用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒的制作方法

1.本发明涉及富集分离技术领域，具体涉及用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒。


背景技术：

2.免疫磁分离技术是外周血细胞快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩人外周血样品中靶细胞，提高靶细胞检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法(ims)是将抗体连接到磁珠上，然后再将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标细胞进行捕获、富集以及磁分离。目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在磁珠捕获效率低、需要更长的时间去特异性捕获目标细胞、微米磁珠单分散性较差。
3.现有的富集分离方法较为简单，分离效率低，同时磁性纳米粒子的改进效果不同，分离效率不同，基于此，需进一步的改进处理。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒，所述试剂盒进行肺癌循环肿瘤细胞瘤细胞富集分离，包括以下步骤：
7.步骤一：将磁性纳米粒子送入到磁力搅拌器内，然后加入磁性纳米粒子总重量2
‑
3倍的乙醇溶剂，随后再加入磁性纳米粒子总重量20
‑
30％的叶酸，以500r/min的转速搅拌20
‑
30min，随后再加入磁性纳米粒子总重量10％的改性石墨烯，搅拌结束，得到叶酸改性磁性纳米粒子；
8.步骤二：将叶酸改性磁性纳米粒子加入肺癌循环肿瘤细胞内进行分离处理，分离结束，即可；
9.所述分离的具体步骤为：
10.s1：将肺癌循环肿瘤细胞、叶酸改性磁性纳米粒子先混合搅拌处理，搅拌转速为100
‑
200r/min，搅拌时间为20
‑
30min，得到待分离体；
11.s2：将磷酸加入到去离子水中，调配溶液的ph至4.0
‑
5.0，得到缓冲液；
12.s3：分选柱置于磁力架上，采用缓冲液润洗分选柱，将待分离体送入到分选柱上，利用重力的原理，进行筛选分离处理，即可。
13.优选地，所述改性石墨烯的改性方法为：将石墨烯按照重量比1:3送入到壳聚糖溶液中，然后加入冰醋酸，调节溶液ph至4.5
‑
5.5；然后再进行超声分散，超声时间为10
‑
20min，超声功率为300
‑
500w，超声结束，得到改性石墨烯。
14.优选地，所述壳聚糖溶液的质量分数为20
‑
40％。
15.优选地，所述壳聚糖溶液的质量分数为30％。
16.优选地，所述超声时间为10
‑
20min，超声功率为300
‑
500w。
17.优选地，所述超声时间为15min，超声功率为400w。
18.优选地，所述步骤二中分离处理的转速为500
‑
1000r/min，分离时间为20
‑
30min。
19.优选地，所述步骤二中分离处理的转速为750r/min，分离时间为25min。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.本发明制备的叶酸修饰的纳米粒子用于癌细胞的分离，分离的肺癌细胞活性可达到92.7％，通过对肺癌细胞的富集分离效率可达到61.3％。
附图说明
22.图1为本发明不同粒径磁珠富集分离肺癌循环肿瘤细胞的分离效率示意图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1.
