四种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及中药化学技术领域，特别涉及四种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法。


背景技术：

2.栀子别名黄栀子、山栀子、白蟾，是茜草科植物栀子gardenia jasminoides ellis的干燥成熟果实，属卫生部颁布的第一批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用。始载于《神农本草经》，在我国各地广泛分布，为临床常见中药，历版药典均有记载。
3.栀子是一种常绿灌木。性苦寒、无毒，归心、肝、肺、胃经。具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒之功效；外用消肿止痛。临床用于热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮痈等症.外治扭挫伤痛。目前对栀子的化学成分和生物活性的研究主要集中在环烯醚萜类成分，并已证实其活性成分具有保肝利胆、抗炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种药理活性，但是对环烯醚萜苷类化合物的研究还需进一步提高。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供四种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法，可以有效解决背景技术中的问题。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
6.四种环烯醚萜苷类化合物，包括化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)和化合物(4)，其特征在于，所述化合物(1)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]
‑
6β
‑
hydroxy
‑
gardoside，其化学结构式为
[0007][0008]
所述化合物(2)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]shanzhiside，其化学结构式为
[0009][0010]
所述化合物(3)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]ixoside，其化学结构式为
[0011][0012]
所述化合物(4)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]geniposidic acid，其化学结构式为
[0013][0014]
四种环烯醚萜苷类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0015]
s1：在室温下，用乙醇对栀子进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，减压回收溶剂，并浓缩得乙醇浸膏；
[0016]
s2：将上述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚浸膏，乙酸乙酯浸膏以及水部位浸膏；
[0017]
s3：将上述水部位浸膏，用少量纯水溶解，利用大孔树脂柱进行梯度洗脱，回收溶剂后得到4个洗脱组分fra～fr d；
[0018]
s4：取fr c，用甲醇溶解过滤，利用反向色谱柱进行梯度洗脱，回收溶剂后得到4个洗脱组分fr c20、fr c30、fr c50和fr c80；
[0019]
s5：取fr c30，用少量二氯甲烷
‑
甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层tlc分析，合并相同流分后获得6个组分fr c30
‑
1～fr c30
‑
6；
[0020]
s6：取组分fr c30
‑
1，用少量二氯甲烷
‑
甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层tlc分析，合并相同流分后获得3个组分fr c30
‑1‑
1～fr c30
‑1‑
3；取组分fr c30
‑1‑
1，用甲醇溶解过滤，经过rp
‑
18高效液相色谱粗分离，在保留时间为42.0
‑
43.0min得到化合物(1)；
[0021]
s7：取组分fr c30
‑
3，用少量二氯甲烷
‑
