一种罗汉果酸甲衍生物及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及一种罗汉果酸衍生物，具体涉及一种罗汉果酸甲衍生物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.食品腐败变质是指食品由于受到各种内外因素的影响，其原有的化学性质、物理性质或感观性状发生了一系列变化，降低或失去其原有的营养价值或商品价值的过程；或指食品在一定环境因素影响下，由微生物作用而发生食品成分与感官性状的各种变化。食品腐败变质的过程实质上是食品中蛋白质、碳水化合物、脂肪等被微生物代谢分解或自身组织酶进行的某些生化过程。例如新鲜的肉、鱼类的后熟，粮食、水果的呼吸作用等都可以引起食品成分的分解、食品组织溃破和细胞膜破裂，为微生物的广泛侵入提供条件，结果导致各类食品的腐败变质。
3.食品腐败变质不仅降低食品的营养价值，使人产生厌恶感，而且还可产生各种有毒有害物质，引起食用者发生急性中毒或产生慢性毒害。食品的腐败变质是各类食品中普遍存在的实际问题。据估计，全世界每年约有10％
‑
20％的食物损失于各种腐败变质，因此造成了巨大的经济损失。
4.食品腐败变质是食品本身、环境因素和微生物作用三者相互影响、相互作用的结果，其中微生物和食品中的酶起了主导作用。为了延长食品的保质期，人们常常在食品加工中添加防腐剂，从而使微生物丧失活性、延缓或阻止其生长。目前，国内外实际食用的食品防腐剂仍然以化学合成的防腐剂为主，如苯甲酸纳、山梨酸钾等等。这些合成防腐剂在常规的使用量下，防腐效果并不十分理想，因此人们往往超量使用，长此以往将对人体造成伤害。
5.在目前食品领域常用的防腐剂主要是酸型防腐剂，比如苯甲酸，山梨酸，丙酸等，其防腐作用主要取决于它们的未解离的酸分子，因此其防腐的作用收到了ph的限制，在碱性介质中防腐作用下降甚至消失。酯型的防腐剂相对在ph5
‑
8的范围均有较好的效果，而且副作用要低。常用的酯型防腐剂包括对羟基苯甲酸酯，富马酸酯，但是酯型防腐剂的问有特殊气味，影响食物口感。
6.目前防腐剂研究的热点是来自于天然植物或动物中提取的成分，比如果胶分解物，儿茶素，壳聚糖等。天然防腐剂对人体无副作用，而且一般都没有不良气味，是目前食品防腐剂研究的热点。
7.现有技术有报道罗汉果提取物具有一定的抑菌作用，但是其有效成分还未知。本发明探究了罗汉果酸酸酯衍生物的防腐、抑菌作用，为新的天然防腐剂的研发提供借鉴意义。


技术实现要素：

8.为了进一步扩展罗汉果的应用领域，特别是在开发一类含有罗汉果活性成分的防
腐剂，本发明利用罗汉果酸甲和羟烷基磺酸盐进行酯化反应，所得衍生物具有改善的溶解性和抑菌性能。
9.一种罗汉果酸甲衍生物，结构式如式(i)所示：
[0010][0011]
其中
‑
(ch2)n
‑
so3m，n为1
‑
4的整数，m为k或na。
[0012]
进一步地，r为
‑
ch2‑
so3m，
‑
(ch2)2‑
so3m，
‑
(ch2)3‑
so3m或
‑
(ch2)4‑
so3m。
[0013]
罗汉果酸是从罗汉果根部的提取物成分，国内学者已经对分离出来的罗汉果酸进行分离和坚定。国内学者王雪芬等从罗汉果根乙醇提取物的乙酸乙酯部位已分离了多种游离的罗汉果酸，包括罗汉果酸甲、罗汉果酸乙、罗汉果酸丙、罗汉果酸丁、罗汉果酸戊(王雪芬等，1996，1998；斯建勇等，1999)。国内学者卢凤来等从罗汉果根中定性并定量分析了两种水溶性较好的三萜酸糖苷——罗汉果酸苷甲ⅱ、罗汉果酸苷乙ⅱ(卢凤来等，2010)
[0014]
罗汉果酸甲，罗汉果酸乙的化学结构如下所示：
[0015][0016]
罗汉果酸丙，罗汉果酸丁的化学结构如下所示：
