一种基于顺式调控元件的引物及其设计方法和在分子标记中的应用与流程

1.本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于顺式调控元件的引物及其设计方法和在分子标记中的应用。


背景技术：

2.dna分子标记技术广泛运用于植物的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及新品种的选育。dna分子标记包括：(1)限制性片段长度多态性rflp；(2) 随机扩增多态性dna分子标记rapd；(3)简单序列重复标记ssr/issr；(4) 扩增片段长度多态性分子标记aflp；(5)特征序列扩增区域多态性标记scar； (6)单核苷酸多态性分子标记snp；(7)起始密码子扩增长度分子标记scot； (8)caat元件扩增多态性分子标记cbdp；(9)相关序列扩增多态性分子标记srap等。其中rflp、rapd、ssr、issr、aflp均属于随机扩增片段长短分子标记，与基因的功能关联性不高，srap，scot和cbdp分子标记与基因的功能具有一定的关联性，而scar往往是针对某一个基因的位点差异来进行性状区分，与基因的功能密切相关。
3.cbdp分子标记是基于启动子保守元件caat来开发分子标记引物，其中 caat在真核生物atg前的
‑
80bp左右的位置广泛存在，与基因的转录存在联系 (singh et al，caat box
‑
derived polymorphism(cbdp):a novel promoter
‑
targeted molecular marker for plants，j.plant biochem.biotechnol，2014，23(2):175
‑
183。该分子标记为单引物扩增，共开发了25条引物，目前在一些植物的遗传多样性分析中被运用。该分子标记扩增的多态性来源仅限于启动子序列内部或启动子序列之间。
4.专利申请cn202010190191.8，公开了一种小麦tadep1基因转录增强顺式作用元件的鉴定及其分子标记和应用，提供了如seq id no.2所示的小麦 tadep1基因转录增强顺式作用元件，以及用于鉴定tadep1基因转录水平的分子标记，用于特异性pcr扩增该标记的引物序列如seq id no.5
‑
6所示。利用该转录增强元件能够提高小麦基因转录水平，可用于基因工程遗传改良目的基因转录水平；利用该标记能够方便、快速、准确地鉴定小麦tadep1基因转录水平，可用于分子标记辅助育种。
5.专利申请cn202011034365.8，公开了位于花生fad2a基因启动子区与花生油酸和亚油酸含量相关的snp分子标记及其应用。分子标记snpc
‑
e位于花生 fad2a基因启动子区，含有如seq id no.1所示序列第13位的多态性为g/a 的核苷酸序列。当该处碱基为g时，其所处位置为顺式调控元件caat( )，当该处碱基为a时，其处于类似增强子元件yact( )中。snpc
‑
e从g变为a时， fad2a的基因表达量会显著提高。且当该处碱基为g时，对应花生油酸含量低，亚油酸含量高；为a时，对应花生油酸含量高，亚油酸含量低。利用这个snp 分子标记可进行花生油酸、亚油酸含量高低鉴定，提高选择效率。
6.但是，目前还未发现有任何文献记载基于顺式调控元件来设计引物，也没有基于gataa、acgtg、tgac、tatcc、actcat、ggtca、aaag、ccga 这8个保守顺式调控元件来设计引物及利用所得引物进行扩增多态性(ceap) 分子标记的相关技术。


技术实现要素：

7.本发明为解决上述技术问题，提供了一种基于顺式调控元件的引物及其设计方法和在分子标记中的应用。
8.为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：
9.一种基于顺式调控元件的引物，所述引物序列如下表表1中的seq id no.1～224所示。
10.进一步地，所述的一种基于顺式调控元件的引物的设计方法，包括以下步骤：根据8个顺式调控元件在植物中的保守性，在顺式调控元件的核心元件序列前、后分别添加填充碱基来设计如seq id no.1～224所示的引物，每个引物序列由三部分组成：5’端为填充序列、中心为顺式调控元件、3’端为随机组合的二核苷酸或三核苷酸序列。
11.进一步地，所述填充序列是12～14个核苷酸长度的序列。
12.进一步地，所设计的引物长度均为18_bp。
13.进一步地，通过调整填充序列的碱基使设计的引物gc含量控制在50％～ 61％之间。
14.进一步地，所述8个顺式调控元件核心序列分别为：
①