甲醇溶解，并进行凝胶柱层析实施等度洗脱；采用薄层tlc分析，合并相同流分后获得5个组分fr c30
‑3‑
1～fr c30
‑3‑
5；取组分fr c30
‑3‑
2，用甲醇溶解过滤，经过rp
‑
18高效液相色谱粗分离，在保留时间为42.0
‑
44.0min得到化合物(2)；取组分fr c30
‑3‑
3，用甲醇溶解过滤，经过rp
‑
18高效液相色谱粗分离，在保留时间为59.0
‑
62.0min和65.0
‑
67.0min分别得到化合物(3)和化合物(4)。
[0022]
优选的，上述步骤s1中所述乙醇的浓度为85％。
[0023]
优选的，上述步骤s3中所述的大孔树脂为d101，梯度洗脱采用的洗脱液依次为水、体积比为30：70的乙醇
‑
水、体积比为50：50的乙醇
‑
水以及体积比为80：20的乙醇
‑
水。
[0024]
优选的，上述步骤s4中所述的反向色谱为ods，梯度洗脱采用的洗脱液依次为体积比为20：80的甲醇
‑
水、体积比为30：70的甲醇
‑
水、体积比为50：50的甲醇
‑
水以及体积比为80：20的甲醇
‑
水。
[0025]
优选的，上述步骤s5中所述的凝胶柱层析的凝胶为sephadex lh
‑
20，等度洗脱剂为二氯甲烷
‑
甲醇，其中，二氯甲烷与甲醇的体积比为50:50。
[0026]
优选的,上述步骤s6和s7中所述的凝胶柱层析的凝胶为sephadex lh
‑
20，等度洗脱剂为二氯甲烷
‑
甲醇，其中，二氯甲烷与甲醇的体积比为70:30。
[0027]
优选的,所述高效液相色谱粗分离采用的色谱柱的规格为cosmosil5c18
‑
ms
‑
ii，5μm，20*250mm；其采用的流速为8ml/min，流动性为甲醇/水。
[0028]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0029]
本发明提供的四种环烯醚萜类化合物作为一种天然化合物，对正常细胞毒性较低，副作用较小；在其细胞毒性浓度以下，还表现出显著的抗炎作用，且具有有效剂量适中，疗效显著，毒副作用小等优点，且制备方法高效，稳定性高，因此，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0030]
图1
‑
8为本发明中的化合物(1)的1h nmr、
13
c nmr、2d
‑
nmr、ms、hplc图；
[0031]
图9
‑
16为本发明中的化合物(2)的1h nmr、
13
c nmr、2d
‑
nmr、ms、hplc图；
[0032]
图17
‑
24为本发明中的化合物(3)的1h nmr、
13
c nmr、2d
‑
nmr、ms、hplc图；
[0033]
图24
‑
32为本发明中的化合物(4)的1h nmr、
13
c nmr、2d
‑
nmr、ms、hplc图；
[0034]
图33示出了本发明中四种环烯醚萜类化合物对raw 264.7细胞的细胞毒性的结果图；
[0035]
图34示出了本发明中四种环烯醚萜类化合物对lps诱导的raw 264.7细胞no释放的抑制率的柱状统计图。
具体实施方式
[0036]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0037]
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0038]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0039]
实施例1
[0040]
四种环烯醚萜苷类化合物，包括化合物(1)、化合物(2)、化合物(3)和化合物(4)，其特征在于，所述化合物(1)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]
‑
6β
‑
hydroxy
‑
gardoside，其化学结构式为
[0041][0042]
所述化合物(2)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]shanzhiside，其化学结构式为
[0043][0044]
所述化合物(3)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]ixoside，其化学结构式为
[0045][0046]
所述化合物(4)的结构经检测确定为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]geniposidic acid，其化学结构式为
[0047][0048]
实施例2
[0049]
