一株阿氏芽孢杆菌NDFY-1及其应用的制作方法

一株阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1及其应用
技术领域
1.本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1及其应用。


背景技术：

2.肥桃是一种营养价值和药用价值都很高的水果，在国内外都有很高的需求量，因其香气扑鼻，口感香甜，含很多维生素，广受大众喜爱。但近年来，在市场以个头论价钱的需求驱动下，桃农为了增加肥桃产量，大量增加了氮肥和其他化学肥料以及除草剂、杀虫剂和其他农药的使用，破坏了土壤的生态，并引起了土壤有机质的降低、土壤板结、透气性差、酸化和微量元素的缺乏等问题，降低了肥桃的品质，严重影响了肥桃产业的发展。
3.微生物肥料作为增产、提质的农资被广泛应用。通过微生物肥料的作用可以使肥桃根际土壤养分提高，酶活性变强，从而达到促进肥桃品质提高的目的。因此，为肥桃微生物肥料的研发提供优良的菌株材料，展示了良好的应用潜力。
4.阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)是2009年发现的芽孢杆菌新种。近年来，阿氏芽孢杆菌在植物促生上相关报道越来越多，阿氏芽孢杆菌t61已被范美玉等人证实是一种耐镉的植物促生菌，可减轻镉对某些水稻品种的胁迫(范美玉等，2021)。paredes
‑
p
á
liz karina等人发现，阿氏芽孢杆菌rs025可以促进金属污染土壤中的密花米草种子发芽，发芽率提高2.5倍(paredes
‑
p
á
liz karina et al.,2016)。park等人从大豆根际分离的阿氏芽孢杆菌srb02被用作土壤改良剂，以减少土壤中亚硝酸盐对植物的毒性作用(park et al.,2017)。muham
‑
mad shakeel等发现阿氏芽孢杆菌可以促进植物吸收锌离子(muhammad et al.,2015)。专利cn105985922a公开了一株阿氏芽孢杆菌j5，其具有产生长素、产铁载体、产氨、产蛋白酶、耐盐、拮抗及解磷等功能，在改善土壤养分、消除盐渍化、促进植物生长和防治病害等方面应用前景广阔。专利cn112410244a公开了一株阿氏芽孢杆菌jnj266，其具有解磷解钾、产蛋白酶、iaa、铁载体等功能，盆栽试验证明该菌株具有良好的核桃促生抗旱功效。
5.但是，不同植物的根际土壤环境不同，分离自其他环境的阿氏芽孢杆菌能否在肥桃根际土壤中稳定定殖并发挥作用是难以预期的。目前还未见有改善肥桃根际土壤养分、促进肥桃品质提高的阿氏芽孢杆菌的相关报道。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1及其应用。该阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1分离自山东省泰安市肥城市肥桃健康植株的根系土壤。该菌株具有优异的产iaa、解磷、解钾以及产铁载体的功效；发酵性能好，发酵液中活菌数量高；利用该菌株能达到促进肥桃生长发育、提高土壤肥料的效果。
7.具体的，本发明涉及以下技术方案：
8.本发明的第一方面，提供一株阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1，该菌株已于2021年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称
cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：cgmcc no.23131。
9.所述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的菌落形态特征为：
10.在lb固体培养基上的菌落形态为近圆形，菌落大小为2
‑
4mm，表面扁平湿润，边缘平整，乳白色，不透明，革兰氏染色阳性。
11.所述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的生理生化特征为：
12.该菌株h2s、吲哚、硝酸盐还原、丙二酸盐、葡萄糖产酸、蔗糖产酸试验呈阳性；v
‑
p试验、明胶液化反应呈阴性；可在nacl浓度为7％和10％的lb液体培养基中生长。
13.所述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的分子生物学特征为：
14.该菌株的16s rrna序列如seq id no.1所示。
15.本发明的第二方面，提供含有所述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的菌剂。
16.所述菌剂中，阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液的形式存在。
