工程化以定植肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境的免疫刺激性细菌
1.相关申请
2.本技术要求于2020年1月16日提交的美国临时专利申请no.62/962,140的优先权权益，题目为“immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors,tumor
‑
resident immune cells,and the tumor microenvironment”，申请人是actym therapeutics,inc.，以及发明人是christopher d.thanos、laura hix glickman、justin skoble、alexandre charles michel iannello和haixing kehoe。
3.本技术要求于2019年11月12日提交的美国临时专利申请no.62/934,478的优先权权益，题目为“immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors and the tumor microenvironment”，申请人是actym therapeutics,inc.，以及发明人是christopher d.thanos、laura hix glickman、justin skoble和alexandre charles michel iannello。
4.本技术要求与2019年4月3日提交的美国临时专利申请no.62/828,990的优先权权益，题目为“salmonella strains engineered to colonize tumors and the tumor microenvironment”，申请人是actym therapeutics,inc.，以及发明人是christopher d.thanos、laura hix glickman、justin skoble和alexandre charles michel iannello。
5.本技术还要求于2019年2月27日提交的美国临时专利申请no.62/811,521的优先权权益，题目是“tumor
‑
targeting microorganisms that promote immuno
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stimulation of the tumor microenvironment”，申请人是actym therapeutics,inc.，以及发明人是christopher d.thanos、laura hix glickman、justin skoble和alexandre charles michel iannello。
6.在允许的情况下，这些申请中的每一个申请的主题均通过引用整体并入。在这些申请中的每一个申请中提供的免疫刺激性细菌可以如本技术中所述进行修饰，以及这些细菌通过引用并入本文。
7.通过引用并入以电子方式提供的序列表
8.与本技术一起提交序列表的电子版本，其内容通过引用以其整体并入。该电子文件创建于2020年2月27日，大小为603千字节，且名称为1706seqpc.txt。
9.发明背景
10.肿瘤已经进化出一种极度的免疫抑制环境。其启动多种机制以逃避免疫监视，重新编程抗肿瘤免疫细胞以抑制免疫性，并且持续突变出对最新癌症疗法的抗性(见例如mahoney et al.(2015)nat.rev.drug discov.14(8):561
‑
584)。抗ctla4、抗pd
‑
1和抗pd
‑
l1免疫检查点抗体的临床成功证实了癌症免疫治疗领域取得了长足的进步(见例如buchbinder et al.(2015)j clin.invest.125:3377
‑
3383；hodi et al.(2015)j clin.invest.125:3392
‑
4000；及chen et al.(2015)j clin.invest.125:3384
‑
3391)。设计克服免疫耐受和逃逸及同时限制目前的免疫疗法的自身免疫相关毒性的免疫治疗方法挑战了免疫肿瘤学领域。因此，需要额外的和创新的免疫疗法和其它疗法。
11.发明概述
12.提供了被修饰为用于抗癌疗法的免疫刺激性细菌。如本文所提供的，免疫刺激性细菌提供了抗肿瘤疗法的多方面方法。细菌提供了一个平台，其中有许多途径可以激发抗肿瘤免疫刺激活性。如本文所提供，细菌如沙门氏菌种(salmonella)通过增加其在肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和/或肿瘤微环境(tme)中累积或靶向的能力而被微调以具有有效的抗肿瘤活性。这是通过修饰实现的，例如改变其可以感染的细胞类型(向性)、其毒性、其逃避免疫系统的能力，例如逃避被补体失活，和/或其在之中可以复制的环境。免疫刺激性细菌还可以编码例如增强或引发免疫应答的产物和其它治疗性/抗癌产物。本文提供的免疫刺激性细菌，由于其改善的肿瘤/肿瘤微环境/肿瘤驻留免疫细胞的定植，以及其对补体和其它抗菌免疫应答的抗性，因此可以全身施用。
13.细菌在其本质上刺激免疫系统；细菌感染诱导免疫和炎症途径和应答，其中一些是抗肿瘤治疗所期望的，而另一些是不期望的。通过缺失或修饰导致不期望的炎症应答的基因和产物，以及加入或修饰诱导期望的免疫刺激性抗肿瘤应答的基因和产物对细菌进行修饰，改良了细菌的抗肿瘤活性。
14.细菌在肿瘤细胞和组织中累积，以及通过在其中的复制可以裂解细胞。细菌从施用部位迁移并可在其它(例如末梢的/转移性的)肿瘤和肿瘤细胞中累积以提供远位效应。修饰本文提供的细菌，由此使其优先感染肿瘤
‑
驻留免疫细胞、肿瘤和肿瘤微环境及在其中累积，并递送其编码治疗性抗癌蛋白和产物的质粒。在本文中，利用所述细菌的这些特性产生具有多种抗肿瘤活性和性质的具有明确免疫刺激性细菌，这些活性和性质可以单独和协同作用。
15.本文提供的细菌基因组被修饰以增加在肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞以及肿瘤微环境中的累积。在此这是通过缺失或禁用造成非肿瘤细胞例如上皮细胞的感染或侵入的基因和/或降低细菌的致细胞病变性而实现，特别是对免疫细胞和肿瘤驻留免疫细胞的致细胞病变性。
16.基于在肿瘤驻留免疫细胞中累积后，在真核调节信号控制下在质粒上编码的蛋白质被表达并分泌至tme中。本文提供的免疫刺激性细菌编码具有抗癌活性的蛋白质，例如通过调节抗肿瘤免疫应答而具有抗癌活性。本文提供的细菌编码导致i型干扰素(ifn)表达的蛋白质。这种蛋白质包括sting(干扰素基因刺激物)及其它免疫刺激性蛋白，这些蛋白是导致i型ifn表达的胞质dna/rna传感器(sensor)途径的一部分，以及是这些蛋白质的变体，其增加i型ifn表达或导致ifn组成型表达。例如，所述免疫刺激性蛋白包括胞质dna/rna传感器的组成型活性变体，例如具有功能获得性突变的那些变体。
17.提供了调节免疫应答以治疗疾病、包括治疗癌症的组合物、其用途和方法。所述组合物含有本文提供的免疫刺激性细菌。还提供了治疗方法和所述细菌的治疗性用途。治疗对象包括人和其它灵长类动物，宠物如狗和猫，以及其它动物，如马、牛和其它农场和动物园动物。
18.提供了包含所述免疫刺激性细菌的药物组合物，及其治疗疾病和病症、特别是增殖性病症例如肿瘤包括实体瘤和血液恶性病的方法和用途。
19.还提供了通过施用所述免疫刺激型细菌或药物组合物或使用组合物进行治疗以抑制实体瘤生长或减小实体瘤体积的方法。例如，提供了向患有实体瘤癌症对象(例如人患
者)施用或使用组合物的方法，所述组合物的单一剂量包含有效量的所述免疫刺激性细菌例如沙门氏菌种(salmonella)。
20.提供了编码免疫刺激性蛋白的免疫刺激性细菌，所述免疫刺激性蛋白是刺激或引起i型ifn表达的组成型活性蛋白。所述免疫刺激性细菌还可以编码其它抗肿瘤治疗剂，例如rnai，以及细胞因子和趋化因子，以及本文描述的对细菌和质粒的其它修饰可以以任何期望的组合进行组合。
21.提供了具有增强的肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞的定植以及增强的抗肿瘤活性的免疫刺激型细菌。对所述免疫刺激性细菌的修饰是通过缺失编码鞭毛的基因和/或修饰基因由此以不产生功能性鞭毛和/或缺失pagp或修饰pagp以产生无活性的pagp产物而进行。结果，所述免疫刺激型细菌是鞭毛蛋白(flagellin)
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和/或pagp
‑
。可选地或者额外地，所述免疫刺激性细菌可以是pagp
‑
/msbb
‑
。
22.所述免疫刺激性细菌可以是天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶
‑
(asd
‑
)，例如通过破坏或缺失编码天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶(asd)的全部或部分内源基因，从而不表达内源asd。所述免疫刺激性细菌可以被修饰以在用于在体外培养细菌的细菌启动子控制下在质粒上编码天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶(asd)，从而使细菌在体内的复制受限。
23.所述免疫刺激性细菌任选具有额外的基因组修饰，由此所述细菌是腺苷或嘌呤营养缺陷型。所述细菌任选地是asd
‑
、puri
‑
和msbb
‑
中的一种或多种。所述免疫刺激性细菌，例如沙门氏菌种(salmonella)，被修饰为编码在肿瘤微环境中赋予抗肿瘤活性的免疫刺激性蛋白，和/或被修饰为使所述细菌优先感染肿瘤微环境中的免疫细胞或肿瘤驻留免疫细胞和/或在免疫细胞中比在其它细胞中诱导更少的细胞死亡。还提供了通过施用所述免疫刺激性细菌以抑制实体瘤生长或减小实体瘤体积的方法。
24.提供了通过将所述免疫刺激性细菌的基因组修饰为鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)，从而不产生鞭毛，和/或将所述免疫刺激性细菌的基因组修饰为pagp
‑
，由此增加所述免疫刺激性细菌例如沙门氏菌种(salmonella)的肿瘤定植的方法。特别地，所述细菌是鞭毛蛋白
‑
腺苷营养缺陷型，且其也是asd
‑
。是鞭毛蛋白
‑
的细菌源自表达鞭毛的细菌种。
25.所述细菌还包含编码治疗性产物的质粒，例如抗肿瘤剂、增加对象免疫应答的蛋白质和/或导致免疫刺激性蛋白(例如i型干扰素(ifn)、包括干扰素
‑
β)组成型表达或增加的表达的蛋白质。这包括刺激免疫系统的编码蛋白质，作为导致i型ifn表达的途径的一部分，且特别是通过使这些蛋白质具有组成性活性。所述质粒还可以编码免疫刺激性蛋白，例如细胞因子，其增加对象的抗肿瘤免疫应答。所述细菌含有编码抗癌治疗剂的质粒，例如干扰rna，包括microrna、shrna和sirna，旨在阻抑、抑制、破坏或另外沉默免疫检查点基因和产物，以及在免疫抑制性途径中起作用的其它靶。所述细菌还可以在质粒上编码肿瘤抗原，以刺激针对肿瘤的免疫应答。编码的蛋白质在真核生物例如哺乳动物和动物识别的启动子或病毒启动子的控制下表达。所述细菌可以表达一种、两种或多种治疗性蛋白质/产物，包括功能获得性免疫刺激性蛋白和/或细胞因子的组合。这些异源蛋白质在真核宿主识别的启动子如rna聚合酶ii或iii启动子的控制下在质粒上被编码。
26.提供了免疫刺激型细菌，其包含在真核启动子控制下编码产物的质粒，其中所述免疫刺激性细菌的基因组被修饰，从而所述细菌是鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和/或pagp
‑
。所述细菌可以是鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和pagp
‑
中的一种或这两种。这些免疫刺激性细菌呈
现出增加的肿瘤/肿瘤微环境和肿瘤驻留免疫细胞定植，并具有增加的抗肿瘤活性。
27.还提供了免疫刺激性细菌，其含有在真核启动子控制下编码治疗性产物的质粒，其中所述免疫刺激性细菌的基因组被修饰，从而所述细菌是pagp
‑
/msbb
‑
。这些细菌还具有增加的肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞以及肿瘤微环境的定植。由于细菌膜和结构中的所得改变，宿主的免疫应答例如补体活性被改变，因此在全身施用时细菌不会被消除。这些细菌也可以是鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)，且可以包含如本文所述的其它修饰，包括改变其可以感染的细胞的修饰，导致在肿瘤微环境、肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞中的累积。因此，本文提供的免疫刺激性细菌可以全身施用并呈现出高水平的肿瘤/肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞的定植。所述免疫刺激性细菌可以是puri
‑
(purm
‑
)、asd
‑
和msbb
‑
中的一种或多种，以及鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和pagp
‑
之一或这二者。
28.所述免疫刺激性细菌可以是puri
‑
(purm
‑
)、msbb
‑
、purd
‑
、鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)、pagp
‑
、adra
‑
、csgd
‑
、qsec
‑
、hila
‑
、lppa
‑
和1ppb
‑
中的一种或多种，特别是鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和/或pagp
‑
，和/或msbb
‑
/pagp
‑
。例如，所述免疫刺激型细菌可包括基因组中的突变，例如降低宿主中非免疫细胞的毒性或感染性的缺失或破坏。例如，所述免疫刺激型细菌可以是pagp
‑
。又如，所述免疫刺激性细菌可以是鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)，且也可以是pagp
‑
。可以对细菌进行修饰，使其在肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境(tme)中累积和表达治疗性产物，从而将免疫治疗性抗肿瘤产物递送至在其具有有益活性的环境中，并避免在其它细胞/环境中表达的不良或毒副作用。编码所述免疫刺激性蛋白/治疗性产物的核酸可以与编码分泌信号的核酸可操纵地连接以表达，由此在宿主中表达时所述免疫刺激性蛋白/治疗性产物被分泌至肿瘤微环境中。
29.如上所述，所述免疫刺激性细菌的基因组也被修饰，使得细菌优先感染免疫细胞，例如肿瘤驻留免疫细胞，和/或基因组被修饰，使得所述细菌与未修饰的细菌相比在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少的细胞焦亡)。结果，所述免疫刺激性细菌与未修饰的细菌相比在肿瘤中或在肿瘤微环境中或在肿瘤驻留免疫细胞中累积或更高程度累积，从而将免疫刺激性蛋白及其组成型活性变体和其它治疗性产物递送至细胞，以刺激或诱导i型干扰素的表达。所述细菌可以是鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)、pagp
‑
和msbb
‑
中的一种或多种，且可包括如本文所述其它这种修饰。
30.所述免疫刺激性细菌也可以是天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶
‑
(asd
‑
)，例如通过破坏或缺失编码天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶(asd)的全部或部分内源性基因，从而不表达内源性asd。这些免疫刺激性细菌可以被修饰为在细菌启动子控制下在质粒上编码天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)，从而可以在体外产生细菌。
31.可以使免疫刺激性细菌对于在肿瘤微环境中富集或累积的特定营养物质(例如腺苷和腺嘌呤)是营养缺陷型的。此外，其也可以被修饰为对这些营养物质是营养缺陷型的，以降低或消除其复制能力。失活/缺失的细菌基因组基因可以通过将其提供在宿主识别的启动子控制下的质粒上以补足。
32.此外，对免疫刺激性细菌的基因组进行修改，由此其优先感染肿瘤驻留免疫细胞。这是通过缺失或破坏在细菌的侵入性或感染性中起作用和/或在诱导细胞死亡中起作用的细菌基因而实现的。所述细菌被修饰为与未修饰的细菌相比或与细菌可以感染的其它细胞相比，其优先感染肿瘤驻留免疫细胞，和/或在这种细胞中诱导更少的细胞死亡。
33.本文提供的免疫刺激性细菌可以包括对细菌基因组修饰，由此所述细菌在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡；和/或对细菌基因组修饰，从而使细菌更有效地在肿瘤、tme或肿瘤驻留免疫细胞中累积。可以进一步修饰这些免疫刺激性细菌，由此所述细菌优先感染肿瘤驻留免疫细胞，和/或可以修饰免疫刺激性细菌的基因组，由此其在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少细胞焦亡)，从而所述免疫刺激性细菌在肿瘤或肿瘤微环境或肿瘤驻留免疫细胞中累积，由此将组成型活性免疫刺激性蛋白或其它治疗性产物递送至细胞以刺激或诱导i型干扰素的表达。
34.所述免疫刺激性细菌可包括参与spi
‑
1依赖性侵入(和/或spi
‑
2)的一种或多种基因或操纵子的缺失或修饰，由此所述免疫刺激性细菌不侵入或感染上皮细胞。可被缺失或失活的基因例如是如下一种或多种：avra，hila，hild，inva，invb，invc，inve，invf，invg，invh，invi，invj，iacp，iagb，spao，spap，spaq，spar，spas，orga，orgb，orgc，prgh，prgi，prgj，prgk，sica，sicp，sipa，sipb，sipc，sipd，sirc，sopb，sopd，sope，sope2，sprb和sptp。消除感染上皮细胞的能力也可以通过对本文的免疫刺激性细菌进行工程化而实现，以包含编码参与spi
‑
1非依赖性侵入的蛋白质的基因的敲除或缺失，例如选自rck、pagn、hlye、pefi、srgd、srga、srgb和srgc中的一种或多种基因。类似地，所述免疫刺激性细菌可包括spi
‑
2中基因和/或操纵子的缺失，例如工程化细菌以逃避含沙门氏菌(salmonella)的囊泡(scv)。这些基因包括例如sifa、ssej、ssel、sopd2、pipb2、ssef、sseg、spvb和stea。
35.例如，所述免疫刺激性细菌可以被修饰以具有降低的致病性，从而相对于没有修饰的细菌减少上皮细胞和/或其它非免疫细胞的感染。这些包括3型分泌系统(t3ss)或4型分泌系统(t4ss)的修饰，例如如本文所述和示例的对沙门氏菌(salmonella)的spi
‑
1途径或t3ss系统的修饰。可以进一步修饰细菌以诱导较少的细胞死亡，例如通过缺失或破坏编码pagp(脂质a棕榈酰转移酶)的核酸，这降低了所述细菌的毒力。
36.可以修饰本文提供的免疫刺激性细菌的基因组以增加或促进免疫细胞的感染，特别是肿瘤微环境中的免疫细胞，例如吞噬细胞。这包括减少非免疫细胞例如上皮细胞的感染，或增加免疫细胞的感染。还可以对细菌进行修饰以减少免疫细胞中的细胞焦亡。对细菌基因组的众多修饰可以实现增加免疫细胞的感染和减少细胞焦亡之一或这二者。本文提供的免疫刺激性细菌包括这种修饰，例如参与spi
‑
1t3ss途径的基因的缺失和/或破坏，例如hila的破坏或缺失，和/或破坏/缺失编码鞭毛蛋白、杆状蛋白(prgj)、针状蛋白(prgi)和qsec的基因。
37.在质粒上编码以在真核生物宿主例如人宿主中表达的治疗性产物在真核调节序列的控制下，包括真核启动子，例如由rna聚合酶ii或iii识别的启动子。这些启动子包括病毒和哺乳动物rna聚合酶ii启动子。
38.示例的病毒启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、eb病毒(ebv)启动子、疱疹病毒启动子、呼吸道合胞病毒(rsv)启动子和腺病毒启动子。其它rna聚合酶ii启动子包括但不限于延伸因子
‑
1(ef
‑
1)α启动子、或ubc启动子(慢病毒)、或pgk(3
‑
磷酸甘油酸激酶)启动子、合成mnd启动子、和合成启动子如cagg(或cag)启动子。合成的cag启动子包含巨细胞病毒(cmv)早期增强子元件(c)；鸡β
‑
肌动蛋白基因的启动子，第一个外显子和第一个内含子(a)；和兔β
‑
珠蛋白基因的剪接受体(g)。mnd是一种合成启动子，包含修饰的momulv ltr的u3区，其具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子(鼠白血病病毒衍生的mnd启
动子(骨髓增殖性肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失，d1587rev引物结合位点被取代；见例如li et al.(2010)1neurosci.methods 189:56
‑
64)。可以使用其它强可调节启动子或组成型启动子。启动子的示例是ef
‑
lalpha启动子、cmv、sv40、pgk、eif4a1、cag和cd68启动子。调节序列还包括终止子、增强子、分泌信号和其它转运信号。
39.包含在免疫刺激性细菌中的质粒可以低拷贝数或中等拷贝数存在，例如通过选择获得中等至低拷贝数的复制起点，例如低拷贝数复制起点。本文表明，当质粒以低至中等拷贝数存在时，细菌的抗肿瘤活性和其它特性得到改善，其中中等拷贝数是小于150或小于约150及大于20或约20或在20或25与150之间，以及低拷贝数是小于25或小于20或小于约25或小于约20个拷贝。
40.本文提供的免疫刺激性细菌包括美国专利申请no.16/033,187中描述的任何菌株和细菌，对其进一步修饰以在肿瘤微环境中或在肿瘤驻留免疫细胞中表达免疫刺激性蛋白和/或优先感染其中免疫细胞和/或对其中的免疫细胞的毒性较小，如本文所述和示例。
41.编码的治疗性蛋白/产物
42.所述免疫刺激性细菌在细菌中在真核启动子控制下的质粒上编码治疗性蛋白质或产物，当其在哺乳动物对象中表达时赋予或有助于在肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫性。
43.由免疫刺激性细菌编码的产物包括作为导致i型干扰素(ifn)表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分的蛋白质及其变体。这些包括活性增加的变体蛋白和导致i型干扰素组成型表达的变体蛋白。这些还包括天然或通过突变而在导致不希望的免疫应答的途径中具有降低的信号传导活性、但具有与天然人蛋白质相当或更高的i型干扰素刺激活性和/或干扰素
‑
β刺激活性的蛋白质。特别是，所述免疫刺激性细菌编码免疫刺激性蛋白的功能获得性(gof)变体，其在未修饰的形式下是导致i型干扰素(ifn)表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分。示例是免疫刺激性蛋白的功能获得性、组成型活性变体，其在人体中促进或引起干扰素疾病，其中对免疫刺激性细菌的基因组进行修饰以使所述细菌优先感染肿瘤驻留免疫细胞，和/或对免疫刺激性细菌的基因组进行修饰，使其在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡(减少细胞焦亡)，从而所述免疫刺激性细菌在肿瘤或肿瘤微环境或肿瘤驻留免疫细胞中累积，以将组成型活性免疫刺激性蛋白递送至细胞以刺激或诱导i型干扰素的表达。所述变体可包括消除免疫刺激性蛋白中磷酸化位点的突变，从而减少激活的b细胞的核因子κ
‑
轻链
‑
增强子(nf
‑
κb)信号传导。这些包括，例如sting、rig
‑
i、mda
‑
5、irf
‑
3、irf
‑
5、irf
‑
7、trim56、rip1、sec5、traf3、traf2、traf6、stat1、lgp2、ddx3、dhx9、ddx1、ddx9、ddx21、dhx15、dhx33、dhx36、ddx60和snrnp200，及其变体，例如在干扰素疾病中表达的那些变体及其具有组成型活性或活性增加的保守型变体。在一些实施方案中，这些包括诱导i型ifn的蛋白质，例如sting、rig
‑
i、irf
‑
3、irf
‑
7或mda5，及其具有增加的活性或组成型活性的变体，其中免疫刺激性蛋白是sting、rig
‑
i、irf
‑
3、irf
‑
7或mda5。
44.因此，本文提供了包含质粒的免疫刺激性细菌，所述质粒含有编码免疫刺激性蛋白的功能获得性变体的异源核酸，其在未修饰的形式下是导致i型干扰素(ifn)表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分。这些功能获得性蛋白在真核调节信号，包括启动子和任选其它调节信号例如增强子、polya和转录终止子控制下的质粒上编码。在质粒上编码蛋白质/产物的核酸可以是多用的，从而编码多种产物。多基因共表达的策略包括使用在单个载体中的多个启动子、融合蛋白、基因之间的蛋白酶解位点、内部核糖体进入位点(ires)和“自
切割”(核糖体跳跃)2a肽。2a肽是长度为18
‑
22个氨基酸(aa)的病毒寡肽，在真核细胞中翻译期间介导多肽的“切割”。因此，通过在编码部分之间包含2a自切割肽如t2a、p2a、f2a和e2a，提供了在单个启动子控制下在质粒上编码治疗性产物的质粒。
45.未修饰形式的免疫刺激性蛋白是信号传导途径中的蛋白质，其感测胞质dna/rna。其包括用增加活性和/或使活性是组成型的氨基酸取代或缺失而修饰的那些蛋白质。提供了免疫刺激性细菌，其包含编码免疫刺激性蛋白的功能获得性、组成型活性变体的质粒。这些功能获得性蛋白质，包括信号传导途径中导致i型干扰素表达的蛋白质，包括在人体中促进或引起干扰素疾病的蛋白质，以及经修饰的功能获得性突变体，被选择以获得i型干扰素的组成型表达。未修饰形式的免疫刺激性蛋白是作为信号传导途径的一部分感测胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸或直接或间接与胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸相互作用以诱导i型干扰素表达的蛋白质，且所述变体蛋白在缺少感测胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸(cdn)或与胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸(cdn)相互作用的情况下诱导i型干扰素的表达。包括不需要胞质核酸、核苷酸、二核苷酸或环状二核苷酸以导致i型干扰素表达的功能获得性变体。这种蛋白质的示例是sting、rig
‑
i、mda
‑
5、irf
‑
3、irf
‑
5、irf
‑
7、trim56、rip1、sec5、traf3、traf2、traf6、stat1、lgp2、ddx3、dhx9、ddx1、ddx9、ddx21、dhx15、dhx33、dhx36、ddx60和snrnp200。
46.在这些免疫刺激性细菌中，编码的功能获得性蛋白变体可以是消除免疫刺激性蛋白中磷酸化位点从而减少激活的b细胞的核因子κ
‑
轻链增强子(nf
‑
κb)信号传导的功能获得性蛋白蛋白变体。或者，所述细菌可以在磷酸化位点包含一个或多个用天冬氨酸(d)取代丝氨酸(s)或苏氨酸(t)的取代，其中天冬氨酸(d)是拟磷酸化的，且获得增加的或组成型的活性。在信号传导途径中导致i型干扰素表达的蛋白质的示例是sting、rig
‑
i、irf
‑
3、irf
‑
7和mda5。本文描述了导致每种这些蛋白质的功能获得性活性的示例突变。突变包括其中编码的免疫刺激性蛋白是变体sting、rig
‑
i、irf
‑
3、irf
‑
7或mda5的那些突变，其中由于病毒感染的结果而被磷酸化的一个或多个丝氨酸(s)或苏氨酸残基被天冬氨酸(d)取代，由此所得变体是组成型诱导i型干扰素的磷酸化模拟物。例如，提供了免疫刺激性细菌，其中免疫刺激性蛋白是irf
‑
3，其在第385、386、396、398、402、404和405位的残基具有一个或多个取代，且这些残基被天冬氨酸残基取代；这包括参照seq id no:312具有s396d取代的irf
‑
3，以及参照seq id no:312包含s396d/5398d/s402d/t404d/s405d突变的irf
‑
3。其它实例是免疫刺激性细菌，其中免疫刺激性蛋白选自sting、mda5、irf
‑
7和rig
‑
i，其中突变选择如下：a)在sting中，参照seq id no:305
‑
309所示人sting，选自以下的一个或多个：s102p，v147l，v147m，n154s，v155m，g166e，c206y，g207e，s102p/f279l，f279l，r281q，r284g，r284s，r284m，r284k，r284t，r197a，d205a，r310a，r293a，t294a，e296a，r197a/d205a，s272a/q273a，r310a/e316a，e316a，e316n，e316q，s272a，r375a，r293a/t294a/e296a，d231a，r232a，k236a，q273a，s358a/e360a/s366a，d231a/r232a/k236a/r238a，s358a，e360a，s366a，r238a和s324a/s326a；b)在mda5中，参照seq id no:310，以下的一个或多个：t331i，t331r，a489t，r822q，g821s，a946t，r337g，d393v，g495r，r720q，r779h，r779c，l372f和a452t；c)在rig
‑
i中，参照seq id no:311，e373a和c268f的一个或两者；以及d)在irf
‑
7中，参照seq id no:313，以下的一个或多个：s477d/s479d，s475d/s477d/s479d，s475d/s476d/s477d/s479d/s483d/s487d和δ247
‑
467。根据下文的示例性保守型氨基酸取代表，
任何这些取代均可以用保守型突变取代。
47.还提供了递送载具，例如外泌体、脂质体、溶瘤病毒、纳米颗粒、免疫刺激性细菌和其它这种载体，其包含编码功能获得性蛋白和其它治疗性产物的核酸，如上文和本文其它地方所述。例如，提供了包含核酸的递送载具，通常是编码功能获得性免疫刺激性蛋白的dna，其是导致i型干扰素表达的信号传导途径的一部分。功能获得性变体可以使i型干扰素组成型表达。例如，这些变体包括本文讨论的任何变体，例如修饰的sting，其中：sting中的修饰使其活性是组成性的，由此其活性不需要cgamp(或其它配体/cdn)；修饰的sting由修饰的tmem173基因编码；所述修饰包括氨基酸的插入、缺失或取代；与未修饰的sting相比，修饰的sting具有增强的免疫刺激活性。sting中的这些氨基酸取代，参照seq id no:305
‑
309所示人sting，包括选自以下的一个或多个：s102p，v147l，v147m，n154s，v155m，g166e，c206y，g207e，s102p/f279l，f279l，r281q，r284g，r284s，r284m，r284k，r284t，r197a，d205a，r310a，r293a，t294a，e296a，r197a/d205a，s272a/q273a，r310a/e316a，e316a，e316n，e316q，s272a，r293a/t294a/e296a，d231a，r232a，k236a，q273a，s358a/e360a/s366a，d231a/r232a/k236a/r238a，s358a，e360a，s366a，r238a，r375a和s324a/s326a。
48.本文提供的免疫刺激性细菌还可以包含编码免疫刺激性蛋白的核苷酸序列，当其在哺乳动物对象中表达时赋予或有助于在肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫性；所述免疫刺激性蛋白在在细菌中在真核启动子的控制下的质粒上编码。示例的启动子包括但不限于延伸因子
‑
1(ef1)α启动子、或ubc启动子、或pgk启动子、或cagg或cag启动子。
49.所述免疫刺激性细菌还可以编码抑制性rna(rnai)，当其在哺乳动物对象中表达时赋予或有助于抗肿瘤免疫性。所述rnai在细菌中在真核启动子的控制下的质粒上编码。对免疫刺激性细菌的基因组进行修饰，使其在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡和/或使其在肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境/肿瘤中累积。
50.本文提供的免疫刺激性细菌还可以编码其它免疫刺激性蛋白。免疫刺激性蛋白可以是细胞因子，例如趋化因子。示例的免疫刺激性蛋白是il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12p70(il
‑
12p40 il
‑
12p35)、il
‑
15、il
‑
15/il
‑
15rα链复合物、il
‑
36γ、il
‑
18、cxcl9、cxcl10、cxcl11、ccl3、ccl4、ccl5、参与或影响或加强t细胞募集/持续性的蛋白质、cd40、cd40配体(cd40l)、ox40、ox40配体(ox40l)、4
‑
1bb、4
‑
1bb配体(4
‑
1bbl)，b7
‑
cd28家族成员，以及肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员。在一些实施方案中，这些包括例如il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12p70(il
‑
12p40 il
‑
12p35)、il
‑
15、il
‑
23、il
‑
36γ、已经减弱结合il
‑
2ra的il
‑
2、il
‑
15/il
‑
15rα链复合物、il
‑
18、被修饰以不结合il
‑
2ra的il
‑
2、cxcl9、cxcl10、cxcl11、干扰素
‑
α、干扰素
‑
β、ccl3、ccl4、ccl5、参与或影响或加强t细胞募集/持续性的蛋白质、cd40、cd40配体、ox40、ox40配体、4
‑
1bb、4
‑
1bb配体、b7
‑
cd28家族成员、tgf
‑
β多肽拮抗剂，以及肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员。
51.所述免疫刺激性细菌可任选包括编码抑制、阻抑或破坏免疫检查点表达的抑制性rna(rnai)的核苷酸序列。rnai可以在细菌中在质粒上编码。编码免疫刺激性蛋白的核苷酸和任选rnai可以低至中等拷贝数存在于质粒上。
52.所述免疫刺激性细菌还可以编码治疗性产物，例如抑制、阻抑或破坏免疫检查点或其它靶点的表达的rnai或crispr盒，所述其它靶点的抑制、阻抑或破坏增加在对象中的抗肿瘤免疫应答；所述rnai或crispr盒在细菌中在质粒上编码。其它治疗性产物包括例如
结合免疫检查点以抑制其活性的抗体，例如抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1和抗ctla
‑
4抗体。
53.rnai包括所有形式的双链rna，可用于沉默靶向的核酸的表达。rnai包括shrna、sirna和microrna(mirna)。在本文公开和描述的实施方案中，任何这些形式均可以互换。通常，rnai在细菌中在质粒上编码。质粒可以包括其它异源核酸，其编码调节或增加细菌活性或产物的感兴趣产物，或可调节待用细菌治疗的对象的免疫系统的其它这种产物。也可以加入、缺失或破坏细菌基因。这些基因可以编码用于细菌生长和复制的产物，或者可编码也调节宿主对细菌的免疫应答的产物。
54.细菌物种包括但不限于例如沙门氏菌(salmonella)、志贺氏杆菌(shigella)、李斯特菌(listeria)、大肠杆菌(e.coli)和双歧杆菌(bifidobacteriae)的菌株。例如，细菌物种包括宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)、痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae)、产单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、鸡伤寒沙门氏菌(salmonella gallinarum)和肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)。
55.物种包括例如沙门氏菌(salmonella)、志贺氏杆菌(shigella)、大肠杆菌(e.coli)、双歧杆菌(bifidobacteriae)、立克次体(rickettsia)、弧菌(vibrio)、李斯特菌(listeria)、克雷伯氏菌(klebsiella)、博德特氏菌(bordetella)、奈瑟氏菌(neisseria)、气单胞菌(aeromonas)、弗朗西斯氏菌(francisella)、霍乱菌(cholera)、棒状杆菌(corynebacterium)、柠檬酸杆菌(citrobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜血杆菌(haemophilus)、布鲁氏菌(brucella)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、军团杆菌(legionella)、红球菌(rhodococcus)、假单胞菌(pseudomonas)、螺杆菌(helicobacter)、芽孢杆菌(bacillus)和丹毒丝菌(erysipelothrix)的菌株，或任一前述所列细菌菌株的其减毒菌株或其修饰菌株。
56.其它合适的细菌物种包括立克次氏体(rickettsia)、克雷伯氏菌(klebsiella)、博德特氏菌(bordetella)、奈瑟氏菌(neisseria)、气单胞菌(aeromonas)、弗朗西斯氏菌(francisella)、棒状杆菌(corynebacterium)、柠檬酸杆菌(citrobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜血杆菌(haemophilus)、布鲁氏菌(brucella)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、军团杆菌(legionella)、红球菌(rhodococcus)、假单胞菌(pseudomonas)、螺杆菌(helicobacter)、弧菌(vibrio)、芽孢杆菌(bacillus)和丹毒丝菌(erysipelothrix)。例如，rickettsia rickettsiae、普氏立克次体(rickettsia prowazekii)、rickettsia tsutsugamuchi、莫氏立克次体(rickettsia mooseri)、西伯利亚立克次体(rickettsia sibirica)、支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)、脑膜炎双球菌(neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)、嗜矿泉气单胞菌(aeromonas eucrenophila)、鲑产气单胞菌(aeromonas salmonicida)、土轮病菌(francisella tularensis)、假结核棒状杆菌(corynebacterium pseudotuberculosis)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(haemophilus somnus)、流产布鲁氏菌(brucella abortus)、胞内分枝杆菌(mycobacterium intracellulare)、嗜肺军团杆菌(legionella pneumophila)、马红球菌(rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、伶鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、枯草芽孢杆菌