四种环烯醚萜苷类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0050]
步骤一，在室温下，将晾干的17kg栀子果实粉碎，用85％乙醇进行多次冷浸、渗漉提取，合并提取液，接着，55℃下减压回收溶剂，浓缩得乙醇浸膏3.0kg；将所述乙醇浸膏混悬于水，然后分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、以及水部位浸膏2600g。
[0051]
步骤二，取上述水部位浸膏2600g，用少量纯水溶解备用。同时，5kg d101大孔树脂用纯水装柱，纯水洗脱至柱面不再下降，湿法上样，再依次用纯水、体积比为30：70的乙醇
‑
水、体积比为50：50的乙醇
‑
水以及体积比为80：20的乙醇
‑
水实施梯度洗脱，控制流速在1000ml/h，不同比例的洗脱溶剂作为一个流分浓缩，回收溶剂后得到4个洗脱组分水洗脱组分(fra，1000g)、30％乙醇水洗脱组分(fr b，300g)、50％乙醇水洗脱组分(fr c，800g)、80％乙醇水洗脱组分(fr d，350g)。
[0052]
步骤三，取fr c，用少量甲醇溶解过滤备用。ods反向色谱用纯水装柱，纯水洗脱至柱面不再下降，湿法上样，再依次用体积比为20：80的甲醇
‑
水、体积比为30：70的甲醇
‑
水、体积比为50：50的甲醇
‑
水以及体积比为80：20的甲醇
‑
水实施梯度洗脱，控制流速在1000ml/h，不同比例的洗脱溶剂作为一个流分浓缩，回收溶剂后得到4个洗脱组分，分别是20％甲醇水洗脱组分(fr c20)、30％甲醇水洗脱组分(fr c30)、50％甲醇水洗脱组分(fr c50)以及80％甲醇水洗脱组分(fr c80)。
[0053]
步骤四，取30％甲醇水洗脱组分fr c30，用少量二氯甲烷
‑
甲醇溶解，并进行sephadex lh
‑
20凝胶(15
×
250mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷
‑
甲醇，体积比为50：50，实施等度洗脱；控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩。采用薄层tlc分
析，合并相同流分后获得6个组分fr c30
‑
1～fr c30
‑
6。
[0054]
步骤五，取组分fr c30
‑
1，用少量二氯甲烷
‑
甲醇溶解，并进行sephadex lh
‑
20凝胶(15
×
350mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷
‑
甲醇，体积比为70:30，实施等度洗脱；控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩，采用薄层tlc分析，合并相同流分后获得3个组分fr c30
‑1‑
1～fr c30
‑1‑
3，取组分fr c30
‑1‑
1，用甲醇溶解过滤，经过rp
‑
18高效液相色谱粗分离(cosmosil 5c18
‑
ms
‑
ii，5μm，20
×
250mm，流速：8ml/min，波长：254nm)，流动相为甲醇：水(25：75,v/v)，在保留时间为42.3min左右得到化合物(1)(23.7mg)。
[0055]
步骤六，取组分fr c30
‑
3，用少量二氯甲烷
‑
甲醇溶解，并进行sephadex lh
‑
20凝胶(15
×
350mm)柱层析，其中使用的洗脱剂为二氯甲烷
‑
甲醇，体积比为70:30，实施等度洗脱；控制流速在200ml/h，每接100ml作为一个流分浓缩，采用薄层tlc分析，合并相同流分后获得5个组分fr c30
‑3‑
1～fr c30
‑3‑
5。取组分fr c30
‑3‑
2，用甲醇溶解过滤，经过rp
‑
18高效液相色谱粗分离(cosmosil 5c18
‑
ms
‑
ii，5μm，20
×
250mm，流速：8ml/min，波长：254nm)，流动相为甲醇：水(28：72,v/v)，在保留时间为42.3min左右得到化合物(2)(33.9mg)；取组分fr c30
‑3‑
3，用甲醇溶解过滤，经过rp
‑
18高效液相色谱粗分离(cosmosil 5c18
‑
ms
‑
ii，5μm，20
×
250mm，流速：8ml/min，波长：254nm)，流动相为甲醇：水(30：70,v/v)，分别在保留时间为42.3min左右和42.3min左右得到化合物(3)(45.2mg)和(4)(52.8mg)。
[0056]
实施例3
[0057]
本实施例对实施例1中的四种环烯醚萜类化合物的结构进行鉴定，具体的操作和结果如下：
