菌mospc2基因编码的稻瘟病菌的致病性蛋白mospc2，其氨基酸序列如seq id no:3所示。
8.进一步的，上述稻瘟病菌的致病性蛋白mospc2，具有与seq id no:3所示的氨基酸序列有90%以上同一性、且具有稻瘟病致病性功能的氨基酸序列。
9.一种敲除稻瘟病菌mospc2基因的稻瘟病菌突变体
∆
mospc2。
10.上述稻瘟病菌mospc2基因在降低稻瘟病菌致病力中的应用。
11.上述稻瘟病菌的致病性蛋白mospc2在降低稻瘟病菌致病力中的应用。
12.本发明的有益之处在于：本发明通过对稻瘟病菌mospc2基因的营养生长、分生孢子萌发、附着孢测定、致病性等生理功能进行验证，证明mospc2基因的敲除或缺失会导致稻瘟病菌致病力的降低，从而说明mospc2基因是稻瘟病菌致病过程中的一个重要基因。本发明所提供的mospc2基因及其应用为稻瘟病菌的防控提供了一个新方向。
13.附图说明：图1为mospc2基因敲出突变体构建过程示意图。
14.图2 为southern杂交用于分析hph基因在突变体中的单拷贝整合。其中 guy11 和dmospc2 突变体的基因组dna 用nrui 消化，然后与探针杂交以验证hph 基因在突变体基因组中的单拷贝整合。
15.图3为 mospc2敲除突变体在cm、sdc、oma平板培养基上的菌落及气生菌丝形态照片。
16.图4为 mospc2敲除突变体在各种外界环境因子胁迫下的菌落形态照片。
17.图5为mospc2 基因敲除突变体与野生型分生孢子形态对比。
18.图6 为mospc2基因敲除突变体与野生型在sdc培养基下28℃培养8天的分生孢子数统计图。
19.图7为mospc2基因敲除突变体与野生型在水稻叶片上的致病力图图8为mospc2 基因敲除突变体与野生型在不同时间下附着孢的萌发情况。
20.具体实施方式：以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
21.（一）供试菌株及植物：稻瘟病菌菌种为稻瘟病菌野生型菌株guy11（magnaporthe oryzae ），供试水稻为水稻易感稻瘟品种co
‑
39。
22.（二）有关培养基及溶液的配制：（1）完全培养基（cmⅱ）：20
×
硝酸盐（50 ml/l），1000
×
微量元素（1 ml/l），1000
×
维生素溶液（1 ml/l），葡萄糖（10 g/l），蛋白胨（2 g/l），酸水解酪蛋白（1 g/l），酵母提取物（1 g/l ），固体培养基加入琼脂粉（20 g/l）；1000
×
维生素溶液(100ml)：biotin 0.01g，pyridoxin 0.01g，thiamine 0.01g，riboflavin0.01g，paba (p
‑
aminobenzonic acid) 0.01g，nicotinic acid 0.01g；1000
×
微量元素(100ml)：znso4. 7h2o 2.2g，h3bo
3 1.1g，mncl2. 4h2o 0.5g，feso4. 7h2o 0.5g，cocl2. 6h2o 0.17g，cuso4. 5h2o 0.16g，na2moo4. 5h2o 0.15g ，na4edta 5g；（2）原生质体再生培养基（tb3）：酵母提取物（3 g/l），酸水解酪蛋白（3 g/l ），蔗糖（200 g/l），固体培养基加入琼脂粉（12 g/l）；（3）稻杆培养基（sdc）：玉米粉（25 g/l），干稻草（150 g/l），琼脂粉（20 g/l）。用于诱导稻瘟病菌产孢。
23.（4）燕麦培养基（oma）：燕麦（50 g/l），配置固体培养基加入琼脂粉（20 g/l）；实施例1 基因的筛选通过ncbi数据库搜索得到酵母中spc2的蛋白序列，并以此为对象在ncbi官网通过
blastp工具进行比对，得到在稻瘟病菌中与之相似的蛋白（mgg_10832），并将其命名为mospc2。稻瘟病菌的致病性蛋白mospc2，其氨基酸序列如seq id no:3所示。编码该蛋白的基因为稻瘟病菌mospc2基因，其基因全长序列如seq id no:1所示；其cdna序列如seq id no:2所示。