(bacillus subtilis)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、五日热罗卡利马氏体菌(rochalimaea quintana)，或根癌土壤杆菌(agrobacterium tumerfacium)。
57.本文以沙门氏菌(salmonella)为例，且特别是鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)菌株，例如命名为ys1646(atcc#202165)或vnp20009的菌株，以及保藏为atcc#14028的野生型菌株，或具有atcc#14028的所有鉴定特征的菌株。其它菌株包括例如re88、sl7207、χ8429、χ8431和χ8468。本文提供的示例的沙门氏菌菌株是免疫刺激性细菌菌株ast
‑
104、ast
‑
105、ast
‑
106、ast
‑
108、ast
‑
20、ast
‑
112、ast
‑
113、ast
‑
115、ast
‑
1 17、ast
‑
118、ast
‑
119、ast
‑
120、ast
‑
121、ast
‑
122和ast
‑
123。这些菌株可以进一步修饰以编码免疫刺激性蛋白，其是导致i型干扰素或其它免疫调节蛋白表达的信号传导途径中蛋白质的功能获得性变体。所述免疫刺激性细菌还可以编码免疫刺激性蛋白，其增加肿瘤微环境中的免疫应答，如细胞因子。还可以修饰免疫刺激性细菌以使其优先感染肿瘤微环境中的免疫细胞或感染肿瘤驻留免疫细胞，和/或在这种免疫细胞中诱导较少的细胞死亡，如本文所述。其序列和描述在本文的发明详述、实施例和序列表中提供。所述免疫刺激性细菌可以源自减毒的细菌菌株，或者通过本文所述的修饰例如缺失asd而减毒，从而限制在体内复制。
58.应当理解，在本文中修饰的和引用细菌基因的情况下，是根据其在沙门氏菌属物种中的名称(名字)而引用的，沙门氏菌属物种是从中可以产生免疫刺激性细菌的示例细菌。本领域技术人员认识到其它物种具有相应的蛋白质，但其名称或名字可以与沙门氏菌属中的名称不同。然而，本文的一般公开内容可应用于其它细菌物种。例如，如本文所示，缺失或失活沙门氏菌中鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和/或pagp导致肿瘤定植增加。类似的鞭毛基因或类似的感染功能可以在其它细菌物种中进行修饰，以实现增加的肿瘤定植。类似地，细菌产物例如本文所述pagp和/或msbb的产物的失活/缺失，可以降低补体激活和/或其它炎症反应，从而增加对肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境的靶向。可以缺失其它物种中参与激活补体途径或其它炎症途径的相应基因，如本文中针对沙门氏菌所示例的。
59.本文提供的免疫刺激性细菌编码多种基因的抑制剂，有助于降低抗肿瘤免疫应答和/或表达基因和/或基因产物和/或刺激免疫系统的产物，从而是免疫刺激性的。
60.本文提供的免疫刺激性细菌具有使其是免疫刺激性的性质。腺苷营养缺陷也具有免疫刺激作用。其还可以在质粒上编码治疗性有效载荷，例如功能获得性/组成型活性sting突变体和其它免疫刺激性蛋白。这种组合的作用通过本文提供的腺苷营养缺陷型菌株增强，其提供在富含腺苷的免疫抑制性肿瘤微环境(tme)中的优先累积或募集。在这种tme中减少腺苷可进一步增强免疫刺激作用。任何已知的或者可以为了治疗性施用而工程化的细菌菌株中的这种特性组合，均提供类似的免疫刺激作用。
61.本文提供的工程化的免疫刺激性细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌免疫刺激性细菌，含有多种协同方式以诱导冷肿瘤的免疫重新激活，以促进肿瘤抗原特异性免疫应答，同时抑制肿瘤用来破坏和逃避持久的抗肿瘤免疫性的免疫检查点途径。实施方案中包括腺苷营养缺陷和增强的血管破坏。这种通过腺苷营养缺陷和增强的血管破坏对肿瘤靶向的改进提高了效力，同时使炎症局部化以限制全身细胞因子暴露和其它免疫疗法方式观察到的自身免疫毒性。
62.异源蛋白如免疫刺激性蛋白和功能获得性免疫刺激性蛋白以及rna在真核宿主细胞转录机制识别的启动子控制下在质粒上表达，如rna聚合酶ii(rnap ii)和rna聚合酶iii(rnap iii)启动子。rnap iii启动子通常在真核宿主中组成型表达；可以调节rnap ii启动子。在由细菌稳定表达的质粒上提供治疗性产物/免疫刺激性蛋白。这种细菌的示例是沙门氏菌菌株，通常是减毒菌株，通过传代或其它方法减毒，或通过本文所述的修饰如腺苷营养缺陷进行减毒。沙门氏菌菌株的示例是具有缺陷的asd基因的修饰的鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)菌株。这些细菌可以被修饰以包括在导入的质粒上携带功能性asd基因；这保持了对质粒的选择，因此不需要基于抗生素的质粒维持/选择系统。质粒上不含功能性asd基因的asd缺陷菌株在宿主中自溶。
63.启动子可以根据肿瘤细胞的环境进行选择，如在肿瘤微环境(tme)中表达的启动子、在缺氧条件下表达的启动子，或者在ph值小于7的条件下表达的启动子。
64.上文描述和列举的任何细菌中的质粒均编码治疗性产物。质粒可以多个拷贝或较少拷贝存在。这可以通过例如复制起点等元件的选择而控制。低、高和中等拷贝数质粒和复制起点为本领域技术人员熟知且可以被选择。在本文免疫刺激性细菌的实施方案中，质粒可以低至中等拷贝数存在，例如约150个或150个和更少拷贝，至低于约25个或约20或25个拷贝的低拷贝数。示例的复制起点是源自pbr322、p15a、psc101、pmb1、cole1、cole2、pps10、r6k、r1、rk2和puc的那些复制起点。
65.质粒编码治疗性多肽，例如诱导i型干扰素的多肽，例如在干扰素病中表达的那些多肽，和/或本文描述的和/或本领域技术人员已知用于癌症治疗的任何治疗性蛋白质。质粒还可以包括编码缺少信号序列的listeriolysin o(llo)蛋白(cytollo)、cpg基序、dna核靶向序列(dts)、和视黄酸可诱导的基因
‑
i(rig
‑
i)结合元件的核酸序列。包含核酸的免疫刺激性细菌可以包括被toll样受体9(tlr9)识别的cpg基序。cpg基序可以在质粒上编码。cpg基序可以包括在细菌基因中，或者是细菌基因的一部分，所述细菌基因在质粒上被编码。例如，包含cpg的基因可以是在质粒上编码的asd。本文提供的免疫刺激性细菌可以包括cpg基序、用于质粒维持的asd基因选择标记和dna核靶向序列中的一个或多个。
66.所述免疫刺激性细菌可以是鞭毛蛋白缺陷的，例如通过编码鞭毛的基因中的缺失或破坏。例如，提供了在编码鞭毛蛋白亚基flic和fljb之一或两者的基因中包含缺失的免疫刺激性细菌，由此所述细菌是鞭毛缺陷的，其中野生型细菌表达鞭毛。所述免疫刺激性细菌在编码核酸内切酶i(enda)的基因中也可以具有缺失或修饰，从而抑制或消除enda活性。
67.本文提供的免疫刺激性细菌可以是天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶
‑
(asd
‑
)，其允许在补充dap的培养基中生长，但当施用对象用于治疗时限制在体内复制。这样的细菌将是自限性的，其可有利于治疗。由于全部或部分的编码天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶的内源基因(asd)的破坏或缺失由此不表达内源asd，因此所述细菌可以是asd
‑
。在其它实施方案中，编码天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶的基因可以包括在质粒上用于体内表达。
68.本文提供的任何免疫刺激性细菌可以包括核酸，通常在质粒上，其包括cpg基序或cpg岛，其中cpg基序被toll样受体9(tlr9)识别。编码cpg基序或岛的核酸在原核生物中是丰富的，因此cpg基序可以包括在细菌基因中，或者是细菌基因的一部分，所述细菌基因在质粒上被编码。例如，细菌基因asd含有免疫刺激性cpg。
69.本文提供的免疫刺激性细菌对于腺苷呈营养缺陷型或者对于腺苷和腺嘌呤呈营
养缺陷型。可以使本文的任何细菌对于腺苷是营养缺陷型，这可以有利地增加抗肿瘤活性，因为腺苷在许多肿瘤中累积，且是免疫抑制性的。
70.本文提供的免疫刺激性细菌可以是鞭毛蛋白缺陷的，其中野生型细菌包含鞭毛。通过破坏或缺失全部或部分编码鞭毛的一个或多个基因，可以使其是鞭毛蛋白缺陷的。例如，提供了免疫刺激性细菌，其具有编码鞭毛蛋白亚基flic和fljb之一或两者的基因的缺失，由此所述细菌是鞭毛缺陷的。
71.本文提供的免疫刺激性细菌可以包括编码cytollo的核酸，所述cytollo是缺少周质分泌信号序列的listeriolysin o(llo)蛋白，由此其在细胞质中累积。这种突变有利地与asd
‑
细菌组合。llo是来自单核细胞增生李斯特菌的胆固醇依赖性成孔溶血素，其介导细菌的吞噬体逃逸。当将自溶菌株导入荷瘤宿主(如人)时，细菌被吞噬性免疫细胞摄取，并进入囊泡。在该环境中，dap的缺乏阻止细菌复制，并导致囊泡中细菌的自溶。然后裂解释放质粒，累积的llo在含胆固醇的囊泡膜中形成孔，并允许将质粒递送到宿主细胞的胞质中。在此，治疗性产物可以使用宿主细胞机制表达，并释放到肿瘤微环境中以实现抗肿瘤治疗。
72.免疫刺激性细菌可以包含在质粒上编码的dna核靶向序列(dts)，如sv40 dts。
73.所述免疫刺激性细菌可在编码核酸内切酶
‑
1(enda)的基因中具有缺失或修饰，由此抑制或消除enda活性。这些示例是含有cpg基序、用于质粒维持的asd基因选择标记和dna核靶向序列之中的一个或多个的免疫刺激性细菌。
74.所述免疫刺激性细菌可以包含在质粒上的核酸，其编码：抑制、阻抑或破坏免疫检查点表达的两种或更多种不同的rna分子，或编码代谢物的抑制剂(其为免疫抑制性的或处于免疫抑制途径中)的rna分子。
75.编码rnai例如shrna或mirna或sirna的核酸，可以在rna编码核酸之后包括转录终止子。在所有实施方案中，在免疫刺激性细菌中的质粒上编码的rnai可以是短发夹rna(shrna)或微小rna(mirna)。
76.任何免疫刺激性细菌中的质粒也可以编码是视黄酸可诱导的基因i(rig
‑
i)的激动剂或rig
‑
i结合元件的核苷酸序列。
77.所述免疫刺激性细菌可以包括基因中的一种或多种缺失，例如puri
‑
(purm
‑
)、msbb
‑
、purd
‑
、鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)、pagp
‑
、adra
‑
、csgd
‑
和hila
‑
中的一种或多种。所述免疫刺激性细菌可以是msbb
‑
。例如，所述免疫刺激性细菌可以包含puri缺失、msbb缺失、asd缺失和adra缺失以及任选地csgd缺失中的一种或多种。细菌基因缺失/修饰的示例是以下任何一项：
78.一种或多种选自以下的基因的突变，其改变脂多糖的生物合成：rfal、rfag、rfah、rfad、rfap、rfb、rfa、msbb、htrb、fira、pagl、pagp、lpxr、arnt、epta和lpxt中的一种或多种；和/或
79.一种或多种选自以下的突变，其引入自杀基因：sacb、nuk、hok、gef、kil和phla中的一种或多种；和/或
80.一种或多种选自以下的突变，其引入细菌裂解基因：hly和cly之一或二者；和/或
81.一种或多种毒力因子的突变，所述毒力因子选自isya、pag、prg、isca、virg、plc和act；和/或
82.一种或多种选自以下的基因的突变，其修饰应激应答：reca、htra、htpr、hsp和
groel；和/或
83.min的突变，其破坏细胞周期；和/或
84.一种或多种选自以下的基因的突变，其破坏或失活调节功能：cya、crp、phop/phoq和ompr。
85.所述免疫刺激性细菌可以是沙门氏菌(salmonella)、志贺氏杆菌(shigella)、大肠杆菌(e.coli)、双歧杆菌(bifidobacteriae)、立克次体(rickettsia)、弧菌(vibrio)、李斯特菌(listeria)、克雷伯氏菌(klebsiella)、博德特氏菌(bordetella)、奈瑟氏菌(neisseria)、气单胞菌(aeromonas)、弗朗西斯氏菌(francisella)、霍乱菌(cholera)、棒状杆菌(corynebacterium)、柠檬酸杆菌(citrobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜血杆菌(haemophilus)、布鲁氏菌(brucella)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、军团杆菌(legionella)、红球菌(rhodococcus)、假单胞菌(p seudomonas)、螺杆菌(helicobacter)、芽孢杆菌(bacillus)或丹毒丝菌(erysipelothrix)的菌株，或任一前述所列细菌菌株的其减毒菌株或其修饰菌株。
86.免疫刺激性细菌的示例是其中质粒包含编码缺少信号序列的listeriolysin o(llo)蛋白(cytollo)、cpg基序、dna核靶向序列(dts)、和视黄酸可诱导的基因
‑
i(rig
‑
i)结合元件的一个或多个核酸序列的那些。
87.在质粒含有在分开的启动子控制下的两种或多种治疗性产物的情况中，每种治疗性产物相隔至少约75个核苷酸，或至少75个核苷酸，最多约或至少100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个核苷酸(或碱基对)，最多约1600或1600个核苷酸(或碱基对)，或在75
‑
1500或1600个核苷酸(或碱基对)之间。
88.其它示例的免疫刺激性细菌包括对腺苷营养缺陷型的那些，且包括：编码鞭毛的基因中的缺失的一种或多种；enda中的缺失；编码cytollo的质粒；核定位序列；和asd质粒互补系统；及编码治疗性产物，包括免疫刺激性蛋白的功能获得性变体，其未修饰的形式是导致i型干扰素(ifn)表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分，例如本文任何描述的。
89.这种免疫刺激性细菌包括沙门氏菌菌株，例如野生型鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)菌株，例如以atcc保藏号no.14028保藏的菌株，或具有以atcc保藏号#14028保藏的菌株的所有鉴定的特征的菌株。其它菌株包括例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)菌株，选自命名为ast
‑
100、vnp20009的菌株或菌株ys1646(atcc#202165)、re88、sl7207、χ8429、χ8431和χ8468的菌株。
90.除了增加在肿瘤细胞中累积和/或减少细胞死亡的修饰之外，所述免疫刺激性细菌可包含以下的一种或多种：puri缺失、msbb缺失、asd缺失和adra缺失，且可编码如本文所述的免疫刺激性蛋白。所述免疫刺激性细菌还可以包括：
91.一种或多种选自以下的基因的突变，其改变脂多糖的生物合成：rfal、rfag、rfah、rfad、rfap、rfb、rfa、msbb、htrb、fira、pagl、pagp、lpxr、arnt、epta和lpxt中的一种或多种；和/或
92.一种或多种选自以下的突变，其引入自杀基因：sacb、nuk、hok、gef、kil和phla中的一种或多种；和/或
93.一种或多种选自以下的突变，其引入细菌裂解基因：hly和cly之一或二者；和/或
94.一种或多种毒力因子的突变，所述毒力因子选自isya、pag、prg、isca、virg、plc和act；和/或
95.一种或多种选自以下的基因的突变，其修饰应激应答：reca、htra、htpr、hsp和groel；和/或
96.min的突变，其破坏细胞周期；和/或
97.一种或多种选自以下的基因的突变，其破坏或失活调节功能：cya、crp、phop/phoq和ompr。
98.所述菌株可以是msbb
‑
、asd
‑
、hila
‑
和/或鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和/或pagp
‑
中的一种或多种。治疗性产物，例如免疫刺激性蛋白的功能获得性变体，其未修饰形式是导致i型干扰素(ifn)、rnai和免疫刺激性蛋白如趋化因子/细胞因子表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分，其在宿主识别的启动子控制下表达，如本文所述的rnap iii启动子或rnap ii启动子。所述免疫刺激性细菌可以是沙门氏菌、志贺氏杆菌、大肠杆菌、双歧杆菌、立克次氏菌、弧菌、李斯特菌、克雷伯氏菌、博德特氏菌、奈瑟菌、气单胞菌、弗朗西斯氏菌、霍乱、棒杆菌、柠檬酸杆菌、衣原体、嗜血杆菌、布鲁氏菌、分支杆菌、支原体、军团杆菌、红球菌、假单胞菌、螺杆菌、芽孢杆菌或丹毒丝菌属的菌株，或任一前述所列细菌菌株的其减毒菌株或其修饰菌株。通常，所述菌株是在宿主中减毒的菌株，其是减毒菌株或通过改变其性质(包括其可以感染的细胞及其在某些细胞或所有细胞中复制的能力)的修饰而减毒。沙门氏菌菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌，是所述细菌的示例。示例的菌株包括源自命名为ast
‑
100、vnp20009的菌株或菌株ys1646(atcc#202165)、re88、sl7207、χ8429、χ8431、χ8468和野生型菌株atcc#14028的鼠伤寒沙门氏菌菌株。
99.提供了含有免疫刺激性细菌的组合物。这种组合物含有细菌和药学上可接受的赋形剂或载体。免疫刺激性细菌包括本文中或本文中并入的专利/申请中描述的或本领域技术人员已知的任何细菌。这种细菌经过修饰以编码免疫刺激性蛋白的变体，其是导致i型干扰素表达的信号传导途径的一部分。蛋白质例如sting蛋白，经过修饰使其活性增加和/或导致i型干扰素例如干扰素
‑
α或干扰素
‑
β组成型表达。所述细菌还可以编码在肿瘤微环境或肿瘤中增加抗肿瘤活性的免疫刺激性蛋白，例如细胞因子。可以修饰细菌的基因组以增加免疫细胞的感染性，和/或降低非免疫细胞的感染性，和/或降低诱导免疫细胞细胞死亡的能力。因此，如本文所述修饰细菌以在肿瘤或肿瘤微环境或肿瘤驻留免疫细胞中累积，和/或递送促进抗肿瘤活性的免疫刺激性蛋白。所述免疫刺激性细菌可另外包含编码rnai例如mirna或shrna或crispr盒的质粒，其靶向免疫检查点，或以其它方式增强细菌的抗肿瘤活性。
100.对于治疗其中免疫刺激影响治疗的疾病或病症，单剂量是治疗有效的。这种刺激的示例是免疫应答，包括但不限于特异性免疫应答和非特异性免疫应答之一或二者、特异性和非特异性免疫应答、先天应答、初级免疫应答、适应性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。
101.提供了作为cgas激动剂的免疫刺激性细菌。这种细菌的示例是沙门氏菌属物种，例如鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)，其是cgas激动剂和干扰素基因刺激物(sting)激动剂之一或两者。例如，这些可用于产生或累积胞质dna的用途和方法中，例如放射疗法和化学疗法。sting在应答细胞质中的传感核酸中激活先天免疫。通过环状二核苷酸(cdn)的结
oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175中描述的方法，其中尤其描述了来自不同物种(包括人)的sting蛋白的干扰素
‑
β和nf
‑
κb信号传导活性，从而鉴别与人sting相比具有较低nf
‑
κb活性的来自不同物种的sting蛋白，以及与人sting相比也具有相当或更高的干扰素
‑
β活性的那些sting蛋白。de oliveira mann et al.(2019)提供了物种比对并确定了每个物种中sting的结构域，包括ctt结构域(也见the supplemental information for de oliveira mann et al.(2019))。
113.非人sting蛋白可以是但不限于来自以下物种的sting蛋白：袋獾(sarcophilus harrisii；seq id no:331)，狨猴(callithrix jacchus；seq id no:341)，牛(bos taurus；seq id no:342)，猫(fells catus；seq id no:338)，鸵鸟(struthio camelus australis；seq id no:343)，朱鹮(nipponia nippon；seq id no:344)，腔棘鱼(latimeria chalumnae；seq id no:345
‑
346)，野猪(sus scrofa；seq id no:347)，蝙蝠(rousettus aegyptiacus；seq id no:348)，海牛(trichechus manatus latirostris；seq id no:349)、鬼鲨(callorhinchus milii；seq id no:350)，小鼠(mus musculus；seq id no:351)和斑马鱼(danio rerio；seq id no:330)。这些脊椎动物sting蛋白很容易激活人细胞中的免疫信号传导，表明sting信号的分子机制在脊椎动物中是相同的(见de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。
114.提供了含有任何免疫刺激性细菌和其它递送载具的药物组合物。正如其用于治疗癌症的用途和治疗癌症的方法。方法和用途包括治疗患有癌症的对象，包括向对象如人施用所述免疫刺激性细菌或药物组合物。提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，包括施用所述免疫刺激性细菌。
115.方法或用途包括其中施用第二抗癌剂或治疗的组合疗法。第二抗癌剂是产生胞质dna的化学治疗剂，或放射疗法，或免疫检查点抑制剂如抗pd
‑
l、或抗pd
‑
ll或抗ctla4抗体，或car
‑
t细胞或其它治疗性细胞如干细胞、til细胞和用于癌症疗法的修饰的细胞。
116.施用可以通过任何合适的途径，如胃肠外途径，且可以包括可促进或增强递送的其它试剂。施用可以是口服的或直肠的，或通过气雾剂进入肺的，或瘤内、静脉内、肌内或皮下的。施用可以通过任何合适的途径，包括全身的或局部的或表面的，例如胃肠外的，包括例如口服的或直肠的，或通过气雾剂进入肺的，瘤内的，静脉内的，肌内，或皮下的。
117.癌症包括实体瘤和血液恶性病，例如但不限于淋巴瘤、白血病、胃癌、以及乳腺癌、心脏癌、肺癌、小肠癌、结肠癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、骨癌、骨髓癌、血液癌、胸腺癌、子宫癌、睾丸癌、子宫颈癌和肝癌。
118.所述免疫刺激性细菌可以配制为供施用的组合物，如悬浮剂。其可以被干燥并以粉末储存。还提供了所述免疫刺激性细菌与其它抗癌剂的组合。
119.提供了治疗癌症和恶性病的组合疗法。所述免疫刺激性细菌可以在其它癌症疗法之前、之后、间歇性或同时施用，其它疗法包括放射疗法、化学疗法，特别是产生胞质dna的基因毒性化学疗法，以及免疫疗法，例如检查点抑制剂抗体，包括抗pd
‑
1抗体、抗pd
‑
l1抗体和抗ctla
‑
4抗体以及其它这种免疫疗法。
120.还提供了分离的细胞，其含有免疫刺激性细菌或含有任何其它递送载具，例如外泌体、脂质体和其它这种载体，其含有编码如本文所述的功能获得性变体蛋白和其它治疗性产物的核酸。细胞包括但不限于免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞、原代细胞系和细胞疗法中
使用的其它细胞。示例的细胞包括例如造血细胞，如t细胞和造血干细胞。造血细胞可以是嵌合的抗原骨髓细胞，例如巨噬细胞。可将递送载具和免疫刺激性细菌离体导入细胞中。因此，例如，提供了含有免疫刺激性细菌的分离细胞，其中：修饰免疫刺激性细菌以使其优先感染肿瘤驻留免疫细胞，和/或修饰免疫刺激性细菌的基因组以使其在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡；且所述细胞是免疫细胞、干细胞、来自原代细胞系的细胞或肿瘤细胞。所述细胞用于细胞疗法的方法中，例如用于治疗癌症。所述细胞对于治疗对象可以是同种异体的或自体的。
121.还提供了通过免疫刺激性细菌增加肿瘤/肿瘤微环境定植的方法。所述方法包括例如修饰细菌的基因组以提供细菌鞭毛蛋白
‑
(flic
‑
/fljb
‑
)和/或pagp
‑
。
122.所使用的术语和表达用作描述而无限制之意，使用这些术语和表达并非意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等价物，但是应认识到，可以考虑各种修改。
123.附图简述
124.图1示出野生型人和袋獾sting蛋白的比对。
125.图2示出野生型人和狨猴sting蛋白的比对。
126.图3示出野生型人和牛sting蛋白的比对。
127.图4示出野生型人和猫sting蛋白的比对。
128.图5示出野生型人和鸵鸟sting蛋白的比对。
129.图6示出野生型人和朱鹮sting蛋白的比对。
130.图7示出野生型人和腔棘鱼(seq id no:345)sting蛋白的比对。
131.图8示出野生型人和斑马鱼sting蛋白的比对。
132.图9示出野生型人和野猪sting蛋白的比对。
133.图10示出野生型人和蝙蝠sting蛋白的比对。
134.图11示出野生型人和海牛sting蛋白的比对。
135.图12示出野生型人和鬼鲨sting蛋白的比对。
136.图13示出野生型人和小鼠sting蛋白的比对。
137.发明详述
138.大纲
139.a.定义
140.b.免疫刺激性细菌概述
141.c.癌症免疫疗法
142.1.免疫疗法
143.2.过继免疫疗法
144.3.癌症疫苗和溶瘤病毒
145.d.癌症细菌性免疫疗法
146.1.细菌疗法
147.2.细菌和病毒免疫应答的比较
148.3.沙门氏菌属疗法
149.a.嗜肿瘤细菌。
150.b.肠道沙门氏菌血清变种鼠伤寒(salmonella enterica serovar typhimurium)
151.c.细菌减毒
152.i.msbb
‑
突变体
153.ii.puri
‑
突变体
154.iii.减毒突变的组合
155.iv.vnp20009和其它减毒的鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)菌株
156.v.工程化以递送大分子的鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)
157.4.增强免疫刺激性细菌以提高治疗指数和在肿瘤驻留免疫细胞中的表达
158.a.asd基因缺失
159.b.腺苷营养缺陷型
160.c.鞭毛蛋白缺陷菌株
161.d.lps生物合成途径中的基因缺失
162.e.生物膜形成所需的基因的缺失
163.f.工程化以逃避含沙门氏菌的囊泡(scv)的沙门氏菌
164.g.缺失spi
‑
1和spi
‑
2基因和/或其它基因以消除细菌感染上皮细胞的能力，包括鞭毛的缺失
165.i.沙门氏菌致病岛1(spi
‑
1)
166.spi
‑1‑
依赖性宿主细胞侵入
167.spi
‑1‑
非依赖性宿主细胞侵入
168.ii.沙门氏菌致病岛2(spi
‑
2)
169.h.增加质粒递送的核酸内切酶(enda)突变
170.i.rig
‑
i结合序列
171.j.dnase ii抑制
172.k.rnase h2抑制
173.l.stabilin
‑
l/clever
‑
1抑制
174.m.cpg基序和cpg岛
175.5.提高免疫细胞摄取革兰氏阴性菌如沙门氏菌及降低免疫细胞死亡的修饰
176.a.免疫细胞摄取细菌
177.b.巨噬细胞细胞焦亡
178.i.鞭毛蛋白
179.ii.spi
‑
1蛋白
180.杆状蛋白(prgj)
181.针状蛋白(prgi)
182.iii.qsec
183.6.细菌培养条件
184.7.增加的肿瘤定植
185.e.在肿瘤微环境中刺激免疫应答的非人sting蛋白和蛋白中的功能获得性突变
186.1.i型干扰素和途径
187.2.i型干扰素疾病和功能获得性突变体
188.3.sting介导的免疫激活
189.4.tmem173等位基因
190.5.组成型sting表达和功能获得性突变
191.6.具有增加的活性或组成型活性的非人sting蛋白及其变体，及具有增加的活性或组成型活性的sting嵌合体及其变体
192.7.发挥胞质dna/rna传感器功能的其它基因产物及组成型变体
193.a.视黄酸可诱导的基因i(rig
‑
i)样受体(rlr)
194.b.mda5/ifih1
195.c.rig
‑
i
196.d.irf
‑
3和irf
‑7197.8.其它i型ifn调节蛋白
198.9.其它治疗性产物
199.f.编码蛋白质的免疫刺激性细菌以及示例质粒和递送载具的构建
200.1.复制起点和质粒拷贝数
201.2.质粒维持/选择组分
202.3.rna聚合酶启动子
203.4.dna核靶向序列
204.5.crispr
205.g.编码组成型诱导i型干扰素的非人sting蛋白和功能获得性修饰的蛋白质和其它治疗性产物的其它递送载具
206.1.外泌体、胞外囊泡及其它囊泡递送载具
207.2.溶瘤病毒
208.a.腺病毒
209.b.单纯疱疹病毒
210.c.痘病毒
211.d.麻疹病毒
212.e.呼肠孤病毒
213.f.水疱性口炎病毒(vsv)
214.g.新城疫病毒
215.h.细小病毒
216.i.柯萨奇病毒
217.j.塞内卡河谷病毒
218.h.药物生产、组合物和制剂
219.1.制备
220.a.细胞库制备
221.b.原料药(drug substance)制备
222.c.药物产品制备
223.2.组合物
224.3.制剂
225.a.流体、注射剂、乳剂
226.b.干燥的热稳定制剂
227.4.用于其它施用途径的组合物
228.5.剂量和施用
229.6.包装和制备产品
230.i.治疗方法和用途
231.1.肿瘤
232.2.施用
233.3.监测
234.j.实施例
235.a.定义
236.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非另有说明，否则本文整个公开内容中所指的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、genbank序列、数据库、网站和其它公开的材料均通过引用整体并入。在本文的术语有多种定义的情况下，以本节中的定义为准。在提到url或其它这样的标识符或地址的地方，应当理解，这样的标识符可改变并且互联网上的特定信息可以发生变化，但是可以通过检索互联网来找到等价信息。对其的引用证实了这种信息的可得性和公开传播。
237.如本文所用，治疗性细菌是当施用于对象如人时实现治疗如癌症或抗肿瘤疗法的细菌。
238.如本文所用，免疫刺激性细菌是治疗性细菌，当被导入对象中时，其会累积在免疫豁免组织和细胞中，例如肿瘤中，并复制和/或表达免疫刺激的产物或导致免疫刺激的产物。例如，由于免疫刺激性细菌不能复制和/或表达产物(或具有降低的复制/产物表达)(除了主要在免疫豁免环境中之外)，所以由于降低的毒性或致病性和/或由于所编码的降低的毒性或致病性的产物，免疫刺激性细菌在宿主中被减毒。本文提供的免疫刺激性细菌被修饰以编码一种或多种产物或表现出使其具有免疫刺激性的性状或性质。这种产物、性质和性状包括但不限于例如以下中的至少一种：免疫刺激性蛋白，例如细胞因子或共刺激分子；dna/rna传感器或其功能获得性变体(例如sting、mda5、rig
‑
i)；rnai，如sirna(shrna和microrna)，crispr，其靶向、破坏或抑制免疫检查点基因如trex1和/或pd
‑
l1；或免疫检查点的抑制剂，如抗免疫检查点抗体。免疫刺激性细菌还可以包括修饰，所述修饰使细菌对于有免疫抑制性或在免疫抑制途径中的代谢物如腺苷呈营养缺陷型。
239.如本文所用，菌株名称vnp20009(见例如国际pct申请公开号wo 99/13053，也参见美国专利号6,863,894)和ys1646和41.2.9可互换使用，且各自是指保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)保藏号no.202165的菌株。vnp20009是鼠伤寒沙门氏菌的改良减毒菌株，其包含msbb和puri缺失，由野生型菌株atcc 14028产生。
240.如本文所用，可互换地使用菌株名称ys1456和8.7，各自是指保藏于美国典型培养物保藏中心及指定保藏号为no.202164的菌株(参见美国专利号6,863,894)。
241.如本文所用，干扰素病是指由于参与调节或诱导干扰素表达的途径的基因产物中的突变而与干扰素上调相关的病症。所述产物的活性通常由介导物调节，如胞质dna或rna或核苷酸；当发生突变时，所述活性是组成型的。i型干扰素疾病包括一组列病症，包括重度
形式的aicardi
‑
goutieres综合征(ags)和较轻的家族性冻疮红斑狼疮(familial chilblain lupus，fcl)。可以在体外产生编码具有这些性质的突变产物的核酸分子，例如通过选择这样的突变，其产生与具有正常活性的等位基因产物相比具有功能获得性的产物，或与本文所述的疾病相关的功能获得性突变体相比具有进一步功能获得性产物。
242.如本文所用，功能获得性突变是与没有所述突变的相同蛋白质相比增加蛋白质活性的突变。例如，如果蛋白质是受体，其对于配体的亲和性则增加；如果其是酶，其将具有增加的活性，包括组成型活性。
243.如本文所用，复制起点是在染色体、质粒或病毒上在此处开始复制的dna序列。对于小dna，包括细菌质粒和小病毒，单个起点即就足够。
244.复制起点决定了载体拷贝数，这取决于所选的复制起点。例如，如果表达载体源自低拷贝数质粒pbr322，则其在约25
‑
50个拷贝/细胞之间，且如果源自高拷贝数质粒puc，则其可以是150
‑
200个拷贝/细胞。
245.如本文所用，细胞中质粒的中等拷贝数为约150或小于150，低拷贝数为15至30，例如20或小于20。低至中等拷贝数小于150。高拷贝数量大于150个拷贝/细胞。
246.如本文所用，2a肽是长度为18
‑
22个氨基酸(aa)的病毒寡肽，其在真核细胞翻译期间介导多肽的切割。名称“2a”是指病毒基因组的特定区域，不同的病毒2a通常以其来源的病毒命名。其中示例的是f2a(口蹄疫病毒2a)、e2a(马鼻炎a病毒)、p2a(猪捷申病毒(porcine teschovirus)
‑
1 2a)和t2a(明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)病毒2a)(见例如liu et al.(2017)scientific reports 7:2193，图1，编码序列；另见seq id no:367
‑
370)。
247.如本文所用，cpg基序是包括由在中央cpg侧翼(在其3
′
和5
′
侧上)的至少一个碱基包围的未甲基化的中央cpg(“p”是指连续的c和g核苷酸之间的磷酸二酯键)的碱基模式。cpg寡聚脱氧核苷酸是长度至少约10个核苷酸，及包括未甲基化的cpg的寡聚脱氧核苷酸。5
′
cg 3
′
中至少c是未甲基化的。
248.如本文所用，rig
‑
i结合序列是指直接的5
′
三磷酸(5
′
ppp)结构，或者从聚(da
‑
dt)序列由rna pol iii合成的5
′
三磷酸(5
′
ppp)结构，这是通过与rig
‑
i的相互作用可以通过rig
‑
i途径激活i型ifn。rna包括至少4个a核糖核苷酸(a
‑
a
‑
a
‑
a)；其可以包含4、5、6、7、8、9、10或更多个。将rig
‑
i结合序列导入细菌的质粒中以转录成polya。
249.如本文所用，“细胞因子”是在细胞信号传导中重要的小蛋白质(～5
‑
20kda)的宽松类别。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子是细胞信号传导分子，其有助于免疫应答中的细胞通信，并刺激细胞向炎症、感染和创伤部位移动。
250.如本文所用，“趋化因子”是指化学引诱(趋化性)细胞因子，其与趋化因子受体结合，包括从天然来源分离的蛋白质以及如通过重组方式或化学合成而合成制备的那些蛋白质。示例的趋化因子包括但不限于il
‑
8、il
‑
10、gcp
‑
2、gro
‑
α、gro
‑
β、grp
‑
γ、ena
‑
78、pbp、ctap iii、nap
‑
2、lapf
‑
4、mig(cxcl9)、cxcl10、cxcl11、pf4、ip
‑
10、sdf
‑
1α、sdf
‑
1β、sdf
‑
2、mcp
‑
1、mcp
‑
2、mcp
‑
3、mcp
‑
4、mcp
‑
5、mip
‑
1α(ccl3)、mip
‑
1β(ccl4)、mip
‑
1γ、mip
‑
2、mip
‑
2α、mip
‑
3α、mip
‑
3β、mip
‑
4、mip
‑
5、mdc、hcc
‑
1、alp、lungkine、tim
‑
1、嗜酸细胞激活趋化因子
‑
1、嗜酸细胞激活趋化因子
‑
2、i
‑
309、scya17、trac、rantes(ccl5)、dc
‑
ck
‑
1、淋巴细胞趋化
因子、lungkine和分形趋化因子(fractalkine)以及其它本领域技术人员已知的。趋化因子参与免疫细胞向炎症部位的迁移，以及免疫细胞的成熟和适应性免疫应答的产生。
251.如本文所用，“免疫刺激性蛋白”是在肿瘤微环境中呈现或促进抗肿瘤免疫应答的蛋白质。示例的这种蛋白质是细胞因子、趋化因子和共刺激分子，例如但不限于gm
‑
csf、il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18、il
‑
21、il
‑
23、il
‑
36γ、ifnα、ifnβ、il
‑
12p70(il
‑
12p40 il
‑
12p35)、il
‑
15/il
‑
15rα链复合物、cxcl9、cxcl10、cxcl11、ccl3、ccl4、ccl5、参与t细胞潜在募集/持续性的分子、cd40、cd40配体(cd40l)、ox40、ox40配体(ox40l)、4
‑
1bb、4
‑
1bb配体(4
‑
1bbl)、b7
‑
cd28家族成员及tnfr超家族成员。
252.如本文所用，胞质dna/rna传感器途径是由存在dna、rna、核苷酸、二核苷酸、环核苷酸和/或环状二核苷酸或其它核酸分子引发的途径，其导致i型干扰素的产生。胞质中的核酸分子来自病毒或细菌或放射或其它这种暴露，导致宿主免疫应答的激活。