[0058]
化合物(1)的结构鉴定
[0059]
黄色不定性粉末，hr
‑
esi ms(negative)给出准分子离子峰[m
‑
h]
‑
m/z 595.1078，提示其分子量为596；结合1h和
13
c nmr(表1)确定其分子式为c
27
h
32
o
15
。
[0060]
参见图1～8，结合表1，1h和
13
c nmr谱图显示该化合物含有一个环烯醚萜苷元片段，一个β葡萄糖以及一个苯丙素片段。首先是环烯醚萜苷元片段，1h nmr上δ
h 7.26(1h,s,h
‑
3)和5.37(1h,s,h
‑
1)是环烯醚萜二氢呋喃环上的特征氢，而δ
h 5.12(2h,s,h
‑
10)则是环外双键氢信号。碳谱中δ
c 95.5(c
‑
1)、150.5(c
‑
3)、109.5(c
‑
4)、36.1(c
‑
5)和41.8(c
‑
9)分别属于环烯醚萜二氢呋喃环上的碳，δ
c 151.0(c
‑
8)和110.5(c
‑
10)是环外双键碳信号，δ
c 74.4(ch)和72.9(ch)是环烯醚萜苷元上c
‑
6和c
‑
7的信号。该环烯醚萜苷元片段的存在也可通过分析1h
‑1h相关、hsqc相关及hmbc相关得到确认。δ
h 4.50(1h,d,j＝8.0hz)是β
‑
葡萄糖糖端基氢信号。此外，1h
‑
nmr谱中两个芳环氢δ
h 7.02(2h,s,h
‑
2”,6”)、一对双键氢7.56(1h,d,j＝15.9hz,h
‑
7”),6.57(1h,d,j＝15.9hz,h
‑
8”)、两个甲氧基δ
h 3.80(6h,s,3”,5
”‑
och3)的存在，可推断该化合物分子中有反式芥子酰基的存在。综合这三个片段，化合物(1)是一个含有芥子酰基取代的环烯醚萜苷化合物。根据c
‑
6和c
‑
7的碳氢信号，初步推断c
‑
6和c
‑
7均连有
‑
oh。文献证明，当h
‑
6和h
‑
7的耦合常数小于1.0hz，且c
‑
3和c
‑
4的位移差为δδ
c
＝41，可证明6
‑
oh为β构型。根据文献比对，7
‑
oh也是β构型。综合1h nmr和
13
c nmr谱图信息，化合物(1)含有的环烯醚萜苷与已知化合物zaluzioside(6β
‑
hydroxy
‑
gardoside methyl ester)十分相似，仅在11位少了一个甲酯取代。hmbc谱中显示葡萄糖的h
‑
6'(δ
h 4.36,4.28))与芥子酰的c
‑
9”(δ
c 166.5)处相关，这提示我们芥子酰基连在环烯醚萜苷上葡萄糖的6位，葡萄糖的c
‑
6'(δ
c 63.3)向高场位移也证明了这一点。因此，推断该化合物(1)为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]
‑
6β
‑
hydroxy
‑
gardoside，将其简称gardeoside a。
[0061]
化合物(2)的结构鉴定
[0062]
黄色不定性粉末，hr
‑
esi ms(posive)给出准分子离子峰[m na] m/z 621.1831，提示其分子量为598；结合1h和
13
c nmr(表1)确定其分子式为c
27
h
34
o
15
。
[0063]
参见图9～16，结合表1，1h和
13
c nmr谱图显示该化合物也是一个含有芥子酰基取代的环烯醚萜苷化合物。对比1h nmr和
13
c nmr谱图信息，化合物(2)含有的环烯醚萜苷与已知化合物shanzhiside十分相似。此外，hmbc谱中显示葡萄糖的h
‑
6'(δ
h 4.36,4.19))与芥子酰的c
‑
9”(δ
c 166.6)处相关，这提示我们芥子酰基连在环烯醚萜苷上葡萄糖的6位，葡萄糖的c
‑
6'(δ
c 63.3)向高场位移也证明了这一点。因此，推断该化合物(2)为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]shanzhiside，将其简称gardeoside b。
[0064]
化合物(3)的结构鉴定
[0065]
黄色不定性粉末，hr
‑
esi ms(posive)给出准分子离子峰[m na] m/z 617.0876，提示其分子量为594；结合1h和
13
c nmr(表1)确定其分子式为c
27
h
30
o
15
。
[0066]
参见图17～24，结合表1，1h和
13
c nmr谱图显示该化合物也是一个含有芥子酰基取代的环烯醚萜苷化合物。1h nmr上h
‑
7(δ
h 6.67)是环上双键氢信号，δ
h 7.30(1h,s,h
‑
3)和5.77(1h,d,j＝3.0hz,h
‑
1)是环烯醚萜二氢呋喃环上的特征氢，以及δ
h 4.46处的β