17.进一步的，该菌剂除包含阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1外，还可包括辅料或载体基质等，如海藻糖、黄腐酸、草炭、硅藻土、各类作物的秸秆、花生壳、动物粪便或者化肥等。
18.所述菌剂的剂型可以为液剂、乳剂、悬浮剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。
19.本发明的第三方面，提供一种阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1菌剂的制备方法，包括以下步骤：
20.将阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度36～38℃，震荡培养12～16h，得到阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液；
21.每1l的所述发酵培养基由如下方法制备而成：
22.将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g可溶性淀粉、15g氯化铵和3g碳酸钙，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
23.优选的，所述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的种子液的接种量为8
‑
12％(体积比)。
24.优选的，所述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液中的活菌数为8.0
×
109cfu/ml
‑
9.0
×
109cfu/ml。
25.上述制备方法中，所制备的阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液可以直接作为液体菌剂使用；进一步的，还可以将阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液与辅料或载体基质混合，制备成固体菌剂。
26.上述制备的阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1菌剂的使用方法为：将阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1液体菌剂与水按照体积比1:29混合均匀，灌根使用；固体菌剂加适量水稀释后灌根施用。两种菌剂可以作为生物有机肥、复合微生物肥料的菌种使用。
27.本发明的第四方面，提供上述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1或含有阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的菌剂在下述1)
‑
4)至少一项中的用途：
28.1)产iaa、解磷、解钾以及产铁载体；
29.2)促进作物生长发育；
30.3)提高作物根际土壤过氧化氢酶、蔗糖酶和脲酶活性；
31.4)提高作物根际土壤有机质、碱解氮和速效钾含量。
32.优选的，所述作物为肥桃。
33.本发明的第五方面，提供一种肥桃微生物肥料，由阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1、耐寒短杆菌和产脲节杆菌的发酵液按重量比(2
‑
4)：1：1复配而成；其中：
34.阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的发酵液由如下方法制备而成：
35.将阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的种子液接种至第一发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度36～38℃，震荡培养12～16h，得到阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液；
36.每1l的所述第一发酵培养基由如下方法制备而成：
37.将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g可溶性淀粉、15g氯化铵和3g碳酸钙，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
38.耐寒短杆菌的发酵液由如下方法制备而成：
39.将耐寒短杆菌的种子液接种至第二发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度30～32℃，震荡培养12～16h，得到耐寒短杆菌发酵液；