[0017][0018]
罗汉果酸水溶性极差，限制了其使用方式。再加上罗汉果酸在天然植物中的含量稀少、分离纯化难度较大、应用研究还处在初级阶段等原因，导致其在食品、保健品、化妆品及药品等领域的应用都受到了局限。发明人在前的专利cn202110597748.4报道了一种酰化
的罗汉果酸衍生物，具有抗炎的活性。是利用罗汉果酸上的羟基进行酰化反应，其溶解性提高，并且具有了新的抗炎的活性。本发明中，发明人针对罗汉果酸甲上的羧基进行酯化反应，发明人预料不到地发现，以羟烷基磺酸钠和罗汉果酸甲酯化反应后，不仅罗汉果酸甲衍生物的溶解度明显提升，而且还具有了改善的抑菌活性，可以作为食品中防腐剂使用。为罗汉果的应用拓宽了应用领域，也提供了一种新的天然防腐剂的研发思路。
[0019]
本发明还提供了式(i)所示的罗汉果酸甲衍生物的制备方法，是罗汉果酸甲和羟烷基磺酸盐酯化反应得到。
[0020]
优选地，式(i)所示的罗汉果酸甲衍生物的制备采用酰氯酯化法，合成路线如下：
[0021][0022]
进一步地，式(i)所示的罗汉果酸甲衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0023]
(s1)将罗汉果酸甲和过量二氯亚砜反应，反应完毕后蒸除过量氯化亚砜和有机溶剂；
[0024]
(s2)向(s1)体系中加入羟烷基磺酸盐和高极性有机溶剂，加热搅拌条件下反应，反应结束后，加入液碱调节体系ph为弱碱性，经过后处理即得产物。
[0025]
步骤(s1)中是二氯甲烷，二氯乙烷，石油醚，乙酸乙酯等常规中低极性有机溶剂中进行；反应温度40
‑
60℃，反应时间4
‑
6h，尾气用液碱吸收。溶剂加入量是罗汉果酸甲质量的0.5
‑
1倍；优选地。步骤(s1)中加入少量的dmf做催化剂。
[0026]
步骤(s2)中，所述高极性有机溶剂为dmf，反应温度30
‑
50℃，反应时间8
‑
15h，反应结束后用碱液调节ph至8.5
‑
10。所述碱液没有特别的限定，比如稀的naoh，koh，饱和nahco3，饱和khco3中的至少一种。所述后处理没有特别的限定，在本发明一个具体实施方式中，是加入液碱调节ph后，静置分层，取有机层，加入无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，用乙醇重结晶，得白色晶体。
[0027]
进一步地，步骤(s1)二氯亚砜和步骤(s2)的羟烷基磺酸盐缓慢滴加，一般在0.5
‑
1h内滴加完毕即可。步骤(s1)和步骤(s2)都属于放热反应，缓慢滴加有利于控制反应平稳进行。
[0028]
进一步地，罗汉果酸甲，二氯亚砜和羟烷基磺酸盐的摩尔比为1:3
‑
5：1
‑
1.5。
[0029]
式(i)所示的罗汉果酸甲衍生物也可以通过常规的成酯方法制备，比如直接酯化
法，酯交换法，本发明优选为上述合成路线中所示的酰氯酯化法。直接酯化法和酯交换法合成温度较高，产率较低；而先将罗汉果酸甲和氯化亚砜反应转化为酰氯后，此步骤反应完全，收率高，所得罗汉果酸甲的酰氯化衍生物反应活性高，反应温度低，收率高。因此，综合考虑，本发明优选采用酰氯酯化法，但是本领域的常规酯化方法也涵盖在本发明的实质内容中，并不应该从本发明保护范围中排除。
[0030]
按照上述比例的原料配制而得的防腐剂，可以有效保存食物，原料都是来自于天然产物，绿色环保安全，在广泛的ph范围内都能保持足够的防腐、抑菌作用，并且无不良味道，适合食品防腐剂使用。
[0031]
本发明还提供了式(i)所示罗汉果酸甲衍生物在防腐、抑菌中的用途。
[0032]
进一步地，式(i)所示罗汉果酸甲衍生物在食品添加剂中的用途；所述食品添加剂为防腐剂。
附图说明