253.如本文所用，诱导先天免疫答(如i型干扰素的诱导)的免疫刺激性蛋白是胞质dna/rna传感器途径的一部分的蛋白质，导致免疫应答介导物例如i型干扰素表达。例如，如本文所述和本领域技术人员已知的，胞质dna由cgas感测，导致cgamp产生和随后的sting(干扰素基因刺激物)/tbk1(tank结合激酶1)/irf3(干扰素调节因子)信号传导及i型干扰素产生。细菌环状二核苷酸(cdn，如细菌环状di
‑
amp)也激活sting。因此，sting是一种诱导i型干扰素的免疫刺激性蛋白。5'
‑
三磷酸rna和双链rna由rig
‑
i和单独的mda
‑
5或mda
‑
5/lgp2感测。这导致线粒体mavs(线粒体抗病毒信号蛋白)聚合，并还激活tbk1和irf3。这种途径中的蛋白质是导致先天免疫应答介导物如i型干扰素表达的免疫刺激性蛋白。可以修饰dna/rna传感器通路中的免疫刺激性蛋白，使其在没有胞质核酸的情况下具有增加的活性或组成型作用，从而导致免疫应答，例如i型干扰素的表达。
254.如本文所用，先天免疫蛋白sting的“羧基末端尾部”或“c末端尾部”(ctt)是指sting蛋白的c末端部分，其在野生型sting蛋白中通过灵活的接头区域连接于cgamp结合结构域域。ctt包括irf3结合位点、tbk1结合位点和traf6结合位点。sting通过tank结合激酶1(tbk1)磷酸化sting蛋白c末端尾部(ctt)，而促进诱导干扰素β(ifn
‑
β)产生。sting和tbk1之间的相互作用是由sting羧基末端尾部(ctt)中进化上保守型的8个氨基酸残基片段介导的。traf6催化sting上k63连接的泛素蛋白链的形成，导致转录因子nf
‑
κb的激活和诱导另一sting依赖性基因表达程序。缺失ctt中的traf6结合位点可减少nf
‑
κb信号传导的激活。用来自具有低nf
‑
κb激活的物种的sting的ctt(或其相应部分)取代人ctt(或其一部分)可以降低人sting对nf
‑
κb的激活。sting ctt是一段非结构化的～40个氨基酸的序列，包含sting磷酸化和irf3募集所需的序列基序(参见de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。人sting残基s366已被鉴定为主要tbk1磷酸化位点，其是激活干扰素信号传导的先天免疫适配子蛋白所共有的lxis基序的一部分(参见de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。人sting ctt包含第二个pxplr基序，其包括tbk1结合所需的残基l374；lxis和pxplr序列在脊椎动物sting等位基因中是保守的(见de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。示例的sting ctt序列和irf3、tbk1和traf6结合位点列于下表中：
[0255][0256]
如本文所用，经过修饰从而“在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少细胞死亡”的细菌是比未经修饰的细菌毒性小的细菌，或者与未经修饰的细菌相比毒力降低的细菌。这种修饰的示例是消除细胞焦亡和改变细菌上lps谱的那些修饰。这些修饰包括破坏或缺失鞭毛蛋白基因，spi
‑
1途径的一种或多种组分如hila、杆状蛋白、针状蛋白、qsec和pagp。
[0257]
如本文所用，“经过修饰以使其优先感染肿瘤驻留免疫细胞”的细菌在其基因组中具有修饰，从而降低其感染除免疫细胞之外的细胞的能力。这种修饰的示例是破坏3型分泌系统或4型分泌系统或影响细菌侵入非免疫细胞的能力的其它基因或系统的修饰。例如，破坏/缺失spi
‑
1组分，该组分是沙门氏菌感染细胞例如上皮细胞所必需的，但不影响沙门氏菌对免疫细胞例如吞噬细胞的感染。
[0258]
如本文所用，“修饰”是指多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，分别包括氨基酸或核苷酸的缺失、插入和取代。修饰多肽的方法对于本领域技术人员来说是常规的，例如通过使用重组dna方法。
[0259]
如本文所用，对细菌基因组或质粒或基因的修饰包括缺失、取代和插入核酸。
[0260]
如本文所用，rna干扰(rnai)是生物学过程，其中rna分子通过中和靶向的mrna分子以抑制翻译并由此抑制靶向的基因的表达来抑制基因表达或翻译。
[0261]
如本文所用，经rnai作用的rna分子是指借助其沉默靶向的基因的表达而是抑制性的。沉默表达意味着靶向的基因的表达被降低或阻抑或抑制。
[0262]
如本文所用，经由rnai的基因沉默被称作是抑制、阻抑、破坏或沉默靶向的基因的表达。靶向的基因包含与抑制性rna中的序列相对应的核苷酸序列，从而抑制性rna使mrna的表达沉默。小干扰rna(sirna)是通常长度为约21个核苷酸的小片段的双链(ds)rna，在每个末端带有3
′
突出部分(2个核苷酸)，可通过在特定序列处结合并促进信使rna(mrna)的降解来“干扰”蛋白质的翻译。这样做时，sirna会根据其相应mrna的核苷酸序列阻止特定蛋白质的产生。这个过程称为rna干扰(rnai)，也称为sirna沉默或sirna敲低。短发夹rna或小发夹rna(shrna)是具有紧密发夹转角的人工rna分子，可用于通过rna干扰(rnai)使靶基因表达沉默。shrna在细胞中的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来完成。
[0263]
如本文所用，抑制、阻抑、破坏或沉默靶向的基因是指改变靶向的基因的表达如翻译的过程，由此降低了由靶向的基因所编码的产物的活性或表达。降低包括完全敲除或部分敲除，由此参照本文提供的免疫刺激性细菌和本文的施用时，得以实现治疗。
[0264]
如本文所用，肿瘤微环境(tme)是肿瘤存在的细胞环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓衍生的炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质(ecm)。存在的病况包括但不限于血管生成增加、缺氧、低ph、乳酸浓度增加、丙酮酸浓度增加、间质液压力增加以及代谢物或代谢改变，例如较高的腺苷水平，表明存在肿瘤。
[0265]
如本文所用，人i型干扰素(ifn)是调节免疫系统的活性的干扰素蛋白的亚组。所有i型ifn都与特定的细胞表面受体复合物(例如ifn
‑
α受体)结合。其中i型干扰素包括ifn
‑
α和ifn
‑
β等。ifn
‑
β蛋白是由成纤维细胞产生的，具有主要参与先天性免疫应答的抗病毒活性。两种类型的ifn
‑
β是ifn
‑
β1(ifnβ1)和ifn
‑
β3(ifnβ3)。
[0266]
如本文所用，核酸或编码的rna靶向基因的表述是指其通过任何机制抑制或阻抑或沉默基因的表达。通常，这种核酸包括至少一部分与靶向的基因互补，其中该部分足以与互补部分形成杂交体。
[0267]
如本文所用，“缺失”当指核酸或多肽序列时，是指与序列例如靶多核苷酸或多肽或天然或野生型序列相比，一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失。
[0268]
如本文所用，“插入”在指核酸或氨基酸序列时，描述了在靶、天然、野生型或其它相关序列内包含一个或多个另外的核苷酸或氨基酸。因此，与野生型序列相比包含一个或多个插入的核酸分子在序列的线性长度内包含一个或多个另外的核苷酸。
[0269]
如本文所用，“加入”核酸和氨基酸序列描述了与另一序列相比在任一末端加入核苷酸或氨基酸。
[0270]
如本文所用，“取代”或“取代”是指用可选的核苷酸或氨基酸取代天然的、靶、野生型或其它核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸，而不改变分子的长度(如残基数所述)。因此，分子中的一个或多个取代不会改变分子的氨基酸残基或核苷酸的数目。与特定多肽相比的氨基酸取代可以依据沿着多肽序列长度的氨基酸残基的数目表示。
[0271]
如本文所用，“在对应于
…
的位置”或核苷酸或氨基酸位置“对应于”如序列表中所述的公开序列中的核苷酸或氨基酸位置的表述，是指在使用标准比对算法例如gap算法与所公开的序列比对以使相同性最大化时鉴别的核苷酸或氨基酸位置。通过比对序列，本领域技术人员可以例如使用保守型且相同的氨基酸残基作为指导鉴别相应的残基。通常，为
了鉴别相应位置，将氨基酸序列进行比对，以获得最高位的匹配(参见例如computational molecular biology,lesk,a.m.,ed.,oxford university press,new york,1988；biocomputing:informatics and genome projects,smith,d.w.,ed.,academic press,new york,1993；computer analysis of sequence data,part i,griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.,humana press,new jersey,1994；sequence analysis in molecular biology,von heinje,g.,academic press,1987；sequence analysis primer,gribskov,m.and devereux,j.,eds.,m stockton press,new york,1991；及carrillo et al.(1988)siam j applied math 48:1073)。
[0272]
如本文所用，序列的比对是指使用同源性来比对两个或多个核苷酸或氨基酸的序列。通常，将以50％或更多相同性相关的两个或多个序列进行比对。比对的序列组是指在相应位置进行比对的及可以包括与基因组dna序列比对的衍生自rna的比对序列(例如est和其它cdna)的2个或更多个序列。相关或变体多肽或核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这种方法通常使匹配最大化，并且包括例如使用手动比对以及通过使用许多可用的比对程序(例如blastp)的方法，和本领域技术人员已知的其它方法。通过比对多肽或核酸的序列，本领域技术人员可以使用保守型且相同的氨基酸残基作为指导来鉴别相似的部分或位置。此外，本领域技术人员还可以使用保守型的氨基酸或核苷酸残基作为指导，以在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸或核苷酸残基。相应的位置也可以基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构的比对。在其它情况下，可以识别相应的区域。本领域技术人员还可以使用保守型的氨基酸残基作为指导，以在人和非人序列之间和之中找到相应的氨基酸残基。
[0273]
如本文所用，多肽例如抗体的“性质”是指多肽表现出的任何性质，包括但不限于结合特异性、结构构型或构象、蛋白质稳定性、对蛋白水解的抗性、构象稳定性、耐热性和对ph条件的耐受性。性质的变化可以改变多肽的“活性”。例如，抗体多肽结合特异性的变化可以改变结合抗原的能力和/或各种结合活性，例如亲和性或亲和性，或体内活性。
[0274]
如本文所用，多肽例如抗体的“活性”或“功能性活性”是指所述多肽表现出的任何活性。这些活性可以凭经验确定。示例的活性包括但不限于例如通过抗原结合、dna结合、配体结合或二聚作用或酶活性例如激酶活性或蛋白水解活性与生物分子相互作用的能力。对于抗体(包括抗体片段)，所述活性包括但不限于特异性结合特定抗原的能力、抗原结合的亲和性(例如高或低亲和性)、抗原结合的亲和力(例如高或低亲和力)、结合率(on
‑
rate)、解离率(off
‑
rate)、效应子功能例如促进抗原中和或清除、病毒中和的能力、以及体内活性例如防止病原体感染或侵入，或促进清除，或穿透体内的特定组织、流体或细胞的能力。可以使用公认的测定法例如elisa、流式细胞仪、表面等离振子共振或等价测定来测量结合率或解离率、免疫组织化学和免疫荧光组织学和显微镜检查、基于细胞的测定、流式细胞仪和结合测定例如淘选测定(panning assay)在体外或体内评估活性。
[0275]
如本文所用，“结合”、“结合的”或其语法上的变化是指分子参与与另一分子的任何有吸引力的相互作用，从而导致其中两个分子彼此紧邻的稳定缔合。结合包括但不限于非共价结合、共价结合(例如可逆和不可逆的共价结合)，及包括分子例如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和小分子如包括药物在内的化合物之间的相互作用。
[0276]
如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分
或完全合成的，例如重组产生的，包括包含免疫球蛋白分子的可变重链和轻区的至少一部分的其任何片段，所述免疫球蛋白分子足以形成抗原结合位点，以及在组装时足以特异性结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。例如，抗体是指包含两个重链(其可以表示为h和h
′
)和两个轻链(其可以表示为l和l
′
)的抗体，其中每个重链可以是足以形成抗原结合位点的全长免疫球蛋白重链或其一部分(例如，重链包括但不限于vh链、vh
‑
ch1链和vh
‑
ch1
‑
ch2
‑
ch3链)，每个轻链可以是足以形成抗原结合位点的全长轻链或其一部分(例如，轻链包括但不限于vl链和vl
‑
cl链)。每个重链(h和h
′
)与一个轻链(分别为l和l
′
)配对。通常，抗体最少地包括可变重链(vh)和/或可变轻链(vl)的全部或至少一部分。抗体还可以包括全部恒定区或恒定区的部分。
[0277]
出于本文的目的，术语抗体包括全长抗体及其一部分，包括抗体片段，例如抗egfr抗体片段。所述抗体片段包括但不限于fab片段、fab
′
片段、f(ab
′
)2片段、fv片段、二硫键连接的fv(dsfv)、fd片段、fd
′
片段、单链fv(scfv)、单链fab(scfab)、双抗体、抗独特型(anti
‑
id)抗体或上述任何一种的抗原结合片段。抗体还包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和胞内抗体。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类别(例如，igg、igm、igd、ige、iga和igy)、任何亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚亚类(例如，igg2a和igg2b)的成员。
[0278]
如本文所用，“核酸”是指通常通过磷酸二酯键连接在一起的至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。术语“核酸”还包括核酸的类似物，例如肽核酸(pna)、硫代磷酸dna和其它这种类似物和衍生物或其组合。核酸还包括dna和rna衍生物，所述dna和rna衍生物含有例如核苷酸类似物或“主链”键而不是磷酸二酯键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键、硫酯键或肽键(肽核酸)。该术语还包括作为等价物的由核苷酸类似物、单(有义或反义)和双链核酸制成的rna或rna的衍生物、变体和类似物。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于rna，尿嘧啶碱基是尿苷。
[0279]
如本文所用，分离的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分开的核酸分子。当通过重组技术生产时，“分离的”核酸分子，例如cdna分子，可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其它化学品。本文提供的示例的分离的核酸分子包括编码提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
[0280]
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操纵地连接”是指核酸区域在功能上彼此相关。例如，可以将编码前导肽的核酸可操纵地连接于编码多肽的核酸，由此可以转录和翻译所述核酸以表达功能性融合蛋白，其中前导肽影响融合多肽的分泌。在一些情况下，将编码第一个多肽(例如前导肽)的核酸与编码第二个多肽的核酸可操纵地连接，并且将核酸转录为单个mrna转录物，但是mrna转录物的翻译可以产生被表达的两个多肽之一。例如，琥珀终止密码子可以位于编码第一个多肽的核酸与编码第二个多肽的核酸之间，使得当导入到部分琥珀抑制细胞中时，所得单个mrna转录物可以被翻译以产生含有第一个和第二个多肽的融合蛋白，或者可以被翻译以仅产生第一个多肽。在另一个实例中，启动子可以与编码多肽的核酸可操纵地连接，由此所述启动子调节或介导核酸的转录。
[0281]
如本文所用，提及例如合成的核酸分子或合成的基因或合成的肽时所用“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
[0282]
如本文所用，天然存在的α
‑
氨基酸的残基是在自然界中发现的那些20个α
‑
氨基酸的残基，其通过带电荷的trna分子与其在人体内同源mrna密码子的特异性识别而掺入蛋白质中。
[0283]
如本文所用，“多肽”是指共价连接的两个或多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用。
[0284]
如本文所用，“肽”是指长度为2至约40或40个氨基酸的多肽。
[0285]
如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有机化合物。多肽包含两个或多个氨基酸。出于本文的目的，所提供的抗体中包含的氨基酸包括二十种天然存在的氨基酸(见下表)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(例如其中α
‑
碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，存在于本文中出现的多肽的各种氨基酸序列中的氨基酸根据其熟知的三个字母或一个字母的缩写识别(见下表)。存在于各种核酸分子和片段中的核苷酸以本领域常规使用的标准单字母名称命名。
[0286]
如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键处化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基通常是“l”异构体形式。“d”异构体形式的残基可以被任何l
‑
氨基酸残基取代，只要多肽保留期望的功能性质即可。nh2是指存在于多肽氨基末端的游离氨基。cooh是指存在于多肽羧基末端的游离羧基。根据j biol.chem.,243:3557
‑
59(1968)中描述并在37c.f.r.
§§
1.821
‑
1.822下接受的标准多肽命名法，氨基酸残基的缩写如下表所示：
[0287]
对应表
[0288][0289]
本文中由式表示的氨基酸残基的所有序列在氨基末端至羧基末端的常规方向上是从左至右的方向。短语“氨基酸残基”定义为包括在以上对应表中列出的氨基酸，修饰的、非天然的和非常见氨基酸。氨基酸残基序列的开始或结束处的破折号表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列或与氨基末端基团(如nh2)或与羧基末端基团(如cooh)的肽键。
[0290]
在肽或蛋白质中，氨基酸的合适的保守型取代为本领域技术人员已知，通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下取代。本领域技术人员认识到，通常多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物学活性(见例如watson et al.,molecular biology of the gene,4th edition,1987,the benjamin/cummings pub.co.,p.224)。.
[0291]
这种取代，例如在本文描述和提供的功能获得性突变中，可以根据下表中列出的示例取代进行：
[0292]
示例的保守型氨基酸取代
[0293]
原始残基示例的保守型取代ala(a)gly；serarg(r)lysasn(n)gln；hiscys(c)sergln(q)asn
glu(e)aspgly(g)ala；prohis(h)asn；glnile(i)leu；valleu(l)ile；vallys(k)arg；gln；glumet(m)leu；tyr；ilephe(f)met；leu；tyrser(s)thrthr(t)sertrp(w)tyrtyr(y)tip；pheval(v)ile；leu
[0294]
其它取代也是允许的，并可以根据经验确定或根据其它已知的保守型或非保守型取代确定。
[0295]
如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指存在于多肽中的20个l
‑
氨基酸。
[0296]
如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指具有与天然氨基酸相似的结构但已被结构修饰以模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。因此，非天然存在的氨基酸包括例如除20个天然存在的氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的d
‑
立体异构体。示例的非天然氨基酸为本领域技术人员已知，包括但不限于2
‑
氨基己二酸(aad)、3
‑
氨基己二酸(baad)、β
‑
丙氨酸/β
‑
氨基丙酸(bala)、2
‑
氨基丁酸(abu)、4
‑
氨基丁酸/哌啶酸(4abu)、6
‑
氨基己酸(acp)、2
‑
氨基庚酸(ahe)、2
‑
氨基异丁酸(aib)、3
‑
氨基异丁酸(baib)、2
‑
氨基庚二酸(apm)、2,4
‑
二氨基丁酸(dbu)、锁链素(des)、2,2
′‑
二氨基庚二酸(dpm)、2,3
‑
二氨基丙酸(dpr)、n
‑
乙基甘氨酸(etgly)、n
‑
乙基天冬酰胺(etasn)、羟基赖氨酸(hyl)、别羟基赖氨酸(ahyl)、3
‑
羟基脯氨酸(3hyp)、4
‑
羟基脯氨酸(4hyp)、异锁链素(ide)、别异亮氨酸(aile)、n
‑
甲基甘氨酸、肌氨酸(megly)、n
‑
甲基异亮氨酸(meile)、6
‑
n
‑
甲基赖氨酸(melys)、n
‑
甲基缬氨酸(meval)、正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)和鸟氨酸(orn)。
[0297]
如本文所用，dna构建体是单链或双链、线性或环状dna分子，其包含以自然界中未发现的方式组合和并列的dna节段。dna构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵的分子的克隆和其它拷贝。
[0298]
如本文所用，dna节段是具有特定属性的较大dna分子的一部分。例如，编码特定多肽的dna节段是较长dna分子的一部分，如质粒或质粒片段，当从5
′
到3
′
方向读取时，其编码特定多肽的氨基酸序列。
[0299]
如本文所用，术语多核苷酸是指从5
′
至3
′
末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括rna和dna，可以从天然来源中分离、体外合成、或由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸分子的长度在本文中根据核苷酸(缩写为“nt”)或碱基对(缩写为“bp”)给出。在上下文允许的情况下，术语核苷酸是指单链和双链分子。当将该术语应用于双链分子时，其用于表示整个长度，且应理解为等同于术语碱基对。本领域
技术人员将认识到，双链多核苷酸的两条链在长度上可以略有不同，其末端可以是交错的；因此，双链多核苷酸分子中的所有核苷酸不能配对。这种未配对末端在长度上通常将不超过20个核苷酸。
[0300]
如本文所用，通过重组方法产生是指使用分子生物学熟知的方法表达由克隆的dna编码的蛋白质。
[0301]
如本文所用，“异源核酸”是编码产物(即rna和/或蛋白质)的核酸，所述产物在体内不由产物在之中表达的细胞正常产生，或者异源核酸是处于通常其不存在于之中的基因座中的核酸，或者是介导或编码通过影响转录、翻译或其它可调节的生化过程来改变内源核酸如dna的表达的介导物的核酸。异源核酸，如dna，也称为外来核酸。本领域技术人员认识到或认为对于核酸在其中表达的细胞而言是异源或外来的任何核酸如dna，在本文中均为异源核酸所涵盖；异源核酸包括也是经内源表达而外源加入的核酸。异源核酸通常对于其所导入之中的细胞而言不是内源的，而是已经从另一细胞获得或合成地制备，或被导入其非天然存在于之中的基因组基因座中，或其表达处于调节序列或者不同于天然调节序列的序列的控制下。
[0302]
本文的异源核酸的实例包括但不限于编码dna/rna传感器途径的蛋白质及其功能获得性变体的核酸，或者编码免疫刺激性蛋白如细胞因子的核酸，所述免疫刺激性蛋白赋予或有助于在肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫性。在免疫刺激性细菌中，异源核酸通常在所导入的质粒上编码，但是可以将其导入细菌的基因组中，例如改变细菌产物表达的启动子。异源核酸，如dna，包括可以以某种方式介导编码治疗性产物的dna表达的核酸，或者其可以编码以某种方式直接或间接介导治疗性产物的表达的产物，例如肽或rna。
[0303]
如本文所用，细胞疗法涉及将细胞递送至对象以治疗疾病或病症。所述细胞可以是同种异体或自体的细胞，其被离体修饰，例如通过用本文提供的免疫刺激性细菌感染，使其在导入对象时递送或表达产物。
[0304]
如本文所用，基因疗法涉及将异源核酸如dna转移至患有寻求之中治疗的疾病或病症的哺乳动物特别是人的某些细胞例如靶细胞中。将核酸如dna以使得异源核酸如dna被表达并产生由此编码的治疗性产物的方式导入所选择的靶细胞中。基因疗法还可用于递送编码基因产物的核酸，所述基因产物取代缺陷基因或补充由其中导入核酸的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码通常不由哺乳动物宿主正常产生或不以治疗有效量或在治疗有效时间产生的治疗性化合物，如生长因子或其抑制剂、或肿瘤坏死因子或其抑制剂，如其受体。编码治疗性产物的异源核酸如dna，可以在导入到患病宿主的细胞之前被修饰，以增强或以另外改变产物或其表达。基因疗法还可包括递送基因表达的抑制剂或阻抑物或其它调节物。
[0305]
如本文所用，“表达”是指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。可以使用本领域已知的任何方法评估多肽的表达水平，包括例如确定由宿主细胞产生的多肽的量的方法。这种方法可包括但不限于通过elisa、凝胶电泳后的考马斯蓝染色、lowry蛋白测定和bradford蛋白测定来定量细胞裂解物中的多肽。
[0306]
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、维持、再生和/或扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达由载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所包含的核酸被复制，从而扩增核酸。
[0307]
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当将载体转化进合适的宿主细胞中时，可以从中核酸表达一种或多种异源蛋白质。关于载体，其包括通常通过限制性消化和连接可将编码多肽或其片段的核酸导入其中的那些载体。关于载体，还包括含有编码多肽如修饰的抗egfr抗体的核酸的那些载体。载体用于将编码多肽的核酸导入宿主细胞中，以扩增核酸或表达/展示由核酸编码的多肽。载体通常保持游离型，但是可以设计为实现基因或其部分整合到基因组染色体中。还考虑了是人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载具的选择和使用是本领域技术人员熟知的。载体还包括“病毒性载体”或“病毒载体”。病毒载体是工程化的病毒，其与外源基因可操纵地连接，以将外源基因转移进细胞中(作为载具或传送物)。
[0308]
如本文所用，“表达载体”包括能表达与调节序列如启动子区域可操纵地连接的dna的载体，所述调节序列可以实现这种dna片段的表达。这种另外的节段可包括启动子和终止子序列，及任选可包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或病毒dna，或可以包含这两种元件。因此，表达载体是指重组dna或rna构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或在导入合适的宿主细胞中导致克隆的dna表达的其它载体。合适的表达载体是本领域技术人员熟知的，包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些表达载体以及保持游离型的那些表达载体或整合入宿主细胞基因组中的那些表达载体。
[0309]
如本文所用，“一级序列”是指多肽中的氨基酸残基的序列或核酸分子中的核苷酸的序列。
[0310]
如本文所用，“序列相同性”是指在比较检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基的数目。序列相同性可以通过核酸或蛋白质序列的序列比对以鉴别相似性或相同性区域而确定。出于本文的目的，通常通过比对以鉴别相同残基而确定序列相同性。比对可以是局部比对或全局比对。可以在比较的序列之间鉴别出匹配、错配和空位。空位是在比对序列的残基之间插入的空位氨基酸或核苷酸以排列相同或相似的字符。通常，可能存在内部和末端空位。当使用空位罚分时，可以确定序列相同性而对末端空位不罚分(例如对末端空位不罚分)。或者，可以在不考虑空位的情况下将序列相同性确定为总比对序列的相同位置/长度的数目
×
100。
[0311]
如本文所用，“全局比对”是从头到尾排列两个序列，每个序列中的每个字母仅排列一次。无论序列之间是否存在相似性或相同性，均会产生比对。例如，基于“全局比对”具有50％序列相同性是指在两个比较的序列的全序列的比对中，每个长度为100个核苷酸的序列中50％的残基是相同的。应理解，即使比对序列的长度不同，全局比对也可以用于确定序列相同性。除非选择“对于末端空位无罚分”，否则在确定序列相同性时将考虑序列末端的差异。通常，全局比对用于在其大部分长度上具有显著相似性的序列。用于进行全局比对的示例性算法包括needleman
‑
wunsch算法(needleman et al.(1970)j.mol.biol.48:443)。用于进行全局比对的示例性程序是可公开获得的，且包括可在国家生物技术信息中心(ncbi)网站(ncbi.nlm.nih.gov/)上获得的全局序列比对工具，以及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的程序。
[0312]
如本文所用，“局部比对”是比对两个序列，但是仅比对序列的具有相似性或相同性的那些部分。因此，局部比对确定一个序列的子节段是否存在于另一序列中。如果不存在
相似性，则不会返回任何比对信息。局部比对算法包括blast或smith
‑
waterman算法(adv.appl.math.2:482(1981))。例如，基于“局部比对”具有50％序列相同性是指在任意长度的两个比较序列的全序列比对中，长度为100个核苷酸的相似性或相同性的区域在次相似性或相同性区域中具有50％的相同的残基。
[0313]
出于本文的目的，可以用每个供应商建立的默认空位罚分通过标准比对算法程序来确定序列相同性。gap程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(含有对于相同性为1的值，和对于非相同性为0的值)和gribskov et al.(1986)nucl.acids res.14:6745的加权比较矩阵，如schwartz and dayhoff,eds.,atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,pp.353
‑
358(1979)所述；(2)对于每个空位的罚分为3.0，且对于每个空位中的每个符号附加0.10罚分；和(3)对于端空位无罚分。无论任何两个核酸分子具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其它类似用语的核苷酸序列，还是任何两个多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”或表述百分比相同性的其它类似用语的氨基酸序列，均可以使用基于局部或全局比对的已知计算机算法确定(见例如wikipedia.org/wiki/sequence_alignment_software，其提供了数十个已知和可公开获得的比对数据库和程序的链接)。通常，出于本文的目的，使用基于全局比对的计算机算法确定序列相同性，如得自ncbi/blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？cmd＝web&page_type＝blasthome)的needleman
‑
wunsch全局序列比对工具；lalign(william pearson implementing the huang and miller algorithm(adv.appl.math.(1991)12:337
‑
357))；可在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html获得的xiaoqui huang的程序。通常，在全局比对中，将每个比较的多肽或核苷酸的全长序列在每个序列的全长进行排列。当所比较的序列为基本相同的长度时，也可以使用局部比对。
[0314]
因此，如本文所用，术语“相同性”表示检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性实例中，“与
…
至少90％相同”是指相对于参考多肽或多核苷酸具有90％至100％百分比相同性。在90％或更高水平的相同性表明以下事实：假设出于示例目的，比较了长度为100个氨基酸或核苷酸的检测多肽或多核苷酸与参考多肽或多核苷酸，不超过10％(即100中有10个)的检测多肽或多核苷酸中的氨基酸或核苷酸与参考多肽的那些氨基酸或核苷酸不同。可以在检测多核苷酸与参考多核苷酸之间进行类似比较。这种差异可以表示为在氨基酸序列的整个长度上随机分布的点突变，或者其可以聚集在不同长度直至允许的最大长度的一个或多个位置，例如10/100个氨基酸差异(约90％相同性)。差异也可能是由于氨基酸残基的缺失或截短所致。差异被定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。取决于所比较序列的长度，在约85
‑
90％以上的同源性或相同性水平，结果可以独立于程序和空位参数设置；通常无需依赖软件即可轻松评估出这种高水平的相同性。
[0315]
如本文所用，“疾病或病症”是指由某些原因或状况包括但不限于感染、获得性状况以及遗传状况等引起的生物体中的病理状况，且其特征在于可识别的症状。
[0316]
如本文所用，“治疗”患有疾病或状况的对象是指所述对象的症状在治疗后部分或全部减轻或保持静态。
[0317]
如本文所用，治疗是指改善疾病或病症的症状的任何作用。治疗包括预防、治疗
和/或治愈。治疗还包括本文提供的任何免疫刺激性细菌或组合物的任何药物用途。
[0318]
如本文所用，预防是指预防潜在疾病和/或预防疾病的症状或进展恶化。
[0319]
如本文所用，“预防(prevention)”或预防(prophylaxis)及其语法等同形式是指降低进展为疾病或病况的风险或可能性的方法。
[0320]
如本文所用，“药物有效物质”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂和常规治疗药，包括小分子药物和治疗性蛋白质。
[0321]
如本文所用，“治疗作用”是指由对象进行治疗而产生的改变，通常为改良或改善疾病或病况的症状或治愈疾病或病况的作用。
[0322]
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指某物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，所述量在施用于对象后至少足以产生治疗性作用。因此，所述量是预防、治愈、改善、抑制或部分抑制疾病或病症的症状所必需的量。
[0323]
如本文所用，“治疗效力”是某指物质、化合物，材料或包含化合物的组合物在已施用所述物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的对象中产生治疗作用的能力。
[0324]
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”是指当将某物质、化合物、材料或包含化合物的组合物施用于对象时具有预期的预防作用的量，所述预防作用例如是预防或延迟疾病或症状的发作或复发、降低疾病或症状的发作或复发的可能性，或降低病毒感染的发生率。通过施用一次剂量不需要发生完全的预防作用，以及可以是在施用一系列剂量后发生作用。因此，可以以一次或多次施用预防有效量。
[0325]
如本文所用，通过治疗例如通过施用药物组合物或其它治疗剂来改善特定疾病或病症的症状，是指可归因于或与组合物或治疗剂的施用相关的任何症状的减轻，无论永久或是暂时、持续或短暂减轻。
[0326]
如本文所用，“抗癌剂”是指对恶性细胞和组织具有破坏性或毒性的任何物质。例如，抗癌剂包括杀死癌细胞或另外抑制或损害肿瘤或癌细胞的生长的物质。示例的抗癌剂是化学治疗剂。
[0327]
如本文所用，“治疗活性”是指治疗性多肽的体内活性。通常，治疗活性是与治疗疾病或病况相关的活性。
[0328]
如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物，如人。
[0329]
如本文所用，患者是指人对象。
[0330]
如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、大猩猩和猴子；啮齿动物，如小鼠和大鼠；禽类，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊；以及猪和其它动物。非人动物排除人作为预期的动物。本文提供的多肽来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大多数多肽是动物来源的，包括哺乳动物来源的。
[0331]
如本文所用，“组合物”是指任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水相的、非水相的或其任何组合。
[0332]
如本文所用，“组合”是指两种或更多种物品之间或之中的任何关联。所述组合可以是两种或更多种分开的物品，例如两种组合物或两种集合物品，其混合物，如两种或更多种物品的单个混合物，或其任意变体。组合的元件通常在功能上关联或相关。
[0333]
如本文所用，组合疗法是指施用两种或更多种不同治疗剂。所述不同的治疗剂可以分开、相继、间歇地提供和施用，或者可以以单一组合物提供。