40.每1l的所述第二发酵培养基由如下方法制备而成：
41.将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g葡萄糖、15g硫酸铵和3g硫酸镁，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
42.产脲节杆菌的发酵液由如下方法制备而成：
43.将产脲节杆菌的种子液接种至第二发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度36～38℃，震荡培养12～16h，得到产脲节杆菌发酵液；
44.每1l的所述第二发酵培养基由如下方法制备而成：
45.将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g葡萄糖、15g硫酸铵和3g硫酸镁，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
46.本发明的有益效果：
47.(1)本发明的阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1的综合性能优异，能够产iaa、解磷、解钾和产铁载体。
48.(2)本发明的阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1能够在肥桃根际土壤中稳定定殖，能够显著提高肥桃种植土壤中过氧化氢酶、蔗糖酶和脲酶活性，还能提高土壤中有机质、碱解氮和速效钾含量，具有显著提高土壤肥力的效果。
49.(3)在盆栽条件下，利用本发明的阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1的发酵液浇灌施入肥桃根部附近的土壤中，能显著提高肥桃的株高、枝杈数量、叶片数量和叶绿素含量，具有促进肥桃生长的效果。
50.(4)本发明的阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1发酵性状好，菌剂生产工艺简单、生产周期短，发酵液中活菌数量高。
51.(5)本发明的阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1与肥料共存时能够稳定存活，可以实现与水溶肥或固溶肥同时施用。
52.(6)将本发明的阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1与耐寒短杆菌和产
脲节杆菌复配制成肥桃微生物肥料，具有显著的协同增效作用，能够进一步提高对肥桃的促生效果。
附图说明
53.图1：菌株ndfy
‑
1的菌落形态。
54.图2：菌株ndfy
‑
1的菌体形态(放大倍数1000
×
)。
55.图3：基于16srdna序列构建的系统发育树。
56.图4：菌株ndfy
‑
1解钾功能图。
57.图5：iaa测定标准曲线。
具体实施方式
58.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
59.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
60.lb液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，nacl 10.0g，去离子水1000ml，ph＝7.0，灭菌条件：121℃高压灭菌20min。
61.lb固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，nacl 10.0g，琼脂粉15.0
‑
20.0g，去离子水1000ml，ph＝7.0，灭菌条件：121℃高压灭菌20min。
62.豆芽汁培养基：100.0g的黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后煮沸30min后，过滤黄豆芽，在液体中加入20.0g葡萄糖，用去离子水补足到1000ml，搅拌均匀。调节ph至7.0
‑
7.5。灭菌温度：121℃下高压灭菌20min。(加入的葡萄糖，灭菌条件为115℃下高压灭菌30min，避免温度过高葡萄糖出现糊化。)
63.蒙金娜有机磷细菌培养基：葡萄糖10.0g，nacl 0.3g，(nh4)2so
4 0.5g，kcl 0.3g，mgso4·
7h2o 0.3g，mnso4·
4h2o 0.03g，feso4·
7h2o 0.03g，caco
3 5.0g，卵磷脂0.2g，去离子水1000ml，ph为7.0
‑
7.5。
64.注：固体有机磷培养基需在液体培养基中另加入1.5％
‑
2％的琼脂粉，配制液体培养基时分装要均匀，每50ml加入1g的caco3，将卵磷脂溶于无水乙醇中，待全部溶解之后加去离子水，加热直至乙醇全部蒸发，灭菌条件：121℃高压灭菌20min。