[0033]
图1是式(i)所示的罗汉果酸甲衍生物的化学结构。
具体实施方式
[0034]
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0035]
实施例1
[0036]
(s1)取罗汉果酸甲4.72g(0.01mol)，4g乙酸乙酯和石油醚混合溶剂(v/v＝1:1)，0.05g无水dmf投入反应容器，在50℃搅拌条件下缓慢滴加3.57g二氯亚砜(0.03mol)，在1h内滴加完毕，保持50℃恒温反应5h，反应期间尾气用10％naoh水溶液吸收，反应结束后蒸出过量的氯化亚砜和溶剂；
[0037]
(s2)向(s1)反应容器中缓慢加入1.61g羟甲基磺酸钠(0.012mol)和5g无水dmf的混合溶液，在1h内滴加完毕，控制体系温度在40℃反应12h，反应结束后用饱和nahco3调节ph至9
‑
9.5范围内，静置分层，取有机层，加入3g无水硫酸钠，静置3h除去溶剂中的水后，过滤，蒸出溶剂，用50℃无水乙醇重结晶，得到白色晶体5.06g，hplc纯度99.2％，收率85.3％。为式(i)结构中n＝1的化合物，为化合物1。
[0038]
产物经过1hnmr(cdcl3)：0.76(3h，s，c28)，0.93(3h，d，c21),1.18(3h，d，c29),1.22(3h，s，c18),1.38(1h，m，c20)，1.45(1h，d,c8),1.56(2h，m，c2)，1.61(1h，t，c17),1.85(3h，s，c26)，2.13(1h，d，c10)，2.52(1h，d，c12
‑
h
a
)，2.62(1h，d，c4),2.70(1h，d，c12
‑
h
b
)，3.55(1h，d，c19
‑
h
a
)，3.81(1h，t，c3),4.65(1h，d，c19
‑
h
b
)，5.63(2h，s)，6.87(1h，t，c24)。部分h的化学位移，特别是亚甲基上h呈多重峰，混在在一起，难以标引。esi:ms(m
‑
na):565.3。
[0039]
实施例2
[0040]
其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(s2)1.61g羟甲基磺酸钠替换为1.78g羟乙基磺酸钠(0.012mol)。最终得到白色晶体5.23g，hplc纯度99.0％，收率86.0％。为式(i)结构中n＝2的化合物，为化合物2。
[0041]1hnmr(cdcl3)：0.76(3h，s，c28)，0.93(3h，d，c21),1.18(3h，d，c29),1.22(3h，s，c18),1.38(1h，m，c20)，1.45(1h，d,c8),1.56(2h，m，c2)，1.61(1h，t，c17),1.85(3h，s，c26)，2.13(1h，d，c10)，2.52(1h，d，c12
‑
h
a
)，2.62(1h，d，c4),2.70(1h，d，c12
‑
h
b
)，3.24(2h，
t)，3.55(1h，d，c19
‑
h
a
)，3.81(1h，t，c3)，4.18(2h，t)，4.65(1h，d，c19
‑
h
b
)，6.87(1h，t，c24)。esi:ms(m
‑
na):551.3。
[0042]
实施例3
[0043]
其他操作和条件和实施例1相同，区别在于步骤(s2)1.61g羟甲基磺酸钠替换为2.11g的4
‑
羟基丁基磺酸钠(0.012mol)。最终得到白色晶体5.49g，hplc纯度99.1％，收率86.3％。为式(i)结构中n＝4的化合物，为化合物3。
