一株耐污小球藻及其在畜禽废弃物处理中的应用的制作方法

1.本发明属于畜牧养殖中的废弃物处理领域，具体涉及一株耐污小球藻及其在畜禽废弃物处理中的应用。


背景技术：

2.随着我国经济的迅猛发展，人民的生活水平逐渐提高，对畜产品的需求与日俱增，传统的养殖方式产生的畜禽养殖产品不足以满足市场需求，因此我国的畜牧养殖业不断朝着规模化、集约化的方向发展。养殖场的畜禽废弃通常是利用沼气工程进行处理，在处理了畜禽废弃物的同时，又能产生清洁能源沼气，可以实现废弃物的资源化利用，符合人类社会可持续发展的理念。但是随着沼气工程的推广利用，大中型养殖场就会产生大量集中的沼液，而沼液的浓度通常很高，富含大量氮、磷、钾等营养物质，若不经处理直接排放，易造成环境的二次污染。目前我国对沼液的处理存在许多问题，如没有足够的土地消纳，生化处理设备投入过大，效果较差等。
3.沼液是畜禽废弃物通过厌氧发酵后产生的液体，其成分及其复杂，除具有氮、磷、钾等大量营养元素和锌、钙、铁、锰等微量元素外，还含有丰富的氨基酸、生长素和矿质元素以及吲哚乙酸、乳酸菌、芽孢杆菌、赤霉素等元素。这些营养元素基本上是以速效养分形式存在的，因此，沼液的速效营养能力强，养分可利用率高，是多元的速效复合肥料，能迅速被动物和农作物吸收利用。因此，沼液虽然本身是一种废水，但是如果能够通过技术进行资源化利用，它就可以作为一种营养成分十分丰富的资源。
4.微藻是一种低等的单细胞光合生物，其光合能力强，生长速度快，生长周期短是微藻的主要优势，可在短期内大量吸收水体中的n、p等营养盐物质。微藻对生长环境要求低，适应能力极强，且易培养，在水池、河流、荒漠甚至戈壁等地生长。微藻的种类繁多，其生理学和生化特性应用广泛，在21世纪初，已发现藻类有三万多种，其中微藻占70％左右，不同种类微藻含有很多功能独特的脂肪、蛋白等生物活性物质。人工培养微藻的培养基需要含有充足的碳、氮、磷等元素，而这些元素在养殖沼液中大量存在，因此利用微藻处理净化沼液迅速成为畜禽环境生物工程领域的一个研究热点。微藻可以在光合作用下利用沼液中氮磷等营养盐进行同化吸收，实现高效的脱氮除磷作用，使沼液达到排放标准。
5.利用微藻处理沼液具有可行性，但是也存在技术难点，不同微藻对沼液的耐受程度不同，净化效果也不同。寻找一株对沼液具有良好耐受性的微藻藻株，该藻株可以在一定范围的沼液中生长良好，并能够高效去除沼液中氮、磷等物质。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有技术中不同微藻对沼液的耐受程度不同，净化效果也不同，缺少耐受性较好的微藻藻株的缺陷，提供一株耐污小球藻及其在畜禽废弃物处理中的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
8.本发明提供一株耐污小球藻dtg5，分类命名为chlorella vulgaris(chlorophyta)dtg5，该藻株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2021297，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为 2021年3月29日；其序列信息如seq id no.1所示，其序利与其它序利相似度低于97.6％。
9.本发明的一株小球藻dtg5分离于养殖场养殖废水多级排放池，分类属于绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，小球藻科，小球藻属，呈绿色，多为单细胞藻，少数为多细胞聚集，细胞形态呈球形或椭圆型，色素占细胞的一半或更多，有细胞核，直径约3～8μm。
10.本发明的小球藻dtg5分离于养殖场养殖废水多级排放池二号处理池的水样，其分离、纯化方法如下：将采集的水样，用200～300目的纱布单层过滤，取200μl过滤好的的水样于96孔板中，逐级稀释至8～10个孔，在显微镜下观察其中的优势藻种。
11.在固体培养基中加入稀释至一定程度的水样，用涂布棒均匀的划在固体培养基中，7～10天后，可见明显藻落，通过镜检寻找纯藻种，用接种环接种于装有液体培养基的1.5ml离心管中。放置培养箱中培养。
12.本发明的小球藻dtg5最适生长浓度测定步骤如下：采集东泰畜牧有限公司原沼液，与纯水按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32比例稀释后，接种筛选得到的微藻。
13.其中，所述小球藻dtg5的培养条件为：温度为25℃
±
1℃。
14.优先的，所述小球藻dtg5在沼液中培养时，光照强度为30
‑
40％(4000lux)，光暗比为12h:12h，每天早晚两次摇晃。
15.计算其1～12d相对生长速率，计算公式如下：k＝(inn2‑
inn1)/(t2‑
t1)
16.其中，k为相对生长速率，t1、t2为对应的培养时间；n1、n2分别为t1、t2时期的藻液的od
680
nm值。
