一种基于顺式调控元件的引物及其设计方法和在分子标记中的应用与流程

技术特征：
1.一种基于顺式调控元件的引物，其特征在于：所述引物序列如seq id no.1～224所示。2.根据权利要求1所述的一种基于顺式调控元件的引物的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：根据8个顺式调控元件在植物中的保守性，在顺式调控元件的核心元件序列前、后分别添加填充碱基来设计如seq id no.1～224所示的引物，每个引物序列由三部分组成：5’端为填充序列、中心为顺式调控元件核心序列、3’端为随机组合的二核苷酸或三核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的一种基于顺式调控元件的引物的设计方法，其特征在于：所述填充序列是12～14个核苷酸长度的序列。4.根据权利要求2所述的一种基于顺式调控元件的引物的设计方法，其特征在于：所设计的引物长度均为18_bp。5.根据权利要求2所述的一种基于顺式调控元件引物的设计方法，其特征在于：通过调整填充序列的碱基使设计的引物gc含量控制在50％～61％之间。6.根据权利要求2所述的一种基于顺式调控元件的引物的设计方法，其特征在于：所述8个顺式调控元件核心序列分别为：
①
aaag元件，是ose核心元件，与器官分化和dof结合位点有关；
②
acgtg元件，是g
‑
box，abre核心元件，与植物的光信号诱导和逆境胁迫应答有关；
③
gataa元件，是i
‑
box核心元件，与植物的光信号诱导有关；
④
ggtca元件，是mbs核心元件，是myb结合位点，与逆境胁迫应答有关；
⑤
actcat元件，是pre核心元件，与脯氨酸和低渗反应有关；
⑥
ccga元件，是ltr核心元件，与低温胁迫应答有关；
⑦
tatcc元件，是sre核心元件，与植物的蔗糖代谢有关；
⑧
tgac元件，是w
‑
box核心元件，是wrky结合位点，与逆境胁迫应答和激素代谢有关。7.一种权利要求1～6任一项所述的基于顺式调控元件扩增多态性分子标记的方法，其特征在于：所述分子标记是单引物扩增，也就是同一条引物既做为上游也做为下游进行pcr扩增，pcr扩增的位点来源于启动子序列、基因编码区序列、启动子和基因编码区序列之间以及基因与3’非编码区域之间的序列。8.根据权利要求7所述的一种基于顺式调控元件扩增多态性分子标记的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)dna提取：采用ctab法提取植物dna；(2)pcr扩增：利用权利要求1设计好的引物对步骤(1)提取的植物dna进行pcr扩增；pcr扩增体系为(20μl)：1μl模板dna(50ng
·
μl
‑1)，1μl引物(10μmol
·
l
‑1)，10μl2 x pcr magicmix，8μl ddh2o；pcr扩增程序为：94℃变性2min，95℃40s；x℃退火60s，其中acgtg和ccga是35℃退火60s，ggtca、actcat和tgac为37℃退火60s，aaag和tatcc为39℃退火60s；gataa为42℃退火60s；72℃180s进行5个循环；接着是95℃40s，退火50℃50s，72℃120s进行35个循环，最后在72℃延伸8min，4℃保存；(3)电泳：利用1.8～2.2％的琼脂糖对pcr扩增完毕的pcr产物进行电泳，然后利用琼脂糖凝胶电泳进行拍照；(4)条带分析：选择扩增效果好、条带清晰和重复性好的条带进行观察、记录，有带赋值为“1”，无带赋值为“0”，强度两倍于弱带时强带赋值记为“1”，弱带赋值记为“0”，用
popgene32计算每条引物的基因多样性指数h、shannon多样性指数i，使用excel2007软件计算多态性比率、多态信息量pic＝1
‑
∑pi2，用ntsys2.10e软件计算各资源间的相似性系数，用upgma法进行聚类分析，构建出遗传聚类图谱。9.一种如权利要求1所述的基于顺式调控元件引物的应用，其特征在于：应用于扩增多态性分子标记中。10.一种如权利要求1所述的引物或权利要求7或8所述的扩增多态性分子标记在以下任一项的应用：在植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于顺式调控元件的引物，其特征在于：所述引物序列如SEQ ID NO.1～224所示。本申请基于顺式作用元件的引物和扩增多态性(CEAP)分子标记的方法可应用于植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种中，推荐每个顺式调控元件使用6条多态性好的引物进行联合聚类分析；同时该标记在芒果、水稻、西红柿、马铃薯、节瓜、柑橘、龙眼等物种中通用性良好；每个顺式调控元件提供了28条引物，共224条引物，方便在不同物种遗传多样性和亲缘关系鉴定中的引物筛选与应用。和亲缘关系鉴定中的引物筛选与应用。和亲缘关系鉴定中的引物筛选与应用。


技术研发人员：罗聪 陈美燕 何新华 余海霞
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2021/12/7