‑
葡萄糖糖端基氢信号h
‑
1'(1h,d,j＝8.0hz)，上述信号提示化合物(3)含有的环烯醚萜苷与已知化合物ixoside十分相似。此外，hmbc谱中显示葡萄糖的h
‑
6'(δ
h 4.28,4.19))与芥子酰的c
‑
9”(δ
c 166.7)处相关，这提示我们芥子酰基连在环烯醚萜苷上葡萄糖的6位，葡萄糖的c
‑
6'(δ
c 63.5)向高场位移也证明了这一点。因此，推断该化合物(3)为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]ixoside，将其简称gardeoside c。
[0067]
化合物(4)的结构鉴定
[0068]
黄色不定性粉末，hr
‑
esi ms(posive)给出准分子离子峰[m na]

m/z 603.1529，提示其分子量为580；结合1h和13c nmr(表1)确定其分子式为c
27
h
32
o
14
。
[0069]
参见图25～32，结合表1，1h和
13
c nmr谱图显示该化合物(4)是一个含有芥子酰基取代的环烯醚萜苷化合物。对比1h nmr和
13
c nmr谱图信息，化合物(2)含有的环烯醚萜苷与已知化合物geniposidic acid十分相似。此外，hmbc谱中显示葡萄糖的h
‑
6'(δ
h 4.30,4.19))与芥子酰的c
‑
9”(δ
c 166.7)处相关，这提示我们芥子酰基连在环烯醚萜苷上葡萄糖的6位，葡萄糖的c
‑
6'(δ
c 63.4)向高场位移也证明了这一点。因此，推断该化合物(4)为6'
‑
o
‑
[(e)
‑
sinapoyl]geniposidic acid，将其简称gardeoside d。
[0070]
表1化合物(1)
‑
(4)在dmso
‑
d6中的1h nmr(400mhz)和13c nmr(100mhz)数据：
[0071]
[0072]
[0073][0074]
实施例4
[0075]
本实施例对四种天然环烯醚萜类化合物进行体外细胞毒性试验，其中采用的细胞株为raw264.7细胞，具体的试验方法和结果如下：
[0076]
mtt法：将raw 264.7细胞接种于96孔细胞培养板，每孔200μl(含有10
×
104个肿瘤细胞)，在37℃、5％co2培养箱中，并且在含10％fbs的dmem培养基中，培养24h，加入不同浓度(0、25、50μg/ml)的本发明提供的四种天然环烯醚萜类化合物中的任一种，继续培养48h；实验结束前4h加20μl的mtt(5mg/ml)，继续在37℃、5％co2条件下孵育4h，吸取培养液后加入二甲基亚砜150μl，振摇至结晶完全溶解，然后于酶标仪检测其吸光度，检测波长570nm，参考波长630nm，计算本发明化合物对raw264.7细胞的生存率，实验结果如图33所示。
[0077]
由图33可知，四种天然环烯醚萜类化合物在本实验实施的浓度下均无明显的细胞
毒性。
[0078]
实施例5
[0079]
本实施例采用四种天然环烯醚萜类化合物进行了体外抗炎实验，其中采用的细胞株为raw264.7细胞，具体的实验方法和结果如下：
[0080]
将raw264.7细胞接种于24孔细胞培养板，每孔500μl，在37℃、5％co2培养箱中，并且在含10％fbs的dmem培养基中，培养24h，加入100ng/ml的脂多糖(lps)和本发明提供的四种天然环烯醚萜类化合物中的任一种，继续在37℃、5％co2条件下培养。24h后收集培养基上清，根据no测定试剂盒说明进行操作，测定no的释放抑制率。
[0081]
实验结果表明，如图34所示，四种天然环烯醚萜类化合物均能显著抑制lps诱导的巨噬细胞raw 264.7中no的释放(p＜0.01)，证明栀子环烯醚萜类化合物具有显著的体外抗炎活性。
[0082]
需要说明的是：本发明的四种环烯醚萜类化合物可应用在制备抗炎功能性食品及药物中。
[0083]
本发明可提供一种药物制剂，其包含治疗有效量的四种环烯醚萜类化合物的任意一种或几种以及其在药学上可接受的载体。值得说明的是，所述药学上可接受的载体例如选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、润滑剂、崩解剂、吸收促进剂以及表面活性剂中的一种或几种。
[0084]
上述药物制剂的剂型选自以下任一种：片剂，胶囊剂，丸剂，颗粒剂，混悬剂，口服液，涂剂，巴布剂，喷雾剂，粉针剂和水针剂。又如，当上述药物制剂采用注射剂时，所述注射剂可以是皮下注射剂、腹腔注射剂、肌肉注射剂以及静脉注射剂中的任一种。
[0085]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。