一种红色疏水色素及其制备方法与应用与流程

1.本技术涉及生物工程领域，特别是一种新型红色疏水色素及其制备方法与应用。


背景技术：

2.近些年来，随着技术的进步和人民生活水平的提高，染料的应用越来越广泛，特别在食品、化妆品领域，对于无毒环保染料的需求越来越大，这对染料工业的发展提出了更高的要求。
3.按照染料的来源，可分为天然染料及合成染料两大类。天然染料应用较早，且大多无毒环保，但存在着在自然界中含量有限、提取工艺复杂、生产成本高等局限性。并且天然染料大部分含有较多羟基，水溶性较高，染色的牢固度不高。合成染料与天然染料相比具有色泽鲜艳、不受原料来源限制、生产成本低等优点，但缺点在于合成染料大多结构复杂，生物毒性高，在自然界中很难降解或降解成本很高，对生态环境破坏较大。天然染料与合成染料的上述缺点严重制约了染料工业的迅速发展及其应用领域的进一步拓展。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明采用生物材料合成无毒环保的新型疏水疏油的红色天然染料化合物(i)，该染料属于萘醌类化合物，其结构式如下(i)所示：
5.该化合物(i)的分子量为512，分子式是c
28
h
20
n2o8，质谱检测结果见附图2；特征紫外吸收波长为207nm，242nm，280nnm,423nm，紫外吸收谱见附图1。
6.该化合物(i)的核磁数据为：1h
‑
nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ1.99(3h,s,h
‑
11),2.34(3h,s,h
‑
11’),3.76(3h,s,6
‑
och3),3.85(3h,s,6
’‑
och3),6.20(1h,s,h
‑
9),6.52(1h,s,h
‑9’
),6.55(1h,s,h
‑
5),7.37(1h,s,h
‑7’
),12.78(1h,s,4
‑
oh),13.44(1h,s,4
’‑
oh),12.85(1h,s,2or2
’‑
nh)；deptq
‑
135 13c
‑
nmr(125mhz,dmso
‑
6d)δ14.4(c
‑
11),13.2(c
‑
11’),135.5(c
‑
10),140.1(c
‑
10’),106.3(c
‑
9),108.1(c
‑9’
),130.1(c
‑
1),131.3(c
‑1’
),122.9(c
‑
2),128.4(c
‑2’
),174.4(c
‑
3),184.2(c
‑3’
),107.9(c
‑
3a),135.5(c
‑
3b),111.1(c
‑
3a’),136.5(c
‑
3b’),169.3(c
‑
4),161.7(c
‑4’
),99.4(c
‑
5),115.1(c
‑5’
),166.3(c
‑
6),57.4(6
‑
och3),163.1(c
‑6’
),57.0(6
’‑
och3),111.9(c
‑
7),104.1(c
‑7’
),179.1(c
‑
8),179.9(c
‑8’
).
7.化学结构式的编号见附图3。
8.其次，本技术还提供了该红色疏水色素(化合物i)的制备方法，其具体步骤如下：
9.1)使用引物5
’‑
cgggatcc atggggtcgactagccac
‑3’
(seq id no.3)和引物5
’‑
cggaattcctaccgaaatgccttctcaag
‑3’
(seq id no.4)通过聚合酶链式反应扩增如seq id no.1所示的debi基因,将扩增得到的debi基因通过限制性核酸内切酶bamhi和ecori连接到pyes2质粒载体中，获得重组质粒pyes2
‑
debi；然后将重组质粒pyes2
‑
debi转化进入酿酒酵母工程菌invsc1中，获得转化后的工程菌，申请人将该转化后的工程菌自命名为工程菌s；
10.2)从保存有工程菌s的固体培养基上挑取单个菌落于sc培养基中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌s的种子培养液；吸取工程菌s的种子培养液加入到的sc培养基之中，于28℃，200rpm摇床中发酵培养24小时；
11.用分光光度计与600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至上述发酵液中，将发酵液置于28℃，200rpm摇床中发酵培养72小时，获得培养物；
12.3)培养物分离纯化：培养结束后，取培养物于离心机中850
×
g离心5分钟去除工程菌s的细胞；将去除细胞后的发酵液用氯仿萃取；此过程重复2次，即获得萃取液，其中包含化合物i；
13.4)将步骤3)获得的萃取液干燥至恒重(优选38℃真空干燥)，获得萃取物；将萃取物过硅胶柱(优选200
‑
300目)层析，收取100％氯仿洗脱的组分，并通过旋转蒸发干燥；