[0334]
如本文所用，出于包括但不限于生物活性或性质的激活、施用、诊断和评估的目的，试剂盒是包装的组合，其任选包括其它元件，如另外的试剂和所述组合或其元件的使用说明。
[0335]
如本文所用，“单位剂型”是指适于人和动物对象以及如本领域中已知单独包装的物理上分立的单位。
[0336]
如本文所用，“单一剂量制剂”是指直接施用的制剂。
[0337]
如本文所用，多剂量制剂是指包含多剂量的治疗剂的制剂及可以直接施用以提供数个单剂量的治疗剂的制剂。所述剂量可以在几分钟、几小时、几周、几天或几个月的时间内施用。多剂量制剂可以允许剂量调节、剂量合并和/或剂量拆分。由于随着时间使用多剂量制剂，因此其通常包含一种或多种防腐剂以防止微生物生长。
[0338]
如本文所用，“制造产品”是制备和销售的产品。如在本技术中通篇使用的，该术语旨在涵盖包含于包装物品中的本文提供的任何组合物。
[0339]
如本文所用，“流体”是指可以流动的任何组合物。因此，流体包括半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、霜剂形式的组合物及其它这种组合物。
[0340]
如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白质(例如分离的抗体或其抗原结合片段)或其生物活性部分(例如分离的抗原结合片段)基本上不含细胞材料或来自蛋白质衍生自之中的细胞或组织的其它污染蛋白质，或基本不含化学合成时的化学前体或其它化学品。如果如通过本领域技术人员用来评估这种纯度的标准分析方法例如薄层色谱法(tlc)、凝胶电泳和高效液相色谱法(hplc)所确定，所述制备物表现为不含容易检测到的杂质，或者制备物足够纯以至于进一步纯化不会可检测地改变该物质的物理和化学性质如酶和生物活性，则可以确定制备物是基本上不含。纯化化合物以产生基本上化学纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，基本上化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可提高化合物的特异性活性。如本文所用，“细胞提取物”或“裂解物”是指由裂解或破坏的细胞制成的制备物或级分。
[0341]
如本文所用，“对照”是指与测试样品基本相同的样品，除了其不使用测试参数进行处理，或者，如果是血浆样品，则其可以来自未受感兴趣的状况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
[0342]
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括其复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，关于包含“免疫球蛋白结构域”的多肽，包括具有一个或多个免疫球蛋白结构域的多肽。
[0343]
如本文所用，除非明确指出仅可选方案或可选方案是互斥的，否则术语“或”用于表示“和/或”。
[0344]
如本文所用，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约还包括精确量。因此，“约5个氨基酸”是指“约5个氨基酸”以及还有“5个氨基酸”。
[0345]
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。例如，任选的变体部分是指该部分是变体或非变体。
[0346]
除非另有说明，否则如本文所用的关于任何保护基、氨基酸和其它化合物的缩写应与其常用用法、公认的缩写或iupac
‑
iub commission on biochemical nomenclature一
pneumophila)、马红球菌(rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、伶鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、五日热罗卡利马氏体菌(rochalimaea quintana)，和根癌土壤杆菌。
[0352]
所述细菌通过一种或多种性质累积，包括扩散、迁移和趋化于免疫豁免的组织或器官或环境，为细菌营养缺陷的提供营养或其它分子的环境，和/或含有复制细胞以提供细菌的进入和复制的环境。本文提供的免疫刺激性细菌和实现这种疗法的细菌物种包括沙门氏菌、李斯特菌和大肠杆菌。所述细菌含有在真核启动子控制下编码表达的治疗性产物的质粒，所述启动子例如rna聚合酶(rnap)ii或iii启动子。通常，rnapiii(也称为poliii)启动子是组成型启动子，以及rnapii(也称为polii)可以被调节。在编码多个产物的情况下，每个产物的表达可以在不同启动子的控制下。
[0353]
在本文提供的细菌中，是经修饰以使其对于腺苷呈营养缺陷型的细菌。这可以通过修饰或缺失参与嘌呤合成、代谢或转运的基因而实现。例如，沙门氏菌种如伤寒沙门氏菌中tsx基因的破坏导致腺苷营养缺陷。腺苷是免疫抑制性的，在肿瘤中高浓度累积；由于细菌在富含腺苷的组织中选择性地复制，因此腺苷营养缺陷提高了细菌的抗肿瘤活性。
[0354]
还提供了经修饰以使其具有有缺陷的asd基因的细菌。对这些体内使用的细菌进行修饰，以包括在导入的质粒上携带功能性asd基因；这样维持了对质粒的选择，使得不需要基于抗生素的质粒维持/选择系统。还提供了在质粒上不含功能性asd基因的asd缺陷菌株的用途，所述菌株因此被工程化为在宿主中是自溶的。
[0355]
还提供了经修饰使其不能产生鞭毛的细菌。这可以通过缺失编码鞭毛蛋白亚基的基因修饰细菌而实现。缺乏鞭毛蛋白的经修饰的细菌具有较低炎性，且因此耐受性更好，并诱导更强力的抗肿瘤应答。
[0356]
还提供了经修饰以产生李斯特菌溶血素(listeriolysin)o(llo)的细菌，其改善了在吞噬细胞中的质粒递送。
[0357]
还提供了经修饰以携带低拷贝、含cpg的质粒的细菌。质粒可以进一步包括其它修饰。
[0358]
还可以将细菌修饰为以使该细菌(如果是沙门氏菌种)表达较少的毒性spi
‑
1(沙门氏菌属致病岛
‑
l)基因。在沙门氏菌属中，负责毒力、侵入、存活和肠外扩散的基因位于沙门氏菌属致病岛(spi)中。
[0359]
可以针对其它期望的性状(包括质粒维持的选择，特别是没有抗生素情况下的选择)对细菌进行进一步修饰，以制备菌株。免疫刺激性细菌任选可编码治疗性多肽，包括抗肿瘤治疗性多肽和抗肿瘤治疗剂。
[0360]
本文提供的免疫刺激性细菌的示例是沙门氏菌种。如本文所述用于修饰的细菌的示例是工程化的鼠伤寒沙门氏菌株，例如用质粒工程化以互补asd基因敲除和无抗生素质粒维持的菌株ys1646(atcc目录号202165；也参见国际pct申请公开号wo 99/13053，也称为vnp20009)。
[0361]
本文提供了经修饰使其对腺苷呈营养缺陷型的免疫刺激性细菌菌株，包含这种菌株的药物组合物被配制为施用于对象、例如人，用于治疗肿瘤和癌症的方法中。
[0362]
本文提供的工程化的免疫刺激性细菌包含多种协同模式，以诱导冷肿瘤的免疫再激活及促进肿瘤抗原特异性免疫应答，同时抑制肿瘤用来破坏和逃逸持久的抗肿瘤免疫性的免疫检查点途径。通过腺苷营养缺陷改善的肿瘤靶向和增强的血管破坏具有改良的效力，同时局部化炎症以限制其它免疫疗法模式观察到的全身性细胞因子暴露和自身免疫毒性。如此修饰的细菌的实例是鼠伤寒沙门氏菌菌株，包括菌株ys1646、特别是asd
‑
菌株的这种修饰以及野生型菌株的这种修饰。
[0363]
c.癌症免疫治疗剂
[0364]
在肿瘤微环境(tme)中发现的免疫抑制性环境(immunosuppressive milieu)是肿瘤初发和进展的驱动力。在免疫系统无法控制并包含肿瘤后，癌症出现。多种肿瘤特异性机制创造了肿瘤环境，其中免疫系统被迫耐受肿瘤及其细胞，而不是消除它们。癌症免疫疗法的目标是挽救免疫系统消除肿瘤的天然能力。
[0365]
1.免疫疗法
[0366]
一些临床癌症免疫疗法已寻求扰乱免疫阻抑与抗肿瘤免疫之间的平衡。通过直接施用细胞因子如il
‑
2和ifn
‑
α刺激免疫的策略已在少数患者中出现适度的临床反应，同时诱导严重的全身性炎症相关毒性(sharma et al.(2011)nat.rev.cancer 11:805
‑
812)。免疫系统已经逐渐形成一些限制自身免疫的检查和平衡，例如t细胞上的程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
l)的上调及其与其同源配体程序性死亡配体1(pd
‑
l1)的结合，所述程序性细胞死亡配体1在抗原呈递细胞(apc)和肿瘤细胞上均表达。pd
‑
l1与pd
‑
l的结合干扰cd8
t细胞信号传导途径，损害cd8
t细胞的增殖和效应子功能，并诱导t细胞耐受性。pd
‑
1和pd
‑
l1是众多通过下调免疫应答起作用的抑制性“免疫检查点”的两个实例。其它抑制性免疫检查点包括细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)、信号调节蛋白α(sirpα)、t细胞激活v
‑
结构域ig阻抑物(vista)、程序性死亡配体2(pd
‑
l2)、吲哚胺2,3
‑
双加氧酶(ido)1和2、淋巴细胞激活基因3(lag3)、半乳凝素(galectin)
‑
9，具有ig和him结构域的t细胞免疫受体(tigit)、t细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域
‑
3(tim
‑
3，也称为甲肝病毒细胞受体2(havcr2))、疱疹病毒侵入介导物(hvem)、cd39、cd73、b7
‑
h3(也称为cd276)、b7
‑
h4、cd47、cd48、cd80(b7
‑
1)、cd86(b7
‑
2)、cd155、cd160、cd244(2b4)、b淋巴细胞和t淋巴细胞弱化子(btla或cd272)及癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(ceacam1或cd66a)。
[0367]
设计用于阻断免疫检查点的抗体，如抗
‑
pd
‑
l(例如派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab))和抗
‑
pd
‑
l1(例如阿妥珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab))，在预防t细胞无变应性和破坏免疫耐受中具有持久的成功。只有一部分经治疗的患者表现出临床获益，且那些经常如此的患者表现出自身免疫相关毒性(见例如ribas(2015)n engl j med 373:1490
‑
1492；topalian et al.(2012)n engl j med 366:3443
‑
3447)。这进一步证实需要本文提供的更有效且毒性更低的疗法。
[0368]
另一种检查点阻断策略是抑制t细胞上ctla
‑
4的诱导，其结合并抑制apc上的共刺激受体如cd80或cd86，与结合相同的受体但亲和性较低的共刺激分化簇28(cd28)竞争。这样阻断了来自cd28的刺激信号，而传递了来自ctla
‑
4的抑制信号，从而阻止了t细胞激活(见phan et al.(2003)proc.natl.acad.sci.u.s.a.100:8372
‑
8377)。抗ctla
‑
4疗法(例如伊匹木单抗(ipilimumab))在某些患者中具有临床成功和持久性，同时表现出严重的免疫相关不良事件的甚至更高发生率(见例如hodi et al.(2010)n.engl.j.med.363:711
‑
723；
schadendorf et al.(2015)j.clin.oncol.33:1889
‑
1894)。还已经显示出肿瘤对抗免疫检查点抗体产生抗性，凸显了对更持久的抗癌疗法的需求，如在本文中提供的那些疗法。
[0369]
2.过继免疫疗法
[0370]
在再激活冷肿瘤以使其更具免疫原性的尝试中，一类称为获得性细胞疗法(adaptive cell therapy，act)的免疫疗法涵盖了多种利用免疫细胞并将其重编程为具有抗肿瘤活性的策略(zielinski et al.(2011)immunol.rev.240:40
‑
51)。基于树突细胞的疗法导入了具有更多免疫刺激性质的遗传工程化树突细胞(dc)。这些疗法尚未成功，因为其不能破坏对癌症的免疫耐受性(见例如rosenberg et al.(2004)nat.med.12:1279)。由于缺乏破坏肿瘤耐受性的能力而在临床上相似失败的是使用含有内源性肿瘤抗原和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)以刺激dc募集的全辐照肿瘤细胞的方法，称为gvax(copier et al.(2010)curr.opin.mol.ther.12:14
‑
20)。一种单独的基于自体细胞的疗法sipuleucel
‑
t(provenge)在2010年被fda批准用于去势抗性前列腺癌。这种疗法利用apc，所述apc从患者中获取并重新装配以表达前列腺酸性磷酸酶(pap)抗原，以刺激t细胞应答，然后在淋巴消融(lymphablation)后重新导入。不幸的是，apc的广泛采用受限于观察到的低客观应答率和高成本，及其使用仅限于前列腺癌的早期阶段(anassi et al.(2011)p t.36(4):197
‑
202)。类似地，自体t细胞疗法(atc)是获取患者自身的t细胞，然后在体外对其再激活以克服肿瘤耐受性，然后在淋巴消融后将其重新导入患者。atc获得了有限的临床成功，且仅在黑素瘤中，同时产生了限制了其实用性的严重安全性和可行性问题(yee et al.(2013)clin.cancer res.19:4550
‑
4552)。
[0371]
嵌合抗原受体t细胞(car
‑
t)疗法是从患者获取t细胞，将t细胞经过重新工程化以表达t细胞受体和抗体ig可变胞外结构域之间的融合蛋白。基于此赋予了抗体的抗原识别性质与激活t细胞的细胞溶解性质(sadelain(2015)clin.invest.125:3392
‑
4000)。成功已经限于b细胞和血液恶性病，以致命的免疫相关的不良事件为代价(jackson et al.(2016)nat.rev.clin.oncol.13:370
‑
383)。肿瘤也可以突变以逃逸靶抗原的识别，包括cd19(ruella et al.,(2016)comput struct biotechnol j.14:357
‑
362)和egfrviii(o
′
rourke et al.(2017)sci transl med.jul l9；(399):eaaa0984)，从而促进免疫逃逸。虽然car
‑
t疗法已在血液恶性病方面获得批准，但其对于治疗实体瘤可行性面临着重大障碍：克服实体瘤微环境的高度免疫抑制性质。需要对现有car
‑
t疗法进行许多其它修饰以潜在地提供针对实体瘤的可行性(kakarla et al.(2014)cancer j.mar
‑
apr；20(2):151
‑
155)。
[0372]
3.癌症疫苗和溶瘤病毒
[0373]
冷肿瘤缺乏t细胞和树突细胞(dc)浸润，且是非t细胞炎性的(sharma et al.(2017)cell 9；168(4):707
‑
723)。在使冷肿瘤再激活以成为更具免疫原性的尝试中，另一类免疫疗法利用可以天然地或通过工程化而累积在肿瘤中的微生物。这些包括设计为刺激免疫系统以表达肿瘤抗原的病毒，从而激活和重编程免疫系统以排斥肿瘤。基于病毒的癌症疫苗已因多种因素在临床上失败，包括对病毒载体本身的既往存在或获得的免疫力，以及对表达的肿瘤抗原缺乏足够的免疫原性(larocca et al.(2011)cancer j.17(5):359
‑
371)。缺乏适当的apc激活佐剂也阻碍了其它非病毒载体癌症疫苗，例如dna疫苗。溶瘤病毒优先在分裂的肿瘤细胞而不是在健康组织中复制，随之肿瘤细胞裂解导致免疫原性肿瘤细胞死亡和进一步的病毒传播。溶瘤病毒talimogene laherparepvec(t
‑
vec)，其使用修饰的
单纯疱疹病毒结合dc募集细胞因子gm
‑
csf，已获得fda批准用于转移性黑素瘤(bastin et al.(2016)biomedicines 4(3):21)。虽然证实了在某些黑素瘤患者中的临床获益，以及与其它免疫疗法相比具有更低的免疫毒性，但这种疗法已经是受限的；其缺乏远端肿瘤疗效和对其它肿瘤类型的更广泛应用。其它基于溶瘤病毒(ov)的疫苗，例如利用副粘病毒、呼肠孤病毒和小核糖核酸病毒的那些疫苗，在诱导全身性抗肿瘤免疫性方面遇到了类似的限制(chiocca et al.(2014)cancer immunol.res.2(4):295
‑
300)。对溶瘤病毒的全身性施用呈现出独特的挑战。在经静脉内注射施用后，病毒被迅速稀释，因此需要可能导致肝毒性的高滴度。如果存在预先存在的免疫性，则病毒会在血液中被迅速中和，且然后所获得的免疫性限制重复给药(maroun et al.(2017)future virol.12(4):193
‑
213)。
[0374]
在基于病毒的疫苗载体和溶瘤病毒的限制中，最大的限制可能是病毒本身。与肿瘤抗原相比，病毒抗原对人t细胞受体(tcr)具有显著更高的亲和性(aleksic et al.(2012)eur j immunol.42(12):3174
‑
3179)。在甚至高度激活的apc的表面上，通过mhc
‑
l与病毒载体抗原一起呈递的肿瘤抗原对于与tcr结合是胜出的，从而导致非常差的抗原特异性抗肿瘤免疫性。如本文提供的其自身不提供高亲和性t细胞表位的肿瘤靶向免疫刺激性载体可以避免这些限制。
[0375]
d.癌症细菌性免疫疗法
[0376]
本文提供了经修饰的免疫刺激性细菌，由此其在肿瘤驻留免疫细胞中累积，而且不感染上皮细胞或其它细胞。免疫刺激性细菌包含在宿主识别的启动子控制下编码和表达及分泌治疗性产物的质粒，所述治疗性产物例如是胞质dna/rna传物途径的一部分的免疫刺激性蛋白，导致i型干扰素的表达。因此，免疫刺激性细菌是癌症治疗剂，其通过修饰的细菌基因组和编码的治疗性产物，将免疫疗法直接递送至肿瘤微环境。本文提供的细菌和方法及用途解决了其它癌症免疫治疗剂先前面临的问题。除了在本文提供的免疫刺激性细菌中表达之外，作为导致i型ifn表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分的免疫刺激性蛋白可以在其它递送载具中编码或提供，所述递送载具例如外泌体、脂质体、溶瘤病毒和基因疗法载体。
[0377]
1.细菌疗法
[0378]
几个世纪以来，据观察与微生物感染相关的急性炎症一直与肿瘤的自发消除有关。细菌具有抗癌活性的认识追溯到19世纪，在那时几位医生观察到感染化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)的患者的肿瘤消退。william coley开始了第一项利用细菌治疗晚期癌症的研究，并开发了一种由化脓性链球菌(s.pyogenes)和粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)组成的疫苗。这个疫苗已成功用于治疗多种癌症，包括肉瘤(sarcomas)、癌瘤、淋巴瘤和黑素瘤。自此已经研究了许多细菌，包括梭菌(clostridium)、分枝杆菌(mycobacterium)、双歧杆菌(bifidobacterium)、李斯特菌如单核细胞增生李斯特菌(l.monocytogenes)、埃希氏菌(escherichia)菌种，作为抗癌疫苗的来源(见例如国际pct申请公开号no.wo1999/013053和wo 2001/025399；bermudes et al.(2002)curr.opin.drug discov.devel.5:194
‑
199；patyar et al.(2010)journal of biomedical science 17:21；及pawelek et al.(2003)lancet oncol.4:548
‑
556)。
[0379]
细菌可以感染动物和人细胞，且有些细菌具有将dna递送到细胞胞质中的先天能力。细菌也适用于疗法，因为其可以口服施用，可以在体内和体外容易繁殖，并且可以冻干
状态储存和运输。细菌遗传学容易操纵，且许多菌株的完整基因组已经得到充分鉴定(felgner et al.(2016)mbio7(5):e01220
‑
16)。结果，细菌已被用于递送和表达多种基因，包括编码细胞因子、血管生成抑制剂、毒素和前药转化酶的那些基因。例如，沙门氏菌属已用于表达免疫刺激分子如il
‑
18(loeffler et al.(2008)cancer gene ther.15(12):787
‑
794)、light(loeffler et al.(2007)pnas 104(31):12879
‑
12883)和fas配体(loeffler et al.(2008)j natl.cancer inst.100:1113
‑
1116)，以治疗肿瘤。细菌载体也比病毒载体更便宜和更易于生产，并且细菌递送优于病毒递送，因为如果需要的话，细菌可以被抗生素迅速消除，从而使其成为更安全的备选物。
[0380]
然而，为了使用菌株，菌株本身必须不是致病的，或者在修饰后不是致病的，以用作治疗剂。例如，在癌症的治疗中，必须将治疗性细菌菌株减毒或使其充分无毒以免引起全身性疾病和/或感染性休克，但仍保持一定水平的感染性以有效地定植于肿瘤。已经描述了遗传修饰的细菌，其用作抗肿瘤剂以引起直接的杀肿瘤效果和/或递送杀肿瘤分子(clairmont et al.(2000)j.infect.dis.181:1996
‑
2002；bermudes,d.et al.(2002)curr.opin.drug discov.devel.5:194
‑
199；zhao,m.et al.(2005)proc.natl.acad.sci.usa 102:755
‑
760；zhao,m.et al.(2006)cancer res.66:7647
‑
7652)。这些之中是肠炎沙门氏菌亚属血清亚型(鼠伤寒沙门氏菌)的生物工程化菌株。与在正常组织中相比，这些细菌优先在肿瘤组织中以>1,000倍累积，并在肿瘤组织中均匀分散(pawelek,j.et al.(1997)cancer res.57:4537
‑
4544；low,k.b.et al.(1999)nat.biotechnol.17:37
‑
41)。优先复制使细菌直接在肿瘤内产生并以高浓度直接递送各种抗癌治疗剂，同时使对正常组织的毒性最小化。当静脉内施用时，这些减毒细菌在小鼠、猪和猴子中是安全的(zhao,m.et al.(2005)proc natl acad sci usa 102:755
‑
760；zhao,m.et al.(2006)cancer res 66:7647
‑
7652；tjuvajev j.et al.(2001)j.control release 74:313
‑
315；zheng,l.et al.(2000)oncol.res.12:127
‑
135)，并且某些活的减毒沙门氏菌属菌株在人体临床实验中，在口服施用后已显示出耐受良好(chatfield,s.n.et al.(1992)biotechnology 10:888
‑
892；dipetrillo,m.d.et al.(1999)vaccine 18:449
‑
459；hohmann,e.l.et al.(1996)j.infect.dis.173:1408
‑
1414；sirard,j.c.et al.(1999)immunol.rev.171:5
‑
26)。鼠伤寒沙门氏菌phop/phoq操纵子是一种由膜相关传感器激酶(phoq)和细胞质转录调节因子(phop)组成的典型细菌双组分调节系统(phop：miller,s.i.et al.(1989)proc natl acad sci usa 86:5054
‑
5058；groisman,e.a.et al.(1989)proc natl acad sci usa 86:7077
‑
7081)。phop/phoq是毒力所需的，并且其缺失会导致该细菌在巨噬细胞中的不佳生存和在小鼠和人体中的明显减毒(miller,s.i.et al.(1989)proc nati acad sci usa 86:5054
‑
5058；groisman,e.a.et al.(1989)proc natl acad sci usa 86:7077
‑
7081；galan,j.e.and curtiss,r.iii.(1989)microb pathog 6:433
‑
443；fields,p.i.et al.(1986)proc natl acad sci usa 83:5189
‑
5193)。phop/phoq缺失菌株已被用作有效的疫苗递送载具(galan,j.e.and curtiss,r.iii.(1989)microb pathog 6:433
‑
443；fields,p.i.et al.(1986)proc natl acad sci usa 83:5189
‑
5193；angelakopoulos,h.and hohmann,e.l.(2000)infect immun 68:2135
‑
2141)。减毒沙门氏菌属已用于靶向递送杀肿瘤蛋白(bermudes,d.et al.(2002)curr opin drug discov devel 5:194
‑
199；tjuvajev j.et al.(2001)j control release 74:313
‑
315)。
[0381]
基于细菌的癌症疗法已示出有限的临床益处。各种细菌物种、包括诺维梭菌(clostridium novyi)(dang et al.(2001)proc.natl.acad.sci.u.s.a.98(26):15155
‑
15160；美国专利公开号2017/0020931、2015/0147315；美国专利号7,344,710和3,936,354)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)(美国专利公开号2015/0224151和2015/0071873)、两岐双岐杆菌(bifidobacterium bifidum)(kimura et al.(1980)cancer res.40:2061
‑
2068)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)(yasutake et al.(1984)med microbiol immunol.173(3):113
‑
125)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)(le et al.(2012)clin.cancer res.l8(3):858
‑
868；starks et al.(2004)j.immunol.173:420
‑
427；美国专利公开号2006/0051380)和大肠杆菌(escherichia coli)(美国专利号9,320,787)已被研究作为抗癌疗法的可能试剂。
[0382]
例如，卡介苗(bacillus calmette
‑
guerin(bcg))菌株已被批准用于在人中治疗膀胱癌，并且比通常被用作一线治疗的膀胱内化疗更有效(gardlik et al.(2011)gene therapy 18:425
‑
431)。另一方法利用单核细胞增生李斯特菌，这是能够在小鼠中诱导有效的cd8
t细胞引发表达的肿瘤抗原的一种活的减毒细胞内细菌(le et al.(2012)clin.cancer res.l8(3):858
‑
868)。在初免
‑
加强方法中，在掺入肿瘤抗原间皮素的基于李斯特菌属的疫苗以及基于同种异体胰腺癌的gvax疫苗的临床实验中，与单独用gvav疫苗处理的患者的3.9个月的中位生存期相比，其在晚期胰腺癌患者中记录了6.1个月的中位生存期(le et al.(2015)j.clin.oncol.33(12):1325
‑
1333)。这些结果并未在较大的2b期研究中得到重复，可能表明在尝试诱导对低亲和性自身抗原例如间皮素的免疫性方面存在困难。
[0383]
细菌菌株可以如本文所述进行修饰。可以通过标准方法和/或通过基因的缺失或修饰，以及通过改变或导入使细菌能够在体内主要在免疫豁免环境(如tme、在肿瘤细胞、肿瘤驻留免疫细胞和实体瘤)中生长的基因，由此对菌株减毒或对其细胞靶位进行修饰。如本文所述用于修饰的起始菌株可以选自例如志贺氏菌(shigella)、李斯特菌(listeria)、大肠杆菌(e.coli)、双歧杆菌(bifidobacteriae)和沙门氏菌(salmonella)。例如，宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)、痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、鸡伤寒沙门氏菌(salmonella gallinarum)和肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)。合适的细菌物种包括立克次氏体(rickettsia)、克雷伯氏菌(klebsiella)、博德特氏菌(bordetella)、奈瑟氏菌(neisseria)、气单胞菌(aeromonas)、弗朗西斯氏菌(francisella)、棒状杆菌(corynebacterium)、柠檬酸杆菌(citrobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜血杆菌(haemophilus)、布鲁氏菌(brucella)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、军团杆菌(legionella)、红球菌(rhodococcus)、假单胞菌(pseudomonas)、螺杆菌(helicobacter)、弧菌(vibrio)、芽孢杆菌(bacillus)和丹毒丝菌(erysipelothrix)。例如，rickettsia rickettsiae、普氏立克次体(rickettsia prowazekii)、rickettsia tsutsugamuchi、莫氏立克次体(rickettsia mooseri)、西伯利亚立克次体(rickettsia sibirica)、支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)、脑膜炎双球菌(neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)、嗜矿泉气单胞菌
(aeromonas eucrenophila)、鲑产气单胞菌(aeromonas salmonicida)、土轮病菌(francisella tularensis)、假结核棒状杆菌(corynebacterium pseudotuberculosis)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(haemophilus somnus)、流产布鲁氏菌(brucella abortus)、胞内分枝杆菌(mycobacterium intracellulare)、嗜肺军团杆菌(legionella pneumophila)、马红球菌(rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、伶鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、五日热罗卡利马氏体菌(rochalimaea quintana)，或根癌土壤杆菌(agrobacterium tumerfacium)。任何已知的治疗性细菌，包括免疫刺激性细菌均可以如本文所述进行修饰。
[0384]
2.对细菌和病毒的免疫应答的比较
[0385]
细菌与病毒一样，具有天然免疫刺激的优势。已知细菌和病毒包含称为病原体相关分子模式(pamp)的保守型结构，该保守型结构由宿主细胞模式识别受体(prr)感测。prr对pamp的识别触发下游信号传导级联反应，这导致诱导细胞因子和趋化因子，和启动导致病原体清除的免疫应答(iwasaki and medzhitov(2010)science 327(5963):291
‑
295)。先天免疫系统为pamp所吸引的方式，以及来自哪种类型的感染原，决定了与侵入的病原体作抗争的适当的适应性免疫应答。
[0386]
一类称为toll样受体(tlr)的prr识别衍生自细菌和病毒来源的pamp，且其位于细胞内的各个区室中。tlr结合一系列配体，包括脂多糖(tlr4)、脂蛋白(tlr2)、鞭毛蛋白(tlr5)、dna中的未甲基化cpg基序(tlr9)、双链rna(tlr3)和单链rna(tlr7和tlr8)(akira et al.(2001)nat.immunol.2(8):675
‑
680；kawai and akira(2005)curr.opin.immunol.17(4):338
‑
344)。例如，鼠伤寒沙门氏菌的宿主监测主要通过tlr2、tlr4和tlr5介导(arpaia et al.(2011)cell 144(5):675
‑
688)。这些tlr通过myd88和trif适配分子发出信号，以介导nf
‑
κb依赖性促炎细胞因子(例如tnf
‑
α、il
‑
6和ifn
‑
γ)的诱导(pandey et al.(2015)cold spring harb perspect biol 7(1):a016246)。
[0387]
另一类prr是nod样受体(nlr)家族。这些受体驻留在宿主细胞的胞质中并识别细胞内pamp。例如，鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白示出激活nlrc4/naip5炎性小体途径，导致胱天蛋白酶
‑
l的裂解和促炎细胞因子il
‑
1β和il
‑
18的诱导，从而导致感染的巨噬细胞的焦亡性细胞死亡(fink et al.(2007)cell microbiol.9(11):2562
‑
2570)。
[0388]
虽然tlr2、tlr4、tlr5和炎性小体的参与诱导介导细菌清除的促炎细胞因子，但其激活主要由nf
‑
κb驱动的信号传导级联反应，导致中性粒细胞、巨噬细胞和cd4
t细胞的募集和激活，而不是抗肿瘤免疫所需的dc和cd8
t细胞的募集和激活(liu et al.(2017)signal transduct target ther.2:e17023)。为了激活cd8
t细胞介导的抗肿瘤免疫性，irf3/irf7依赖性i型干扰素信号传导对于dc激活和肿瘤抗原的交叉呈递以促进cd8
t细胞启动至关重要(diamond et al.(2011).j.exp.med.208(10):1989
‑
2003；fuertes et al.(2011).j.exp.med.208(l0):2005
‑
2016)。i型干扰素(ifn
‑
α，ifn
‑
β)是由两种不同的tlr依赖性和tlr非依赖性信号传导途径诱导的特征细胞因子。用于诱导ifn
‑
β的tlr依赖性途径在病原体胞吞后发生，从而tlr3、7、8和9检测胞内体中病原体衍生的dna和rna元件。tlr 7
和8识别病毒核苷和核苷酸，且其合成激动剂例如雷西莫特(resiquimod)和咪喹莫特(imiquimod)已在临床上得到验证(chi et al.(2017)frontiers in pharmacology 8:304)。合成的dsrna，例如聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(i:c))和聚iclc(由聚l赖氨酸配制以抵抗rnase消化的类似物)是tlr3和mda5途径的激动剂，和ifn
‑
β的强力诱导剂(caskey et al.(2011)j.exp.med.208(12):2357
‑
66)。病毒和细菌dna中存在的胞内体cpg基序的tlr9检测也可以通过irf3诱导ifn
‑
β。另外，已经示出tlr4通过irf3的myd88非依赖性trif激活来诱导ifn
‑
β(owen et al.(2016)mbio.7：1e02051
‑
15)。随后示出dc的tlr4激活与i型ifn无关，因此tlr4通过i型ifn激活dc的能力可能是生物学无关的(hu et al.(2015)proc.natl.acad.sci.u.s.a.112(45):13994
‑
13999)。此外，尚未示出tlr4信号传导直接募集或激活cd8
t细胞。
[0389]
在tlr非依赖性i型ifn途径中，一种途径是由胞质中的单链(ss)和双链(ds)rna的宿主识别而介导的。这些由rna解旋酶包括视黄酸诱导基因i(rig
‑
i)、黑素瘤分化相关基因5(mda
‑
5))感测，以及通过ifn
‑
β启动子刺激物1(ips
‑
l；也称为线粒体抗病毒信号蛋白或mavs)适配蛋白介导的irf
‑
3转录因子的磷酸化而感测，从而导致ifn
‑
β的诱导(ireton and gale(2011)viruses 3(6)：906
‑
919)。还已经在常见的慢病毒shrna载体中偶然发现了在u6启动子转录起始位点以aa二核苷酸序列形式的合成rig
‑
i结合元件。其随后在质粒中的缺失防止混淆脱靶i型ifn激活(pebemard et al.(2004)differentiation 72:103
‑
111)。
[0390]
第二种类型的tlr非依赖性i型干扰素诱导途径是通过干扰素基因刺激物(sting)介导的，sting是一种胞质er驻留适配蛋白(adaptor protein)，现已被认为是从感染性病原体或异常宿主细胞损害中感测胞质dsdna的主要介导物(barber(2011)immunol.rev 243(1)：99
‑
108)。sting信号传导激活tank结合激酶(tbk1)/irf3轴和nf
‑
κb信号传导轴，导致诱导ifn
‑
β和强力激活先天性和适应性免疫的其它促炎细胞因子和趋化因子(burdette et al.(2011)nature 478(7370):515
‑
518)。通过sting感测胞质dsdna需要环状gmp
‑
amp合酶(cgas)，这是直接结合dsdna的宿主细胞核苷酸转移酶，以及在应答中合成环状二核苷酸(cdn)第二信使环状gmp
‑
amp(cgamp)，其结合并激活sting(sun et al.(2013)science 339(6121):786
‑
791；wu et al.(2013)science 339(6121):826
‑
830)。衍生自细菌的cdn，例如由细胞内单核细胞增生李斯特菌产生的c
‑
di
‑
amp也可以直接结合鼠sting，但是仅结合5个人sting等位基因中的3个。与由其中两个嘌呤核苷通过具有3
′‑3′
键的磷酸桥连接的细菌产生的cdn不同，由哺乳动物cgas合成的cgamp中的核苷酸间磷酸桥通过非规范2
′‑3′
键连接。这些2
′‑3′
分子以比细菌3
′‑3′
cdn好300倍的亲和性与sting结合，并因此是人sting的更强力的生理学配体(见例如civril et al.(2013)nature 498(7454):332
‑
337；diner et al.(2013)cell rep.3(5):1355
‑
1361；gao et al.(2013)sci.signal 6(269):p11；ablasser et al.(2013)nature503(7477):530
‑
534)。
[0391]
人的cgas/sting信号传导途径已经进化为优先应答病毒性病原体而不是细菌病原体，这可以解释为什么携带宿主肿瘤抗原的细菌疫苗已成为人体中不佳的cd8
t细胞引发载体。来自常规dc的sting依赖性i型ifn信号传导对于cd8
t细胞的tlr非依赖性激活是检测病毒的主要机制，其中仅在sting途径被病毒失活时才操作由浆细胞样dc的tlr依赖性i型ifn产生(hervas