65.硅酸盐细菌培养基：蔗糖5.0g，na2hpo
4 2.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，caco
3 0.1g，fecl
3 0.005g，玻璃粉1.0g，去离子水1000ml，ph＝7.0。
66.注：固体解钾培养基需在液体培养基中另加入1.5％
‑
2％的琼脂，配制液体培养基时玻璃粉需要均匀分装，灭菌条件：121℃高压灭菌20min。
67.r2a培养基：酵母提取物0.5g，葡萄糖0.5g，胰蛋白胨0.5g，酸水解酪素0.5g，可溶性淀粉0.5g，七水硫酸镁0.05g，l
‑
色氨酸200mg，k2hpo
4 0.3g，丙酮酸钠0.3g，双蒸水1000ml，使用kh2po4和k2hpo4调节ph值至7.2，灭菌条件：121℃高压灭菌20min。
68.salkowski比色液的配制方法：体积分数为35％的hclo4量取50ml，添加1ml浓度为0.5mol/l的fecl3溶液，充分混合，暗光条件下保存。
69.sa限铁培养基：蔗糖20.0g；l
‑
天门冬酰胺2.0g；mgso4·
7h2o 0.5g；k2hpo
4 0.5g；去离子水1000ml；121℃高压灭菌20min。
70.cas铁载体含量检测液：取6.0ml的10mmol/l ctab溶液加入规格为100ml的容量瓶内并使用双蒸水稀释。将1.5ml的1mmol/l fecl3溶液与7.5ml的2mmol/l cas溶液混匀后，沿玻璃棒缓慢转移至容量瓶中。称取4.307g的pipes(哌嗪二乙磺酸)溶解于30ml的去离子水中，再缓慢滴加naoh溶液调节ph，将此液加入至容量瓶中，并用去离子水定容。
71.实施例1：菌株的鉴定
72.本发明从山东省泰安市肥城市肥桃健康植株的根系土壤中筛选获得一株具有肥桃促生效果的菌株ndfy
‑
1，对菌株ndfy
‑
1从菌落形态、生理生化指标和16s rdna等方面进行鉴定，具体如下：
73.(1)菌落形态特征：
74.使用三区划线法对菌落形态进行观察，将单菌落划线到lb固体培养基平板上，放置于37℃培养箱中培养24h，观察其菌落形态。
75.把37℃培养箱培养24h后的菌落染色制片，用显微镜对菌体形态进行观察，革兰氏染色判断其阳性或阴性。
76.菌落形态图如图1所示；染色后显微镜观察得到的菌体形态图见图2。结果表明：菌株ndfy
‑
1在lb固体培养基上的菌落形态为近圆形，菌落大小为2
‑
4mm，表面扁平湿润，边缘平整，乳白色，不透明，革兰氏染色阳性。
77.(2)生理生化特征
78.生理生化指标鉴定使用青岛海博生物技术有限公司提供的细菌微量生理生化鉴定管，根据《伯杰细菌鉴定手册》中的方法对菌株进行生理生化特征鉴定，结果见表1。
79.表1：菌株ndfy
‑
1的生理生化特征
[0080][0081]
[0082]
注： 为阳性；－为阴性。
[0083]
(3)菌株16s rdna序列分析
[0084]
菌株ndfy
‑
1的16s rdna序列如seq id no.1所示。使用mega5.0构建系统发育树，如图3所示，与bacillus aryabhattai同在一个最小的分支，进化距离最近，结合其菌落形态及生理生化特性，鉴定菌株ndfy
‑
1为阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)。
[0085]
基于上述对菌株的形态学鉴定和分子学鉴定结果，将分离得到的菌株ndfy
‑
1鉴定为阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)，命名为阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)ndfy
‑
1。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
[0086]
生物材料：ndfy
‑1[0087]
分类命名：阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)
[0088]
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0089]
保藏机构简称：cgmcc
[0090]
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0091]
保藏日期：2021年8月9日
[0092]
保藏中心登记入册编号：cgmcc no.23131。
[0093]
实施例2：菌株ndfy
‑
1解磷、解钾、产iaa、产铁载体试验
[0094]
1、解磷试验：
[0095]
将菌株ndfy
‑