25.用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒，所述试剂盒进行肺癌循环肿瘤细胞富集分离，包括以下步骤：
26.步骤一：将磁性粒子送入到磁力搅拌器内，然后加入磁性粒子总重量2倍的乙醇溶剂，随后再加入磁性粒子总重量20％的叶酸，以500r/min的转速搅拌20min，随后再加入磁性粒子总重量10％的改性石墨烯，搅拌结束，得到叶酸改性磁性粒子；
27.步骤二：将叶酸改性磁性粒子加入肺癌循环肿瘤细胞内进行分离处理，分离结束，即可；
28.所述分离的具体步骤为：
29.s1：将肺癌循环肿瘤细胞、叶酸改性磁性粒子先混合搅拌处理，搅拌转速为100r/min，搅拌时间为20min，得到待分离体；
30.s2：将磷酸加入到去离子水中，调配溶液的ph至4.0，得到缓冲液；
31.s3：分选柱置于磁力架上，采用缓冲液润洗分选柱，将待分离体送入到分选柱上，利用重力的原理，进行筛选分离处理，即可。
32.本实施例的改性石墨烯的改性方法为：将石墨烯按照重量比1:3送入到壳聚糖溶液中，然后加入冰醋酸，调节溶液ph至4.5；然后再进行超声分散，超声时间为10min，超声功率为300w，超声结束，得到改性石墨烯。
33.本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为20％。
34.本实施例的超声时间为10min，超声功率为300w。
35.本实施例的步骤二中分离处理的转速为500r/min，分离时间为20min。
36.本实施例平行进行了3组实验，分别为：采用粒径25nm、150nm和1um本发明提供的叶酸改性磁性粒子富集分离处理肺癌循环肿瘤细胞，结果如图1所示。
37.图bcd分别为采用粒径25nm、150nm和1um本发明提供的叶酸改性磁珠富集分离处
理10h时细胞状态图，图fgh分别为采用粒径25nm、150nm和1um本发明提供的叶酸改性磁珠富集分离处理24h时细胞状态示意图。从分离效果图可知，粒径25nm的叶酸改性磁性粒子(磁珠)的分离效果最好，故后续实验中采用粒径25nm磁珠进行。
38.实施例2.
39.用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒，所述试剂盒进行肺癌循环肿瘤细胞富集分离，包括以下步骤：
40.步骤一：将磁性纳米粒子送入到磁力搅拌器内，然后加入磁性纳米粒子总重量3倍的乙醇溶剂，随后再加入磁性纳米粒子总重量30％的叶酸，以500r/min的转速搅拌30min，随后再加入磁性纳米粒子总重量10％的改性石墨烯，搅拌结束，得到叶酸改性磁性纳米粒子；
41.步骤二：将叶酸改性磁性纳米粒子加入肺癌循环肿瘤细胞内进行分离处理，分离结束，即可；
42.所述分离的具体步骤为：
43.s1：将肺癌循环肿瘤细胞、叶酸改性磁性纳米粒子先混合搅拌处理，搅拌转速为200r/min，搅拌时间为30min，得到待分离体；
44.s2：将磷酸加入到去离子水中，调配溶液的ph至5.0，得到缓冲液；
45.s3：分选柱置于磁力架上，采用缓冲液润洗分选柱，将待分离体送入到分选柱上，利用重力的原理，进行筛选分离处理，即可。
46.本实施例的改性石墨烯的改性方法为：将石墨烯按照重量比1:3送入到壳聚糖溶液中，然后加入冰醋酸，调节溶液ph至5.5；然后再进行超声分散，超声时间为20min，超声功率为500w，超声结束，得到改性石墨烯。
47.本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为40％。
48.本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为30％。
49.本实施例的超声时间为20min，超声功率为500w。
50.本实施例的步骤二中分离处理的转速为1000r/min，分离时间为30min。
51.实施例3：
52.用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒，所述试剂盒进行肺癌循环肿瘤细胞富集分离，包括以下步骤：
53.步骤一：将磁性纳米粒子送入到磁力搅拌器内，然后加入磁性纳米粒子总重量2.5倍的乙醇溶剂，随后再加入磁性纳米粒子总重量25％的叶酸，以500r/min的转速搅拌25min，随后再加入磁性纳米粒子总重量10％的改性石墨烯，搅拌结束，得到叶酸改性磁性纳米粒子；