‑
stubbs et al.(2014)j immunol.193:1151
‑
1161)。进一步地，对于细菌如鼠伤寒沙门氏菌，虽然能够通过tlr4诱导ifn
‑
β，但cd8
t细胞既不被诱导也不被清除
或保护性免疫所需要(lee et al.(2012)immunol lett.148(2):138
‑
143)。许多细菌菌株包括鼠伤寒沙门氏菌缺乏生理相关的cd8
t表位，阻碍了细菌疫苗的开发及对随后感染的保护性免疫，即使来自相同的遗传菌株也是如此(lo et al.(1999)j.immunol.162:5398
‑
5406)。基于细菌的癌症免疫疗法在其诱导i型ifn募集和激活cd8
t细胞的能力方面受到生物学限制，所述能力是促进肿瘤抗原交叉呈递和持久的抗肿瘤免疫性所必需的。然而，本文提供的免疫刺激性细菌被工程化以解决这个问题。本文提供的免疫刺激性细菌诱导病毒样tlr非依赖性i型ifn信号传导，而不是tlr依赖性细菌免疫信号传导，这将优先诱导cd8
t细胞介导的抗肿瘤免疫性。
[0392]
sting应答感测胞质中的核酸而激活先天免疫。下游信号传导通过cdn的结合而被激活，所述cdn是细菌或宿主酶cgas应答与胞质dsdna的结合而合成的。细菌和宿主产生的cdn具有独特的磷酸桥结构，这区分了其激活sting的能力。ifn
‑
β是激活的sting的特征细胞因子，病毒诱导的i型ifn而不是细菌诱导的ifn是有效的cd8
t细胞介导的抗肿瘤免疫性所需要的。本文提供的免疫刺激性细菌包括是sting激动剂的那些细菌和表达sting的那些细菌。
[0393]
3.沙门氏菌属疗法
[0394]
沙门氏菌属是可以用作癌症治疗剂的细菌属的示例。本文示例的沙门氏菌属是减毒菌种，或者是通过如本文所述修饰用作癌症治疗剂的菌种，其具有降低的毒性。
[0395]
a.嗜肿瘤细菌
[0396]
当从远端部位注射时，许多细菌物种已证实在实体瘤内优先复制。这些物种包括但不限于沙门氏菌属、双歧杆菌属、梭菌属和埃希氏杆菌属的菌种。细菌的天然肿瘤归巢性质与宿主对细菌感染的先天免疫应答相结合，被认为介导抗肿瘤应答。这种肿瘤组织嗜性已经示出不同程度地降低肿瘤的大小。这些细菌物种的肿瘤嗜性的一个促成因素是在缺氧或低氧环境中复制的能力。已经对许多这些天然的嗜肿瘤细菌进一步工程化，以提高其抗肿瘤应答的效力(在zu et al.(2014)crit rev microbiol.40(3):225
‑
235；和felgner et al.(2017)microbial biotechnology 10(5):1074
‑
1078中进行综述)。
[0397]
b.肠沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌(salmonella enterica serovar typhimurium)
[0398]
肠沙门氏菌亚属血清型鼠伤寒沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌)是用作抗癌治疗剂的细菌物种的示例。使用细菌刺激宿主对癌症的免疫性的一种方法是通过革兰氏阴性兼性厌氧菌鼠伤寒沙门氏菌，其优先累积在体内的缺氧和坏死区域，包括肿瘤微环境。由于来自组织坏死的营养物的可用性、渗漏的肿瘤脉管系统以及其在逃逸免疫系统的肿瘤微环境中生存的可能性增加，因此鼠伤寒沙门氏菌在这些环境中累积(baban et al.(2010)bioengineered bugs 1(6):385
‑
394)。鼠伤寒沙门氏菌能够在有氧和厌氧条件下生长；因此，其可以定植于不太缺氧的小肿瘤和更缺氧的大肿瘤。
[0399]
鼠伤寒沙门氏菌是通过粪
‑
口途径传播的革兰氏阴性兼性病原体。其不仅引起局部胃肠道感染，而且在经口摄入后进入血液和淋巴系统，从而感染全身组织，例如肝脏、脾和肺。野生型鼠伤寒沙门氏菌的全身施用过度刺激tnf
‑
α诱导，导致细胞因子级联反应和感染性休克，如果不进行治疗可能会致命。结果，必须对致病细菌菌株例如鼠伤寒沙门氏菌进行减毒，以防止全身感染，而不完全抑制其有效地定植于肿瘤组织的能力。通常通过使得可
以引发免疫应答的细胞结构如细菌外膜的突变或限制其在没有补充营养物的情况下复制的能力来实现减毒。
[0400]
鼠伤寒沙门氏菌是一种细胞内病原体，其可被髓样细胞如巨噬细胞迅速摄取，或可诱导其自身摄取进非吞噬细胞如上皮细胞中。一旦在细胞内部，其可以在含有沙门氏菌属的囊泡(scv)中复制，且也可以逃逸到某些上皮细胞的胞质中。已经鉴别了鼠伤寒沙门氏菌致病性的许多分子决定因素，这些基因簇集在沙门氏菌属致病岛(spi)中。两个最佳鉴定的致病岛是负责介导非吞噬细胞的细菌侵入的spi
‑
1和在scv中复制所需的spi
‑
2(agbor and mccormick(2011)cell microbiol.13(12):1858
‑
1869)。这些致病岛均编码称为三型分泌系统(t3ss)的大分子结构，该结构可将效应子蛋白跨宿主膜转运(galan and wolf
‑
watz(2006)nature 444:567
‑
573)。
[0401]
c.细菌减毒
[0402]
作为癌症治疗施用的治疗性细菌应被修饰，由此其不导致疾病。实现此的各种方法是本领域已知的。例如，营养缺陷型突变使细菌无法合成必需的营养物，以及广泛使用了基因的缺失/突变，如aro、pur、gua、thy、nad和asd(美国专利公开号2012/0009153)。由涉及这些基因的生物合成途径产生的营养物通常在宿主细胞中不可用，并因此细菌存活是挑战性的。例如，沙门氏菌属和其它菌种的减毒可以通过缺失aroa基因来实现，该基因是莽草酸酯(shikimate)途径的一部分，从而将糖酵解与芳族氨基酸的生物合成联系起来(felgner et al.(2016)mbio 7(5):e01220
‑
16)。因此，缺失aroa导致细菌对芳族氨基酸呈营养缺陷型及随后减毒(美国专利公开号2003/0170276、2003/0175297、2012/0009153、2016/0369282；国际申请公开号wo 2015/032165和wo 2016/025582)。类似地，已经缺失了参与芳族氨基酸的生物合成途径的其它酶，包括aroc和arod，以实现减毒(美国专利公开号2016/0369282；国际专利申请公开号wo 2016/025582)。例如，鼠伤寒沙门氏菌菌株sl7207是芳族氨基酸营养缺陷型(aroa
‑
突变体)；a1和a1
‑
r菌株是亮氨酸
‑
精氨酸营养缺陷型。vnp20009是嘌呤营养缺陷型(puri
‑
突变体)。如本文所示，其对于免疫抑制性核苷腺苷也呈营养缺陷型。
[0403]
使细菌减毒的突变还包括但不限于改变脂多糖的生物合成的基因(例如rfal、rfag、rfah、rfad、rfap、rfb、rfa、msbb、htrb、fira、pagl、pagp、lpxr、arnt、epta和lpxt)的突变，；导入自杀基因(例如sacb、nuk、hok、gef、kil或phla)的突变，；导入细菌裂解基因(例如hly和cly)的突变；毒力因子(例如isya、pag、prg、isca、virg、plc和act)的突变；修饰应激应答的基因(例如reca、htra、htpr、hsp和groel)的突变；破坏细胞周期如min的突变；破坏或失活调节功能的基因(例如cya、crp、phop/phoq和ompr)的突变(美国专利公开号2012/0009153、2003/0170276、2007/0298012；美国专利号6,190,657；国际申请公开号：wo 2015/032165；felgner et al.(2016)gut microbes 7(2):171
‑
177；broadway et al.(2014)j.biotechnology 192:177
‑
178；frahm et al.(2015)mbio 6(2):e00254
‑
15；kong et al.(2011)infection and immunity 79(12):5027
‑
5038；kong et al.(2012)proc.natl.acad.sci.usa 109(47):19414
‑
19419)。理想地，遗传减毒包括基因缺失而不是点突变，以防止可能导致回复至强毒表型的自发性补偿突变。
[0404]
i.msbb
‑
突变体
[0405]
鼠伤寒沙门氏菌中的由msbb基因编码的酶脂质a生物合成肉豆蔻酰基转移酶催化
末端肉豆蔻基基团加入脂多糖(lps)的脂质a结构域中(low et al.(1999)nat.biotechnol.17(1):37
‑
41)。因此，msbb的缺失改变lps(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)的脂质a结构域的酰基组成。这种修饰显著降低了lps诱导感染性休克的能力，使细菌菌株减毒并减少了tnfα的潜在有害产生，从而降低全身毒性。鼠伤寒沙门氏菌msbb突变体保持其优先定植在小鼠的肿瘤而不是其它组织的能力并保留抗肿瘤活性，从而提高基于沙门氏菌属的免疫治疗剂的治疗指数(见例如美国专利公开号2003/0170276、2003/0109026、2004/0229338、2005/0225088和2007/0298012)。
[0406]
例如，鼠伤寒沙门氏菌vnp20009菌株中msbb的缺失导致产生主要是五酰化的lps，其毒性低于天然六酰化的lps，并允许全身递送而不会引起中毒性休克(lee et al.(2000)international journal of toxicology 19:19
‑
25)。可以将其它lps突变导入本文提供的细菌菌株中，包括沙门氏菌属菌株，其显著降低毒力，并从而提供较低的毒性并允许以较高剂量施用。
[0407]
ii.puri
‑
突变体
[0408]
应用可以通过使其对一种或多种必需营养素例如嘌呤(例如腺嘌呤)、核苷(例如腺苷)或氨基酸(例如精氨酸和亮氨酸)成为营养缺陷型而减毒的免疫刺激性细菌。特别地，在本文提供的免疫刺激性细菌如鼠伤寒沙门氏菌的实施方案中，使优先在肿瘤微环境中累积的细菌对腺苷呈营养缺陷型。因此，本文所述的免疫刺激性细菌菌株被减毒，因为其需要腺苷以生长，并且其优先定植于tme，tme如下所述具有大量的腺苷。
[0409]
嘌呤的生物合成途径涉及磷酸核糖酰氨基咪唑合成酶，这是一种由puri基因(与purm基因同义)编码的酶。因此，puri基因的破坏使细菌对嘌呤呈营养缺陷型。除了被减毒外，puri
‑
突变体在肿瘤环境中富集并具有显著的抗肿瘤活性(pawelek et al.(1997)cancer research 57:4537
‑
4544)。先前已经描述了由于其快速细胞转换，这种定植得自肿瘤间质液中存在的高浓度嘌呤。由于puri
‑
细菌无法合成嘌呤，因此需要外部来源的腺嘌呤，并据认为这将导致其在富含嘌呤的肿瘤微环境中生长受限(rosenberg et al.(2002)j.immunotherapy 25(3):218
‑
225)。虽然最初报道vnp20009菌株含有puri基因的缺失(low et al.(2003)methods in molecular medicine vol.90,suicide gene therapy：47
‑
59)，但随后对vnp20009的整个基因组的分析表明，puri基因没有缺失，但是由于染色体倒置而被破坏(broadway et al.(2014)journal of biotechnology 192:177
‑
178)。整个基因包含在侧翼是插入序列的vnp20009染色体的两个部分中(其中一个具有活性转座酶)。
[0410]
本文表明，puri突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株对于在肿瘤微环境高度富含的核苷腺苷呈营养缺陷型。因此，当使用vnp20009时，无需导入任何其它修饰即可实现腺苷营养缺陷。对于其它菌株和细菌，puri基因可以如在vnp20009中一样被破坏，或者可以包含puri基因的全部或部分缺失，以防止回复至野生型基因。
[0411]
iii.减毒突变的组合
[0412]
细菌免疫疗法期望的是通过染色体的不同区域上的基因缺失而具有多种遗传减毒的细菌，因为可以增加减毒，同时降低通过与野生型遗传物质的同源重组来获得基因回复至强毒表型的可能性。通过同源重组恢复毒力将需要在同一生物体内发生两个单独的重组事件。理想情况下，选择用于免疫治疗剂的减毒突变的组合在不降低效力的情况下增加耐受性，从而增加治疗指数。
[0413]
例如，如以下所讨论的，鼠伤寒沙门氏菌vnp20009菌株中msbb和puri基因的破坏已被用于肿瘤靶向和生长抑制，并在动物模型中引发了低毒性(clairmont et al.(2000)j.infect.dis.181:1996
‑
2002；bermudes et al.(2000)cancer gene therapy:past achievements and future challenges,edited by habib kluwer academic/plenum publishers,new york,pp.57
‑
63；low et al.(2003)methods in molecular medicine,vol.90,suicide gene therapy:47
‑
59；lee el al.(2000)international journal of toxicology 19:19
‑
25；rosenberg et al.(2002)j.immunotherapy 25(3):218
‑
225；broadway et al.(2014)j.biotechnology 192:177
‑
178；loeffler et al.(2007)proc.natl.acad.sci.u.s.a.104(31):12879
‑
12883；luo et al.(2002)oncology research 12:501
‑
508)。然而，vnp20009在人实验中没有表现出相同的肿瘤累积和抗肿瘤活性。因此，表现出任何抗肿瘤活性所需的更高剂量由于毒性是不可能的。本文提供的免疫刺激性细菌，其包含基因修饰的组合，例如降低毒力、增加耐受性、减少或消除细菌感染上皮(和其它非免疫)细胞、增加在肿瘤驻留免疫细胞中的累积和减少肿瘤驻留免疫细胞的细胞死亡，以及改善治疗指数的其它希望的性质，由此解决了这个问题。
[0414]
iv.vnp20009和其它减毒的鼠伤寒沙门菌菌株
[0415]
可以如本文所述进行修饰的治疗性细菌的示例是命名为vnp20009的菌株(atcc#202165，ys1646)。临床候选物vnp20009(atcc#202165，ys1646)通过缺失msbb和puri基因对于安全性至少减毒50,000倍(clairmont et al.(2000)j.infect.dis.181:1996
‑
2002；low et al.(2003)methods in molecular medicine,vol.90,suicide gene therapy 47
‑
59；lee et al.(2000)international journal of toxicology 19:19
‑
25)。还考虑了减毒的沙门氏菌属的类似菌株。如上所述，缺失msbb改变了脂多糖(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)的脂质a结构域的组成((low et al.(1999)nat.biotechnol.17(1):37
‑
41)。这防止脂多糖诱导的感染性休克，对细菌菌株减毒并降低全身毒性，同时减少潜在有害的tnfα产生(dinarello,c.a.(1997)chest 112(6suppl):321s
‑
329s；low et al.(1999)nat.biotechnol.17(1):37
‑
41)。puri基因的缺失使细菌对嘌呤呈营养缺陷型，这进一步使细菌减毒并使其在肿瘤微环境中富集(pawelek et al.(1997)cancer res.57:4537
‑
4544；broadway et al.(2014)j.biotechnology 192:177
‑
178)。
[0416]
vnp20009在肿瘤中的累积取决于各因素的组合，包括：atcc#14028的亲代菌株的固有侵入性、其在缺氧环境中复制的能力，以及对存在于肿瘤间质液中的高浓度嘌呤的需求。本文示出vnp20009也对核苷腺苷呈营养缺陷型，其可以在肿瘤微环境中累积至病理上的高水平并有助于免疫抑制性肿瘤微环境(peter vaupel and amulf mayer oxygen transport to tissue xxxvii,advances in experimental medicine and biology 876chapter 22,pp.177
‑
183)。将vnp20009施用给具有同基因或人异种移植肿瘤的小鼠时，细菌优先以超过300
‑
1000:1的比率在肿瘤的细胞外成分内累积，降低tnαf诱导，及证实与对照小鼠相比的肿瘤生长抑制以及延长的生存期(clairmont et al.(2000)j.infect.dis.181:1996
‑
2002)。然而，来自1期临床实验的结果表明虽然vnp20009相对安全且耐受良好，但在人黑素瘤肿瘤中观察到了不佳的累积，而且证实很小的抗肿瘤活性(toso et al.(2002)j.clin.oncol.20(1):142
‑
152)。由于与高水平的促炎细胞因子相关的毒性，影响任何抗肿瘤活性所需的较高剂量是不可能的。
[0417]
鼠伤寒沙门氏菌的其它菌株可以用于肿瘤靶向递送和疗法，例如亮氨酸
‑
精氨酸营养缺陷型a
‑
1(zhao et al.(2005)pnas 102(3):755
‑
760；yu et al.(2012)scientific reports 2:436；美国专利号8,822,194；美国专利公开号2014/0178341)及其衍生物ar
‑
l(yu et al.(2012)scientific reports 2:436；kawagushi et al.(2017)oncotarget 8(12):19065
‑
19073；zhao et al.(2006)cancer res.66(15):7647
‑
7652；zhao et al.(2012)cell cycle 11(1):187
‑
193；tome et al.(2013)anticancer research 33:97
‑
102；murakami et al.(2017)oncotarget 8(5):8035
‑
8042；liu et al.(2016)oncotarget 7(16):22873
‑
22882；binder et al.(2013)cancer immunol res.1(2):123
‑
133)；aroa
‑
突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株sl7207(guo et al.(2011)gene therapy 18:95
‑
105；美国专利公开号2012/0009153、2016/0369282和2016/0184456)及其专性厌氧菌衍生物yb1(wo 2015/032165；yu et al.(2012)scientific reports 2:436；leschner et al.(2009)plos one4(8):e6692；yu et al.(2012)scientific reports 2:436)；aroa
‑
/arod
‑
突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株brd509(一种sl1344(野生型)菌株的衍生物)(yoon et al.(2017)european j.of cancer 70:48
‑
61)；asd
‑
/cya
‑
/crp
‑
突变体鼠伤寒沙门氏菌菌株c4550(sorenson et al.(2010)biology:targets&therapy 4:61
‑
73)和phop
‑
/phoq
‑
鼠伤寒沙门氏菌菌株lh430(wo 2008/091375)。
[0418]
在涉及患有晚期黑素瘤的患者的研究中，菌株vnp20009未能显示出临床益处，但将治疗安全地施用于晚期癌症患者。确立最大耐受剂量(mtd)。因此，这种菌株以及其它类似工程化的细菌菌株，可用作靶向肿瘤的治疗性递送载具的起始材料。本文提供的修饰提供了通过增加治疗剂的抗肿瘤效力和/或安全性和耐受性以增加功效的策略。
[0419]
v.工程化以递送大分子的鼠伤寒沙门菌
[0420]
鼠伤寒沙门氏菌也已被修饰以将肿瘤相关抗原(taa)存活蛋白(svn)递送至apc以引发适应性免疫(美国专利公开号2014/0186401；xu et al.(2014)cancer res.74(21):6260
‑
6270)。svn是凋亡蛋白的抑制剂(iap)，其延长细胞存活并提供细胞周期控制，以及在所有实体瘤中均过表达，而在正常组织中表达较差。这项技术利用沙门氏菌属致病岛2(spi
‑
2)及其iii型分泌系统(t3ss)，将taa递送到apc的胞质中，该apc然后被激活以诱导taa特异性cd8
t细胞和抗肿瘤免疫(xu et al.(2014)cancer res.74(21):6260
‑
6270)。与基于李斯特菌属的taa疫苗类似，这种方法在小鼠模型中显示成功希望，但尚未在人中证实有效的肿瘤抗原特异性t细胞引发。
[0421]
除基因递送外，鼠伤寒沙门氏菌也已用于递送小干扰rna(sirna)和短发夹rna(shrna)，以用于癌症疗法。例如，减毒的鼠伤寒沙门氏菌已被修饰以表达某些shrna，例如靶向stat3和ido1的那些(国际专利申请公开号wo 2008/091375和美国专利号9,453,227)。用针对免疫抑制基因吲哚胺脱氧酶(ido)的shrna质粒转化的vnp20009在鼠黑素瘤模型中成功使ido表达沉默，导致肿瘤细胞死亡和中性粒细胞的显著肿瘤浸润(blache et al.(2012)cancer res.72(24):6447
‑
6456)。将这种载体与共施用的pegph2o(消耗细胞外透明质酸的酶)组合，示出在治疗胰腺导管腺癌肿瘤方面的积极结果(manuel et al.(2015)cancer immunol.res.3(9):1096
‑
1107；美国专利公开号2016/0184456)。在另一项研究中，发现因phop/phoq缺失而减毒及表达信号转导与转录活化因子3(stat3)
‑
特异性shrna的鼠伤寒沙门氏菌菌株抑制肿瘤生长及减少转移器官的数目，从而延长c57bl6小鼠的寿命
(zhang et al.(2007)cancer res.67(12):5859
‑
5864)。在另一实例中，鼠伤寒沙门氏菌菌株sl7207已用于递送靶向ctnnb1的shrna，所述ctnnb1是编码β
‑
连环蛋白的基因(guo et al.(2011)gene therapy18:95
‑
105；美国专利公开号2009/0123426、2016/0369282)，而鼠伤寒沙门氏菌菌株vnp20009已用于递送靶向stat3的shrna(manuel et al.(2011)cancer res.71(12):4183
‑
4191；美国专利公开号2009/0208534、2014/0186401、2016/0184456；国际专利申请公开号wo 2008/091375；wo 2012/149364)。已经使用鼠伤寒沙门氏菌菌株a1
‑
r和vnp20009将靶向自噬基因atg5和beclin1的sirna递送至肿瘤细胞(liu et al.(2016)oncotarget 7(16):22873
‑
22882)。需要改良这些菌株，使其更有效刺激免疫应答，及具有其它有利的性质，例如本文提供的免疫刺激性细菌。在国际pct申请公开号wo 2019/014398和美国专利公开号2019/0017050a1中描述了对各种细菌的进一步和另外的修饰。也如本文所述，可对每个这些出版物中描述的细菌如本文所述进行修饰，以进一步改良免疫刺激性和肿瘤靶向性质。
[0422]
可以如本文所述修饰细菌以具有降低的炎症作用，以及因此较低的毒性。结果，例如可以施用更高的剂量。沙门氏菌属的任何这些菌株以及本领域技术人员已知和/或上文和在此列出的其它细菌物种中的任何菌株均可如本文所述进行修饰，例如通过导入腺苷营养缺陷进行修饰。示例的是本文所述的鼠伤寒沙门氏菌菌种。
[0423]
本文提供的细菌菌株被工程化以递送治疗性分子/产物。本文的菌株递送免疫刺激性蛋白，包括可以组成型引发/诱导i型ifn表达的胞质dna/rna传感器的修饰的功能获得性变体，以在其它免疫刺激性蛋白，如细胞因子，其肿瘤微环境中促进抗肿瘤免疫应答。菌株还可以包含减少吞噬细胞的细胞焦亡的基因组修饰，从而提供更强大的免疫应答，和/或减少或消除感染/侵入上皮细胞的能力，但保留感染/侵入吞噬细胞的能力，因此其在肿瘤和肿瘤
‑
驻留免疫细胞中更有效地累积。所述细菌菌株编码治疗性产物。在肿瘤驻留免疫细胞中的累积使编码的治疗性产物被表达及分泌进肿瘤微环境中，提高治疗功效。
[0424]
4.增强免疫刺激性细菌以提高治疗指数和在肿瘤驻留免疫细胞中的表达
[0425]
本文提供了对免疫刺激性细菌降低毒性及改善抗肿瘤活性的增强。这种增强的示例如下。这种增强是针对沙门氏菌属、特别是鼠伤寒沙门氏菌描述的，应理解本领域技术人员可以在其它细菌物种和其它沙门氏菌属菌株中实现类似的增强。
[0426]
a.asd基因缺失
[0427]
细菌中的asd基因编码天冬氨酸
‑
半醛脱氢酶。鼠伤寒沙门氏菌的asd
‑
突变体对二氨基庚二酸(dap)具有专性要求，这是细胞壁合成所必需的，并将在dap剥夺的环境中裂解。当asd基因在质粒上反式互补时，这种dap营养缺陷可用于质粒选择和体内质粒稳定性的维持，而无需使用抗生素。基于无抗生素的质粒选择系统是有利的，以及其允许1)在不良症状的事件中施用的抗生素作为快速清除机制的用途，和2)在通常避免这种用途的情况下允许无抗生素的大规模生产。asd基因互补系统提供了这种选择(gal
á
n et al.(1990)gene 94(1):29
‑
35)。预期使用asd基因互补系统在肿瘤微环境中维持质粒，以增加经工程化以递送编码基因和治疗性产物/蛋白如sting蛋白及如本文所述其它免疫刺激性蛋白的质粒的鼠伤寒沙门氏菌的效力。
[0428]
鼠伤寒沙门氏菌的asd突变体的另一用途是利用dap营养缺陷产生自溶(或自杀)菌株，用于将大分子递送至感染的细胞，而无需持久地定植于宿主肿瘤的能力。当在体外或
体内生长时，asd基因的缺失使细菌对dap呈营养缺陷型。本文所述的实例(见实施例3)提供了一种asd缺失菌株，其对于dap呈营养缺陷型，且包含编码治疗性产物及不含asd互补基因的质粒，使得该菌株对于在体内复制是缺陷的。将这个菌株在dap存在下在体外繁殖并正常生长，并然后作为免疫治疗剂施用于不存在dap的哺乳动物宿主。自杀菌株可以侵入宿主细胞，但是由于在哺乳动物组织中不存在dap而不能复制，从而自动裂解并递送其胞质内容物(例如质粒或蛋白质)。
[0429]
在本文提供的实例中，vnp20009的asd基因缺失菌株被进一步修饰以表达缺少其内源周质分泌信号序列(cytollo)的llo蛋白，从而使其在沙门氏菌属的细胞质中累积。llo是来自单核细胞增生李斯特菌的胆固醇依赖性成孔溶血素，其介导细菌的噬菌体逃逸。当将自溶菌株导入荷瘤小鼠时，细菌被吞噬性免疫细胞摄取，并进入含沙门氏菌属的囊泡(scv)。在这种环境下，缺乏dap将阻止细菌复制，并导致scv中细菌的自溶。然后，自杀菌株的裂解将允许释放质粒和累积的llo，其将在含胆固醇的svc膜上形成孔，并允许将质粒递送到宿主细胞的胞质中。在此，在真核启动子控制下的质粒上编码的基因产物可以通过宿主细胞机制表达。
[0430]
b.腺苷营养缺陷型
[0431]
衍生自色氨酸和atp/腺苷途径的代谢产物是在肿瘤内形成免疫抑制环境的主要驱动力。以游离形式存在于细胞内部和外部的腺苷是免疫功能的效应子。腺苷降低t细胞受体诱导的nf
‑
κb的激活，并抑制il
‑
2、il
‑
4和ifn
‑
γ。腺苷降低t细胞的细胞毒性，增加t细胞的免疫失能，并增加t细胞分化为foxp3
或lag
‑3
调节性t细胞(t
‑
reg)。在nk细胞中，腺苷降低ifn
‑
γ产生，并抑制nk细胞的细胞毒性。腺苷阻断中性粒细胞的粘附和外渗，降低吞噬作用，以及降低超氧化物和一氧化氮的水平。腺苷还降低巨噬细胞上tnf
‑
α、il
‑
12和mip
‑
1α(ccl3)的表达，减弱ii类mhc的表达，以及增加il
‑
10和il
‑
6的水平。腺苷免疫调节活性在其释放到肿瘤的细胞外空间并激活靶免疫细胞、癌细胞或内皮细胞的表面上的腺苷受体(adr)后发生。肿瘤微环境中高腺苷水平导致局部免疫抑制，这限制了免疫系统消除癌细胞的能力。
[0432]
细胞外腺苷是由膜相关的胞外酶cd39和cd73的相继活性产生的，所述酶在肿瘤基质细胞上表达，通过由死亡细胞或垂死细胞产生的atp或adp的磷酸分解作用共同产生腺苷。cd39将细胞外atp(或adp)转化为5’amp，其由cd73转化为腺苷。内皮细胞上的cd39和cd73的表达在肿瘤微环境的缺氧条件下增加，从而增加腺苷水平。肿瘤缺氧可以由血液供应不足和肿瘤脉管系统紊乱造成，从而削弱氧气递送(carroll and ashcroft(2005)expert.rev.mol.med.7(6):1
‑
16)。发生在肿瘤微环境中的缺氧也抑制腺苷酸激酶(ak)，所述激酶可将腺苷转化为amp，从而导致非常高的细胞外腺苷浓度。缺氧肿瘤微环境中腺苷的细胞外浓度已测量为10
‑
100μm，这比约0.1μm的典型细胞外腺苷浓度高约100
‑
1000倍(vaupel et al.(2016)adv exp med biol.876:177
‑
183；antonioli et al.(2013)nat.rev.can.13:842
‑
857)。由于肿瘤中的缺氧区域远离微血管，因此腺苷在肿瘤某些区域的局部浓度可能高于其它区域。
[0433]
为了指导抑制免疫系统的效应，腺苷还可以通过对癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响来控制癌细胞的生长和扩散。例如，腺苷可以主要通过刺激a
2a
和a
2b
受体来促进血管生成。刺激内皮细胞上的受体可以调节细胞间粘附分子1(icam
‑
1)和e
‑
选择素在内皮细胞
forbes(2012)integr biol(camb)4(2):165
‑
176)，但当细菌通过静脉内施用时，鞭毛对于在动物内进行肿瘤定植是不需要的(stritzker el al.(2010)international journal of medical microbiology 300:449
‑
456)。每个鞭毛丝均由数以千计的鞭毛蛋白亚基组成。鼠伤寒沙门氏菌染色体包含两个基因，flic和fljb，其编码抗原独特的鞭毛蛋白单体。当通过口服感染途径施用时，flic和fljb均缺陷的突变体是非动性和无毒性的，但当在胃肠外施用时，则保持毒力。
[0439]
鞭毛蛋白是沙门氏菌属的主要促炎性决定因子(zeng et al.(2003)j immunol 171:3668
‑
3674)，并由细胞表面上的tlr5和胞质中的nlcr4直接识别(lightfield et al.(2008)nat.immunol.9(10):1171
‑
1178)。这两种途径均导致促炎应答，从而导致细胞因子包括il
‑
1β、il
‑
18、tnf
‑
α和il
‑
6的分泌。已经尝试通过将细菌工程化为分泌创伤弧菌(vibrio vulnificus)鞭毛蛋白b来增加对鞭毛蛋白的促炎反应，从而使基于沙门氏菌属的癌症免疫疗法更加有效力，所述创伤弧菌鞭毛蛋白b与flic和fljb编码的鞭毛蛋白相比，诱导更大的炎症(zheng et al.(2017)sci.transl.med.9(376):eaak9537)。
[0440]
提供了免疫刺激性细菌，如沙门氏菌种鼠伤寒沙门氏菌，将其工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基flic和fljb，以减少促炎信号传导。例如，如本文所示，将缺乏msbb的沙门氏菌属菌株(其导致减少的tnf
‑
α诱导)与flic和fljb敲除组合。所得沙门氏菌属菌株具有tnf
‑
α诱导降低和tlr5识别降低的组合。这些修饰msbb
‑
、flic
‑
和fljb
‑
可以与细菌质粒(任选地含有cpg)以及与cdna表达盒组合，以提供在真核启动子控制下的异源蛋白的表达，例如sting途径功能获得性蛋白变体、免疫刺激性细胞因子和/或抑制性rnai分子。由此产生的细菌具有减少的促炎信号传导和强大的抗肿瘤活性。
[0441]
鞭毛的消除赋予了额外的有利性质，从而增加了所述细菌的治疗指数。例如，如本文所示(见例如实施例6)，鞭毛的消除(即在沙门氏菌中，flic
‑
/fljb
‑
)，减少鼠巨噬细胞和人单核细胞中的细胞焦亡，导致无法感染上皮细胞，以及限制肿瘤驻留免疫/骨髓细胞对细菌的吸收。
[0442]
如下文和本文别处所述，鞭毛的缺失可与赋予改善细菌治疗指数的有利性质的一种或多种其它基因组修饰组合，包括例如asd
‑
、msbb
‑
、puri
‑
、pagp
‑
、csgd
‑
、adra
‑
和/或本文所述的其它修饰。可以用编码增加对象抗肿瘤免疫应答的治疗性产物的质粒转化这种修饰的细菌，所述治疗性产物包括例如胞质dna/rna传感器及其功能获得性突变体，以及免疫刺激性蛋白例如细胞因子。
[0443]
例如，如本文提供的，在鼠伤寒沙门氏菌vnp20009的asd缺失菌株中构建flic
‑
和fljb
‑
双突变体。还将通过破坏puri/purm而毒力减弱的vnp20009进行工程化，以包含msbb缺失，导致产生比野生型脂质a产毒低的lps脂质a亚基。与具有野生型脂质a的菌株相比，这样导致在静脉内施用后在小鼠模型中降低tnf
‑
α产生。同样，在含有asd、puri/purm和msbb缺失的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株上构建flic
‑
和fljb
‑
双突变体。所得菌株是通过修饰脂质a以减少tlr2/4信号传导以及缺失鞭毛蛋白亚基以降低tlr5识别和炎性小体诱导以使细菌炎性减弱的示例菌株。鞭毛蛋白亚基的缺失组合lps的修饰允许宿主中更高的耐受性，并指导针对产生免疫刺激性蛋白和/或针对tme中希望的靶位递送rna干扰的免疫刺激应答，这引发抗肿瘤应答及促进对肿瘤的适应性免疫应答。
[0444]
d.lps生物合成途径中基因缺失
[0445]
革兰氏阴性细菌的脂多糖(lps)是细菌膜外叶的主要成分。其由三个主要部分组成：脂质a、非重复核心寡糖和o抗原(或o多糖)。o抗原是lps的最外部分，并作为防止细菌渗透的保护层，但是o抗原的糖组分在菌株之间差异很大。脂质a和核心寡糖变化较小，以及更通常在相同物种的菌株中是保守型的。脂质a是lps的包含内毒素活性的部分。其通常是以多种脂肪酸装饰的二糖。这些疏水性脂肪酸链将lps锚定在细菌膜中，以及其余lps从细胞表面突出。
[0446]
脂质a结构域是革兰氏阴性细菌大部分毒性的原因。通常，血液中的lps被认为是重要的病原体相关分子模式(pamp)，以及诱导极大的促炎应答。lps是包含cd14、md2和tlr4的膜结合受体复合物的配体。tlr4是一种跨膜蛋白，其可以通过myd88和trif途径发出信号，以刺激nf
‑
κb途径及导致促炎细胞因子如tnf
‑
α和il
‑
1β的产生，其结果可能是可以致命的内毒素性休克。哺乳动物细胞的胞质中的lps可以直接与胱天蛋白酶4、5和11的card结构域结合，导致自体激活和焦亡性细胞死亡(hagar et al.(2015)cell research 25:149
‑
150)。
[0447]
脂质a的组成和脂质a变体的产毒性是有据可查的。例如，与具有多个磷酸基团的脂质a相比，单磷酸化脂质a的炎性要低得多。脂质a上酰基链的数量和长度也会对毒性程度产生极大影响。来自大肠杆菌的规范脂质a有六个酰基链，并且这种六酰基化具有很强的毒性。鼠伤寒沙门氏菌脂质a与大肠杆菌的相似；其是一种葡糖胺二糖，带有四个一级和两个二级羟基酰基链(raetz and whitfield(2002)annu.rev.biochem.71:635
‑
700)。如上所述，鼠伤寒沙门氏菌的msbb
‑
突变体不能进行lps的末端肉豆蔻酰化，并主要产生五酰化脂质a，其毒性明显低于六酰化脂质a。用棕榈酸酯修饰脂质a是通过棕榈酰转移酶(pagp)催化。pagp基因的转录受phop/phoq系统的控制，该系统由低浓度镁(例如在scv内)激活。因此，鼠伤寒沙门氏菌的酰基含量是可变的，以及对于野生型细菌，其可以被六或五酰化。鼠伤寒沙门氏菌将其脂质a棕榈酸化的能力增加了对分泌到吞噬溶酶体中的抗菌肽的抗性。
[0448]
在野生型鼠伤寒沙门氏菌中，pagp的表达产生七酰化的脂质a。在msbb
‑
突变体中(其中不能加入脂质a的末端酰基链)，pagp的诱导产生六酰化的lps(kong et al.(2011)infection and immunity 79(12):5027
‑
5038)。六酰化的lps已被证实是最具促炎性的。虽然其它基团已试图利用这种促炎信号，例如通过缺失pagp以仅允许产生六酰化的lps(felgner et al.(2016)gut microbes 7(2):171
‑
177；felgner et al.(2018)oncoimmunology 7(2):e1382791)，但由于tnf
‑
α介导的lps的促炎性质和反常较低的适应性免疫，这可能导致较差的耐受性(kocijancic et al.(2017)oncotarget 8(30):49988
‑
50001)。
[0449]
lps是强力的tlr
‑
4激动剂，诱导tnf
‑
α和il
‑
6。在静脉内注射vnp20009的临床实验中(toso et al.(2002)j.clin.oncol.20(1):142
‑
152)，以1e9 cfu/m2的剂量限制毒性是细胞因子介导的(发热，低血压)，在2小时时血清中tnf
‑
α水平>100,000pg/ml以及il
‑
6水平>10,000pg/ml。尽管vnp20009中的msbb缺失以及其降低的产热原性，但可能是由于六酰化lps的存在，lps在高剂量下仍可能有毒性。因此，pagp
‑
/msbb
‑
菌株在较高剂量下耐受性更好，因为其不能产生六酰化的lps，并将允许在人中以1e9 cfu/m2或更高给药。更高剂量可以导致肿瘤定植增加，从而增强免疫刺激性细菌的治疗功效。
[0450]
在本文中，沙门氏菌细菌、例如鼠伤寒沙门氏菌被工程化为缺乏鞭毛蛋白亚基
flic和fljb，以降低促炎信号传导。例如，如本文所示，将导致tnf
‑
α诱导降低的缺乏msbb的沙门氏菌菌株与flic和fljb敲除组合。这样获得组合了降低的tnf
‑
α诱导和降低的tlr5识别的沙门氏菌菌株。这些修饰可以与本文讨论的pagp
‑
及其它基因组修饰组合，以及将所得细菌可以用免疫刺激质粒(编码免疫刺激性蛋白)(任选地包含cpg)转化。由此产生的细菌具有降低的促炎信号传导，但具有强大的抗肿瘤活性。
[0451]
本文示例的是活的减毒沙门氏菌菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌的示例菌株，其仅能产生五酰化lps，含有msbb基因的缺失(防止脂质a的末端肉豆蔻酰化，如上所述)，及通过缺失pagp(防止棕榈酰化)进一步修饰。经修饰以产生五酰化lps的菌株将允许较低水平的促炎细胞因子，改善血液中的稳定性和对补体固定的抗性，增加对抗微生物肽的敏感性，增强耐受性，以及在进一步修饰以表达治疗性产物时增加抗肿瘤免疫性，所述治疗性产物例如是异源免疫刺激性蛋白和/或针对例如免疫检查点的干扰rna。
[0452]
如本文提供的，例如pagp