1用已灭菌的牙签点接于蒙金娜有机磷培养基平板中，放置于28℃恒温电热培养箱中培养7d取出，并观察菌株周围有无出现解磷圈。
[0096]
结果发现，菌株ndfy
‑
1周围出现解磷圈。量取菌株ndfy
‑
1于蒙金娜有机磷培养基平板产生的透明圈直径d与细菌菌落直径d的比值，以此判定菌株解磷功能的强弱。经测定，菌株ndfy
‑
1的d/d的比值为2.50。
[0097]
2、解钾试验：
[0098]
将菌株ndfy
‑
1用已灭菌的牙签点接于硅酸盐检测培养基平板中，放置于28℃培养箱中培养1
‑
2d取出，并观察平板上有无出现油滴状的菌落。
[0099]
结果发现，菌株ndfy
‑
1周围有油滴状菌落出现(图4)，说明菌株ndfy
‑
1具有良好的解钾功能。
[0100]
3、产iaa试验：
[0101]
将菌株ndfy
‑
1接种到含l
‑
色氨酸的液体r2a培养基中，置于恒温振荡箱，在180r/min，28℃的条件震荡培养4d。吸取2ml培养4d的细菌悬浮液，并于离心管中在10000r/min的条件下离心10分钟，吸取上清液并将其添加到试管中，加入等体积的salkowski比色液，在避光条件下静置30分钟等待显色，并测定od
530
值。
[0102]
配制iaa系列浓度标准液，以od
530
为横坐标，以iaa工作浓度为纵坐标，绘制标准曲线(图5)，利用标准曲线计算出每单位体积发酵液的iaa含量。
[0103]
经计算，菌株ndfy
‑
1单位体积发酵液的iaa含量为62.5μg/ml。
[0104]
4、产铁载体试验：
[0105]
使用铂金丝接种环接种单菌落于sa限铁液体培养基中，于180r/min，37℃条件下震荡培养2d，将培养2d的菌液转移至灭菌后的10ml离心管，于13000r/min的条件下离心15min，吸取上清液和定量现配的cas检测液等体积充分混匀后，静置1h后测定波长在630nm
处的吸光值，为as，对照调零使用去离子水，参比值的测定用相同方法，读取未接种细菌的sa液体培养基在630nm波长下的吸光值，为ar，铁载体活性单位＝[(ar
‑
as)/ar]
×
100。
[0106]
经测定，菌株ndfy
‑
1铁载体活性达63.2％。
[0107]
实施例3：菌株ndfy
‑
1发酵性能试验
[0108]
1、具体发酵工艺：
[0109]
(1)种子液的制备：
[0110]
从lb固体培养基平板上使用无菌牙签挑取单菌落，进行活化，划线至另一个lb固体培养基平板上，于37℃培养箱中培养12h。把培养好的菌株使用接种环接至50ml液体lb培养基中，于180r/min，37℃条件下震荡培养12h。
[0111]
(2)发酵培养：
[0112]
将阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的种子液按体积比10％接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度37℃，震荡培养14h，得到阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液。
[0113]
2、发酵培养基优化：
[0114]
发酵培养基组成是影响微生物生长代谢的主要因素，本发明以豆芽汁培养基为基础，对培养基中的碳源、氮源和无机盐成分进行了优化，优化后的发酵培养基如下：
[0115]
每1l的所述发酵培养基由如下方法制备而成：
[0116]
将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g可溶性淀粉、15g氯化铵和3g碳酸钙，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
[0117]
以豆芽汁培养基作为对照，采用相同的发酵条件进行发酵培养，对发酵液中的生物量进行测定。生物量的测定采用稀释涂布平板计数法。
[0118]
经测定，采用本发明优化后的发酵培养基进行发酵培养，发酵液中最大活菌数能达到8.5
×
109cfu/ml；作为对照的豆芽汁培养基，其最大活菌数为1.5
×
107cfu/ml。说明采用优化后的发酵培养基能显著提高发酵液中的活菌数量。
[0119]
实施例4：菌株ndfy
‑
1在肥料中的存活试验
[0120]
试验选用山东农大肥业科技有限公司的液体水溶肥松土1号(总腐植酸≥90g/l，矿源黄腐酸≥75g/l，总养分≥200g/l，n≥120g/l，no3‑
‑
n≥10g/l，h
‑
psa生物能物质≥10g/l)。
[0121]
将菌株ndfy
‑
1的发酵液以10％(体积比)加入液体水溶肥中，混合均匀，密封储存于阴凉处，每隔10d测定一次水溶肥中的菌体数量，连续测定60d。结果显示，液体水溶肥中菌株ndfy
‑
1的菌体数量没有大幅下降，总体水平较高，损失率较低。经过60d，菌体存活率为96.7％，试验结果见表2。
[0122]