[0044]1hnmr(cdcl3)：0.76(3h，s，c28)，0.93(3h，d，c21),1.18(3h，d，c29),1.22(3h，s，c18),1.38(1h，m，c20)，1.45(1h，d,c8)，1.61(1h，t，c17),1.85(3h，s，c26)，2.13(1h，d，c10)，2.52(1h，d，c12
‑
h
a
)，2.62(1h，d，c4),2.70(1h，d，c12
‑
h
b
)，3.26(2h，t)，3.55(1h，d，c19
‑
h
a
)，，3.81(1h，t，c3)，4.02(2h，t)，4.65(1h，d，c19
‑
h
b
)，6.87(1h，t，c24)。璜丁基上
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
ch2‑
so3na中间的两个亚甲基上h和罗汉果酸甲中其他亚甲基的h混在一起，无法分辨。esi:ms(m
‑
na):579.3。
[0045]
经过测试，化合物1在水中的溶解度为1.43g/100g水，化合物2在水中的溶解度为1.36g/100g水，化合物3在水中的溶解度为1.27g/100g水，而罗汉果酸甲在水中溶解度仅为0.13g/100g水。说明本发明得到的罗汉果酸甲和羟烷基磺酸钠酯化得到的衍生物溶解度明显改善，主要在分子结构中引入了高亲水性的磺酸钠基团。
[0046]
应用例抑菌率的测试
[0047]
培养基为牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，氯化钠5g，加水煮沸使各成分充分溶解，定容至1000ml，冷却至常温后，用稀的naoh或hcl调节ph分别为5
±
0.1，6
±
0.1，7
±
0.1，8
±
0.1，9
±
0.1，所得培养基在121℃灭菌15min，用于细菌的培养。
[0048]
细菌：采用大肠杆菌(escherichia coli)。
[0049]
细菌接种于培养基，进行活化，具体是在37℃摇床培养至560nm出吸光度为0.2，分装到无菌试管中，每个无菌试管中有10ml培养基，分别加入2mg和5mg的式(i)化合物(分别是实施例1，实施例2，实施例3制备得到)，以及罗汉果酸甲，并用hcl或者naoh调节至不同的ph值，在37℃水浴恒温振荡器器中进行培养，为实验组；以保存在4℃冰箱中不加入式(i)化合物的无菌培养基作为空白对照组，测试t时刻560nm处的吸光度。抑菌率(i)计算公式如下：
[0050][0051]
其中
△
a
t
为空白对照和实验组在t时刻在560nm处吸光度(a
560
)的增量，
△
a0为空白对照和实验组在接种时(t＝0)时a
560
的增量。
[0052]
抑菌率每个数据平行测试5组，取平均值，结果如下表1(罗汉果酸甲衍生物添加量5mg/10ml)和表2(罗汉果酸甲衍生物添加量2mg/10ml)所示：
[0053]
表1
[0054]
[0055][0056]
表2
[0057][0058]
安全性测试
[0059]
(1)毒理学安全评估：采用12周龄雌性小鼠30只，随机分分为5组，每组6只，分别是实验组(灌胃实施例化化合物1
‑
3，以及罗汉果酸甲，灌胃剂量按照0.1g/kg)，和空白对照组(灌胃相同剂量生理盐水)，一天一次，连续灌胃30天后，观察小鼠体征，排卵期周期，血液指标，生化指标，肝肾功能，蛋白，脂肪，代谢，均未发现明显影响，表明小鼠食用后没有明显的毒性反应。说明本发明对罗汉果酸甲进行酯化改性后得到的衍生物并没有显示出毒性。
[0060]
(2)急性毒性评估：对20只12周龄小鼠，雌雄各半，灌胃剂量5g/kg，持续一周，未发现小鼠有中枢兴奋或抑制状态，未见肌张力改变或肌震颤症状，小鼠活动、进食、睡眠正常，未见呼吸异常，一周后未发现小鼠死亡。