54.步骤二：将叶酸改性磁性纳米粒子加入肺癌循环肿瘤细胞内进行分离处理，分离结束，即可；
55.所述分离的具体步骤为：
56.s1：将肺癌循环肿瘤细胞、叶酸改性磁性纳米粒子先混合搅拌处理，搅拌转速为150r/min，搅拌时间为25min，得到待分离体；
57.s2：将磷酸加入到去离子水中，调配溶液的ph至4.5，得到缓冲液；
58.s3：分选柱置于磁力架上，采用缓冲液润洗分选柱，将待分离体送入到分选柱上，
利用重力的原理，进行筛选分离处理，即可。
59.本实施例的改性石墨烯的改性方法为：将石墨烯按照重量比1:3送入到壳聚糖溶液中，然后加入冰醋酸，调节溶液ph至5.0；然后再进行超声分散，超声时间为15min，超声功率为400w，超声结束，得到改性石墨烯。
60.本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为30％。
61.本实施例的超声时间为15min，超声功率为400w。
62.本实施例的步骤二中分离处理的转速为750r/min，分离时间为25min。
63.实施例4：
64.用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒，所述试剂盒进行肺癌循环肿瘤细胞富集分离，包括以下步骤：
65.步骤一：将磁性纳米粒子送入到磁力搅拌器内，然后加入磁性纳米粒子总重量2.2倍的乙醇溶剂，随后再加入磁性纳米粒子总重量22％的叶酸，以500r/min的转速搅拌23min，随后再加入磁性纳米粒子总重量10％的改性石墨烯，搅拌结束，得到叶酸改性磁性纳米粒子；
66.步骤二：将叶酸改性磁性纳米粒子加入肺癌循环肿瘤细胞内进行分离处理，分离结束，即可；
67.所述分离的具体步骤为：
68.s1：将肺癌循环肿瘤细胞、叶酸改性磁性纳米粒子先混合搅拌处理，搅拌转速为150r/min，搅拌时间为25min，得到待分离体；
69.s2：将磷酸加入到去离子水中，调配溶液的ph至4.5，得到缓冲液；
70.s3：分选柱置于磁力架上，采用缓冲液润洗分选柱，将待分离体送入到分选柱上，利用重力的原理，进行筛选分离处理，即可。
71.本实施例的改性石墨烯的改性方法为：将石墨烯按照重量比1:3送入到壳聚糖溶液中，然后加入冰醋酸，调节溶液ph至4.6；然后再进行超声分散，超声时间为12min，超声功率为320w，超声结束，得到改性石墨烯。
72.本实施例的壳聚糖溶液的质量分数为22％。
73.本实施例的超声时间为12min，超声功率为320w。
74.本实施例的步骤二中分离处理的转速为600r/min，分离时间为23min。
75.对比例1：
76.未采用叶酸改性磁性纳米粒子，单采用25nm磁性纳米粒子处理。
77.肺癌细胞活性测试标准：
78.小鼠肺癌移植瘤制备：
79.小鼠肺癌细胞用8％胎牛血清dmem培养基进行培养，进行传代2
‑
3次，取其中对数生长期的细胞，用浓度0 25％的胰蛋白酶进行消化后1000r/min进行离心，时间10min，取下液加0.9％生理盐水进行细胞悬浮并稀释浓度至1.0
×
106/ml，取.1ml对实验对象小鼠进行接种；
80.移植瘤指标的测定。治疗开始日起每3d建立模型测量一次肿瘤的最大直径(a)与横径(b)，并计算体积；共治疗21d，第22d行颈椎脱臼法处死后取出小鼠脾，测量肿瘤体积；
81.计算出肿瘤细胞活性率，细胞活性率＝(对照组肿瘤重量
‑
实验组肿瘤重量)/对照
组瘤重
×
100％。
82.实施例1
‑
4和对比例1采用25nm改性磁珠/磁珠富集分离肺癌循环肿瘤细胞的效率及分离得到的细胞活性测试结果如下：
83.组别富集分离效率(％)细胞活性(％)实施例160.692.3实施例260.992.1实施例361.392.7实施例458.692.4对比例145.490.1
84.磁性纳米粒子通过叶酸进行改进处理，改进中加入的改性石墨烯，通过石墨烯与壳聚糖溶液配合，从而提高石墨烯与叶酸、磁性纳米粒子的相容性，提高原料之间的连接度；改性石墨烯通过石墨烯进行改进处理，能够提高原料之间的搭配效果，从而促进叶酸与磁性纳米粒子结合效果，从而提高磁性纳米粒子的改进效果；进而改进产品对细胞的分离效果，经过测试，分离率最高可达到61.3％。
85.因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
86.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。