24.实施例2 基因敲除（1）以稻瘟病菌野生型guy11基因组为模板，选取mospc2基因上游1000bp片段以mospc2
‑
f1（正向）、mospc2
‑
f2（反向）引物扩增得到mospc2上臂片段，选取mospc2基因下游1000bp片段以mospc2
‑
f3（正向）、mospc2
‑
f4（反向）扩增得到mospc2下臂片段(图1)。之后将上臂、潮霉素磷酸转移酶基因hph（seq id no:4）和下臂片段进行融合，将融合产物以mospc2
‑
nest f和mospc2
‑
nest r进行大量扩增得到大量dna融合产物。将融合产物进行原生质体转化以取代稻瘟病菌spc2基因。
25.（2） 原生质体转化过程：
①
加入10 μl的上述dna融合产物于分装好的野生型稻瘟病菌原生质体中，轻轻混匀，静置20
‑
25 min（使原生质体与dna充分接触）；
②
加入1 ml ptc，轻轻混匀，静置20
‑
25 min；
③
加入适量的tb3液体培养基，轻轻混匀，用封口膜将管口封号，于28℃培养箱中黑暗复苏12
‑
16 h。
26.④
在熔解好的tb3固体培养基中加入所需浓度的潮霉素（600μl/200ml），倒入复苏的离心管中。混匀后，倒入无菌的15 cm培养皿中，待培养基冷却凝固后，再倒入已加入对应浓度潮霉素（1200μl/200ml）的tb3培养基，使其覆盖表面，冷却凝固后，用封口膜将培养皿封口，倒置于8℃光照培养箱中培养6
‑
10 d；
⑤
待培养皿中长出转化子，小心挑取上层培养基中的单菌落接种于cmii固体培养基平板中，后续进一步对转化子进行验证；（3） 利用mospc2基因内部引物mospc2
‑
ko
‑
f 和mospc2
‑
ko
‑
r进行pcr敲除验证，以阴性无条带，阳性有条带为对照选取无条带转化子进行下一步验证。利用mospc2
‑
f1和潮霉素磷酸转移酶基因hph内部引物hyg r进行潮霉素转入验证，以阴性无条带为对照，选取有条带的转化子进行southern blot的验证。
27.（4） southern杂交鉴定：选取mospc2基因下游编码区序列设计探针（seq id no:5），选取探针内没有识别位点的限制性核酸内切酶nrui分别对候选转化子与野生型菌株guy11的基因组dna进行酶切（图2）。在杂交验证图中，野生型泳道中出现预设的大小的条带2.07 kb，而突变体泳道中出现2.60 kb大小的条带（图2），与预测相符，说明转化子中的mospc2基因已成功被hph基因替换，且为单拷贝插入。鉴定获得稻瘟病菌突变体
∆
mospc2。
28.（5）所用引物序列：seq id no. 6：mospc2
‑
f1：tggccatgttgttcttcatc；seq id no. 7：mospc2
‑
f2：cattcattgttgacctccactagctccatgtgtacaagaaagttggtt；seq id no. 8：mospc2
‑
f3：gcaaaggaatagagtagatgccgaccgaaatatcaaatttcaagtta；seq id no.9：mospc2
‑
f4：aatagagcaatacgcaagag；
seq id no. 10：mospc2
‑
nest f：acagcacatggtagttgctg；seq id no. 11：mospc2
‑
nest r：agcagcgctcggtgagcatg；seq id no. 12：mospc2
‑
ko
‑
f：gcagctggtgagcacatact；seq id no. 13：mospc
‑
ko
‑
r：tgtctgcacctgtagctgat；seq id no. 14：hyg r：cggtggtgcagatgaacttc。
