马来甜龙竹转基因体系的建立方法与流程

h，直至愈伤组织表面干燥为止，将吹干后的愈伤组织转移至筛选培养基中，在25
±
2℃下暗培养的条件下进行筛选培养，每4周继代一次，3次继代后得到抗性愈伤组织；5）抗性愈伤组织分化及抗性苗生根：将经过筛选培养得到的抗性愈伤组织转移至分化培养基i中，在光强45 μmol
·
m
‑2·
s
‑1.光周期16/8 h，温度25
±
2℃的培养条件下进行分化培养，待分化培养得到的再生芽后转移至分化培养基ii中，待长到3~4 cm后转移至生根培养基中，在光强45 μmol
·
m
‑2·
s
‑1.光周期16/8 h，温度25
±
2℃的培养条件下进行生根诱导，30 d左右生根；6）抗性植株分子鉴定：用pcr法对上述获得的再生植株进行检测，确定外源基因已整合到马来甜龙竹基因组dna中，并在rna层面表达。
5.进一步地，步骤1）中愈伤组织诱导培养基的配方为ms 3 mg
·
l
‑
1 2，4
‑
d 0.5 mg
·
l
‑
1 naa 500 mg
·
l
‑
1 ch 500 mg
·
l
‑
1 pro 500 mg
·
l
‑
1 gln sucrose 30 g
·
l
‑
1 gelrite 3.3 g
·
l
‑1，ph 5.7；增殖培养基配方为：ms 2mg
·
l
‑
1 2，4
‑
d 0.5 mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 500 mg
·
l
‑
1 ch 20 g
·
l
‑
1 sucrose 3.3 g
·
l
‑
1 gelrite，ph 5.7。
6.进一步地，步骤2）中菌液中含有乙酰丁香酮（as）200μm。
7.进一步地，步骤3）中共培养培养基的配方为ms 2mg
·
l
‑
1 2，4
‑
d 0.5 mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 200 μm as 30 g
·
l
‑
1 sucrose 3.3 g
·
l
‑
1 gelrite，ph 5.7。
8.进一步地，步骤4）中筛选培养基配方ms 2mg
·
l
‑
1 2，4
‑
d 0.5 mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 150 mg
·
l
‑1hyg 200 mg
·
l
‑
1 tim 30 g
·
l
‑
1 sucrose 3.3 g
·
l
‑
1 gelrite，ph 5.7。
9.进一步地，步骤5）中分化培养基i配方为ms 0.02 mg
·
l
‑
1 tdz 20 g
·
l
‑
1 sucrose 150 mg
·
l
‑1hyg 200 mg
·
l
‑
1 tim 3.3 gelrite g l
‑1，ph:6.0；分化培养基ii 配方为：ms 1 mg
·
l
‑
1 6
‑
ba 1 mg
·
l
‑
1 kt 0.25 mg
·
l
‑
1 naa 500 mg
·
l
‑
1 ch 150 mg
·
l
‑1hyg 200 mg
·
l
‑
1 tim 20 g
·
l
‑
1 sucrose 3.3 g l
‑1gelrite，ph 5.7；生根培养基配方为：1/2ms iba 3 mg
·
l
‑1 3.3 g
·
l
‑
1 gelrite，ph5.7。
10.本发明以马来甜龙竹愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法从472块愈伤组织中成功获得34棵抗性植株，转化率为7.20 %，抗性植株均有花青素积累表型，提取其中6棵抗性植株进行rna提取，并反转录得到其cdna进行pcr检测，结果证实玉米花青素基因已转入竹子基因组中。本发明转化效率高，步骤简单，周期短，效果显著，对其他竹种的转基因体系建立具有一定的参考作用。
附图说明
11.图1为本发明的农杆菌侵染前愈伤组织状态图；图2为本发明的农杆菌和胚性愈伤组织共培养状态图；图3为本发明的愈伤组织在筛选培养基中的状态图；图4为本发明的愈伤组织在分化培养基i中的状态图；图5为本发明的愈伤组织在分化培养基ii中的状态图；图6为本发明的转基因植株；图7为本发明的转基因植株pcr检测结果；图中，dl 2000：dl 2000 marker；wt：未转化植株；h2o：水代替dna模板进行扩增；
l1~l6：转基因株系1至6号； ：以含有lc的质粒未模板进行扩增作为阳性对照；图8为本发明驯化移栽的转基因植株。
具体实施方式
12.以下结合说明书附图，对本发明做进一步详细描述，以更好地理解本技术方案。
13.实施例1：愈伤组织获得选取马来甜龙竹无菌苗，取其幼嫩腋芽接种于愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织诱导培养基基本培养基为ms（murashige&skoog），添加外源激素2，4
‑
二氯苯氧乙酸（2，4
‑
d）3 mg
·
l
‑1，萘乙酸（1
‑
naphthlcetic acid，naa）0.5 mg
·
l
‑1，再添加水解酪蛋白（caseinhydrolysate,ch）500 mg
·
l
‑1，脯氨酸（l
‑
proline,pro）500 mg
·
l
‑1，谷氨酰胺（l
‑
glutamine, gln）500 mg
·
l
‑1，再添加蔗糖（sucrose）30 g
·
l
‑1，水晶洋菜（gelrite）3.3 g
·
l
‑1，调节ph为5.7。在25
±
2℃温度中按培养，诱导30 d左右，有愈伤组织产生，随后挑选乳黄色致密胚性愈伤组织转移至愈伤组织增殖培养基中，增殖培养基的基本培养基为ms，添加有2 mg
·
l
‑12，4
‑
d，0.5 mg
·
l
‑
1 6
‑
苄基腺嘌呤（n
‑
(phenylmethyl)
‑
9h
‑
purin
‑6‑
amine, 6
‑
ba），500 mg
·
l
‑1ch，20 g
·
l
‑1sucrose和3.3 g
·
l
‑1gentril，ph为5.7。每4周更换一次增殖培养基，见图1。
14.实施例2：农杆菌培养试验所用农杆菌菌株为eha105，质粒为pcambia1301，带有以camv35s启动子的潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）及以ubi启动子的玉米花青素基因（lc）；将带有目的质粒的农杆菌在含有50 mg