17.本发明保护小球藻dtg5在畜禽废弃物处理中的应用中，尤其是沼液的净化中。
18.应用所述小球藻dtg5净化沼液的方法，包括：
19.将采集到的原沼液经过与纯水按照1:4最佳沼液生长浓度比例稀释，选用生长对数期的微藻(od
680 nm值为1.0左右)按1:10比例接种于稀释好的沼液中。
20.微藻对沼液中的高浓度氮、磷等有害物质均具有很好去除效果，但是研究发现养殖场直接产生的沼液浓度很高、浊度很大，光线难以透过，会严重影响微藻的光合作用，使微藻在沼液中的生长受到影响，甚至会导致其死亡，对沼液的净化效果就会降低。因此，可以采用稀释等预处里方法，降低沼液的浓度和使光线能够透过的程度。
21.沼液净化效果的检测指标为化学需氧量、总磷、总氮和氨态氮。
22.总氮和总磷等去除率(r)计算公式为：
23.r＝(c0－c
t
)/c0×
100％
24.其中，c0为初始总氮总磷等浓度；
25.c
t
为培养t天后的浓度(mg/l)。
26.本发明的有益效果在于：
27.本发明的小球藻dtg5，其在经过适当稀释的养殖场沼液中可以生长，利用沼液中的氮、磷、钾等营养物质作为自身生长的氮源、碳源，从而对沼液起到高效的脱氮除磷效果。本发明小球藻对沼液中的氨氮和总磷的去除效果较好，8 天的去除率分别可以达到98.14％和91.93％。
附图说明
28.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
29.图1为本发明耐污小球藻dtg5藻株在光学显微镜下的细胞形态；
30.图2为本发明中基于耐污小球藻dtg5构建的系统发育树；
31.图3为本发明分离纯化获得的耐污小球藻dtg5在不同浓度沼液下的生长曲线；
32.图4为本发明分离纯化获得的耐污小球藻dtg5与另外两株从沼液中分离纯化获得的藻株对沼液中氨氮去除的对比；
33.图5为本发明分离纯化获得的耐污小球藻dtg5与另外两株从沼液中分离纯化获得的藻株对沼液中总氮去除的对比；
34.图6为本发明分离纯化获得的耐污小球藻dtg5与另外两株从沼液中分离纯化获得的藻株对沼液中总磷去除的对比；
35.图7dtg5序列与其它物种的比较图。
具体实施方式
36.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
37.实施例1
38.藻株的分离、纯化
39.(1)样品的采集
40.本发明所涉及的藻株是从东泰畜牧养殖公司养殖废水多级排放池二号处理池中采集的水样中分离得到的。从选定地点采集水样，置于锥形瓶中，在4℃冰箱内保存备用。
41.(2)藻株的分离、纯化及培养
42.采用稀释分离法和固体培养基相结合的方法对微藻进行分离。将采集的藻液用200～300目的纱布过滤后，使用96孔板按梯度稀释沼液，稀释至适当的程度后在bg
‑
11固体培养基上利用涂布棒均匀涂布，直至平板上菌落单一，然后用光学显微镜观察经过培养后的微藻藻株是否细胞形态一致，若一致则达到分离的目的，若不一致则重复平板涂布的工作，直至细胞形态单一。用接种环接种于装有bg
‑
11液体培养基的1.5ml离心管中，置于光照培养箱中培养，直至肉眼可见绿色藻落后，每日不定时摇动离心管。
43.表1为bg
‑
11培养基配方及用量
44.bg11培养基配方
[0045][0046]
注：a5 co母液为h3bo
3 2.86g/l；mncl2·
4h2o 1.81g/１；znso4·
7h2o 0.222g/l；cuso4· 5h2o 0.079g/l；namoo4·
2h2o 0.390g/l；co(no3)2·
6h2o 0.0494g/l
[0047]
藻株的鉴定和保藏
[0048]
(1)藻株的鉴定
[0049]
藻株的鉴定先在光学显微镜下观察其形态，通过《中国淡水藻志》等书籍判断，然后再进行分子生物学鉴定。观察该藻株的细胞形态、大小、结构等特征。光学显微镜观察下的藻株形态如图1所示。
[0050]
本发明的所述耐污小球藻dtg5在显微镜下观察，藻体呈绿色，多为单细胞藻，少数为多细胞聚集，细胞形态呈球形或椭圆形，色素体占细胞一半或更多，有细胞核，直径约为3～8μm。对藻株进行分子生物学鉴定，以提取的dna为模板，引物选取绿藻门通用引物，引物序列为：上游引物(forward)rp8 5
’‑
acctgg ttg atc ctg cca gta g
‑3’
；下游引物(reverse)rp9 5
’‑
acc ttg tta cgactt ctc ctt cct c
‑3’
。进行pcr扩增，建立pcr反应体系均为50μl。其中 dna模板5～8μl，上游和下游引物各2μl，2
×
taq plus master mix为25μ l。pcr扩增反应条件设置为：94℃预变形5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃彻底延伸7min。反应完成后取5μl pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后筛选获得的阳性克隆产物，委托公司测序。