‑
突变体也可以在鼠伤寒沙门氏菌vnp20009的asd、msbb、puri/purm和flic/fljb缺失菌株或本文所述的其它菌株或野生型鼠伤寒沙门氏菌上构建。所得菌株是通过修饰脂质a以减少tlr2/4信号传导、缺失鞭毛蛋白亚基以减少tlr5识别和炎性小体诱导以及缺失pagp以产生五酰化lps而减轻细菌炎性的示例菌株。鞭毛蛋白亚基的缺失组合lps的修饰，允许更高的宿主中的耐受性，以及更高的血液中的稳定性和对补体固定的抗性，改善向肿瘤部位的运输，以指导产生任何基因产物的免疫刺激应答，例如产生免疫刺激性蛋白，和/或递送针对the中希望靶标的rna干扰，以引发抗肿瘤应答及促进对肿瘤的适应性免疫应答。
[0453]
e.生物被膜(biofilm)形成所需的基因的缺失
[0454]
细菌和真菌能够形成称为生物被膜的多细胞结构。细菌生物被膜被包裹在统称为细胞外聚合物质的分泌的和细胞壁相关的多糖、糖蛋白和糖脂以及细胞外dna的混合物中。这些细胞外聚合物质保护细菌免受多种伤害，如清洁剂、抗生素和抗微生物肽。细菌生物被膜允许表面定植，并且是大量假体(例如注射口和导管)感染的原因。生物被膜还可以在感染过程中在组织中形成，这导致细菌持久性和脱落持续时间增加，并限制了抗生素疗法的有效性。生物被膜中细菌的长期持续存在与增加的肿瘤发生有关，例如在胆囊的伤寒沙门氏菌(s.typhi)感染中(di domenico et al.(2017)int.j mol.sci.18:1887)。
[0455]
鼠伤寒沙门氏菌生物膜形成受csgd调控。csgd激活csgbac操纵子，这导致curli菌毛亚基csga和csgb的产生增加(zakikhani et al.(2010)molecular microbiology 77(3):77l
‑
786)。csga被tlr2识别为pamp，并诱导人巨噬细胞产生il
‑
8(tukel et al.(2005)molecular microbiology 58(1):289
‑
304)。此外，csgd通过激活编码二鸟苷酸环化酶的adra基因间接增加纤维素产生。由adra产生的小分子环二鸟苷单磷酸(c
‑
di
‑
gmp)是在几乎所有细菌菌种中都普遍存在的第二信使。adra介导的c
‑
di
‑
gmp增加增强纤维素合成酶基因bcsa的表达，其进而通过刺激bcsabzc和bcsefg操纵子来增加纤维素产生。免疫刺激性细菌如鼠伤寒沙门氏菌形成生物膜的能力降低可通过缺失参与生物被膜形成的基因来实现，例如csgd、csga、csgb、adra、bcsa、bcsb、bcsz、bcse、bcsf、bcsg、dsba或dsbb(anwar el al.(2014)plos one 9(8):e106095)。
[0456]
鼠伤寒沙门氏菌可在实体瘤中形成生物被膜，以防止宿主免疫细胞吞噬。不能形成生物被膜的沙门氏菌属突变体可以更快地被宿主吞噬细胞摄取，并从感染的肿瘤中清除
(crull et al.(2011)cellular microbiology 13(8):1223
‑
1233)。吞噬细胞内细胞内定位的这种增加可减少细胞外细菌的持久性，并增强质粒递送和编码的治疗性产物表达和释放进tme以及通过rna干扰敲低基因的有效性，如本文所述。被工程化以减少生物被膜形成的免疫刺激性细菌将增加从肿瘤/组织的清除率，并因此增加了对治疗的耐受性，并将防止患者中假体的定植，从而增加了这些菌株的治疗益处。腺苷模拟物可以抑制鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成，表明肿瘤微环境中高腺苷浓度可以促进肿瘤相关生物被膜形成(koopman et al.(2015)antimicrob agents chemother 59:76
‑
84)。如本文所提供的，活的减毒细菌菌株如鼠伤寒沙门氏菌，其包含puri破坏(及因此定植于富含腺苷的肿瘤)，并还通过缺失生物被膜形成所需的一个或多个基因而被阻止形成生物被膜，所述菌株被工程化以递送编码治疗性产物和干扰rna的质粒以刺激强烈的抗肿瘤免疫应答，所述治疗性产物如胞质dna/rna传感器及其功能获得性变体以及其它免疫刺激性蛋白如细胞因子。
[0457]
adra基因编码产生c
‑
di
‑
gmp的二鸟苷酸环化酶，其是鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成所需的。c
‑
di
‑
gmp与宿主胞质蛋白sting结合并且是宿主胞质蛋白sting的激动剂。通过缺失adra以减少c
‑
di
‑
gmp产生的免疫刺激细菌是违反直觉的，但细菌突变体如鼠伤寒沙门氏菌突变体，无法形成生物被膜(包括adra突变体)，在小鼠肿瘤模型中已证实降低的治疗潜力(crull et al.(2011)cellular microbiology 13(8):1223
‑
1233)。sting的一些人等位基因难以结合细菌产生的3'3'cdn(corrales et al.(2015)cell reports 11:1018
‑
1030)
[0458]
如本文所述，细菌菌株如鼠伤寒沙门氏菌被工程化为腺苷营养缺陷型，并且通过lps的修饰和/或鞭毛蛋白的缺失和/或生物膜形成所需基因的缺失而降低其诱导促炎细胞因子的能力，对所述菌株进一步修饰以递送干扰rna，及其它治疗性抗癌产物，如免疫刺激性蛋白，包括胞质dna/rna传感器及其功能获得性变体(例如sting等)和细胞因子，以促进强力的抗肿瘤免疫应答。
[0459]
f.工程化以逃避含沙门氏菌的囊泡(scv)的沙门氏菌
[0460]
沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门氏菌，是细胞内病原体，其主要在称为含沙门氏菌属的囊泡(scv)的膜结合区室中复制。在某些上皮细胞系中，鼠伤寒沙门氏菌示出以较低频率逃逸到胞质中，在那里其可以复制。由于scv的脂质双层是潜在的屏障，因此被工程化为以更高效率逃逸scv的沙门氏菌属在递送大分子如质粒方面更有效。质粒释放到宿主胞质中允许在质粒上编码的治疗性产物表达，所述治疗性产物受宿主识别的调节信号例如真核启动子的控制，从而提高了治疗性产物的产生和递送至tme的效率，特别是当细菌被肿瘤驻留免疫细胞吞噬时，以及提高了所述细菌的治疗指数。
[0461]
本文提供了具有增强的scv逃逸频率的沙门氏菌菌株和方法。如下文和本文别处所讨论的，这是通过缺失沙门氏菌诱导丝体(sif)形成所需的基因来实现的。这些突变体的scv逃逸频率增加，以及可以在宿主细胞的胞质中复制。例如，已经证实使用鼠伤寒沙门氏菌的sifa突变体的增强的质粒递送。sifa基因编码spi
‑
2t3ss
‑
2分泌的效应蛋白，该效应蛋白模拟或激活宿主gtp酶的rhoa家族(ohlson el al.(2008)cell host&microbe 4:434
‑
446)。可以靶向编码参与sif形成的分泌效应物的其它基因。这些基因包括例如ssej、ssel、sopd2、pipb2、ssef、sseg、spvb和stea。通过防止sif形成来增强鼠伤寒沙门氏菌的逃逸将活细菌释放到胞质中，在那里其可以复制。
[0462]
增强鼠伤寒沙门氏菌从scv中逃逸并增加大分子如质粒的递送的另一种方法是异源溶血素的表达，其导致scv膜中的孔形成或者scv膜破裂。一种这样的溶血素是来自单核细胞增生李斯特菌的listeriolysin o蛋白(llo)，其由hlya基因编码。llo是一种胆固醇依赖性成孔溶细胞素，其由单核细胞增生李斯特菌属分泌，并且主要负责吞噬体逃逸和进入宿主细胞的胞质。从鼠伤寒沙门氏菌分泌llo可导致细菌逃逸及导致在胞质中复制。为了防止完整的鼠伤寒沙门氏菌逃逸scv及在胞质中复制，可以从基因中除去编码分泌信号序列的核苷酸，产生cytollo。以这种方式，活性llo包含在鼠伤寒沙门氏菌的细胞质内，并且llo仅在细菌进行裂解时释放(例如由于asd
‑
菌株中缺乏细胞内dap所致)。scv中的细菌裂解允许质粒和累积的cytollo释放，这将在scv中形成孔，允许将质粒递送到宿主胞质中，在那里可以表达编码的治疗性产物。
[0463]
如本文所提供，沙门氏菌菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌菌株vnp20009，被工程化为表达cytollo以增强表达治疗性产物例如sting蛋白及其变体和其它免疫刺激性蛋白的质粒的递送，可以增加免疫刺激性细菌的治疗效力。有利的是细菌被工程化为在肿瘤驻留免疫细胞中累积，由此表达的治疗产物被直接释放到肿瘤微环境中。
[0464]
g.缺失spi
‑
1和spi
‑
2基因和/或其它基因以消除细菌感染上皮细胞的能力，包括鞭毛的缺失
[0465]
如上所述，在某些细菌物种中，包括沙门氏菌物种例如鼠伤寒沙门氏菌中，发病机制涉及称为沙门氏菌致病岛(salmonella pathogenicity islands，spi)的基因簇。鼠伤寒沙门氏菌是一种细胞内病原体，可被骨髓细胞如巨噬细胞迅速吸收，或者其可以在非吞噬细胞如上皮细胞中诱导自身吸收。一旦进入细胞内，其可以在含有囊泡的沙门氏菌(scv)内复制，并且也可以逃逸到一些上皮细胞的胞质中。两个最具特征的致病岛是spi
‑
1，其造成介导细菌侵入非吞噬细胞如上皮细胞，以及spi
‑
2，其是scv内复制所必需的(agbor and mccormick(2011)cell microbiol.13(12):1858
‑
1869)。spi
‑
1和spi
‑
2编码称为三型分泌系统(t3ss)的大分子结构，其可以跨宿主膜转运效应蛋白(galan and wolf
‑
watz(2006)nature 444:567
‑
573)。
[0466]
i.沙门氏菌致病岛1(spi
‑
1)
[0467]
spi
‑1‑
依赖性宿主细胞侵入
[0468]
侵入相关的沙门氏菌致病岛1(spi
‑
1)，包括3型分泌系统(t3ss)，造成效应蛋白转位到宿主细胞的胞质中，引起肌动蛋白重排，导致沙门氏菌的摄取。沙门氏菌利用spi
‑
1编码的三型分泌系统(t3ss)侵入非吞噬性肠上皮细胞，形成针状结构，将效应蛋白直接注入宿主细胞的胞质中。这些效应蛋白导致真核细胞细胞骨架的重排以促进侵入肠上皮，并且还诱导促炎细胞因子。spi
‑
1基因座包括39个基因，其编码这个侵入系统的成分(见例如kimbrough et al.(2002)microbes infect.4(1):75
‑
82)。spi
‑
1基因包含许多操纵子，包括：sitabcd，sprb，avra，hilc，orgabc，prgkjih，hild，hila，iagb，sptp，sicc，iacp，sipadcb，sica，spaopqrs，invfgeabcij和invh。所述操纵子和基因及其功能在例如kimbrough et al.((2002)microbes infect.4(1):75
‑
82)中描述和描绘。spi
‑
1基因包括但不限于：avra，hila，hild，inva，invb，invc，inve，invf，invg，invh，invi，iacp，iagb，spao，spap，spaq，spar，spas，orga，orgb，orgc，prgh，prgi，prgj，prgk，sica，sicp，sipa，sipb，sipc，sipd，sirc，sopb，sopd，sope，sope2，sprb和sptp。
[0469]
t3ss是一种复合物，通过以atp依赖性方式将细菌蛋白质效应子直接注入宿主细胞中，在革兰氏阴性菌的感染性中起重要作用。t3ss复合物穿过细菌内外膜并在与宿主细胞接触时在真核细胞膜上产生形成一个孔。其由输出装置、针样复合物和针尖的转位子组成(见例如kimbrough et al.(2002)microbes infect.4(1):75
‑
82)。所述针样复合物包括针状蛋白prgi，这是将复合物锚定在细菌膜中的基体，以及由蛋白质prgh、prgk和invg以及其它蛋白质包括invh、prgj(杆状蛋白)和invj组成。在宿主细胞中形成孔的转位子是蛋白质sipb、sipc和sipd的复合物。允许效应蛋白转位的输出装置包含蛋白质spap、spaq、spar、spas、inva、invc和orgb。建立蛋白质分泌特定顺序的细胞质分选平台由蛋白质spao、orga和orgb组成(见例如manon et al.(2012),salmonella,chapter 17,eds.annous and gurtler,rijeka,pp.339
‑
364)。
[0470]
通过t3ss
‑
1(spi
‑
1的t3ss)转位到宿主细胞内的效应子包括sipa、sipc、sopb、sopd、sope、sope2和sptp，其对于细胞侵入至关重要。例如，鼠伤寒沙门氏菌sipa突变体表现出降低60
‑
80％的侵入，sipc缺失导致降低95％的侵入，以及sopb缺失导致降低50％的侵入(见例如manon et al.(2012),salmonella,chapter 17,eds.annous and gurtler,rijeka,pp.339
‑
364)。其它效应子包括控制沙门氏菌诱导的炎症的avra。结合分泌的蛋白并将其维持在能分泌的构象中的分子伴侣包括sica、invb和sicp。转录调节因子包括hila、hild、invf、sirc和sprb。未分类的t3ss spi
‑
1蛋白在iii型分泌中具有多种功能，包括orgc、inve、invi、iacp和iagb(见例如kimbrough et al.(2002)microbes infect.4(1):75
‑
82)。
[0471]
spi
‑
1t3ss对于穿过肠道上皮层是必不可少的，但当细菌经肠胃外注射时，其对于感染是可有可无的。某些蛋白质(如prgi和prgj)和针状复合物本身的注射也可以诱导炎性小体激活和吞噬细胞的焦亡。这种促炎细胞死亡可以通过直接诱导抗原呈递细胞(apc)的死亡以及修饰细胞因子环境来阻止记忆性t细胞的产生，从而限制强大的适应性免疫应答的启动。因此，通过失活或敲除参与spi
‑
1的一个或多个基因而失活spi
‑
1依赖性侵入，消除了细菌感染上皮细胞的能力，但不影响其感染或侵入吞噬细胞(包括吞噬性免疫细胞如肿瘤相关骨髓细胞)的能力。这些spi
‑
1基因包括但不限于如下基因：avra，hila，hild，inva，invb，invc，inve，invf，invg，invh，invi，invj，iacp，iagb，spao，spap，spaq，spar，spas，orga，orgb，orgc，prgh，prgi，prgj，prgk，sica，sicp，sipa，sipb，sipc，sipd，sirc，sopb，sopd，sope，sope2，sprb和sptp。
[0472]
spi
‑1‑
非依赖性宿主细胞侵入
[0473]
缺乏t3ss
‑
1的沙门氏菌属突变体已显示出通过t3ss
‑
1非依赖性侵入机制侵入许多细胞系/类型，涉及多种蛋白质，包括侵入素rck、pagn和hlye。rck操纵子包含6个开放阅读框：pefi、srgd、srga、srgb、rck和srgc。pefi编码pef操纵子的转录调节因子，其参与pef菌毛的生物合成。这些菌毛参与生物被膜形成、与鼠小肠的粘附以及幼鼠内体液累积。srga氧化pefa的二硫键，pef菌毛的主要结构亚基。srgd编码推定的转录调节因子；srgd与pefi一起工作诱导鞭毛基因表达的协同负调节。srgb编码推定的外膜蛋白，以及srgc编码推定的转录调节因子(见如manon et al.(2012),salmonella,chapter 17,eds.annous and gurtler,rijeka,pp.339
‑
364)。
[0474]
rck是由肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌的大毒力质粒编码的
l7kda外膜蛋白，其诱导与上皮细胞的粘附和上皮细胞的侵入，并通过防止膜攻击复合物的形成，赋予对补体中和的高水平的抗性。与野生型菌株相比，rck突变体表现出在上皮细胞侵入中降低2
‑
3倍，而rck过表达导致侵入增加。rck通过受体介导的过程诱导细胞进入，促进局部肌动蛋白重塑以及薄弱且紧密粘附的膜扩展。因此，沙门氏菌属可以通过两种不同的机制进入细胞：由t3ss
‑
1复合物介导的触发机制和由rck诱导的拉链机制(manon et al.(2012),salmonella,chapter 17,eds.annous and gurtler,rijeka,pp.339
‑
364)。
[0475]
侵入素pagn是一种外膜蛋白，已显示出其在沙门氏菌属侵入中起作用。pagn表达受phop调节。通过phoq感测特定刺激，例如酸化的巨噬细胞吞噬体环境或低mg
2
浓度，然后激活phop以调节特定基因。已经表明，鼠伤寒沙门氏菌中pagn的缺失导致肠细胞侵入减少3倍，而不改变细胞粘附。尽管还没有完全了解pagn介导的进入机制，但已经表明肌动蛋白聚合是侵入所需的。研究表明，pagn是balb/c小鼠中沙门氏菌属存活所需的，并且pagn突变体相比于亲本菌株对于定植于小鼠的脾脏不太有竞争性。因为pagn被phop激活，所以其主要在细胞内表达，其中编码t3ss
‑
1的spi
‑
1岛被下调。因此，离开上皮细胞或巨噬细胞的细菌可能具有最佳的pagn表达水平，但具有较低的t3ss
‑
1表达，这可以介导与宿主细胞破坏后遇到的其它细胞的后续相互作用，表明pagn在沙门氏菌属发病机理中的作用(manon et al.(2012),salmonella,chapter 17,eds.annous and gurtler,rijeka,pp.339
‑
364)。
[0476]
hlye与大肠杆菌hlye(clya)溶血素具有90％以上的序列相同性。当通过外膜囊泡释放从细菌细胞输出时，hlye蛋白裂解上皮细胞，并参与上皮细胞侵入。hlye也参与全身性沙门氏菌属感染的建立(manon et al.(2012),salmonella,chapter 17,eds.annous and gurtler,rijeka,pp.339
‑
364)。
[0477]
因此，消除细菌感染上皮细胞的能力也可以通过将本文的免疫刺激性细菌工程化为包含敲除或缺失/破坏编码参与spi
‑
1非依赖性侵入的蛋白质的基因而实现，例如基因rck、pagn、hlye、pefi、srgd、srga、srgb和srgc中的一种或多种。
[0478]
本文提供的免疫刺激细菌包括具有hila基因和/或t3ss途径中的其它基因的缺失或破坏的那些细菌。当施用这些细菌时，例如通过静脉内或肿瘤内施用，感染集中在吞噬细胞，例如巨噬细胞和树突细胞，其不需要spi
‑
1t3ss以进行吸收。这增强了本文提供的免疫刺激细菌的安全性。其可以防止脱靶细胞侵入及防止粪口传播。除了减少非吞噬细胞例如上皮细胞对沙门氏菌的摄取外，这个途径中基因的缺失或破坏还通过阻止巨噬细胞中的炎性小体激活和细胞焦亡来延长吞噬细胞的寿命，因此与在这个途径中不包含缺失的细菌相比，诱导人巨噬细胞中较少的细胞死亡。例如，缺失spi
‑
1途径中的基因(例如针状蛋白和杆状蛋白)可通过阻止炎性小体激活而阻止止细胞焦亡，但保持tlr5信号传导。这转而又允许延长编码蛋白的分泌，例如由本文提供的免疫刺激性细菌编码的sting蛋白或其它治疗性/抗癌产物，以及允许巨噬细胞运输至肿瘤，从而改良所述免疫刺激细菌的功效。
[0479]
如本文所述，提供了经修饰的免疫刺激性细菌，使其不感染上皮细胞，但保留感染吞噬细胞包括肿瘤驻留免疫细胞的能力，从而有效将所述免疫刺激性细菌和编码的治疗性产物靶向肿瘤微环境。这是通过缺失或敲除spi
‑
1中的任何蛋白质来实现的，包括但不限于缺失以下的一个或多个：avra，hila，hild，inva，invb，invc，inve，invf，invg，invh，invi，invj，iacp，iagb，spao，spap，spaq，spar，spas，orga，orgb，orgc，prgh，prgi，prgj，prgk，sica，sicp，sipa，sipb，sipc，sipd，sirc，sopb，sopd，sope，sope2，sprb和sptp，以及rck，
pagn，hlye，pefi，srgd，srga，srgb和srgc的一或多个。
[0480]
不感染上皮细胞的免疫刺激性细菌可以如本文所述进一步修饰，以编码刺激免疫系统的治疗性产物包括例如诱导i型干扰素的产物(例如胞质dna/rna传感器及其gof变体)，以及编码免疫刺激性蛋白如细胞因子。所述细菌通常具有asd缺失，使其无法在哺乳动物宿主中复制。例如，提供了修饰的鼠伤寒沙门氏菌菌株，其通过缺失一个或多个spi
‑
1基因被修饰，以及通过puri缺失、msbb缺失和asd缺失的一个或多个而修饰，以及通过递送编码治疗性产物的质粒而进一步修饰，所述治疗性产物例如是刺激免疫系统的蛋白质，例如胞质dna/rna传感器及其功能获得性突变体，其诱导i型干扰素，和/或免疫刺激性细胞因子。
[0481]
例如，提供了缺失表达spi
‑
1相关3型分泌系统(t3ss
‑
1)所需的调节基因(如hila或invf)，t3ss
‑
1结构基因(如invg或prgh)和/或t3ss
‑
1效应基因(例如sipa或avra)的细菌。如上所述，这个分泌系统负责将效应蛋白注入非吞噬宿主细胞例如上皮细胞的胞质中，从而引起细菌的摄取；缺失这些基因的一个或多个可消除上皮细胞的感染/侵入。缺失一个或多个基因如hila，提供了可以静脉内或瘤内施用的免疫刺激性细菌，导致吞噬细胞的感染，其不需要spi
‑
1t3ss以摄取，以及延长了这些吞噬细胞的寿命。所述hila突变还减少了促炎细胞因子的数量，提高了疗法的耐受性，以及适应性免疫应答的质量。
[0482]
额外地或可选地，所述免疫刺激性细菌可以在基因中包含敲除或缺失以失活参与spi
‑
1非依赖性感染/侵入的产物，例如基因pagn、hlye、pefi、srgd、srga、srgb和srgc的一个或多个，降低或消除细菌感染上皮细胞的能力。
[0483]
如本文所述，参与spi
‑
1途径的基因和细菌鞭毛激活吞噬细胞(免疫细胞)中的炎性小体，引发细胞焦亡。敲除或破坏spi
‑
1基因和编码鞭毛的基因，减少或消除细胞焦亡，及消除上皮细胞的感染，导致吞噬细胞的感染增加。因此，免疫刺激性细菌可以包含敲除或缺失以使诱导肿瘤驻留免疫细胞细胞死亡的基因产物失活，例如编码由炎性小体直接识别的蛋白质的基因；这些包括fljb、flic、prgi和prgj。如本文所示(见例如实施例6)，鞭毛的消除(即在沙门氏菌中的flic
‑
/fljb
‑
)可减少鼠巨噬细胞和人单核细胞中的细胞焦亡，导致不能感染上皮细胞，及限制肿瘤驻留免疫/骨髓细胞对细菌的吸收。
[0484]
因此，提供了在吞噬细胞特别是肿瘤驻留免疫细胞中累积的免疫刺激性细菌，在之中其表达由真核调节信号例如rna聚合酶ii控制的质粒编码的产物。产物包括例如通过增加i型干扰素表达的途径而引起免疫应答的那些，其增加肿瘤微环境中的宿主免疫应答。免疫刺激性细菌还可以编码其它产物，包括免疫刺激性蛋白如il
‑
2，进一步增强肿瘤微环境中的免疫应答。
[0485]
ii.沙门氏菌致病岛2(spi
‑
2)
[0486]
沙门氏菌还有沙门氏菌致病岛2(spi
‑
2)，编码另一种t3ss，在细菌进入宿主细胞后被激活，以及干扰吞噬体成熟，导致特定的含沙门氏菌的液泡(scv)形成，沙门氏菌在细胞内存活和复制期间驻留其中。spi
‑
2t3ss效应子包括sseb、ssec、ssed和spic，其负责在细胞内细菌周围组装f
‑
肌动蛋白外壳；这种肌动蛋白外壳促进scv与含肌动蛋白或肌动蛋白驱动的囊泡融合，以及防止其与不利的区室融合。sifa负责沙门氏菌诱导的丝体(sif)的形成，其是连接受感染细胞中各个scv的小管。sifa对于维持scv的完整性是必要的，以及sifa突变体被释放到宿主细胞的胞质中。ssef和sseg是spi
‑
2t3ss的组分，其参与scv定位和细
胞运输过程，将细菌存活和复制所需的材料导向scv。ssef和sseg也参与sif的形成。其它spi
‑
2t3ss效应子包括pipb2、sopd2和ssej，其参与sif和scv的形成以及液泡完整性的维持；spvc、ssel和ssph1参与宿主免疫信号传导；stec、ssph2、srfh/ssei和spvb参与scv f
‑
肌动蛋白网络的形成、受感染吞噬细胞的迁移、抑制肌动蛋白聚合以及受感染细胞的p
‑
体分解(coburn et al.(2007)clinical microbiology reviews 20(4):535
‑
549；figueira and holden(2012)microbiology 158:1147
‑
1161)。
[0487]
本文的免疫刺激性细菌可包括影响scv和相关结构例如sif的形成或完整性的任何spi
‑
2t3ss基因中的缺失或修饰。这些突变体的scv逃逸频率增加，以及可以在胞质中复制。例如，免疫刺激性细菌如沙门氏菌菌种，被工程化为逃避scv，其在将大分子如质粒递送至宿主胞质方面更有效，因为scv的脂质双层是潜在的屏障。通过阻止sif形成来增强细菌从scv的逃逸将活细菌释放到胞质中，在此其可以在宿主细胞机制的控制下(即在真核调控元件的控制下，如真核启动子)复制和表达编码的治疗性产物或蛋白质。这增强了细菌的治疗功效，且是通过缺失或突变沙门氏菌诱导的丝体(sif)形成所需的基因来实现的，所述基因包括例如sifa、ssej、ssel、sopd2、pipb2、ssef、sseg、spvb和stea。
[0488]
可以逃避scv的免疫刺激性细菌可以如本文所述进一步修饰，以编码刺激免疫系统的产物，包括例如诱导i型干扰素的产物，以及编码细胞因子。所述细菌通常具有asd缺失，使其无法在哺乳动物宿主中复制。
[0489]
h.增加质粒递送的核酸内切酶(enda)突变
[0490]
enda基因(例如seq id no:250)编码核酸内切酶(例如seq id no:251)，其介导革兰氏阴性菌周质中双链dna(dsdna)的降解。实验室大肠杆菌最常见的菌株是enda
‑
，是提高质粒dna的产量而在enda基因中的突变。这个基因在物种之间是保守型的。为了促进完整的质粒dna递送，缺失或突变所述工程化免疫刺激性细菌的enda基因以阻止其核酸内切酶活性。这种突变的示例是e208k氨基酸取代(durfee,et al.(2008)j bacteriol.190(7)：2597
‑
2606)或感兴趣的物种中的相应突变。enda，包括e208，在细菌物种，包括沙门氏菌物种中是保守型的(见例如seq id no:251)。因此，e208k突变可用于消除其它物种包括沙门氏菌菌种中的核酸内切酶活性。本领域技术人员可以导入其它突变或缺失以消除enda活性。实现这种突变或者缺失或破坏基因以消除本文免疫刺激性细菌例如沙门氏菌中enda的活性，可以提高完整质粒dna递送的效率，从而增加编码的治疗性产物的表达及增强抗肿瘤功效。
[0491]
i.rig
‑
i结合序列
[0492]
如上所述，i型干扰素(ifn
‑
α、ifn
‑
β)是由不同的tlr依赖性和tlr非依赖性信号传导途径诱导的特征细胞因子。在tlr非依赖性i型干扰素途径中，一种途径是由宿主识别胞质中的单链(ss)和双链(ds)rna介导的。这些由rna解旋酶感测，包括视黄酸诱导基因i(rig
‑
i)、黑色素瘤分化相关基因5(mda
‑
5)，并通过ifn
‑
β启动子刺激物1(ips
‑
1)适配蛋白介导的irf
‑
3转录因子的磷酸化，导致i型干扰素的诱导(ireton and gale(2011)viruses 3(6):906
‑
919)。rig
‑
i识别带有5'
‑
三磷酸的dsrna和ssrna。这个部分可以直接结合rig
‑
i，或者也可以通过poly dna依赖性rna聚合酶iii(pol iii)从poly(da
‑
dt)模板合成(chiu,yh et al.(2009)cell 138(3):576
‑
91)。包含两个aa二核苷酸序列的poly(da
‑
dt)模板出现在常见的慢病毒shrna克隆载体中的u6启动子转录起始位点。其随后在质粒中的缺失阻
止了i型ifn的激活(pebernard et al.(2004)differentiation 72:103
‑
111)。rig
‑
i结合序列可包含在本文提供的质粒中；这种包含可以通过诱导i型ifn产生来增加免疫刺激，从而增加本文免疫刺激性细菌的抗肿瘤活性。
[0493]
j.dnase ii抑制
[0494]
负责外来和自身dna降解的另一种核酸酶是dnase ii，这是驻留在胞内体区室中及在凋亡后降解dna的核酸内切酶。缺乏dnase ii(在小鼠中为dnase2a)导致胞内体dna的累积，其逃逸到胞质中并激活cgas/sting信号传导(lan yy et al.(2014)cell rep.9(1):180
‑
192)。人的dnase ii缺乏表现为自身免疫性i型干扰素疾病。在癌症中，被肿瘤驻留巨噬细胞吞噬的垂死肿瘤细胞通过dnase ii消化胞内体区室中的dna来阻止cgas/sting激活和潜在的自身免疫性(ahn et al.(2018)cancer cell 33:862
‑
873)。因此，如本文提供的免疫刺激性细菌菌株的实施方案编码可抑制肿瘤微环境中dnase ii的产物，引起内吞的凋亡性肿瘤dna在胞质中的累积，在此其可以作为有效的cgas/sting激动剂。
[0495]
k.rnase h2抑制
[0496]
trex1(three
‑
prime repair exonuclease，三素修复核酸外切酶)和dnase ii用来清除异常的dna累积，rnase h2类似地用来消除胞质中rna:dna杂合体的致病性累积。rnase h2的缺陷也造成aicardi
‑
gouti
è
res综合征的自身免疫表型(rabe,b.(2013)j mol med.91:1235
‑
1240)。已经示出rnase h2的缺失和随后rna:dna杂合体或基因组嵌入的核糖核苷酸底物的累积激活cgas/sting信号传导(mackenzie et al.(2016)embo j.apr15；35(8):831
‑
44)。因此，编码抑制或降低rnase h2表达的产物从而抑制rnase h2的免疫刺激性细菌菌株的实施方案获得了肿瘤衍生的rna:dna杂合体及其衍生物，其激活cgas/sting信号传导和增强抗肿瘤免疫性。
[0497]
l.stabilin
‑
l/clever
‑
1抑制
[0498]
主要在单核细胞上表达并参与调节免疫性的另一种分子是stabilin
‑
1(基因名称stab1，也称为clever
‑
1、feel
‑
1)。stabilin
‑
l是一种i型跨膜蛋白，其在炎症后在内皮细胞和巨噬细胞以及特别在肿瘤相关的巨噬细胞上被上调(kzhyshkowska et al.(2006)j.cell.mol.med.10(3):635
‑
649)。基于炎症激活，stabilin
‑
l充当清除剂并帮助伤口愈合和凋亡小体清除，并且可以防止组织损伤，例如肝纤维化(rantakari et al.(2016)pnas 113(33):9298
‑
9303)。stabilin
‑
l的上调直接抑制了抗原特异性t细胞应答，以及在单核细胞中被sirna敲低显示出增强其促炎功能(palani,s.et al.(2016)j immunol.196:115
‑
123)。因此，编码抑制或降低stabilin
‑
l/clever
‑
l在肿瘤微环境中的表达的产物的免疫刺激性细菌菌株的实施方案，增强肿瘤驻留巨噬细胞的促炎功能。
[0499]
m.cpg基序和cpg岛
[0500]
未甲基化的胞苷
‑
磷酸
‑
鸟苷(cpg)基序在细菌基因组dna中普遍存在，但在脊椎动物基因组dna中不存在。含有cpg基序的致病性dna和合成寡脱氧核苷酸(odn)激活宿主防御机制，导致先天性和获得性免疫应答。未甲基化的cpg基序包含一个中央未甲基化的cg二核苷酸加上侧翼区域。在人中，根据结构的差异及其诱导的免疫应答的性质，已经鉴别了四种不同类别的cpg odn。k型odn(也称为b型)包含1至5个cpg基序，通常位于硫代磷酸酯骨架上。d型odn(也称为a型)具有混合的磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架，并具有单个cpg基序，侧翼是允许形成茎环结构的回文结构序列，以及在3'和5'末端的poly g基序。c型odn具有硫代
磷酸酯骨架并包含可形成茎环结构或二聚体的多个回文结构cpg基序。p类cpg odn具有硫代磷酸酯骨架，并包含带有双回文结构的多个cpg基序，可以在其富含gc的3'末端形成发夹(scheiermann and klinman(2014)vaccine 32(48):6377
‑
6389)。出于本文的目的，cpg在质粒dna中编码；其可以作为基序或在基因中导入。
[0501]
toll样受体(tlr)是感测病原体相关分子模式(pamp)和激活针对病原体的先天免疫的关键受体(akira et al.(2001)nat.immunol.2(8):675
‑
680)。tlr9识别原核生物dna中非天然存在于哺乳动物dna中的去甲基化cpg基序(mckelvey et al.(2011)1autoimmunity 36:76
‑
86)。免疫细胞亚群的内体中病原体被吞噬之后识别cpg基序会诱导irf7依赖性i型干扰素信号传导及激活先天免疫和适应性免疫。
[0502]
本文提供了携带含有cpg岛/基序的质粒的免疫刺激性细菌，例如沙门氏菌属物种，如鼠伤寒沙门氏菌菌株。这些细菌可以激活tlr9并诱导i型ifn介导的先天免疫和适应性免疫。如本文所示例，含有去甲基化cpg岛的细菌质粒可引发先天性和适应性抗肿瘤免疫应答，其与编码产物例如功能获得性变体sting蛋白组合可具有协同或增强的抗肿瘤活性。例如，asd基因(见例如seq id no:48)编码高频率的去甲基化cpg岛。如本文所述或从本文描述中明显可见，cpg基序可以与任何治疗性产物例如sting蛋白及其突变体组合包含在免疫刺激性细菌中，并从而通过调节tlr例如tlr9而增强或改善抗肿瘤免疫应答。
[0503]
免疫刺激性cpg可以包含在质粒中，通过包含编码基因产物，通常来自细菌基因(例如asd)的核酸以及通过加入包含cpg基序的核酸。本文的质粒可包含cpg基序。示例的cpg基序是已知的(见例如美国专利号8,232,259、8,426,375和8,241,844)。这些包括例如合成的免疫刺激寡核苷酸，长度在10至100、10至20、10至30、10至40、10至50或10至75个碱基对之间，具有通式(cpg)
n
，其中n是重复数。通常使用至少一或两次重复；非cg碱基可以散布于其中。本领域技术人员非常熟悉cpg基序通过调节tlr，特别是tlr9来诱导免疫应答的一般性用途。
[0504]
5.提高通过免疫细胞摄取革兰氏阴性菌如沙门氏菌及降低免疫细胞死亡的修饰
[0505]
本文提供的免疫刺激性细菌，例如示例的鼠伤寒沙门氏菌菌株，可以被修饰以增加被免疫细胞例如肿瘤驻留免疫细胞的摄取，及降低被非免疫细胞例如上皮细胞的摄取。还可以对细菌进行修饰以减少免疫细胞死亡，例如通过减少巨噬细胞焦亡。可以对细菌基因组进行许多修饰以实现增加免疫细胞的感染和减少细胞焦亡之一或这二者。本文提供的免疫刺激性细菌包括这种修饰，例如参与spi
‑
1t3ss途径的基因的缺失和/或破坏，例如hila、杆状蛋白和/或针状蛋白的破坏或缺失，和/或破坏/缺失编码鞭毛蛋白的其它细菌基因。这些修饰使细菌可以在肿瘤驻留免疫细胞中累积，在那里其可以表达编码的治疗性产物并将其直接释放到肿瘤微环境中，从而提高治疗效果。此外，延长肿瘤驻留巨噬细胞的寿命(例如通过减少细胞焦亡)，可以有效产生编码的治疗性产物，并激活肿瘤微环境中的免疫应答，进一步增强细菌的抗肿瘤治疗功效。
[0506]
a.免疫细胞摄取细菌
[0507]
可以修饰本文提供的免疫刺激性细菌的基因组以增加或促进免疫细胞的感染，特别是肿瘤微环境中的免疫细胞，例如吞噬细胞。这包括降低非免疫细胞例如上皮细胞的感染，或增加免疫细胞的感染。革兰氏阴性菌如沙门氏菌的侵入表型可得自促进宿主细胞侵入的途径中编码的基因的活性。示例了沙门氏菌的侵入相关沙门氏菌致病岛1(spi
‑
1)。
al.(2016)scientific reports 6:37447；fink and cookson(2007)cellular microbiology 9(11):2562
‑
2570；及winter et al.(2015)infect.immun.83(4):1546
‑
1555)。
[0514]
本文的免疫刺激性细菌的基因组可以被修饰以缺失、破坏或突变鼠伤寒沙门氏菌中的鞭毛蛋白基因flic和fljb，导致降低肿瘤驻留免疫细胞如巨噬细胞的细胞死亡，及增强所述免疫刺激型细菌的抗肿瘤免疫应答。
[0515]
ii.spi
‑
1蛋白
[0516]
spi
‑
1蛋白还激活巨噬细胞中的nlrc4炎性小体，激活胱天蛋白酶
‑
1及通过细胞焦亡导致细胞死亡。例如，这些效应子包括但不限于杆状蛋白(prgj)和针状蛋白(prgi)。
[0517]
杆状蛋白(prgj)
[0518]
nlrc4炎性小体还检测无鞭毛的鼠伤寒沙门氏菌。鞭毛蛋白非依赖性应答是由于prgj的检测所致，其是鼠伤寒沙门氏菌中的spi
‑
1t3ss杆状蛋白。将纯化的prgj蛋白递送至巨噬细胞胞质导致快速nlrc4依赖性胱天蛋白酶
‑
1激活，以及il
‑
1β的分泌，类似于鞭毛蛋白诱导的作用(miao et al.(2010)proc.natl.acad.sci.u.s.a.107(7):3076
‑
3080)。因此，鼠伤寒沙门氏菌中编码prgj的基因的突变或敲除可以减少巨噬细胞焦亡，从而通过保护易被细菌杀死的免疫细胞而增强免疫刺激性细菌的抗肿瘤免疫作用。
[0519]
针状蛋白(prgi)
[0520]
prgi是鼠伤寒沙门氏菌中的spi
‑
1t3ss针状蛋白，也由nlrc4炎性小体识别和激活nlrc4炎性小体。将鼠伤寒沙门氏菌prgi递送至人原代单核细胞衍生巨噬细胞的胞质导致il
‑
1β分泌及随后的细胞死亡。与表达鞭毛蛋白的菌株相比，表达prgi但不表达鞭毛蛋白的沙门氏菌突变体示出在较晚的时间点激活原代单核细胞衍生的巨噬细胞中的炎性小体(kortmann et al.(2015)j.immunol.195:815
‑
819)。因此，本文提供的免疫刺激性细菌可以修饰为突变或缺失编码鼠伤寒沙门氏菌针状蛋白的基因，防止免疫细胞焦亡，及增强抗肿瘤免疫效果。
[0521]
iii.qsec
[0522]
传感器qsec是一种高度保守型的膜组氨酸传感器激酶，其被发现在许多革兰氏阴性细菌中，且对环境做出反应并调节一些毒力因子的表达。这些毒力因子包括例如flhdc基因，其编码鼠伤寒沙门氏菌中鞭毛生物合成的主要调节因子；sopb基因，其编码在非吞噬细胞的侵入、含沙门氏菌的囊泡(scv)的早期成熟和运输调节以及抑制scv
‑
溶酶体融合中起作用的蛋白质；及sifa基因，这是scv维持和膜完整性所需的。
[0523]
已经表明，led209对qsec的选择性抑制通过抑制qsec介导的毒力相关的基因表达(例如flhdc、sifa和sopb)的激活而抑制细菌毒力而不抑制鼠伤寒沙门氏菌生长，以及部分保护小鼠免于在感染鼠伤寒沙门氏菌或土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)后死亡。发现qsec阻滞通过在感染的巨噬细胞中抑制过度的炎性小体激活而抑制胱天蛋白酶
‑
1激活、il
‑
1β释放和鼠伤寒沙门氏菌诱导的巨噬细胞焦亡。抑制qsec还阻抑鞭毛基因的表达和运动，及阻抑鼠伤寒沙门氏菌在上皮细胞中的侵入和复制能力(li et al.(2016)scientific reports 6:37447)。因此，对本文中的免疫刺激性细菌进行修饰以突变或敲除编码qsec的基因，可以通过将鼠伤寒沙门氏菌感染集中于非上皮细胞及通过降低免疫细胞中的细胞死亡(例如通过防止巨噬细胞中的焦亡)而增强抗肿瘤免疫应答。
[0524]
6.细菌培养条件
[0525]
细菌的培养条件会影响其基因表达。已有文献证实鼠伤寒沙门氏菌可通过参与spi