·
l
‑1卡那霉素（kan）和50 mg
·
l
‑1的利福平（rif）的固体yep培养基平板上划板活化，28℃暗培养2~3 d后挑取单菌落接种于1 ml含有50 mg
·
l
‑1卡那霉素（kan）和50 mg
·
l
‑1的利福平（rif）的液体yep培养基中，28℃，200rpm振摇培养，当菌液od
600
达到0.5~0.6后将全部1 ml菌液接种于50 ml含有50 mg
·
l
‑1卡那霉素（kan）和50 mg
·
l
‑1的利福平（rif）的液体yep培养基中，28℃，200 rpm振摇培养至菌液od
600
达到0.5~0.6，随后添加as至浓度达到200μm，并继续振荡培养30 min。
15.实施例3：侵染及共培养将胚性愈伤组织浸泡在准备好的侵染液中，期间不断摇动，侵染15 min左右后取出愈伤组织。用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的菌液，随即接种于共培养培养基中，共培养培养基使用ms为基本培养基，并添加有2 mg
·
l
‑
1 2，4
‑
d，0.5 mg
·
l
‑
1 6
‑
ba，200 μm as，30 g
·
l
‑
1 sucrose和3.3 g
·
l
‑1gentril。愈伤组织与农杆菌在共培养培养基中培养4 d，培养条件为25
±
2℃，暗培养，见图2。
16.实施例4：筛选培养共培养4 d后将愈伤组织取出，使用无菌水清洗共培养后的愈伤组织3~4遍，至洗出后的废液不再浑浊为止，再使用200 mg
·
l
‑1特美汀（tim）的无菌水清洗浸泡5 min。清洗后转移至无菌滤纸上吸干表面水分，再在超净工作台中用无菌风吹1~2 h至愈伤组织表面干燥。然后转移至筛选培养基中进行筛选培养，筛选培养基的配方为：使用ms为基本培养基，并添加有2 mg
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l
‑
1 2，4
‑
d，0.5 mg
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l
‑
1 6
‑
ba，150 mg
·
l
‑
1 潮霉素（hygromycin b，hyg），200 mg
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l
‑
1 tim，30 g
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l
‑
1 sucrose和3.3 g
·
l
‑1gentril，ph 5.7，25
±
2℃，暗培养。每4周继代一次，继代两次后可得抗性愈伤组织，见图3。
17.实施例5：抗性愈伤组织分化及抗性苗生根使用筛选培养中得到愈伤组织，转移至分化培养基i中，分化培养基的配方为：使用ms为基本培养基，添加0.02 mg
·
l
‑1噻苯隆（thidiazuron，tdz），200 mg
·
l
‑
1 gln，150 mg
·
l
‑
1 hyg，200 mg
·
l
‑
1 tim，20 g
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l
‑
1 sucrose和3.3 g
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l
‑1gelrite，ph 6.0，在光强45 μmol
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m
‑2·
s
‑1，光周期16/8 h，温度25
±
2℃的培养条件下进行分化培养，30 d左右得到抗性苗，见图4，随即转移至分化培养基ii中，见图5，分化培养基ii的配方为：使用ms为基本培养基，添加1 mg
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l
‑
1 6
‑
ba，1 mg
·
l
‑
1 kt，0.25 mg
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l
‑
1 naa，500 mg
·
l
‑
1 ch，150 mg
·
l
‑
1 hyg，200 mg
·
l
‑
1 tim，20 g
·
l
‑
1 sucrose和3.3 g
·
l
‑1gelrite，ph 5.7，光强45 μmol
·
m
‑2·
s
‑1，光周期16/8 h，温度25
±
2℃。待抗性植株在分化培养基ii中长至3~4 cm后转移至生根培养基中，生根培养基配方为：以1/2 ms为基本培养基，添加3 mg
·
l
‑1吲哚丁酸（indole
‑3‑
butytric acid, iba），30 g
·
l
‑
1 sucrose和3.3 g
·
l
‑1gelrite，ph 5.7，光强45 μmol
·
m
‑2·
s
‑1，光周期16/8 h，温度25
±
2℃。1周左右即可看到生根，30 d后根伸长变粗，如图6所示。
18.实施例6：抗性植株分子鉴定提取转基因马来甜龙竹叶片rna，进行反转录得到其cdna，进行pcr检测，所用的玉米花青素基因lc的引物序列为：5'
‑
cgacgctttgttcaccctgt
‑
3'和5'
‑
acgggagcagcacaggaaat
‑
3'。pcr程序为：95℃预变性5 min；然后95℃变性30s，58℃退火30s，循环30次；72℃延伸5min；结果见图7，6棵转基因植株电泳结果均为阳性。
19.实施例7：植株驯化移栽将经过鉴定的转基因植株从培养瓶中取出，在流水下小心冲洗去除其根上残留的培养基，待培养基冲洗干净后，种植于基质中。基质给足水分，植株使用塑封袋罩住防止失水，在光强45 μmol
·
m
‑2·
s
‑1，光周期16/8 h，温度25
±
2℃条件下进行驯化，一周后在塑封袋顶部剪开2 cm左右的开口，每隔1~2 d扩大一次开口，直至塑封袋顶部完全开口，保持2~3 d后植株无明显失水现象后撤去塑封袋，该方法驯化的转基因马来甜龙竹见图8。