aaag元件，是ose 核心元件，与器官分化和dof结合位点有关；
②
acgtg元件，是g
‑
box，abre 核心元件，与植物的光信号诱导和逆境胁迫应答有关；
③
gataa元件，是i
‑
box 核心元件，与植物的光信号诱导有关；
④
ggtca元件，是mbs核心元件，是 myb结合位点，与逆境胁迫应答有关；
⑤
actcat元件，是pre核心元件，与脯氨酸和低渗反应有关；
⑥
ccga元件，是ltr核心元件，与低温胁迫应答有关；
⑦
tatcc元件，是sre核心元件，与植物的蔗糖代谢有关；
⑧
tgac元件，是w
‑
box核心元件，是wrky结合位点，与逆境胁迫应答和激素代谢有关。
15.进一步地，一种如上述所述的基于顺式调控元件扩增多态性分子标记的方法，其特征在于：所述分子标记是单引物扩增，也就是同一条引物既做为上游也做为下游进行pcr扩增，pcr扩增的位点来源于启动子序列、基因编码区序列、启动子和基因编码区序列之间以及基因与3’非编码区域之间的序列；具体包括以下步骤：
16.(1)dna提取：采用ctab法提取植物dna；
17.(2)pcr扩增：利用权利要求1设计好的引物对步骤(1)提取的植物dna 进行pcr扩增；pcr扩增体系为(20μl)：1μl模板dna(50ng
·
μl
‑1)，1μl引物(10μmol
·
l
‑1)，10μl2 x pcrmagicmix，8μl ddh2o；pcr扩增程序为：94℃变性2min，95℃40s；x℃退火60s，其中acgtg和ccga是35℃退火60s，ggtca、actcat和tgac为37℃退火60s，aaag和tatcc为 39℃退火60s；gataa为42℃退火60s；72℃180s进行5个循环；接着是95℃ 40s，退火50℃50s，72℃120s进行35个循环，最后在72℃延伸8min，4℃保存；
18.(3)电泳：利用1.8～2.2％的琼脂糖对pcr扩增完毕的pcr产物进行电泳，然后利用琼脂糖凝胶电泳进行拍照；
19.(4)条带分析：选择扩增效果好、条带清晰和重复性好的条带进行观察、记录，有带赋值为“1”，无带赋值为“0”，强度两倍于弱带时强带赋值记为“1”，弱带赋值记为“0”，用popgene32计算每条引物的基因多样性指数h、shannon 多样性指数i，使用excel2007软件计算多态性比率、多态信息量pic＝1
‑
∑pi2，用ntsys2.10e软件计算各资源间的相似性系数，用upgma法进行聚类分析，构建出遗传聚类图谱。
20.进一步地，一种基于顺式调控元件的引物在扩增多态性分子标记中的应用。
21.进一步地，一种如权利要求1所述的引物或权利要求7或8所述的扩增多态性分子标记在以下任一项的应用：在植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种中的应用。
22.本技术引物设计pcr扩增原理图如3所示。利用本技术引物和ceap分子标记方法可以扩增启动子区域、基因区域、启动子与基因区域、基因与3’非编码区域之间的区域，而在不同品种之间，以上任何一个区域序列发生插入或缺失变异，就可以检测出多态性。本技术所述引物序列如下表1所示：
23.表1引物序列
24.25.26.27.28.[0029][0030]
由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：
[0031]
(1)本技术所开发的扩增多态性(ceap)分子标记是基于8个保守顺式作用元件来进行设计的，8个保守元件与植物生长发育调控基因存在密切的联系，因此扩增多态性(ceap)属于与基因性状关联的分子标记。
[0032]
(2)本技术基于8个核心保守顺式作用元件gataa、acgtg、tgac、 tatcc、actcat、ggtca、aaag、ccga开发的扩增多态性(ceap)分子标记，每个保守顺式作用元件设计了28条引物，总共开发了224条引物，ceap 分子标记具有同时扩增启动子、基因内部以及启动子与基因或基因与非编码区域之间序列的能力。而cbdp分子标记只能扩增启动子之间的序列长度多态性，这与ceap分子标记的设计原理存在明显的差异。
[0033]
(3)本技术基于顺式作用元件扩增多态性(ceap)分子标记方法是基于 dna进行的pcr扩增，扩增时候不同元件的退火温度存在差异，pcr产物通过琼脂糖进行电泳检测。
[0034]
(4)本技术基于顺式作用元件的引物和扩增多态性(ceap)分子标记方法可应用于植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种，推荐每个元件要使用6条多态性好的引物进行扩增，然后进行联合聚类分析；在芒果、水稻、西红柿、马铃薯、节瓜、柑橘、龙眼等物种中具有良好的通用性。