29.（6）实验所用pcr反应体系：扩增pcr反应体系（50μl）：模板 0.5μl，2x reaction mix 25μl，上游引物 2μl，下游引物2μl，ddh2o 25μl。pcr反应程序为：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1kb/min，30个循环，72℃ 10min，16℃ 10min。
30.融合pcr反应体系（25μl）：模板上游片段、潮霉素片段和下游片段摩尔比1：3：1加入，10x pcr buffer 2.5μl，dntp mixture 0.5μl，ltaq酶 0.25μl，ddh20 21.75μl。pcr反应程序为：94℃ 3min，94℃ 35s，58℃ 5min，72℃ 5min，10个循环，16℃ 10min。
31.实施例3：mospc2基因的缺失影响稻瘟病菌的营养生长将野生型guy11、突变体
∆
mospc2分别接种在cmⅱ、sdc和oma三种不同的培养基平板中，于28℃下黑暗培养7 d，培养结束后量取菌落生长直径并拍照保存。实验结果显示，在三种培养基中，突变体的菌落生长直径都小于野生型（图3），尤其是在sdc培养基中出现显著性降低的情况，说明mospc2基因的缺失会影响稻瘟病菌的营养生长。
32.实施例4： mospc2基因的缺失影响稻瘟病菌对外界环境胁迫应答将野生型菌株guy11、突变体
∆
mospc2分别接种在含有0.5 mm diamide（二酰胺，造成氧化压力）、2 mm dtt（二硫苏糖醇，对内质网造成压力）以及400 μg/ml cfw（细胞壁抑制剂钙荧光白，对细胞壁造成压力）的cm
ꢀⅱ
培养基中28℃黑暗培养7 d。实验结果显示突变体在含有diamide和dtt的cm
ꢀⅱ
平板上生长显著减慢，在含有cfw的cm
ꢀⅱ
平板上生长显著变快（图4）。上述结果表明，mospc2基因的缺失影响稻瘟病菌对外界环境胁迫应答。
33.实施例5：mospc2基因参与调控稻瘟病菌的无性繁殖过程将野生型guy11、突变体
∆
mospc2接种于sdc培养基平板中央，于28℃下黑暗培养5 d后，将培养基表面的气生菌丝刮去，放置于28℃温室中并在黑光灯调控下诱导3 d产孢，定量统计相应菌株在sdc培养基中分生孢子的产量。实验结果显示，突变体
∆
mospc2产生的部分孢子形态异常，利用cfw对不同菌株的分生孢子进行染色，进一步观察其形态（图5）：从显微镜观察中发现野生型菌株的分生孢子基本为三细胞两隔膜，而突变体存在三种孢子形态：没有隔膜，一个隔膜和两个隔膜，其中单个隔膜的孢子比例为64.6%，且分生孢子的大小相对野生型也缩小了。另一方面，与野生型guy11相比，突变体
∆
mospc2的产孢量也显著下降（图6）。上述结果说明mospc2基因对稻瘟病菌的无性繁殖过程至关重要。
34.实施例6： mospc2基因参与调控稻瘟病菌的致病过程收集野生型guy11、突变体
∆
mospc2的分生孢子悬浮液（1
×
105个/ml），分别接种于三周龄的水稻叶片上进行水稻喷雾实验，于6 d后观察叶片病斑。结果显示，在水稻叶片上，野生型guy11能产生典型的稻瘟病病斑，而突变体
∆
mospc2未产生病斑（图7）。综上结果表明，mospc2基因的缺失使稻瘟病菌致病性显著下降，说明mospc2基因在稻瘟病菌致病过程中具有重要作用。
35.实施例7： mospc2基因的缺失延缓了附着胞的成熟
分别收集了野生型guy11、突变体
∆
mospc2菌株的分生孢子，在疏水性条件下诱导其附着胞的萌发。通过显微镜分别观察不同菌株在4 h、8 h和16 h时附着胞的萌发与形成。实验发现（图8），野生型guy11菌株的分生孢子在4 h时已经基本萌发，而突变体
∆
mospc2的分生孢子萌发出现迟缓的情况，在16 h时其萌发率也只有82%。根据统计结果显示，突变体
∆
mospc2分生孢子的附着胞形成率与萌发率的结果相似，野生型的分生孢子在8 h时已经基本形成附着胞，但突变体在16 h时附着胞形成率只有61%。上述结果表明mospc2基因的缺失延缓了附着胞的发育。