伯克霍尔德氏菌的数字PCR检测试剂盒的制作方法

伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测试剂盒。


背景技术：

2.伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)属于假单孢均可的rrnai群，属内的种包括洋葱伯克霍尔德氏菌(b.cepacia)、椰毒伯克霍尔德氏菌(b.cocovenenans)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(b.rnallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(b.pseudomallei)、石竹伯克霍尔德氏菌(b.caruophylli)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(b.gladioli)、皮氏伯克霍尔德氏菌(b.picketti)及茄伯克霍尔德氏菌(b.solanacearum)等。
3.伯克霍尔德氏菌属内的种分别对人、动物及植物有感染性，为致病菌。其中，与人类疾病有关的有五个种，分别为洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、假鼻疽伯克霍尔德氏菌、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和皮氏伯克霍尔德氏菌。这其中，关于洋葱伯克霍尔德氏菌感染的报道最为常见。伯克霍尔德氏菌感染后的症状包括高热、呼吸衰竭、菌血症、皮肤软组织感染、尿路感染等。伯克霍尔德氏菌普遍存在耐药性高的特点，因此在治疗过程中，需首先对感染的病原菌进行鉴定，再进行有针对性的治疗。现有技术中，仍多采用菌种分离培养的方式对伯克霍尔德氏菌进行鉴定，但分离培养的方法大多需要18～24h，消耗的时间较长，给治疗带来不便。
4.数字pcr技术是一种核酸分子绝对定量技术，其检测需要的时间段，且样品需求量低，检测灵敏度高，如能将数字pcr技术应用于伯克霍尔德氏菌的检测，可以大幅提高检测效率，更及时的给感染者确定治疗方案，但目前尚未见到数字pcr应用于伯克霍尔德氏菌检测的报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测试剂盒。
6.本发明提供了伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测的引物探针组，其包括：
7.如seqidno:1～2所示核酸序列的两条引物，和如seqidno:3～5所示核酸序列的三条探针。
8.本发明中，如seqidno:1～2所示核酸序列的两条引物是根据保守序列设计的通用引物，对洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌和假鼻疽伯克霍尔德菌都能准确识别并扩增。
9.本发明中，如seqidno:3～4所示核酸序列的两条探针靶向洋葱伯克霍尔德菌，而如seqidno:5所示核酸序列条探针靶向鼻疽伯克霍尔德菌和假鼻疽伯克霍尔德菌。
10.本发明中，所述探针的5’端和3’端分别修饰荧光基团和淬灭基团；
11.所述荧光基团选自alexa350、alexa488、alexa532、alexa549、alexa647、alexa680、cf350、cf488、cf532、cf594、cf647、cf680、fam、hex、vic、rox、cal610、texasred、cy5、
quasar670或quasar705；
12.所述淬灭基团选自bhq
‑
0、bhq
‑
1、bhq
‑
2、bhq
‑
3、mgb、dabcyl或eclip seλ。
13.本发明所述的探针中：
14.如seq id no:3所示核酸序列的探针5’端和3’端分别修饰fam和mgb；
15.如seq id no:4所示核酸序列的探针5’端和3’端分别修饰fam和mgb；
16.如seq id no:5所示核酸序列的探针5’端和3’端分别修饰cy5和mgb。
17.一些实施例中，
18.如seq id no:3所示核酸序列的探针5’端修饰fam，3’端修饰mgb；
19.如seq id no:4所示核酸序列的探针5’端修饰fam，3’端修饰mgb；
20.如seq id no:3所示核酸序列的探针5’端修饰cy5，3’端修饰mgb；
21.本发明所述的引物探针组在制备检测伯克霍尔德氏菌的试剂盒中的应用。
22.本发明所述引物探针组合物用于检测的伯克霍尔德氏菌包括洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌和假鼻疽伯克霍尔德菌。
23.本发明还提供了一种检测伯克霍尔德氏菌的试剂盒，其包括本发明所述的引物探针组。
24.本发明所述的试剂盒中，还包括内源外参的检测引物和探针。
25.本发明所述试剂盒以ic