[0035]
(5)本技术提供了一种新型扩增启动子和基因之间序列的锚定pcr分子标记技术，提供了224条引物，方便在不同物种中的筛选与应用。
[0036]
(6)本技术还给出了基于顺式作用元件引物的扩增多态性(ceap)分子标记方法，采用dna提取、pcr扩增和琼脂电泳分析，方法简单可行，成本低廉。
附图说明
[0037]
为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
[0038]
图1为本技术8个顺式调控元件在8个不同芒果中的联合聚类结果分析图；
[0039]
图2为本技术基于顺式调控元件的引物扩增多态性(ceap)分子标记在不同物种中的扩增效果分析图；
[0040]
图3为本技术基于顺式调控元件引物的引物设计pcr扩增原理图。
[0041]
附图中：
①‑
水稻；
②‑
西红柿；
③‑
马铃薯；
④‑
节瓜；
⑤‑
柑橘；
⑥‑
龙眼。
具体实施方式
[0042]
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
[0043]
实施例1
[0044]
一种基于顺式调控元件的引物，所述引物序列如表1中的seq id no.1～224 所示，该引物的设计方法，包括以下步骤：根据8个顺式调控元件在植物中的保守性，在顺式调控元件的核心元件序列前、后分别添加填充碱基来设计如seq idno.1～224所示的引物，每个引物序列由三部分组成：5’端为填充序列、中心为顺式调控元件核心序列、3’端为随机组合的二核苷酸或三核苷酸序列。
[0045]
所述填充序列是12～14个核苷酸长度的序列；所设计的引物长度均为 18_bp；通过调整填充序列的碱基使设计的引物gc含量控制在50％～61％之间；所述8个顺式调控元件核心序列分别为：
①
aaag元件，是ose核心元件，与器官分化和dof结合位点有关；
②
acgtg元件，是g
‑
box，abre核心元件，与植物的光信号诱导和逆境胁迫应答有关；
③
gataa元件，是i
‑
box核心元件，与植物的光信号诱导有关；
④
ggtca元件，是mbs核心元件，是myb结合位点，与逆境胁迫应答有关；
⑤
actcat元件，是pre核心元件，与脯氨酸和低渗反应有关；
⑥
ccga元件，是ltr核心元件，与低温胁迫应答有关；
⑦
tatcc 元件，是sre核心元件，与植物的蔗糖代谢有关；
⑧
tgac元件，是w
‑
box核心元件，是wrky结合位点，与逆境胁迫应答和激素代谢有关。
[0046]
一种如上述所述的基于顺式调控元件扩增多态性分子标记的方法，所述分子标记是单引物扩增，也就是同一条引物既做为上游也做为下游进行pcr扩增， pcr扩增的位点来源于启动子序列、基因编码区序列、启动子和基因编码区序列之间以及基因与3’非编码区域之间的序列；具体包括以下步骤：
[0047]
(1)dna提取：采用ctab法提取植物dna；
[0048]
(2)pcr扩增：利用权利要求1设计好的引物对步骤(1)提取的植物dna 进行pcr扩增；pcr扩增体系为(20μl)：:1μl模板dna(50ng
·
μl
‑1)， 1μl引物(10μmol
·
l
‑1)，10μl 2x pcrmagicmix，8μl ddh2o；pcr扩增程序为：94℃变性2min，95℃40s；x℃退火60s，其中acgtg和ccga是35℃退火60s，ggtca、actcat和tgac为37℃退火60s，aaag和tatcc为39℃退火60s；gataa为42℃退火60s；72℃180s进行5个循环；接着是95℃ 40s，退火50℃50s，72℃120s进行35个循环，最后在72℃延伸8min，4℃保存；
[0049]
(3)电泳：利用1.8～2.2％的琼脂糖对pcr扩增完毕的pcr产物进行电泳，然后利用琼脂糖凝胶电泳进行拍照；
[0050]
(4)条带分析：选择扩增效果好、条带清晰和重复性好的条带进行观察、记录，有带
赋值为“1”，无带赋值为“0”，强度两倍于弱带时强带赋值记为“1”，弱带赋值记为“0”，用popgene32计算每条引物的基因多样性指数h、shannon 多样性指数i，使用excel2007软件计算多态性比率、多态信息量pic＝1
‑
∑pi2，用ntsys2.10e软件计算各资源间的相似性系数，用upgma法进行聚类分析，构建出遗传聚类图谱。
[0051]
一种基于顺式调控元件的引物在扩增多态性分子标记中的应用。
[0052]
一种如上述所述的引物或扩增多态性分子标记在以下任一项的应用：在植物遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和分子标记辅助育种中的应用。