14.5)清洗：将干燥产物用10ml甲醇振荡悬浮，21000
×
g离心10分钟，弃上清，取沉淀，此过程重复2次用于去除有机物杂质，获得粗提物；之后分别以乙酸乙酯和正己烷代替甲醇，采用同样的方法清洗该粗提物，将获得的产物干燥，即为纯净的红色素化合物i。
15.本技术获得的化合物(i)属于有机颜料，可广泛应用于合成纤维、塑料、橡胶、皮革、涂料、油墨、油漆、化妆品、食品添加剂等领域。
16.本发明以埃默森蓝状菌rasamsonia emersonii cbs 393.64菌基因组dna作为模板,通过全基因合成得到化合物(i)合成酶基因debi，合成得到的debi基因序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。改造后的合成酶debi显著提升了化合物i的产率，为3.68g/l。
17.本技术首次利用改造后的合成酶debi基因在酿酒酵母工程菌invsc1中表达，合成新型疏水疏油的天然红色染料i。该利用的工程菌合成红色天然染料i的方法及提取工艺染料产率高，不受原料来源限制，操作过程易控制，生产成本低。
18.红色天然染料i为首次合成疏水疏油的新化合物，显色性、匀染性和色牢度较好，其合成原料来自酿酒酵母菌体自身的代谢产物，无毒无害，易于降解，不会对生态环境造成污染。
附图说明
19.图1为红色素化合物i的紫外吸收谱。
20.图2为红色素化合物i的质谱检测图[m
‑
h] 。
[0021]
图3为红色素化合物i的化学结构式编号。
[0022]
图4为实施例3化合物i检测结果图。
具体实施方式
[0023]
实施例所涉及的试剂及培养基成分为：
[0024]
sc培养基(以质量百分数计)：缺乏尿嘧啶的缺陷型氨基酸混合物(do supplement
‑
ura)0.062％，不含碳源无氨基酸酵母氮源(sc minimal medium)6.4％，葡萄糖2％；ph5.5。
[0025]
实施例中使用的乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和dmso购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
[0026]
酿酒酵母工程菌invsc1购自invittrogen公司。
[0027]
以下实施例涉及的原料、器材除非特别说明，均由市售途径购买获得。
[0028]
实施例1制备化合物(i)
[0029]
本实施例制备红色天然染料(化合物i)的具体步骤如下：
[0030]
1)使用序列如seq id no.3所示的前引物和序列如seq id no.4所示的后引物通过聚合酶链式反应扩增如seq id no.1所示的debi基因,将扩增得到的debi基因通过限制性核酸内切酶bamhi和ecori连接到pyes2质粒载体中，获得重组质粒pyes2
‑
debi；然后将重组质粒pyes2
‑
debi转化进入酿酒酵母工程菌invsc1中，获得转化后的工程菌，申请人将该转化后的工程菌自命名为工程菌s；
[0031]
2)从保存有工程菌s的固体培养基上挑取单个菌落于2ml的sc培养基中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌s的种子培养液；吸取1ml工程菌s的种子培养液加入到的sc培养基之中，于28℃，200rpm摇床中发酵培养24小时；
[0032]
用分光光度计与600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至上述发酵液中，将发酵液置于28℃，200rpm摇床中发酵培养72小时，获得培养物；
[0033]
3)培养物分离纯化：培养结束后，取200ml培养物于离心机中850
×
g离心5分钟去除工程菌s的细胞；将去除细胞后的发酵液用200ml氯仿萃取；此过程重复2次，所获得的萃取液即包含化合物(i)；
[0034]
4)将步骤3)获得的萃取液38℃真空干燥至恒重，获得萃取物；将萃取物过硅胶柱(200目)层析，收取100％氯仿洗脱的组分，并通过旋转蒸发干燥；然后将干燥产物用10ml甲醇振荡悬浮，21000
×
g离心10分钟，弃上清，重复本步骤2次用于去除有机物杂质，获得粗提物；
[0035]
然后分别以乙酸乙酯和正己烷代替甲醇，采用同样的方法清洗该粗提物，干燥后得到红色是固体粉末。
[0036]
经检测，该粉末结构式如所示，申请人将其命名为化合物(i)。其紫外吸收谱如图1所示，质谱检测图[m
‑
h] 如图2所示，化学结构式编号如图3所示。
[0037]
本实施例中，根据200ml培养物得到的红色化合物的量推算出1l发酵液中的总产量，计算获得工程菌s的培养物中化合物i产量达到最高，为3.68g/l，说明该化合物具有较高的酵母菌生物合成率。