‑
1及其相关t3ss
‑
1的机制，在感染后30至60分钟内诱导巨噬细胞而非上皮细胞的快速促炎胱天蛋白酶依赖性细胞死亡(lundberg et.al(1999)journal of bacteriology 181(11):3433
‑
3437)。现在已知这种细胞死亡是由炎性小体的激活介导的，其随后激活胱天蛋白酶
‑
1，促进il
‑
1β和il
‑
18的成熟和释放，并启动称为细胞焦亡的一种新的细胞死亡形式(broz and monack(2011)immunol.rev.243(1):174
‑
190)。这种细胞焦亡活性可以通过使用对数期细菌诱导，而静止期细菌不在巨噬细胞中诱导这种快速细胞死亡。spi
‑
1基因在细菌生长的对数期被诱导。因此，通过在稳定期收获鼠伤寒沙门氏菌用于治疗，可以防止巨噬细胞的快速焦亡。巨噬细胞是先天免疫系统的重要介导物，并且可以作用于分泌对于建立适当的抗肿瘤应答至关重要细胞因子。此外，限制促炎细胞因子如il
‑
1β和il
‑
18的分泌将改善施用的鼠伤寒沙门氏菌疗法的耐受性。如本文所提供，在稳定期收获的免疫刺激性鼠伤寒沙门氏菌将用于诱导抗肿瘤应答。
[0526]
7.增加的肿瘤定植
[0527]
vnp20009是一种基于减毒的鼠伤寒沙门氏菌的微生物癌症疗法，专为癌症治疗而开发。vnp20009通过缺失msbb和puri(purm)基因而减毒。puri缺失使得所述微生物对于嘌呤或腺苷呈营养缺陷型。msbb基因的缺失降低了与细菌脂多糖(lps)相关的毒性，通过阻止末端肉豆蔻基加入脂质a结构域，及产生毒性较小形式的脂质a(khan et al.(1998)mol.microbiol.29:571
‑
579)。
[0528]
vnp20009定植肿瘤的能力在小鼠和人之间存在差异。vnp20009的全身施用导致小鼠肿瘤定植；而在人患者中全身施用vnp20009导致很少的肿瘤定植。示出在小鼠体内，vnp20009在全身施用后表现出高度的肿瘤定植(见例如clairmont et al.(2000)j infect.dis.181:1996
‑
2002；及bermudes et al.(2001)biotechnol genet eng rev.18:219
‑
33)。然而，在晚期黑色素瘤患者的1期研究中，经静脉输注30分钟后，在人肿瘤中检测到的vnp20009非常少(见toso et al.(2002)j clin.oncol.20:142
‑
52)。纳入评估vnp20009较长时间的4小时输注的随访研究的患者也证实在肿瘤活检后缺乏可检测的vnp20009(heimann et al.(2003)j immunother.26:179
‑
180)。经肿瘤内施用后，检测到vnp20009衍生物的定植(nemunaitis et al.(2003)cancer gene ther.10:737
‑
44)。将vnp20009直接瘤内施用于人肿瘤导致肿瘤定植，表明人肿瘤可以被高水平定植，以及小鼠和人之间的肿瘤定植差异仅在全身施用后发生。
[0529]
vnp20009等菌株被人补体失活，从而导致低肿瘤定植。本文提供了提供改善的补体抗性的菌株。这些菌株在细菌基因组中包含修饰，以及也可以携带通常为低或中等拷贝数的质粒，以任选地编码基因以供复制(在真核启动子的控制下的asd)和编码治疗性产物的核酸，例如但不限于细胞因子、刺激i型干扰素产生的蛋白质的功能获得性突变体，以及其它这种治疗性基因/产品，如本文别处所述。
[0530]
下表总结了细菌基因型/修饰、其功能性作用以及效果/益处。
[0531][0532][0533]
本文提供的菌株是δflg，因此其没有鞭毛和/或δpagp。此外，所述菌株是δpuri(δpurm)、δmsbb和δasd中的一种或多种(在细菌基因组中)。质粒被修饰以在宿主识别的启动子(例如真核启动子，如rna聚合酶ii启动子，包括来自真核生物和动物病毒的那些启动子)控制下编码产物。所述质粒可任选地编码asd以允许在体内复制，以及编码具有其它有益功能的核酸(例如cpg)和如本文别处所述的基因产物。
[0534]
所述免疫刺激性细菌源自合适的细菌菌株，包括减毒菌株和野生型菌株或其它非减毒菌株。细菌菌株可以是减毒菌株，或通过标准方法减毒的菌株，或由于本文提供的修饰而减毒的菌株，这些减毒菌株是其定植能力主要限于免疫豁免的组织和器官，特别是免疫细胞和肿瘤细胞包括实体瘤而减毒的。细菌包括但不限于例如如下的菌株：沙门氏菌(salmonella)、志贺氏杆菌(shigella)、李斯特菌(listeria)、大肠杆菌(e.coli)和双歧杆菌(bifidobacteriae)。例如，菌种包括宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)、痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae)、产单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、鸡伤寒沙门氏菌(salmonella gallinarum)和肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)。其它合适的细菌物种包括立克次氏体(rickettsia)、克雷伯氏菌(klebsiella)、博德特氏菌(bordetella)、奈瑟氏菌(neisseria)、气单胞菌(aeromonas)、弗朗西斯氏菌(francisella)、棒状杆菌(corynebacterium)、柠檬酸杆菌(citrobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜血杆菌(haemophilus)、布鲁氏菌(brucella)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、军团杆菌(legionella)、红球菌(rhodococcus)、假单胞菌(pseudomonas)、螺杆菌(helicobacter)、弧菌(vibrio)、芽孢杆菌(bacillus)和丹毒丝菌(erysipelothrix)。例如，rickettsia rickettsiae、普氏立克次
体(rickettsia prowazekii)、rickettsia tsutsugamuchi、莫氏立克次体(rickettsia mooseri)、西伯利亚立克次体(rickettsia sibirica)、支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica)、脑膜炎双球菌(neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)、嗜矿泉气单胞菌(aeromonas eucrenophila)、鲑产气单胞菌(aeromonas salmonicida)、土轮病菌(francisella tularensis)、假结核棒状杆菌(corynebacterium pseudotuberculosis)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(haemophilus somnus)、流产布鲁氏菌(brucella abortus)、胞内分枝杆菌(mycobacterium intracellulare)、嗜肺军团杆菌(legionella pneumophila)、马红球菌(rhodococcus equi)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、伶鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、五日热罗卡利马氏体菌(rochalimaea quintana)，或根癌土壤杆菌(agrobacterium tumerfacium)。
[0535]
本文提供的免疫刺激性细菌的示例是沙门氏菌物种。如本文所述修饰的细菌示例是沙门氏菌的野生型菌株，例如具有以在atcc中保藏号#14028保藏的菌株的所有鉴定特征的菌株。提供了工程化的鼠伤寒沙门氏菌菌株，如菌株ys1646(atcc catalog#202165；也称为vnp20009，也见国际pct申请公开号wo 99/13053)，其是用质粒工程化以补充asd基因敲除和无抗生素质粒维持。然后将菌株修饰为缺失鞭毛蛋白基因和/或缺失pagp。使所述菌株也呈现出嘌呤特别是腺苷营养缺陷型，且其是asd
‑
和msbb
‑
。可以在质粒上提供asd基因以在真核宿主中复制。这些缺失和质粒在本文别处描述。本文别处描述的和/或本领域技术人员已知的编码治疗性产物和免疫刺激性蛋白和其它产物的任何核酸均可以包括在质粒中。如本文别处所述，质粒通常以低至中等拷贝数存在。治疗性产物包括胞质dna/rna传感器的功能获得性突变体，可组成型诱发/诱导i型ifn表达，以及包括其它免疫刺激性蛋白如细胞因子，其促进肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答，以及本文描述的其它这种产物。
[0536]
e.在肿瘤微环境中刺激免疫应答的非人sting蛋白和蛋白中的功能获得性突变
[0537]
提供了含有核苷酸序列的免疫刺激细菌，所述核苷酸序列编码治疗性基因产物，特别是抗癌产物，包括促进或刺激抗肿瘤或抗病毒免疫应答的产物。治疗性产物包括被称为胞质dna/rna传感器的产物，当暴露于细胞的胞质中的核酸如rna、dna、核苷酸、二核苷酸、环状核苷酸、环状二核苷酸和其它这种分子时引发免疫应答。本文中的免疫刺激性细菌编码具有增加的活性或组成型引起免疫应答的修饰的产物，且不需要胞质中存在所述dna/rna产物。示例是编码的蛋白质，其包含增加肿瘤微环境中的免疫应答的功能获得性突变。提供的不仅是免疫刺激性细菌，而且其它递送载具可用于递送编码这种免疫刺激性蛋白的核酸，或递送编码的蛋白质。这些递送载具包括外泌体、载体和病毒。例如，还可以修饰溶瘤病毒以表达功能获得性产物，特别是溶瘤病毒例如痘苗病毒，其是细胞质病毒。编码的功能获得性产物可以在外泌体、脂质体和其它合适载具中递送，其通常靶向肿瘤。
[0538]
编码功能获得性产物(和/或其它治疗性产物)的免疫刺激性细菌包括优先感染肿瘤包括肿瘤驻留免疫细胞的免疫刺激性细菌，和/或基因组被修饰以在肿瘤驻留免疫细胞中诱导较少的细胞死亡的免疫刺激性细菌，从而免疫刺激性细菌在肿瘤细胞和肿瘤驻留免疫细胞中累积，将组成型活性蛋白和/或其它治疗性产物递送至细胞和肿瘤微环境，以刺激
对肿瘤的免疫应答。免疫刺激性细菌还可在对象中编码肿瘤抗原以增强针对特定肿瘤的应答。可以对本文提供的和上下文描述的任何免疫刺激细菌进行修饰以编码这种功能获得性产物。所述产物在启动子及在真核生物(例如人或其它动物或哺乳动物)对象中识别的任何其它希望的调节序列控制下在质粒上编码。通常，编码功能获得性产物的核酸在rna聚合酶ii启动子的控制下。
[0539]
所述治疗性产物，包括功能获得性变体及其它抗癌产物在真核启动子的控制下表达，所述功能获得性变体包括如本文所述的sting蛋白和i型干扰素信号传导途径中的其它蛋白质。启动子包括例如ef
‑
1α启动子、cmv、sv40、pgk、eif4a1、cag、cd68和合成mnd启动子；病毒启动子，如o、mscv和tlr启动子，以及呼吸道合胞病毒(rsv)启动子；细胞启动子，例如eif
‑
1α；诱导型嵌合启动子，例如tet
‑
cmv；和组织特异性启动子(chang et al.(2013)cold spring harb protoc；doi:10.1101/pdb.prot075853)。
[0540]
此外，本文描述的用于修饰的任何细菌，例如以下任何菌株：沙门氏菌(salmonella)、志贺氏杆菌(shigella)、大肠杆菌(e.coli)、双歧杆菌(bifidobacteriae)、立克次体(rickettsia)、弧菌(vibrio)、李斯特菌(listeria)、克雷伯氏菌(klebsiella)、博德特氏菌(bordetella)、奈瑟氏菌(neisseria)、气单胞菌(aeromonas)、弗朗西斯氏菌(francisella)、霍乱菌(cholera)、棒状杆菌(corynebacterium)、柠檬酸杆菌(citrobacter)、衣原体(chlamydia)、嗜血杆菌(haemophilus)、布鲁氏菌(brucella)、分枝杆菌(mycobacterium)、支原体(mycoplasma)、军团杆菌(legionella)、红球菌(rhodococcus)、假单胞菌(pseudomonas)、螺杆菌(helicobacter)、芽孢杆菌(bacillus)和丹毒丝菌(erysipelothrix)，或其减毒株或其修饰株、外泌体、脂质体和溶瘤病毒，可以通过在细菌中导入含有核酸的质粒或在质粒上编码的核酸进行修饰，所述核酸在宿主识别的rna聚合酶启动子控制下编码功能获得性产物。所述功能获得性产物在感染的对象的细胞中表达。所述免疫刺激性细菌包括如本文所述经修饰以在肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞中累积或优先感染肿瘤和肿瘤驻留免疫细胞的那些细菌。例如，编码导致i型干扰素(ifn)如ifn
‑
β表达或组成型表达的功能获得性产物的免疫刺激性细菌进一步被修饰为感染上皮细胞的能力下降或无能力感染，但能感染吞噬细胞，包括肿瘤驻留免疫细胞，和/或细菌被修饰为使其不杀死被感染的吞噬细胞。
[0541]
本文中的免疫刺激性细菌可以编码被称为胞质dna/rna传感器的产物，当暴露于细胞的胞质中的核酸例如rna、dna、核苷酸、二核苷酸、环状核苷酸、环状二核苷酸和其它这种分子时引起免疫应答。本文中的免疫刺激性细菌编码组成型引发免疫应答的修饰的产物，且不需要胞质中存在dna/rna和其它核苷酸。这种示例是诱导i型干扰素表达的途径的组分。本文预期的产物包括这些dna/rna传感器的修饰形式，其具有组成型活性或活性增加(功能获得性产物)，从而在细胞的胞质中不存在核苷酸、二核苷酸、环状核苷酸、环状二核苷酸和其它这种配体的情况下表达或产生一种或多种i型干扰素。这些修饰产物在细胞、特别是在肿瘤细胞和肿瘤驻留免疫细胞中的表达，导致i型干扰素(包括干扰素
‑
β)在肿瘤微环境中的组成型表达。因为表达这些功能获得性产物的免疫刺激细菌以及溶瘤病毒(以及本文所述的其它递送载具)在肿瘤细胞和肿瘤驻留免疫细胞中累积或优先感染，因此所述产物在肿瘤微环境中表达，导致肿瘤微环境中的免疫应答增加和增强的治疗功效。
[0542]
可以在免疫刺激性细菌和其它载具中编码的示例的基因产物包括但不限于感测
或参与识别胞质dna/rna并激活i型干扰素产生的先天途径的蛋白质。参与激活i型干扰素的先天dna/rna识别的蛋白质包括但不限于：sting，rig
‑
i，mda
‑
5，irf
‑
3，irf
‑
7，trim56，rip1/ripk1，sec5/exoc2，traf2，traf3，traf6，stat1，lgp2/dhx58，ddx3/ddx3x，dhx9/ddx9，ddx1，ddx21，dhx15/ddx15，dhx33/ddx33，dhx36/ddx36，ddx60和snrnp200。导致i型干扰素组成型表达的任何这些蛋白质中的功能获得性突变是已知的，或可以鉴定的，且可以由免疫刺激性细菌或其它载体和递送载具(例如外泌体或脂质体)递送至肿瘤微环境，例如通过感染细胞或靶向和结合肿瘤细胞进行。所述功能获得性突变包括在患有得自i型干扰素组成型表达的疾病的个体中鉴定的那些。功能获得性产物的示例是在患有干扰素疾病的对象中存在的那些。如上所述，也可以通过筛选以产生功能获得性产物来鉴定突变。
[0543]
本文中的免疫刺激性细菌编码这种蛋白质，例如sting，包括具有比人sting的nf
‑
κb信号传导活性低的nf
‑
κb信号传导活性的非人sting蛋白，以及所述sting蛋白的变体和其它dna/rna传感器，其组成型引起免疫应答，且不需要胞质中存在dna/rna或其它核苷酸配体。这样的示例是诱导i型干扰素表达的途径的组分。
[0544]
可以进一步修饰编码经鉴定的功能获得性突变产物的核酸以改良表达性质。修饰包括例如密码子优化以提高在哺乳动物(特别是人)对象中的转录效率，例如减少gc含量或cpg二核苷酸含量、除去隐蔽剪接位点、阴性cpg岛、取代shine
‑
dalgarno(sd)序列，及取代tata框和/或末端信号以提高转录效率。此外，密码子可以通过改变密码子选择偏好、降低gc含量、降低mrna二级结构、除去过早的polya位点、除去rna不稳定基序(are)、降低mrna的稳定自由能、修饰内部chi位点和核糖体结合位点及减少rna二级结构而优化以提高转录效率。
[0545]
1.i型干扰素和途径
[0546]
已知由核酸(例如单链和双链rna)及环状二核苷酸和其它这种形式的核酸的宿主识别介导的i型干扰素诱导途径来诱导i型ifn。还存在toll样受体(tlr)非依赖性i型干扰素途径，由胞质中的单链(ss)和双链(ds)rna的宿主识别介导。这些核酸由rna解旋酶感测，包括视黄酸可诱导基因i(rig
‑
i)、黑色素瘤分化相关基因5(mda
‑
5)，及通过ifn
‑
β启动子刺激物1(ips
‑
1)适配蛋白
‑
介导irf
‑
3转录因子的磷酸化，从而诱导ifn
‑
β(ireton and gale(2011)viruses 3(6):906
‑
919)。如本文所讨论的，这些途径中的蛋白质可以被修饰，或者可以作为变体存在，导致i型干扰素(也称为干扰素1型)(包括ifn
‑
α和ifn
‑
β)的组成型表达。本文提供了编码变体蛋白的免疫刺激性细菌和其它递送载具，包括外泌体、脂质体和溶瘤病毒。这些递送载具可用于通过直接施用于对象和/或将其施用于同种异体或自体细胞以治疗癌症，用于细胞疗法方案。
[0547]
i型干扰素(ifn；也称为干扰素1型)，包括ifn
‑
α和ifn
‑
β，且是具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的多效细胞因子。大多数细胞类型都会产生ifn
‑
β；而ifn
‑
α主要由造血细胞产生，尤其是浆细胞样树突细胞。i型干扰素是通过模式识别受体(prr)和通过细胞因子在感测病原体相关分子模式(pamp)(包括微生物和病毒核酸和lps(脂多糖))之后产生的。其参与针对病原体(包括病毒)感染的先天免疫应答，且是强力的免疫调节剂，可促进抗原呈递，介导dc成熟，激活细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、自然杀伤(nk)细胞和巨噬细胞，以及通过促进高亲和性抗原特异性t和b细胞应答和免疫学记忆的发展激活适应性免疫系统。
[0548]
i型干扰素对肿瘤表现出抗增殖和促凋亡作用，并对肿瘤新血管系统具有抗血管
生成作用。其诱导mhc i类分子在肿瘤细胞表面表达，增加肿瘤细胞的免疫原性，及激活对它们的细胞毒性。i型干扰素已被用作治疗癌症和病毒感染的治疗剂。例如，ifn
‑
α(以商标为售卖)被批准用于治疗毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、恶性黑色素瘤(malignant melanoma)、aids相关的卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)和滤泡性非霍奇金淋巴瘤(follicular non
‑
hodgkin's lymphoma)；其还用于治疗慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，cml)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、非滤泡性非霍奇金淋巴瘤(non
‑
follicular non
‑
hodgkin's lymphoma)、硬纤维瘤(desmoid tumor)和皮肤t细胞淋巴瘤(cutaneous t
‑
cell lymphoma)(ivashkiv and donlin(2014)nat.rev.immunol.14(1):36
‑
49；kalliolias and ivashkiv(2010)arthritis research&therapy 12(suppl 1):s1；lee,s.and margolin,k.(2011)cancers 3:3856
‑
3893)。
[0549]
i型干扰素在肿瘤和肿瘤微环境中的表达在免疫刺激细菌和本文中的其它递送载具加以设计以引起的免疫应答中。诱导或诱发i型干扰素为治疗癌症提供抗肿瘤免疫性。
[0550]
2.i型干扰素疾病和功能获得性突变体
[0551]
i型干扰素(ifn)、促炎细胞因子和趋化因子的诱导对于启动预防或抑制病原体感染的免疫应答是必要的。这种应答也可以作为抗肿瘤剂而有效。本文提供的免疫刺激细菌和其它递送载具编码组成型诱导i型ifn的蛋白质。这些蛋白质是出现在患有涉及免疫应答调节物的过度产生的各种疾病或病症的个体中的那些蛋。例如，i型干扰素和促炎细胞因子的过度产生或过量产生或缺陷的负调节可导致不良影响，例如炎症和自身免疫性疾病。涉及i型干扰素和促炎细胞因子过度产生(通常是慢性的)的疾病被称为干扰素疾病(见例如lu and macdougall(2017)front.genet.8:118；和konno et al.(2018)cell reports 23:1112
‑
1123)。与i型干扰素疾病相关的疾病和临床表型包括aicardi
‑
goutieres综合征(ags)、sting相关的婴儿期发病血管病变(savi)、singleton
‑
merten综合征(sms)、非典型sms、家族性冻疮狼疮(fcl)、系统性狼疮红斑病(sle)、双侧纹状体坏死(bsn)、脑血管疾病(cvd)、遗传性对称性色素沉着症(dsh)、痉挛性下肢轻瘫(sp)、x连锁网状色素沉着症(xlpdr)、蛋白酶体相关自身炎症综合征(praas)、颅内钙化(icc)、孟德尔对分枝杆菌病的易感性(msmd)和脊椎软骨发育不良(spencd)(见例如rodero et al.(2016)j.exp.med.213(12):2527
‑
2538)。这些表型与特定基因型相关，涉及导致参与i型干扰素诱导的产物的组成型活性的基因中突变。
[0552]
干扰素信号传导的持续激活可能是由于：1)功能丧失突变，导致胞质dna增加(例如trex1和samhd1中的突变)或胞质rna/dna杂合体增加(例如rnaseh2a、rnaseh2b、rnaseh2c和pola1中的突变)；2)功能丧失突变，导致胞质中rna编辑缺陷和自身核酸rna物质感测异常(例如adar1中的突变)；3)功能获得性突变，导致胞质ifn信号途径组成型激活/对胞质核酸配体的敏感性增加(例如rig
‑
i、mda5和sting中的突变)；4)功能丧失突变，导致未折叠蛋白应答紊乱引起的通过mavs导致rna信号传导异常(例如skiv2l中的突变)；5)负责限制ifn受体(ifnar1/2)信号传导的分子中的功能丧失突变，导致不受控制的刺激ifn的基因(isg)产生(例如usp18和isg15中的突变)；6)蛋白酶体功能障碍，通过未知机制导致ifn信号传导增加(如psma3、psmb4和psmb8中的突变)；及7)trap/acp5和c1q中功能丧失突变，其中导致i型ifn信号传导的机制尚不清楚(rodero et al.(2016)1exp.med.213(12):
2527
‑
2538)。
[0553]
本文感兴趣的是导致功能获得的突变。在sting、mda5和rig
‑
i中存在与功能获得(gof)相关的已知突变，导致编码蛋白的组成型激活和/或增强的敏感性或与内源性配体增加的亲和性或结合。例如，sting中的gof突变与savi和fcl相关；mda5中的gof突变与ags和sms相关；以及rig
‑
i中的gof和gof突变与非典型sms相关。
[0554]
本文提供的免疫刺激性细菌和溶瘤病毒编码具有功能获得性突变的这些蛋白质，其利用这些蛋白质的组成型激活以增加i型ifn和促炎细胞因子的产生。本文提供了靶向编码肿瘤的免疫刺激性细菌以及溶瘤病毒和其它递送载具，其编码具有功能获得性突变的sting、mda5和/或rig
‑
i。这种免疫刺激性细菌和其它递送载具增加肿瘤微环境中i型干扰素和促炎细胞因子的产生，增强抗肿瘤免疫应答及改良免疫刺激性细菌的治疗功效。编码sting的基因称为tmem173，编码mda5的基因称为ifih1，编码rig
‑
i的基因称为ddx58。每个基因都有许多等位基因，且已知的突变可能发生在具有任何等位基因的基因中，从而导致功能获得。下面列出的突变可以单独出现，或可以任意组合使用。其它导致功能获得的突变可以通过常规筛选/突变方案鉴别。下表列出了sting/tmem173(seq id nos:305
‑
309)、mda5/ifih1(seq id no:310)和rig
‑
i/ddx58(seq id no:311)的各个中示例的功能获得性突变。也可以导入其它突变，例如缺失或取代一个或多个磷酸化位点，例如sting中324
‑
326sls
→
ala以及其它取代以消除磷酸化位点，以减少sting中核因子
‑
κb(nf
‑
κb)信号传导或其它采用这种信号传导的蛋白质。
[0555]
所得蛋白质可以在本文提供的免疫刺激性细菌中编码。蛋白质在免疫刺激性细菌中的质粒上编码，或者可以在溶瘤病毒的基因组上编码，或通过递送载具例如外泌体或脂质体递送。
[0556]
功能获得性突变表
[0557]
[0558][0559]
通过参照如seq id no:305
‑
309所示人sting序列，氨基酸残基r197、d205、r310、r293、t294、e296、s272、q273、e316、d231、r232、k236、s358、e360、s366和r238分别对应于参照如seq id no:351所示鼠sting序列的氨基酸残基r196、d204、r309、r292、t293、e295、s271、q272、e315、d230、r231、k235、s357、e359、s365和r237。
[0560]
3.sting介导的免疫激活
[0561]
sting(干扰素基因刺激物)，又称跨膜蛋白173(tmem173)、irf3激活介导物(mita)、蛋氨酸
‑
脯氨酸
‑
酪氨酸
‑
丝氨酸(mpys)和内质网(er)干扰素刺激物(eris)，是一种
存在于内质网中的379个氨基酸的蛋白质，且作为信号传导适配蛋白发挥作用，控制免疫应答基因如i型ifn和促炎细胞因子的转录。sting途径的刺激激活内皮细胞并诱导干扰素应答基因、凋亡途径基因的上调，及培养物中的内皮细胞死亡和组织因子表达，这是凝血级联反应的强力引发剂(liu et al.(2014)n.engl.j.med.371:507
‑
518)。
[0562]
由于其在促进ifn产生和炎症方面的作用，人sting是癌症和感染性疾病的免疫治疗靶点。例如，研究表明sting由其配体环状二核苷酸(cdn)的直接激活可诱导肿瘤死亡。由此通过激活sting介导的细胞死亡途径可以直接杀死sting表达增加的肿瘤。树突状细胞(dc)中sting途径的激活促进dc成熟，从而启动cd8
t细胞介导的细胞毒性反应及产生记忆应答以防止癌症复发。sting还可以提高放疗和化疗的治疗功效，因为这些治疗会释放dna。在小鼠中，疫苗的功效取决于sting，因为所述疫苗在人haq功能丧失等位基因的小鼠模型中无效。cdn在haq小鼠中失去其佐剂活性，证实sting在感染中的作用。
[0563]
sting信号传导增强对肿瘤抗原的宿主免疫识别并导致强力的抗肿瘤应答。研究表明，sting表达和信号传导在许多癌症中受到抑制，包括结直肠癌，以及这种sting信号传导的丧失阻碍了dna损伤应答和抗肿瘤t细胞引发。在许多原发性和转移性黑色素瘤以及burkett's淋巴瘤、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、hpv
癌症、hcv或hbv相关肝细胞癌和疱疹病毒相关癌症中，sting表达也丧失/失调。将sting在细胞内dna信号传导缺陷的癌细胞系例如293t和mcf7中重构，挽救了细胞内途径，并可以诱导i型ifn和其它信号转导途径(见例如美国专利申请公开号2018/0085432)。因此，正在开发用于癌症免疫疗法的sting激动剂。美国专利申请公开号2018/0085432描述了施用编码野生型sting的核酸序列用于调节免疫系统以治疗疾病，例如由外来因子(例如细菌、真菌、寄生虫和病毒感染)引起的那些，以及还诱导抗肿瘤应答。sting可作为多核苷酸、多肽、肽、反义寡核苷酸、在表达sting的载体中、抗体等施用于患者以治疗癌症。载体包括病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、vsv和逆转录病毒)、脂质体、其它含脂质复合物以及其它能介导将多核苷酸递送至宿主细胞的大分子复合物(美国专利公开号2018/0085432)。美国专利公开号2018/0311343描述了施用编码组成型活性人sting多肽的mrna与编码感兴趣的抗原例如肿瘤、病毒或细菌抗原的mrna，以引起针对抗原的免疫应答。
[0564]
sting作为胞质dna/rna传感器在先天免疫中发挥重要作用。sting凭借其与来自胞质dsdna的产物的相互作用，“感测”来自感染性病原体或异常宿主细胞损伤的胞质dsdna。通过sting感测胞质dsdna需要环状gmp
‑
amp合酶(cgas)，这是一种直接与dsdna结合的宿主细胞核苷酸转移酶，并在应答中合成环状二核苷酸(cdn)第二信使环状gmp
‑
amp(cgamp)，其结合并激活sting(见例如barber(2011)immunol.rev.243(1):99
‑
108；sun et al.(2013)science 339(6121):786
‑
791；及wu et al.(2013)science 339(6121):826
‑
830)。sting也被胞质中细菌合成的cdn激活，包括环状二gmp和环状二amp。sting与cdn结合后二聚化并激活tank结合激酶(tbk1)，其然后磷酸化irf
‑
3和nf
‑
κb转录因子。irf3、irf7和nf
‑
κb依赖性信号途径的激活诱导产生ifn
‑
β和其它促炎细胞因子，如tnf
‑
α、il
‑
12p40和ifn
‑
γ，其强力激活先天性和适应性免疫(burdette et al.(2011)nature 478(7370)：515
‑
518)。异常或变体sting不与cdn结合而组成性型作用，发生在患有干扰素疾病的对象中。因此，其可以组成型诱导i型干扰素的产生。sting由tmem173编码。
[0565]
4.tmem173等位基因
[0566]
干扰素基因刺激物(sting)由跨膜蛋白173(tmem173)基因编码，其是一个长度为～7kb的基因。人tmem173基因的特征在于等位基因的显著异质性和群体分层。最常见的人tmem173等位基因被称为r232(指存在于残基232位的氨基酸；见seq id no:305
‑
309，列出了各种人tmem173等位基因的序列)。超过一半的美国人口不是r232/r232。第二个最常见的等位基因是r71h
‑
g230a
‑
r293q(haq)。其它常见的等位基因包括aq(g230a
‑
r293q)、q293和h232。发现haq/haq细胞以极低的程度表达sting蛋白，并与r232/r232细胞相比，tmem173转录物的水平降低。r232/r232是欧洲人最常见的基因型，而haq/r232是东亚人最常见的基因型。非洲人没有haq/haq基因型，但有q293等位基因，而且～4％的非洲人是aq/aq，这在其它种族人群中是不存在的。haq和h232可能是功能丧失等位基因，并且～30％的东亚人和～10％的欧洲人是haq/haq、haq/h232或h232/h232(patel and jin(2018)genes&immunity,doi:10.1038/s41435
‑
018
‑
0029
‑
9)。
[0567]
5.组成型sting表达和功能获得性突变
[0568]
tmem173中的几个激活或功能获得(gof)突变，遗传的以及新生的，均与一种罕见的自身炎症性疾病savi(sting相关的婴儿期发病血管病变)有关。savi是一种常染色体显性遗传病，且其特征是全身炎症、间质性肺病、皮肤血管炎和复发性细菌感染。具有新生tmem173突变的savi的特征通过在于早发(<8周)和严重的表型，而家族性突变导致晚发(青少年到成人)和较轻的临床症状。遗传的tmem173激活突变包括g166e和v155m，而新生突变包括n154s、v155m、v147m、v147l、c206y、r284g、r281q和s102p/f279l(patel and jin(2018)genes&immunity,doi:10.1038/s41435
‑
018
‑
0029
‑
9)。其它已鉴定的tmem173激活突变包括r284m、r284k、r284t和r375a(美国专利公开号2018/0311343)。tmem173中另一个功能获得性突变是r284s，其导致高度组成型活性sting，并被发现在没有激活cdn的情况下触发先天免疫信号传导，导致促炎细胞因子的慢性产生(konno et al.(2018)cell reports 23:1112
‑
1123)。
[0569]
tmem173突变，例如n154s、v155m和v147l，和/或上表中列出的任何突变，单独或以任何组合导致功能获得性sting，所述sting具有组成型活性及对配体刺激高度敏感过敏，导致sting
‑
干扰素途径的慢性激活。这已经得到证实(liu et al.(2014)n.engl.j.med.371:507
‑
518)。将突变的tmem173(带有各个取代v147l、n154s、v155m和功能丧失突变体v155r)和非突变的tmem173的构建体转染到sting阴性hek293t细胞中，并用sting配体cgamp进行刺激。用n154s、v155m和v147l突变体转染的细胞表现出高度升高的ifnb1(编码ifn
‑
β的基因)报告基因活性，而用sting配体cgamp刺激并未显著增强这种活性。用功能丧失突变体(v155r)、未突变的tmem173或对照质粒转染的细胞没有显著的基线激活。用cgamp刺激在具有未突变tmem173的细胞中产生剂量依赖性模式的应答，以及在表达功能丧失突变体的细胞中仅在最高cgamp浓度才产生最小应答(liu et al.(2014)n.engl.j.med.371:507
‑
518)。这些结果表明，即使在没有cgamp刺激的情况下，激活的tmem173突变也会导致sting的组成型激活。
[0570]
g207e是另一种功能获得性sting突变，其导致脱发、光敏性、甲状腺功能障碍和savi特征。g207e突变导致hek细胞中炎症相关途径的组成型激活，以及患者外周血单核细胞(pbmc)中的异常干扰素特征和炎症小体激活。使用具有r232或h232等位基因和gof突变g207e的sting变体，表明在用cdn刺激后，r232 g207e变体导致ifn
‑
β和stat1/2途径的活性
略有增加，而h232 g207e变体，ifn
‑
β水平保持不变，且stat1/2显示活性减弱。这两种变体在刺激后均示出相似的stat3和nf
‑
κb途径激活。这些结果表明，在第232位的r于cgamp结合和ifn诱导是重要的，并表明g207e突变体导致sting信号传导途径的组成型激活和nf
‑
κb途径的配体依赖性过度激活。具有r232等位基因和g207e的患者患有的疾病更严重；这种多态性强化了突变体sting的组成型激活，导致下游靶标如ifn、il1
‑
β和il
‑
18的过度表达(见例如keskitalo et al.(2018)得自：doi.org/10.1101/394353)。
[0571]
将鼠sting(见例如seq id no:351)中的67个氨基酸单独或成组突变(burdette et al.(2011)nature 478(7370):515
‑
518)，以鉴别参与循环di
‑
gmp(c
‑
di
‑
gmp)结合和/或ifn诱导的氨基酸。其中鉴别的突变体是超活性突变体r196a/d204a、s271a/q272a、r309a/e315a、e315a、e315n、e315q和s271a(通过参照seq id no:305
‑
309所示人sting序列而分别对应于r197a/d205a、s272a/q273a、r310a/e316a、e316a、e316n、e316q和s272a)，其自发诱导的ifn处于低水平转染及不应答c
‑
di
‑
gmp，以及突变体r374a、r292a/t293a/e295a/e299a、d230a、r231a、k235a、q272a、s357a/e359a/s365a、d230a/r231a/k235a/r237a和r237a(通过参照seq id no:305
‑
309所示人sting序列而分别对应于r375a、r293a/t294a/e296a(在人sting中没有e299a等价物)、d231a、r232a、k236a、q273a、s358a/e360a/s366a、d231a/r232a/k236a/r238a和r238a，其当过表达时诱导ifn，但不应答c
‑
di
‑
gmp。
[0572]
施用编码野生型sting的核酸可以诱导免疫应答；在靶向肿瘤的递送载具中施用具有本文提供的组成型活性的功能获得性sting突变体导致更强力的免疫应答和更有效的抗癌治疗剂。通过靶向肿瘤地施用组成型活性sting或其它这种修饰的dna/rna传感器(例如本文提供的mda5或rig
‑
i的功能获得性突变体)而增强的免疫应答，提供了治疗上更有效的抗癌治疗。例如，如本文所述，修饰所述免疫刺激性细菌使其不感染上皮细胞，但保留感染包括肿瘤驻留免疫细胞在内的吞噬细胞的能力，有效地将免疫刺激性细菌靶向肿瘤微环境，改良治疗效率和防止不期望的全身免疫应答。这些靶向肿瘤的细菌被工程化为编码功能获得性sting、mda5或rig
‑
i突变体，其具有组成型活性，例如即使在没有配体刺激的情况下也提供强力的i型ifn应答以改善肿瘤微环境中的抗癌免疫应答。
[0573]
因此，例如施用组成型激活的sting可以提供一种替代方法来增强sting信号传导，用于癌症的免疫治疗性治疗。在某些实施方案中，本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激性细菌以及溶瘤病毒可以被修饰以编码具有选自以下的具有功能获得性突变的sting/tmem731(seq id no:305
‑
309)：s102p，v147l，v147m，n154s，v155m，g166e，r197a，d205a，r197a/d205a，c206y，g207e，d231a，r232a，k236a，r238a，d231a/r232a/k236a/r238a，s272a，q273a，s272a/q273a，f279l，s102p/f279l，r281q，r284g，r284s，r284m，r284k，r284t，r293a，t294a，e296a，r293a/t294a/e296a，r310a，e316a，e316n，e316q，r310a/e316a，s324a/s326a，s358a，e360a，s366a，s358a/e360a/s366a和r375a。
[0574]
6.具有增加的活性或具有组成型活性的非人sting蛋白及其变体，及具有增加的活性或具有组成型活性的sting嵌合体及其变体
[0575]
如上所述，胞质双链dna(dsdna)通过内质网(er)驻留适配蛋白sting(ifn基因刺激物)刺激i型干扰素(ifn)的产生，其激活转录因子干扰素调节因子3(irf3)。tank结合激酶(tbk1)/irf3轴导致i型ifn的诱导，以及树突状细胞(dc)的激活和肿瘤抗原的交叉呈递，从而激活cd8
t细胞介导的抗肿瘤免疫性。sting信号传导还激活活化的b细胞的核因子κ
‑
轻链增强子(nf