‑
s为外源性内参，该内参的核酸序列为tcacaatcttgacctgcacggcaaagagacgcttcttgtggagctcgacaacgcaacaacgcgacggatctacgtcacagcgagtatagtgaaaacgaagttgctgacggcggaagcgacatagggatctgtcagttgtcattcgcgaaa。研究表明，该片段与病原菌或人基因组都不会发生交叉反应。
26.本发明中，所述内源外参两条检测引物的核酸序列如seq id no:6～7所示；
27.本发明具体实施例中，所述内源外参检测探针核酸序列如seq id no:8所示。如seq id no:8所示核酸序列的探针5’端和3’端分别修饰vic和bhq1。
28.本发明所述的试剂盒中，还包括数字pcr的检测试剂，所述检测试剂包括ddpcr mix、rox染料和超纯水。
29.本发明所述的试剂盒中，还包括样品处理试剂；
30.所述样品包括：口腔拭子、血液、腹腔积液、创面组织或痰液；
31.所述样品处理试剂包括基因组dna提取试剂。
32.本发明中，所述基因组dna的提取试剂为磁珠法dna提取试剂。
33.本发明还提供了一种检测伯克霍尔德氏菌的方法，其以本发明所述的试剂盒进行检测。
34.本发明所述检测方法中，检测体系包括：ddpcr mix、引物探针混合物、内源外参片段和待测样品的dna。
35.本发明所述检测方法中，扩增程序包括：98℃5min【98℃15s，60℃1min】
×
40个循环。
36.本发明提供了伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测的引物探针组，并提供了伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测的试剂盒。利用该引物、探针组能够准确鉴定样品中是否含有洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌的dna，且对三种伯克霍尔德氏菌的检测都具有良好的灵敏性。
具体实施方式
37.本发明提供了伯克霍尔德氏菌的数字pcr检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
38.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
39.实施例1
40.1、引物探针设计
41.1.1依据洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌、序列分析结果，采用primer express软件，设计引物和探针；同时搭配一组外源内参的引物探针，具体信息如下：
[0042][0043]
2、样品
[0044]
2.1菌dna样品：外购灭活菌，磁珠法提取基因组dna。
[0045]
2.2人dna样品：口腔拭子，磁珠法提取基因组dna。
[0046]
2.3外源内参模板：生物公司合成，溶解稀释后备用。
[0047]
3、检测方法
[0048]
3.1数字pcr扩增体系
[0049]
3.1.1 25xb引物探针混合液
[0050]
组分储存液(μm)体积(μl/人份)50
×
rox染料 0.3b
‑
f4000.0375b
‑
r4000.0375bc
‑
p11000.0375bc
‑
p21000.0375
bm
‑
p1000.0375ic
‑
f4000.0375ic
‑
r4000.0375ic
‑
p1000.0375合计/0.6
[0051]
3.1.2 ddpcr反应体系
[0052]
试剂体积(μl)终浓度水0.4 5
×
ddpcr mix31
×
25xb引物探针混合液0.61
×
ic
‑
s1 dna10 合计15 [0053]
3.1.3扩增程序
[0054]
98℃5min【98℃15s，60℃1min】
×
40
[0055]
4结果
[0056]
4.1特异性检测
[0057]
[0058]
[0059][0060]
结果表明，本发明所述引物、探针组合，用于数字pcr法检测多种常见的细菌真菌的特异性良好，检测洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌三个重复的稳定性也较好，且洋葱伯克霍尔德氏菌与鼻疽伯克霍尔德菌/假鼻疽伯克霍尔德菌无交叉。
[0061]
4.2最低检测限测试
[0062]
[0063]
[0064]
[0065]
[0066][0067]
结果表明，以本发明提供的引物和探针不论检测洋葱伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德菌、假鼻疽伯克霍尔德菌都能稳定检测到0.3copies/μl，即最低检测4.5copies/反应。
[0068]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。