[0038]
实施例2化合物(i)溶解度的测试
[0039]
在25℃下，分别称取100ml溶液：乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和dmso放入烧杯中。分别称取20g实施例1获得的红色色素固体粉末(即化合物i)，并分别加入盛有溶液乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和dmso的烧杯中。逐步加入红色色素固体粉末的溶质，不断搅拌，充分溶解。保证溶液过饱和，过滤取出未溶解的固体红色素，并在55℃烘干24小时，保证溶剂完全挥发。分别称量未溶解的固体总质量，通过公式(20g
‑
未溶解色素质量＝已溶解色素质量)，求出100ml溶剂中已经溶解的固体质量，即为该温度下该固体的溶解度。化合物i的溶解度检测结果如表1所示：
[0040]
表1溶解度表(25℃，单位：g/100ml溶剂)
[0041][0042]
[0043]
表1检测结果说明化合物i除了在dmso溶解度较好外，均不溶于其他溶剂，其疏水疏油的特性表明化合物i不容易因为洗涤、沾染油污等原因掉色，色牢固好。
[0044]
实施例3酿酒酵母工程菌invsc1中生产化合物i的分析
[0045]
1.包含空白质粒pyes2的酿酒酵母工程菌invsc1通过与实施例1制备方法相同的方法培养72小时，取培养物备用。
[0046]
2.取制备方法中的工程菌s的培养物和上述培养物，进行液相检测，420nm波长，流动相为乙腈
‑
水(0.1％甲酸)，流速为1ml/min，洗脱方法为10
‑
90％乙腈梯度洗脱60min。
[0047]
检测结果如图4所示，包含空白质粒pyes2的酿酒酵母工程菌invsc1的培养物如(图4a)所示，表明未检测到化合物i的合成；工程菌s的培养物如(图4b)所示，表明检测到化合物i；证明debi是合成化合物i的关键酶。
[0048]
实施例4化合物i的提取、分析和纯化
[0049]
包含重组质粒pyes2
‑
debi的酿酒酵母工程菌invsc1通过与实施例1相同的方法培养24小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分离得到0.79g的化合物i。
[0050]
实施例5化合物i的提取、分析和纯化
[0051]
包含重组质粒pyes2
‑
debi的酿酒酵母工程菌invsc1通过与实施例1相同的方法培养48小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分离得到1.91g的化合物i。
[0052]
实施例6化合物i的提取、分析和纯化
[0053]
包含重组质粒pyes2
‑
debi的酿酒酵母工程菌invsc1通过与实施例1相同的方法培养72小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分离得到3.68g的化合物i。
[0054]
实施例7化合物i的提取、分析和纯化
[0055]
包含重组质粒pyes2
‑
debi的酿酒酵母工程菌invsc1通过与实施例1相同的方法培养96小时，结果从重组工程菌s的1l培养物中分离得到3.58g的化合物i。
[0056]
实施例8色素理化性质测定
[0057]
取实施例1获得的化合物实施例1获得的化合物(i)，以常规方法进行理化特性检测：色差参数(de、dc、dh)检测方法依照gb/t6688
‑
2008进行,检测色差仪型号为konica minoltacolor reader cr
‑
10 plus；粒径检测方法依照gb/t 19077
‑
2016进行,检测仪器为马尔文3000；ph的测定参照gb/t 2390
‑
2013进行,检测仪器为梅特勒fe28；强度指标检测方法依据gb/t 6688
‑
2008进行,检测强度仪器型号为尤尼柯uv
‑
4800；电导率指标检测方法依据gb11007
‑
89进行，检测设备是梅特勒fe30k；粘度指标检测方法依据gb/t10247
‑
2008进行，主要设备是粘度计，表面张力检测方法依据gb/t22237
‑
2008进行,主要设备是安妙as
‑
120n张力仪。检测结果如下表2所示：
[0058]
表2
[0059][0060][0061]
由表2可见，实施例1获得的红色粉末化合物(i)初始粒径较小，有利于下游染色工业的的应用；同时，化合物(i)色差、老化率均具有较好的检测结果，证明该生物色素显色性、匀染性和色牢度较好，可以替代现有颜料，应用于合成纤维、塑料、橡胶、皮革、涂料、油墨、油漆、化妆品、食品添加剂等领域，绿色环保。
[0062]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。