[0053]
实施例2
[0054]
一种基于顺式调控元件的引物，所述引物序列如表1中的seq id no.1～224 所示，该引物的设计方法，包括以下步骤：根据8个顺式调控元件在植物中的保守性，在顺式调控元件的核心元件序列前、后分别添加填充碱基来设计如seq idno.1～224所示的引物，每个引物序列由三部分组成：5’端为填充序列、中心为顺式调控元件核心序列、3’端为随机组合的二核苷酸或三核苷酸序列。
[0055]
所述填充序列是12～14个核苷酸长度的序列；所设计的引物长度均为 18_bp；通过调整填充序列的碱基使设计的引物gc含量控制在50％～61％之间；所述8个顺式调控元件核心序列分别为：
①
aaag元件，是ose核心元件，与器官分化和dof结合位点有关；
②
acgtg元件，是g
‑
box，abre核心元件，与植物的光信号诱导和逆境胁迫应答有关；
③
gataa元件，是i
‑
box核心元件，与植物的光信号诱导有关；
④
ggtca元件，是mbs核心元件，是myb结合位点，与逆境胁迫应答有关；
⑤
actcat元件，是pre核心元件，与脯氨酸和低渗反应有关；
⑥
ccga元件，是ltr核心元件，与低温胁迫应答有关；
⑦
tatcc 元件，是sre核心元件，与植物的蔗糖代谢有关；
⑧
tgac元件，是w
‑
box核心元件，是wrky结合位点，与逆境胁迫应答和激素代谢有关。
[0056]
一种如上述所述的基于顺式调控元件扩增多态性分子标记的方法，所述分子标记是单引物扩增，也就是同一条引物既做为上游也做为下游进行pcr扩增， pcr扩增的位点来源于启动子序列、基因编码区序列、启动子和基因编码区序列之间以及基因与3’非编码区域之间的序列；具体包括以下步骤：
[0057]
(1)植物基因组dna提取：取栽培于广西大学校内基地的芒果、水稻、西红柿、马铃薯、节瓜、柑橘、龙眼不同品种的健康叶片为材料，通过ctab法 (十六烷基三甲基溴化铵法)提取基因组dna，将提取得到的dna稀释成45～ 55ng
·
μl
‑1；
[0058]
(2)pcr扩增：pcr扩增的体系为(20μl)：1μl模板dna(50ng
·
μ l
‑1)；1μl引物(10μmol
·
l
‑1)；10μl 2x pcr magicmix(tiandz)；8μ lddh2o；pcr扩增程序为：94℃变性2min，95℃40s，x℃退火60s，72℃180s 进行5个循环，接着是95℃40s，退火50℃50s，72℃120s进行35个循环，最后在72℃延伸8min，4℃保存；
[0059]
(3)电泳：利用1.8～2.2％的琼脂糖对上述pcr扩增完毕的pcr产物进行电泳，然后利用琼脂糖凝胶电泳进行拍照；
[0060]
(4)条带分析：选择扩增效果好、条带清晰和重复性好的条带进行观察、记录；有带赋值为“1”，无带赋值为“0”，强度两倍于弱带时强带赋值记为“1”，弱带赋值记为“0”；用popgene32(1.32版本)计算每条引物的基因多样性指数(h)，shannon多样性指数(i)；使用excel2007软件计算多态性比率、多态信息量pic＝1
‑
∑pi2，详细信息见表2；用ntsys2.10e
软件计算各资源间的相似性系数，用upgma法进行聚类分析，构建出遗传聚类图谱，如图1所示。
[0061]
表2ceap分子标记部分引物在八个芒果品种上的扩增情况
[0062]
[0063][0064]
注：表2中，pb:多态性百分比；tnb:总条带数；npb:多态性条带数；h:基因多样性指数；i:香农指数。
[0065]
一种基于顺式调控元件的引物在扩增多态性分子标记中的应用，应用于芒果亲缘关系鉴定中，具体是：通过上述聚类分析发现，从每个保守元件引物中筛选出6条扩增多态性好的引物进行联合聚类，非常好的体现了芒果的亲缘关系；因此，提出在进行植物遗传多样性和亲缘关系分析的时候，8个位点的引物均需要选择，先从每个元件的28条引物中筛选出6条多态性好的引物进行pcr扩增，然后进行联合聚类分析，其结果能准确的反应物种的遗传多样性和亲缘关系。
[0066]
一种基于顺式调控元件的引物ceap在不同物种中通用性的检测方法：分别提取了水稻、西红柿、马铃薯、节瓜、柑橘、龙眼的dna，并分别进行pcr扩增，通过电泳可以看出，ceap分子标记的引物可以在以上物种中进行pcr扩增，条带清晰且具有多态性，如图2所示。该实验结果说明：基于顺式调控元件的引物ceap分子标记具有在不同物种中的通用性。
[0067]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。