[0051]
其中，将得到的结果经ncbi数据库对比，获得测序结果后，从数据库下载相似的18rrna部分序列，用blast软件进行基因序列的同源性分析，发现其与小球藻(chlorellasp.)的相似性很高，属于小球藻的一个分支。用mega4.0 软件对所测序列与下载序列进行多序列对齐排列并采用neighbor
‑
joining算法构建进化树，用bootstrp method法检验进化树的稳定性和一致性，每个系统树500次自展分析。构建的耐污小球藻dtg5的系统进化树如图2所示。
[0052]
(2)藻株的保藏
[0053]
将筛选出的耐污小球藻dtg5接种于bg
‑
11培养基中，放入培养箱中培养，培养条件为：温度为25℃
±
1℃，光照为40％(4000lux)，光暗比为12h:12h，每天早晚两次摇晃。
[0054]
藻株生长至一定浓度，应用低温保存法和继代保存法进行保藏。
[0055]
其中，所述耐污小球藻dtg5应用低温保存法步骤为：将生长至一定浓度的小球藻dtg5离心后，用冻存液(10％dmso 90％bg
‑
11液体培养基)混匀，放置于4℃30min，然后移入
‑
20℃冰箱30min，最后移入液氮罐中长期保存。
[0056]
其中，所述耐污小球藻dtg5应用继代保存法步骤为：该藻株接种后放在适宜的光照条件下培养，待藻细胞生长繁殖达到较高密度，可见明显的条状或块状的藻细胞群时，再移至低温(4℃)、弱光的条件下保藏。
[0057]
上述经分离纯化获得并鉴定的耐污小球藻dtg5藻株，于2021年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心保藏编号为cctcc no：m 2021297。
[0058]
为探究上述分离、纯化、保藏的耐污小球藻dtg5藻株对畜禽废弃物的处理能力，将其应用于畜牧养殖沼液中富营养物质的去除中，本发明开展了在最佳沼液稀释浓度的培养小球藻dtg5的试验研究。
[0059]
下面的试验中，所有试验组均设置三个重复。
[0060]
藻株最适生长浓度探究
[0061]
在筛选到具有净化效果的小球藻dtg5后，探究该株微藻的沼液最适稀释浓度，本发明对从东泰畜牧公司采集的原沼液进行梯度稀释，然后接种该藻株，并将bg
‑
11培养基处理组设为对照组，每两天测定一次od680 nm，绘制各浓度沼液和对照组该藻株的生长曲线。小球藻dtg5在不同浓度沼液下的生长曲线如图3所示。其中，各处理组中1:4稀释组所述小球藻dtg5生物积累量最大，更适合藻株生长，并且生长趋势与bg
‑
11培养基培养基本保持一致，而且在od680 nm值要高于对照组。
[0062]
本试验所用养殖沼液取自东泰畜牧有限公司原沼液，为处理的沼液颜色浑浊且含有大量杂质，微藻的光合作用受到影响，无法正常生长，且未经处理的沼液含原虫、细菌、真菌等物质，尤其是真菌类生物会在培养基中迅速生长、抢占资源导致微藻生长缓慢甚，至不生长，因此对沼液做了高压灭菌和稀释等处理。
[0063]
表2 接种前沼液的理化指标(单位：mg/l)
[0064][0065]
将采集到的原沼液经过高压灭菌后与纯水按照1:4的比例稀释至最佳沼液生长浓度，将生长到对数期的微藻(od
680 nm为1.0左右)按照1:10的比例接种于稀释好的的沼液中，置于温度为25℃
±
1℃，光照强度为40％(4000lux)，光暗比为12h:12h的培养箱中培养。
[0066]
对比例
[0067]
将同时从东泰畜牧养殖公司养殖废水多级排放池二号处理池中于本发明的小球藻dtg5筛选出的栅藻dty2和小球藻dtg3作为对比，在同样的条件下培养至生长对数期用于本试验的研究。
[0068]
所有试验组共培养8天，每天早晚人工摇晃两次，每两天测定一次沼液理化指标。
[0069]
试验结果
[0070]
养殖沼液中氨氮的变化如图4所示。在接种8天的时间内，3株对沼液中的氨氮均有不同程度的去除能力。到第8天时，3株微藻对沼液中的氨氮去除率都达到80％以上，其中小球藻dtg5藻株的效果最好为98.14％，藻株dtg3和dty2分别为80.95％、85.14％。而cn 109234167a的发明专利中报道的小球藻第在21天的效果才与本技术接近。养殖沼液中总氮的变化如图5所示。
[0071]
养殖沼液中总磷的变化如图6所示。在接种8天的时间内，3株对沼液中的总磷均有
不同程度摄取吸收能力。其中，小球藻dtg5藻株对沼液中总磷的去除率为91.93％，明显高于藻株dtg3的55％和dty2的57.07％。而21天才能达到与本专利中的8天的处理类似的效果。图7为dtg5序列与其它物种的比较图。由此可见，本发明通过分离、纯化获得的小球藻dtg5藻株在一定浓度的沼液中具有耐受性，并且取其具有良好的净化作用，脱氮除磷效果显著。与其他两株微藻相比较，本发明的微藻具有更强的净化能力和对沼液耐受能力更好，具有更加实际的应用价值。
[0072]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。