表2：菌株ndfy
‑
1在液体水溶肥中的菌体数量变化
[0123][0124]
实施例5：菌株ndfy
‑
1在作物根际的定殖能力测定
[0125]
(1)菌株ndfy
‑
1双抗生素突变菌株的筛选及稳定性检测
[0126]
刮取2环活化的菌株ndfy
‑
1菌苔于不含利福平的lb液体培养基中，32℃培养至对数生长期，将种子液以2％(体积比)的接种量接种到利福平浓度为0.5μg/ml的lb液体培养基中，培养8～24h，将该培养液以2％(体积比)的接种量接种到利福平浓度为1μg/ml的lb液体培养基中，培养24h，依次转接入利福平浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml的lb中。将得到的抗利福平菌株接种到含300μg/ml利福平和5μg/ml壮观霉素(spe)的lb液体培养基中，对同时抗利福平和壮观霉素的双抗菌株进行筛选，筛选过程中，lb液体培养基中利福平的浓度为300μg/ml，抗壮观霉素菌株与抗利福平菌株抗生素浓度的递加及筛选方法相同，重复在不含利福平与壮观霉素的平板上活化3代，再分别回接到含利福平300μg/ml和壮观霉素300μg/ml的lb液体培养基中进行培养，最终获得能够稳定遗传并且同时抗利福平和壮观霉素的双抗标记菌株。
[0127]
(2)菌株ndfy
‑
1在肥桃根际的定殖能力测定
[0128]
将上述试验得到的ndfy
‑
1双抗生素突变菌株接种到不含抗生素的lb培养基中，28℃摇床培养过夜。取1ml菌液转接到含利福平(300μg/ml)和壮观霉素(300μg/ml)的lb培养基中，28℃摇床培养12h。再取1ml生长好的菌液转接到不含抗生素的lb液体培养基中，培养48h获得双抗标记菌株菌液，将菌液离心去上清后制成菌悬液，调整菌体浓度为108cfu/ml。
[0129]
挑选长势一致肥桃苗的20盆，其中，10盆为施加双抗标记的ndfy
‑
1菌株的处理组，10盆为施加灭活的双抗标记的ndfy
‑
1菌株的对照组。处理组每盆灌根20ml双抗标记的ndfy
‑
1菌株菌悬液，对照组每盆灌根15ml灭活的双抗标记的ndfy
‑
1菌株菌悬液。
[0130]
灌根后的第10、20、40、60d，回收肥桃根际土，采用梯度稀释涂布法，在双抗生素平板上涂布并计数，检测ndfy
‑
1菌株在肥桃根际的定殖情况。试验结果如表3所示。随着试验时间的延长，处理组ndfy
‑
1双抗标记菌株在肥桃根际的数量虽有一定程度的下降，但60d时每克干土中其菌体数量仍达到6.0
×
106cfu/g，而对照组没有菌落产生，说明ndfy
‑
1菌株能够在肥桃根际稳定定殖。
[0131]
表3：ndfy
‑
1菌株在肥桃根际的定殖结果
[0132][0133]
实施例6：菌株ndfy
‑
1对肥桃生长的影响
[0134]
1、试验地点：
[0135]
试验于2020年10月1日在泰安市肥城山东农大肥业科技有限公司大棚进行。此地
区位于山东省中部，属温带半湿润气候，降水量适宜，温度适宜。供试植株为在泰安肥城市刘台桃园购买的肥桃苗。土壤的ph值＝6.5，弱酸性。
[0136]
2、试验材料：
[0137]
菌株ndfy
‑
1的发酵液，由如下方法制备而成：
[0138]
将阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1的种子液接种至第一发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度37℃，震荡培养14h，得到阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1发酵液；
[0139]
每1l的所述第一发酵培养基由如下方法制备而成：
[0140]
将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g可溶性淀粉、15g氯化铵和3g碳酸钙，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
[0141]
耐寒短杆菌的发酵液，由如下方法制备而成：
[0142]
将耐寒短杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号accc06432)的种子液接种至第二发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度31℃，震荡培养14h，得到耐寒短杆菌发酵液；
[0143]
每1l的所述第二发酵培养基由如下方法制备而成：
[0144]
将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g葡萄糖、15g硫酸铵和3g硫酸镁，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
[0145]
产脲节杆菌的发酵液由如下方法制备而成：
[0146]
将产脲节杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号accc10474)的种子液接种至第二发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速180r/min，温度37℃，震荡培养14h，得到产脲节杆菌发酵液；
[0147]
每1l的所述第二发酵培养基由如下方法制备而成：
[0148]
将100g黄豆芽加入到1000ml去离子水中，水沸腾后蒸煮30min，过滤除去黄豆芽，在过滤后的液体中加入30g葡萄糖、15g硫酸铵和3g硫酸镁，用去离子水补足至1000ml，搅拌均匀，调节ph至7.0
‑
7.5，灭菌。
[0149]
将菌株ndfy
‑
1的发酵液、耐寒短杆菌的发酵液、产脲节杆菌的发酵液中的活菌数调整成一致，均为109cfu/ml。
[0150]
3、试验处理：
[0151]
试验设5个处理，分别为：
[0152]
处理1：施用菌株ndfy
‑
1的发酵液；每株600ml，将20ml发酵液与580ml水混匀，浇灌施入肥桃植株根部附近的土壤中；
[0153]
处理2：施用耐寒短杆菌的发酵液；每株600ml，将20ml发酵液与580ml水混匀，浇灌施入肥桃植株根部附近的土壤中；
[0154]
处理3：施用产脲节杆菌的发酵液；每株600ml，将20ml发酵液与580ml水混匀，浇灌施入肥桃植株根部附近的土壤中；
[0155]
处理4：施用混合菌液，混合菌液是将上述阿氏芽孢杆菌ndfy
‑
1、耐寒短杆菌和产脲节杆菌的发酵液按重量比3：1：1复配，得到混合菌液；每株600ml，将20ml混合菌液与580ml水混匀，浇灌施入肥桃植株根部附近的土壤中；
[0156]
处理5：ck处理，浇灌600ml水。
[0157]
各处理所选择的肥桃苗的大小、长势尽可能保持一致。各个处理设置6组平行。各个处理的其他培养条件保持一致。
[0158]
4、样品采集：
[0159]
采集50天试验后的肥桃叶片，运用五点取样法收集50天试验各个处理的根际土样，测定叶片叶绿素含量、根际土样的酶活和养分。
[0160]
叶片叶绿素含量采用spad 502plus叶绿素计检测；土壤过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶活性分别采用高锰酸钾滴定法、苯酚钠比色法、3,5
‑
二硝基水杨酸比色法进行测定。土壤有机质、速效磷、速效钾和碱解氮含量分别采用重铬酸钾容量法、碳酸氢钠钼锑抗比色法、乙酸铵火焰光度计法和碱解扩散法进行测定。
[0161]
5、试验结果：
[0162]
(1)植株生长测定结果：
[0163]
对肥桃植株的株高和叶绿素含量进行测定，结果见表4。
[0164]
表4：不同处理对植株生长的影响
[0165]
处理株高(cm)叶绿素含量(spad)处理152.4
±
2.053.5
±
1.0处理243.0
±
1.050.0
±
0.5处理341.8
±
1.551.3
±
0.7处理465.3
±
3.060.2
±
1.5处理538.5
±
1.548.6
±
0.8
[0166]
(2)根际土壤酶活测定结果：
[0167]
对肥桃根际土壤酶活性进行测定，结果见表5。
[0168]
表5：不同处理对土壤酶活的影响
[0169]
处理过氧化氢酶(ml/g)脲酶(mg/g)蔗糖酶(mg/g)处理13.2
±
0.040.82
±
0.0218.4
±
0.2处理22.4
±
0.010.73
±
0.0213.5
±
0.2处理32.6
±
0.020.68
±
0.0112.7
±
0.1处理44.1
±
0.051.20
±
0.0424.2
±
0.3处理52.1
±
0.010.62
±
0.0110.8
±
0.1
[0170]
(3)根际土壤养分测定结果：
[0171]
对肥桃根际土壤养分进行测定，结果见表6。
[0172]
表6：不同处理对土壤养分的影响
[0173]
处理有机质(g/kg)碱解氮(mg/kg)速效磷(mg/kg)速效钾(mg/kg)处理115.3
±
0.0242.6
±
0.620.4
±
0.158.2
±
1.0处理214.5
±
0.0138.5
±
0.218.5
±
0.254.5
±
0.8处理314.9
±
0.0140.2
±
0.317.9
±
0.153.6
±
0.5处理418.2
±
0.0155.8
±
1.026.2
±
0.366.8
±
1.5处理514.2
±
0.0134.0
±
0.516.8
±
0.152.0
±
0.5
[0174]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。