‑
κb)信号传导轴，导致促炎应答，但不激活抗肿瘤免疫性所需的dc和cd8
t细胞。
[0576]
基于2'3'cgamp的识别，sting从内质网通过高尔基体易位，从而募集tank结合激酶1(tbk1)并激活转录因子irf3和nf
‑
κb。sting的羧基末端尾部(c末端尾部或ctt)区域是激活tbk1和刺激irf3磷酸化所必需且足够的；其也参与nf
‑
κb信号传导。ctt是一段约40个氨基酸的非结构化片段，包含sting磷酸化和irf3募集所需的序列基序。irf3和nf
‑
κb下游信号传导归因于在脊椎动物物种间保守的sting的c末端尾部(ctt)内特定序列基序。ctt中的模块基序，包括irf3、tbk1和traf6结合模块，其控制细胞信号传导和免疫应答的强度和特异性。
[0577]
根据物种及其sting ctt离散元件的各自特征，irf
‑
3和nf
‑
κb下游应答可能会受到影响，且有时甚至相反。sting ctt元件命令并微调两个信号传导途径之间的平衡，从而产生不同的生物应答。例如，在人和小鼠免疫细胞中，sting依赖性irf
‑
3激活主要导致i型干扰素应答。人细胞中的sting信号传导还通过traf6募集通过经典和可能的非经典nf
‑
κb途径驱动促炎应答。人sting残基s366(见例如seq id no:305
‑
309)是主要的tbk1磷酸化位点，其是ctt中lxis基序的部分，这是irf3结合所需的，而第二个pxplr基序包括残基l374，是tbk1结合所需的。lxis和pxplr基序在所有脊椎动物sting等位基因中均高度保守。在其它物种中，sting信号传导主要导致nf
‑
κb信号传导轴的激活。例如，负责nf
‑
κb信号传导过度活化的斑马鱼ctt在c极末端包含一个具有高度保守型的pxexxd基序的延伸，这在人和哺乳动物sting等位基因中是不存在的；这个基序与肿瘤坏死因子受体相关因子6(traf6)结合位点具有相似性。虽然traf6在人sting信号传导中的作用不是必需的，但traf6募集对于斑马鱼sting诱导的nf
‑
κb激活是必需的。人
‑
斑马鱼sting嵌合体，其中人sting被工程化为包含斑马鱼sting ctt模块dpvettdy，诱导nf
‑
κb激活高100倍以上，表明这个区域对于引导增强的nf
‑
κb信号激活是必要且足够的。加入斑马鱼ctt还导致sting干扰素应答增加(见de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。
[0578]
本文利用物种间irf3和nf
‑
κb信号传导之间平衡的差异来产生修饰的sting蛋白，这些蛋白降低了nf
‑
κb信号传导，和/或任选增加了irf3信号传导，使得在sting蛋白被递送至tme并表达时，与未修饰的sting蛋白相比，所得应答是增强的抗肿瘤/抗病毒应答。
[0579]
在一些实施方案中，来自具有低或无nf
‑
κb信号传导活性的物种的sting蛋白被提供在递送载具中，包括本文描述的或本领域技术人员已知的任何免疫刺激性细菌，及提供在其它递送载具中，例如病毒载体，包括溶瘤病毒载体、微细胞、外泌体、脂质体，以及提供在细胞中，如用于细胞疗法中和用于递送载具的t细胞，如细菌和溶瘤载体。
[0580]
非人sting蛋白可包括但不限于来自如下物种的sting蛋白：袋獾(sarcophilus harrisii；seq id no:331)，狨猴(callithrix jacchus；seq id no:341)，牛(bos taurus；seq id no:342)，猫(fells catus；seq id no:338)，鸵鸟(struthio camelus australis；seq id no:343)，朱鹮(nipponia nippon；seq id no:344)，腔棘鱼(latimeria chalumnae；seq id nos:345
‑
346)，野猪(sus scrota；seq id no:347)，蝙蝠(rousettus aegyptiacus；seq id no:348)，海牛(trichechus manatus latirostris；seq id no:349)，鬼鲨(callorhinchus milli；seq id no:350)，及小鼠(mus musculus；seq id no:351)。这些脊椎动物sting蛋白易于激活人细胞中免疫信号传导，表明sting信号传导的分
子机制在大多数脊椎动物中是共享的(见de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。
[0581]
在其它实施方案中，非人sting蛋白在所述非人sting中对应于人sting的那些的基因座中包含任何组成型sting表达和功能获得性突变(见图1
‑
13，其提供了示例比对，以及实施例28，其提供了各物种中相对应的突变)，如上文第5节所述。
[0582]
在其它实施方案中，提供了sting蛋白的嵌合体。在嵌合体中，第一物种sting蛋白的ctt区域或其赋予或参与nf
‑
κb信号传导/活性的部分被来自第二物种的相应ctt或其部分取代，第二物种的sting蛋白具有较低的或极少的、比人sting低的nf
‑
κb信号传导活性。来自第二物种的ctt也或另外具有增加的i型ifn信号传导。通常，第一物种是人，所述ctt或其部分来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼和鬼鲨等物种的sting，具有较低的nf
‑
κb活性。这因此获得诱导i型干扰素的sting蛋白，其对于抗肿瘤活性很重要，并且具有有限的或没有在抗肿瘤疗法中不希望的nf
‑
κb活性。所述嵌合体可以进一步包括在相应基因座中的组成型sting表达和功能获得性突变，以增加或提供i型干扰素组成型活性。在所有实施方案中，可以缺失traf6结合基序以进一步降低或消除在抗肿瘤治疗剂中不期望的活性。
[0583]
这些非人sting蛋白、嵌合体和突变体在递送载具中提供，例如本文描述的或本领域技术人员已知的任何递送载具，包括溶瘤病毒载体、细胞(例如用于细胞疗法的干细胞和t细胞)、外泌体、微细胞、脂质体和本文提供的免疫刺激性细菌，其在肿瘤驻留免疫细胞中累积，并将编码的蛋白质递送至肿瘤微环境和肿瘤。非人sting蛋白、修饰的sting蛋白和嵌合体用作治疗剂，用于在如本文所述或本领域技术人员已知的其它方法中治疗肿瘤。还提供了包含sting蛋白、递送载具和编码核酸的药物组合物。
[0584]
7.充当胞质dna/rna传感器的其它基因产物及组成型变体
[0585]
a.视黄酸可诱导的基因i(rig
‑
i)样受体(rlr)
[0586]
感测或与胞质核酸相互作用的其它基因产物是视黄酸可诱导的基因i(rig
‑
i)样受体(rlr)，包括rig
‑
i和mda5(黑色素瘤分化相关蛋白5)。rlr是病毒dsrna和细菌分泌的核酸的细胞质传感器，以及包括rig
‑
i、mda5和lgp2(遗传生理学实验室laboratory of genetics and physiology 2)。基于如病毒dsrna等配体的结合，rig
‑
i和mda5激活线粒体抗病毒信号传导适配蛋白或mavs，其募集肿瘤坏死因子(tnf)受体相关因子(traf)，以在线粒体外膜组装信号传导复合体。下游信号传导组分进一步被traf募集，导致irf
‑
3(干扰素调节因子3)、irf
‑
7、nf
‑
κb(活化的b细胞的核因子κ
‑
轻链增强子)以及ap
‑
1(激活蛋白1)的磷酸化和激活。结果，诱导了干扰素、促炎细胞因子和参与病原体清除的其它基因的表达(见例如lu and macdougall(2017)front.genet.8:118)。
[0587]
与sting一样，由于功能获得性突变所致mda5和rig
‑
i的组成型激活导致i型ifn的诱导，其可用于增强免疫刺激性细菌和溶瘤病毒的抗肿瘤免疫应答。
[0588]
b.mda5/ifih1
[0589]
另一个干扰素疾病基因是具有含有解旋酶c结构域的蛋白1诱导的ifn(ifih1)，也称为黑色素瘤分化相关蛋白5(mda5)，其是细胞质dexd/h盒rna受体的rig
‑
i样家族成员。mda5由ifih1编码，是一种1025个氨基酸的细胞质模式识别受体，其感测细胞质中的病毒双链rna(dsrna)和分泌的细菌核酸，并通过适配分子mavs(线粒体抗病毒信号传导蛋白)激活
i型干扰素信号传导。mavs募集肿瘤坏死因子(tnf)受体相关因子(traf)，进而募集下游信号传导组分，导致irf
‑
3(干扰素调节因子3)、irf
‑
7、nf
‑
κb(活化的b细胞的核因子κ
‑
轻链增强子)和ap
‑
1(激活蛋白1)的磷酸化和活化。这样导致了干扰素、促炎细胞因子和参与病原体清除的其它基因的表达(rutsch et al.(2015)am.j.hum.genet.96:275
‑
282；rice et al.(2014)nat.genet.46(5):503
‑
509；lu and macdougall(2017)front.genet.8:118)。
[0590]
功能获得性(gof)ifih1变体发生在患有自身免疫性病症的患者中，包括aicardi
‑
goutieres综合征(ags)和singleton
‑
merten综合征(sms)，其特征在于明显的血管炎症。ags是一种炎症性疾病，特别影响大脑和皮肤，且其特征在于干扰素诱导的转录物的上调。ags通常是由于编码dna外切核酸酶trex1、rnase h2内切核酸酶复合物的3个非等位基因组分、三磷酸脱氧核苷三磷酸水解酶samhd1和双链rna编辑酶adar1的任何基因中的突变所致而发生的。一些患有ags的患者在任何这6个基因中没有突变，但ifih1中有gof突变，表明这个基因也与ags有关。singleton
‑
merten综合征(sms)是一种常染色体显性遗传疾病，其特征在于异常的血管(如钙化)、牙齿(如早发性牙周炎、牙根吸收)和骨骼(如骨质减少、肢端骨质溶解、骨质疏松)。sms患者中干扰素特征基因上调，这与ifih1中的gof突变有关(rice et al.(2014)nat.genet.46(5):503
‑
509；rutsch et al.(2015)am.j.hum.genet.96:275
‑
282)。
[0591]
在表达低水平内源性病毒rna受体的hek293t细胞中比较了在ags患者中鉴别的野生型ifih1和6种ifih1 gof突变体(r720q、r779h、r337g、r779c、g495r、d393v)的ifn
‑
β报道子刺激活性。野生型ifih1基于长(>1kb)dsrna类似物聚肌苷酸
‑
聚胞苷酸(polyi:c)结合被诱导，但不被短的162bp的dsrna诱导，并且在没有外源rna的情况下具有较低活性。除了应答polyi:c的强大信号传导外，ifih1突变体还示出对162bp短dsrna应答的显著诱导ifn信号传导。在没有外源配体的情况下，所述突变体也表现出高4至10倍的基线信号传导活性(rice et al.(2014)nat.genet.46(5):503
‑
509)。
[0592]
另一个功能获得性ifih1突变r822q被鉴别为通过触发i型干扰素产生引起sms，并导致早期动脉钙化以及牙齿炎症和吸收。hek293t细胞(内源性ifih1表达水平最低)用于过表达野生型和r822q mda5。野生型ifih1表达导致ifnb1(干扰素，β1，成纤维细胞)以剂量依赖性方式表达增加，而突变的ifih1导致ifnb1表达增加约20倍。在用dsrna类似物poly(i:c)刺激后，r822q ifih1较野生型ifih1导致ifnb1高水平表达，表明r822q ifih1对非自身dsrna过度活跃。sms患者的全血样本中干扰素特征基因如ifi27、ifi44l、ifit1、isg15、rsg15、rsad2和siglec1的表达也较高，这与通过r822q ifih1的ifnb1的较高表达水平一致(rutsch et al.(2015)am.j.hum.genet.96:275
‑
282)。
[0593]
在具有另一种ifih1 gof突变a489t的患者中观察到的干扰素特征指示i型干扰素疾病；ifih1 a489t与增加的干扰素产生和类似于冻疮狼疮、ags和sms的表型有关(bursztejn et al.(2015)br.j.dermatol.173(6):1505
‑
1513)。a489t变体不仅在用长dsrna类似物poly(i:c)刺激后导致ifn诱导，用短dsrna刺激也如此。在具有sms表型的患者中发现ifih1、t3311和t331r中两个另外的功能获得性突变，这些患者表现为ifn诱导的转录物显著上调。t3311和t331r变体导致ifn
‑
β表达增加，即使在没有外源dsrna配体的情况下，这与观察到的mda5的组成型激活一致(lu and macdougall(2017)front.genet.8:118)。
[0594]
a946t是另一种ifih1 gof突变，导致i型干扰素的产生增加，促进炎症并增加自身免疫的风险。ifih1中的a946t突变当与tmem173 r232等位基因和g207e gof突变结合时产生累加效应，导致严重的早发表型，其特征类似于savi(keskitalo et al.(2018)preprint,available from doi.org/10.1101/394353)。g821s是ifih1中的gof突变，已被证实导致小鼠模型中自发进展的狼疮样自身免疫症状(rutsch et al.(2015)am.j.hum.genet.96:275
‑
282)，而在患有ags的个体中鉴别的ifih1错义突变a452t、r779h和l372f示出导致i型干扰素过量产生(oda et al.(2014)am.j.hum.genet.95:121
‑
125)。
[0595]
本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激性细菌以及溶瘤病毒可以被修饰为编码具有选自如下(单独或任意组合的)功能获得性突变的mda5/ifih1(seq id no:310)：t331i，t331r，r337g，l372f，d393v，a452t，a489t，g495r，r720q，r779h，r779c，g821s，r822q和a946t。
[0596]
c.rig
‑
i
[0597]
视黄酸可诱导的基因i(rig
‑
i)，也称为ddx58(dexd/h
‑
盒解旋酶58)是其组成型激活与如非典型sms等干扰素疾病的发展有关的另一种蛋白质。rig
‑
i，像mda5/ifih1一样，是rig
‑
i样受体(rlr)家族的成员，以及是925个残基的胞质模式识别受体，在病毒dsrna的检测中起作用。rig
‑
i通过促进i型和iii型干扰素和促炎细胞因子表达的独立途径启动对病毒rna的先天免疫应答(jang et al.(2015)am.j.hum.genet.96:266
‑
274；lu and macdougall(2017)front.genet.8:118)。
[0598]
非典型sms，没有标志性的牙齿异常，但具有可变的表型，包括青光眼、主动脉钙化和骨骼异常，已发现其是由dexd/h
‑
盒解旋酶58基因(ddx58)中的突变引起的，其编码视黄酸可诱导的基因i(rig
‑
i)。特别地，ddx58中的e373a和c268f突变被鉴别为导致rig
‑
i中的功能获得。突变的ddx58数量增加与nf
‑
κb报道基因活性基础水平的显著增加有关，以及这种活性通过dsrna类似物poly(i:c)刺激而进一步增加。rig
‑
i突变还在基础水平诱导irf
‑
3磷酸化和二聚化，并导致ifnb1、干扰素刺激基因15(isg15)和趋化因子(c
‑
c基序)配体5(ccl5)在基础的和poly(i:c)转染的hek293ft细胞中的表达均增加。这些结果表明突变的ddx58/rig
‑
i导致组成型激活，导致增加的ifn活性和ifn刺激的基因表达(jang et al.(2015)am.j.hum.genet.96:266
‑
274；lu and macdougall(2017)front.genet.8:118)。
[0599]
本文提供的靶向肿瘤的免疫刺激性细菌和溶瘤病毒可以被修饰为编码具有功能获得性突变的rig
‑
i/ddx58(seq id no:311)，所述功能获得性突变例如但不限于e373a和c268f(单独或组合的)。
[0600]
d.irf
‑
3和irf
‑7[0601]
病原体相关分子模式(pamp)被宿主模式识别受体(prr)识别，如rig
‑
i样受体、rig
‑
i和mda5，通过转录因子irf
‑
3、irf
‑
7和nf
‑
κb导致下游信号传导，导致i型干扰素的产生。
[0602]
irf
‑
3(干扰素调节因子3)和irf
‑
7是i型ifn基因的关键激活物。在病毒诱导的c末端磷酸化之后(通过tbk1)，活化的irf
‑
3和irf
‑
7形成同源二聚体，从细胞质易位至细胞核，并与ifn刺激的应答元件(isre)结合以诱导i型ifn应答。irf
‑
3在未受刺激的细胞中组成型表达，以无活性的细胞质形式存在，而irf
‑
7在细胞中不组成型表达，并且由ifn、脂多糖和病毒感染诱导。irf
‑
3的过表达显著增加了病毒介导的i型ifn基因的表达，从而诱导抗病毒
状态。irf
‑
3激活也已显示出在病毒感染后上调cc
‑
趋化因子rantes(ccl5)的转录(lin et al.(1999)mol.cell biol.19(4):2465
‑
2474)。
[0603]
irf
‑
3的c末端结构域中的残基s385、s386、s396、s398、s402、t404和s405在病毒感染后被磷酸化，诱导构象变化，这导致irf
‑
3激活。irf
‑
3激活不仅由病毒感染诱导，也由脂多糖(lps)和poly(i:c)诱导。在irf
‑
3的c末端簇中可以磷酸化的7个残基中，单点突变s396d足以产生组成型活性形式的irf
‑
3。与野生型irf
‑
3相比，irf
‑
3(s396d)将ifnα1、ifn
‑
β和rantes启动子的反式激活分别提高了13、14和11倍。与野生型irf
‑
3相比，另一个突变体irf
‑
3(s396d/s398d)将ifnα1、ifn
‑
β和rantes启动子的反式激活分别提高了13、12和12倍。irf3的另一个组成型活性突变体是irf
‑
3(5d)，其中第396、398、402、404和405位的丝氨酸或苏氨酸残基被拟磷酸天冬氨酸残基取代(irf
‑
3(s396d/s398d/s402d/t404d/s405d))。通过将免疫应答信号传导途径中的其它蛋白质如rig
‑
i、mda5和sting中的丝氨酸残基突变为拟磷酸天冬氨酸，可以实现类似的功能获得性突变，导致免疫应答介导物的组成型活性，如i型干扰素的诱导。
[0604]
irf
‑
3(5d)显示组成型dna结合和反式激活活性、二聚体形成、与转录辅激活因子p300(也称为ep300或e1a结合蛋白p300)/cbp(也称为creb结合蛋白或crebbp)缔合以及核定位。病毒感染不会进一步诱导其反式激活活性。irf
‑
3(5d)是一种非常强的ifn
‑
β和isg15基因表达激活物；单独的irf
‑
3(5d)刺激ifn
‑
β表达与病毒感染一样强烈，以及与野生型irf
‑
3相比使ifnα1、ifn
‑
β和rantes启动子的反式激活分别提高9倍、5.5倍和8倍(见例如lin et al.(2000)j.biol.chem.275(44):34320
‑
34327；lin et al.(1998)mol.cell biol.18(5):2986
‑
2996；servant et al.(2003)j biol.chem.278(11):9441
‑
9447)。任何的第s385、s386、s396、s398、s402、t404和s405位可以单独或组合突变，以在本文提供的免疫刺激性细菌、溶瘤病毒和其它递送剂例如外泌体中产生组成型活性的irf
‑
3突变体。
[0605]
irf
‑
7的组成型活性形式包括其中不同的c末端丝氨酸被拟磷酸asp取代的突变体，包括irf
‑
7(s477d/s479d)、irf
‑
7(s475d/s477d/s479d)和irf
‑
7(s475d/s476d/s477d/s479d/s483d/s487d)。irf
‑
7(s477d/s479d)是ifna和rantes基因表达的强反式激活物，并且刺激基因表达，即使在没有病毒感染的情况下。irf
‑
7(s475d/s477d/s479d)和irf
‑
7(s475d/s476d/s477d/s479d/s483d/s487d)没有进一步增强irf
‑
7(s477d/s479d)的反式激活活性，但是所有3个突变体的反式激活活性都受到病毒感染的进一步刺激。位于未感染细胞的细胞核的突变体irf
‑
7(δ247
‑
467)是irf
‑
7的一种非常强的组成型形式；其在未受刺激和病毒感染的细胞中激活的转录比野生型irf
‑
7高1500倍以上(lin et al.(2000)j biol.chem.275(44):34320
‑
34327)。本文提供的免疫刺激性细菌、病毒和其它递送剂例如外泌体，可以编码和表达组成型活性irf
‑
7突变体，包括在残基475
‑
477、479、483和487处具有取代的那些，以及具有氨基酸缺失的那些。所述免疫刺激性细菌在由哺乳动物宿主(包括人)识别的启动子和任何其它希望的调节信号控制下在质粒上编码这些蛋白质。
[0606]
8.其它i型ifn调节蛋白
[0607]
参与识别激活i型ifn应答的dna/rna的其它蛋白质可以突变以产生组成型i型ifn表达。未修饰的和/或修饰的蛋白质可以在本文提供的免疫刺激性细菌、溶瘤病毒和其它递送载具例如外泌体和脂质体中编码，以用于将蛋白质递送至肿瘤微环境如递送至肿瘤驻留免疫细胞，以增加i型干扰素的表达。
[0608]
这些蛋白质包括但不限于如下名称的蛋白质：trim56，rip1，sec5，traf2，traf3，traf6，stat1，lgp2，ddx3，dhx9，ddx1，ddx21，dhx15，dhx33，dhx36，ddx60和snrnp200。
[0609]
[0610][0611]
可以在体外进行定点诱变，以鉴别具有增强活性的突变，其导致i型ifn更高水平表达和/或组成型表达。完整的基因组dna可得自经历自身免疫和自身炎症症状的非相关患者及得自健康个体，以筛选和鉴别其表达导致i型ifn表达增加或组成型表达的其它产物。可以进行全外显子组测序，并且可以分析内含子和外显子，从而鉴别在与i型干扰素增加的或组成型表达相关的途径中具有突变的蛋白质。在鉴别突变后，将编码全长基因的cdna分子(带有或不带有鉴别的突变)转染进报告细胞系中，其测量i型干扰素的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达置于ifn
‑
β的启动子控制下。组成型活性的功能获得性突变体将促进ifn
‑
β的表达，而未受刺激的野生型蛋白则否。刺激可以通过病毒感染、细菌感染、细菌核酸、lps、dsrna、poly(i:c)或通过增加蛋白质配体(例如cdn)的外源水平来实现。鉴别的蛋白质还包括增强针对对象中感兴趣的抗原的免疫应答的蛋白质。所述免疫应答包括细胞或体液免疫应答，其特征在于如下一项或多项：(i)刺激i型干扰素信号传导途径；(ii)刺激nf
‑
κb信号传导途径；(iii)刺激炎症应答；(iv)刺激细胞因子产生；(v)刺激树突状细胞发育、活性或动员；(vi)表示产物的表达增强免疫应答的任何其它应答；以及(vii)前述(i)至(vi)的任何组合。
[0612]
9.其它治疗性产物
[0613]
免疫刺激性蛋白
[0614]
免疫刺激性细菌还可以编码免疫刺激性蛋白，例如细胞因子，包括趋化因子，其增强或刺激或唤起抗肿瘤免疫应答，特别是当在肿瘤、肿瘤微环境和/或肿瘤驻留免疫细胞中表达时。可以修饰本文的免疫刺激性细菌以编码促进或诱导或增强抗肿瘤应答的免疫刺激性蛋白。免疫刺激性蛋白可以在真核启动子控制下的细菌中的质粒上编码，例如rna聚合酶ii识别的启动子，用于在真核对象中表达，特别是待施用所述免疫刺激性细菌的对象，例如人。除了真核启动子之外，编码免疫刺激性蛋白的核酸还可以包括用于在细胞中表达或运输的其它调节信号，例如用于细胞表面上的分泌或表达的其它调节信号。
[0615]
可以修饰本文的免疫刺激性细菌以编码促进或诱导或增强抗肿瘤应答的免疫刺激性蛋白。免疫刺激性蛋白可以在真核启动子控制下的细菌中的质粒上编码，例如rna聚合酶ii识别的启动子，用于在真核对象中表达，特别是待施用所述免疫刺激性细菌的对象，例如人。除了真核启动子之外，编码免疫刺激性蛋白的核酸还可以包括用于在细胞中表达或运输的其它调节信号，例如用于细胞表面上的分泌或表达的其它调节信号。
[0616]
免疫刺激性蛋白是在合适的环境例如肿瘤微环境(tme)中可以促进或参与或增强施用所述免疫刺激型细菌的对象的抗肿瘤应答的那些。免疫刺激性蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，例如但不限于il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12、il
‑
15和il
‑
18；趋化因子，例如但不限于ccl3、ccl4、ccl5、cxcl9、cxcl10和cxcl11；和/或共刺激分子，例如但不限于cd40、cd40l、ox40、ox40l、4
‑
1bb、4
‑
1bbl、tnf/tnfr超家族成员和b7
‑
cd28家族成员。本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可以促进、增强或以另外增加或唤起抗肿瘤应答的其它这种免疫刺激性蛋白被考虑用于在本文提供的免疫刺激细菌中进行编码。
[0617]
在一些实施方案中，本文中的免疫刺激性细菌被工程化为表达细胞因子以刺激免疫系统，包括但不限于il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12(il
‑
12p70(il
‑
12p40 il
‑
12p35))、il
‑
15(和il
‑
15:il
‑
15rα链复合物)和il
‑
18。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，免疫刺激性细菌可以被工程化以表达趋化因子，例如ccl3、ccl4、ccl5、cxcl9、cxcl10和cxcl11。这些修饰和编码其的细菌在上面讨论，并在下面举例说明。
[0618]
编码细胞因子和趋化因子的免疫刺激性细菌
[0619]
在一些实施方案中，本文中的免疫刺激性细菌被工程化为表达细胞因子以刺激免疫系统，包括但不限于il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12(il
‑
12p70(il
‑
12p40 il
‑
12p35))、il
‑
15(和il
‑
15:il
‑
15rα链复合物)和il
‑
18。细胞因子刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，并增强细胞毒性细胞对肿瘤细胞的识别。在一些实施方案中，免疫刺激性细菌可以被工程化以表达趋化因子，例如ccl3、ccl4、ccl5、cxcl9、cxcl10和cxcl11。
[0620]
免疫刺激性蛋白是在合适的环境例如肿瘤微环境(tme)中可以促进或参与或增强施用免疫刺激性细菌的对象的抗肿瘤应答的那些。免疫刺激性蛋白包括但不限于细胞因子、趋化因子和共刺激分子。这些包括细胞因子，例如但不限于il
‑
2、il
‑
7、il
‑
12、il
‑
15和il
‑
18；趋化因子，例如但不限于ccl3、ccl4、ccl5、cxcl9、cxcl10和cxcl11；和/或共刺激分子，例如但不限于cd40、cd40l、ox40、ox40l、4
‑
1bb、4
‑
1bbl、tnf/tnfr超家族成员和b7
‑
cd28家族成员。本领域技术人员已知的用于治疗肿瘤或可以促进、增强或以另外增加或唤起抗
肿瘤应答的其它这种免疫刺激性蛋白被考虑用于在本文提供的免疫刺激细菌中进行编码。
[0621]
还可以修饰本文提供的免疫刺激细菌的基因组以增加或促进免疫细胞的感染，特别是肿瘤微环境中的免疫细胞，例如吞噬细胞。还可以对细菌进行修饰以减少免疫细胞中的细胞焦亡。免疫刺激性细菌包括例如具有破坏/抑制spi
‑
1途径的修饰的那些，例如hila的破坏或缺失，和/或鞭毛蛋白基因、杆状蛋白、针状蛋白和/或pagp的破坏/缺失，如本文别处详述和示例。
[0622]
il
‑2[0623]
白细胞介素
‑
2(il
‑
2)是第一个被批准用于治疗癌症的细胞因子，其通过几种机制参与免疫系统的激活，包括激活和促进ctl生长，淋巴因子激活的杀伤细胞(lak)的产生，促进treg细胞生长和增殖，刺激til，促进t细胞、b细胞和nk细胞增殖和分化。重组il
‑
2(ril
‑
2)被fda批准用于治疗转移性肾细胞癌(rcc)和转移性黑色素瘤(sheikhi et al.(2016)iran j.immunol.13(3)：148
‑
166)。
[0624]
il
‑7[0625]
il
‑
7是il
‑
2超家族的成员，与t细胞的存活、增殖和体内平衡有关。il
‑
7受体中的突变已示出导致t细胞的丧失和严重联合免疫缺陷(scid)的发展，突出了il
‑
7在t细胞发育中的关键作用。il
‑
7是一种稳态细胞因子，可为静息的初始和记忆t细胞提供连续信号，以及在淋巴细胞减少症期间积累，导致t细胞增殖和t细胞库集多样性增加。与il
‑
2相比，il
‑
7选择性地扩展cd8
t细胞而不是cd4
foxp3
调节性t细胞。重组il
‑
7已示出增强小鼠中接种疫苗和过继细胞疗法后的抗原特异性t细胞应答。il
‑
7还可以在造血干细胞移植化疗后促进t细胞恢复中发挥作用。晚期恶性肿瘤患者的早期临床实验表明，重组il
‑
7在生物活性剂量下具有良好的耐受性和有限的毒性(即其中循环cd4
和cd8
t细胞的数量增加了3至4倍)(lee,s.and margolin,k.(2011)cancers 3:3856
‑
3893)。已示出il
‑
7对肿瘤(例如胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、前列腺癌和胶质母细胞瘤)具有抗肿瘤作用，并且在小鼠模型中体内施用il
‑
7导致癌细胞生长减少。il
‑
7还被证实增强ifn
‑
γ在大鼠胶质瘤肿瘤中的抗肿瘤作用，并诱导单核细胞产生il
‑
1α、il
‑
1β和tnf
‑
α，从而抑制黑色素瘤生长。此外，在治疗小儿肉瘤后施用重组il
‑
7导致促进免疫恢复(lin et al.(2017)anticancer research 37:963
‑
968)。
[0626]
il
‑
12(il
‑
12p70(il
‑
12p40 il
‑
12p35))
[0627]
促进细胞介导的免疫性的生物活性il
‑
12(il
‑
12p70)是一种异源二聚体，由p35和p40亚基组成，而il
‑
12p40单体和同源二聚体则作为il
‑
12拮抗剂。il
‑
12由抗原呈递细胞分泌，促进nk细胞和t细胞分泌ifn
‑
γ，抑制肿瘤血管生成，导致nk细胞、cd8
t细胞和cd4
t细胞的活化和增殖，增强cd4
th0细胞向th1细胞分化，以及促进针对肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。il
‑
12在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌和肉瘤的小鼠模型中已示出抗肿瘤作用(kalinski et al.(2001)blood 97:3466
‑
3469；sheikhi et al.(2016)iran j.immunol.13(3):148
‑
166；lee,s.and margolin,k.(2011)cancers 3:3856
‑
3893)。
[0628]
il
‑
15和il
‑
15:il
‑
15rα
[0629]
il
‑
15在结构上与il
‑
2相似，虽然il
‑
2和il
‑
15均为t细胞的增殖和活化提供早期刺激，但il
‑
15阻断il
‑
2诱导的细胞凋亡，这是导致消除刺激的t细胞及诱导t细胞耐受、限制记忆性t细胞应答及潜在限制单独的il
‑
2的治疗功效的过程。il
‑
15还支持记忆cd8
t细
胞的持久性，以维持长期抗肿瘤免疫性，并通过以抗原非依赖性方式直接激活cd8
效应t细胞，在临床前小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性。除了cd8
t细胞外，il
‑
15负责效应子自然杀伤(nk)细胞的发育、增殖和激活(lee,s.and margolin,k.(2011)cancers 3:3856
‑
3893；han et al.(2011)cytokine 56(3):804
‑
810)。
[0630]
il
‑
15和il
‑
15受体α(il
‑
15rα)由抗原呈递细胞(例如单核细胞和树突状细胞)协同表达，并且il
‑
15通过il
‑
15rα反式呈递给在cd8
t细胞和nk细胞表面上表达的il
‑
15βγc受体复合物。可溶的il
‑
15:il15
‑
rα复合物已示出通过il
‑
15βγc复合物调节免疫应答，以及示出将il
‑
15以预先形成的il
‑
15和可溶的il
‑
15rα复合物施用，il
‑
15的生物活性增加50倍，其半衰期与单独施用il
‑
15相比更长。这种通过与il
‑
15rα预缔合显著提高il
‑
15的治疗功效已在鼠肿瘤模型中证实(han et al.(2011)cytokine 56(3):804
‑
810)。
[0631]
il
‑
18
[0632]
il
‑
18通过nk和cd8
t细胞诱导ifn
‑
γ分泌，增强其毒性。il
‑
18还激活巨噬细胞并刺激th1辅助cd4
t细胞的发育。il
‑
18在一些临床前小鼠模型中已示出有希望的抗肿瘤活性。例如，施用重组il
‑
18(ril
‑
18)通过激活cd4
t细胞和/或nk细胞介导的应答，导致同源小鼠的黑色素瘤或肉瘤消退。其它研究表明，il
‑
18的抗肿瘤作用是由ifn
‑
γ介导的，并涉及抗血管生成机制。il
‑
18与其它细胞因子(如il
‑
12)或共刺激分子(如cd80)的组合增强了il
‑
18介导的抗肿瘤作用。晚期实体瘤和淋巴瘤患者的i期临床实验表明施用il
‑
18是安全的，并且导致免疫调节活性和患者中血清ifn
‑
γ和gm
‑
csf水平增加及适度的临床应答。临床实验表明，il
‑
18可以与其它抗癌治疗剂组合，如单克隆抗体、细胞毒性药物或疫苗(fabbi et al.(2015)j.leukoc.biol.97:665
‑
675；lee,s.and margolin,k.(2011)cancers 3:3856
‑
3893)。
[0633]
已发现经工程化为表达il
‑
18的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株，在全身施用后在同源小鼠中抑制皮下(s.c.)的肿瘤或肺转移瘤的生长，而没有任何毒性作用。使用这种工程化细菌进行治疗诱导肿瘤中t细胞、nk细胞和粒细胞的累积，并导致细胞因子的瘤内产生(fabbi et al.(2015)j.leukoc.biol.97:665
‑
675)。
[0634]
趋化因子
[0635]
趋化因子是小细胞因子家族，可介导白细胞迁移到损伤或炎症区域，并参与介导免疫和炎症应答。根据半胱氨酸残基在其序列中的位置，趋化因子分为四个亚家族，即xc
‑
、cc
‑
、cxc
‑
和cx3c
‑
趋化因子配体，或xcl、ccl、cxcl和cx3cl。趋化因子配体与其同源受体结合并调节免疫细胞的循环、归巢和滞留，其中每个趋化因子配体
‑
受体对选择性地调节某种类型的免疫细胞。不同的趋化因子吸引不同的白细胞群体，并在体内形成浓度梯度，其中被吸引的免疫细胞通过梯度向趋化因子浓度较高的方向移动(argyle d.and kitamura,t.(2018)front.immunol.9:2629；dubinett et al.(2010)cancer j.16(4):325
‑
335)。趋化因子可以通过增加免疫细胞对肿瘤的浸润，促进抗原呈递细胞(apc)向肿瘤引流淋巴结移动，引发幼稚t细胞和b细胞，从而改良抗肿瘤免疫应答(lechner et al.(2011)immunotherapy 3(11):13171340)。本文的免疫刺激性细菌可以被工程化以编码趋化因子，包括但不限于ccl3、ccl4、ccl5、cxcl9、cxcl10和cxcl11。
[0636]
ccl3，ccl4，ccl5
[0637]
ccl3、ccl4和ccl5具有高度的同源性，并在人和小鼠中的结合一些细胞类型包括
未成熟dc和t细胞上的ccr5(ccl3、ccl4和ccl5)和ccr1(ccl3和ccl5)。已示出治疗性t细胞通过ccl3、ccl4和ccl5的肿瘤特异性分泌诱导先天免疫细胞趋化于肿瘤部位(dubinett et al.(2010)cancer j.16(4):325
‑
335)。
[0638]
诱导t辅助细胞1型(th1)应答可释放ccl3。小鼠体内和体外研究表明，ccl3对中性粒细胞和单核细胞均有趋化性；具体而言，ccl3可以介导骨髓前体细胞(mpc)从骨髓动员，并具有mpc调节和刺激作用。用ccl3转染的人卵巢癌细胞示出肿瘤内增强的t细胞浸润和巨噬细胞，导致改良的抗肿瘤应答，并表明ccl3介导的中性粒细胞趋化性抑制了肿瘤生长。被ccl3招募的用肿瘤抗原人黑色素瘤相关基因(mage)
‑
1转染的dc在黑色素瘤小鼠模型中表现出优异的抗肿瘤作用，包括增加淋巴细胞增殖、细胞溶解能力、存活力和降低肿瘤生长。ccl3与mage
‑
1的抗原特异性平台的组合使用也已用于治疗胃癌。ct26是一种高免疫原性小鼠结肠肿瘤，其产生的ccl3减缓体内肿瘤生长；这个过程被表明是由自然杀伤(nk)细胞的ccl3依赖性累积驱动，并因此ifnγ导致cxcl9和cxlc10的产生(allen et al.(2017)oncoimmunology 7(3):e1393598；schaller et al.(2017)expert rev.clin.immunol.13(11):1049
‑
1060)。
[0639]
ccl3已被用作治疗癌症的佐剂。在小鼠肝细胞癌射频消融后施用ccl3活性变体eci301增加了肿瘤特异性应答，并且进一步表明这种机制依赖于ccr1的表达。也已经示出ccl3在全身性癌症中作为佐剂取得了成功，在白血病/淋巴瘤模型中接种ccl3和il
‑
2或粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)的小鼠表现出存活率增加(schaller et al.(2017)expert rev.clin.immunol.13(11):1049
‑
1060)。
[0640]
ccl3和ccl4在指导cd8
t细胞浸润进黑色素瘤和结肠癌的原发肿瘤部位中发挥作用。ccl4的肿瘤产生导致cd103
dc的累积；通过wnt/β
‑
连环蛋白依赖性途径抑制ccl4，阻止黑色素瘤肿瘤的cd103
dc浸润(spranger et al.(2015)nature 523(7559):231
‑
235)。在结肠癌小鼠模型中，ccl3还显示出增强cd4
和cd8
t细胞向原发肿瘤部位的浸润(allen et al.(2017)oncoimmunology 7(3):e1393598)。
[0641]
ccl3或ccl5与其受体(分别为ccr1和ccr5)的结合将未成熟的dc、单核细胞、记忆和t效应细胞从循环中移至炎症或感染部位。例如，在结肠直肠肿瘤中的ccl5表达有助于t淋巴细胞的趋化作用和存活。ccl3和ccl5已在几个临床前模型中单独使用或组合疗法中使用以诱导肿瘤消退和免疫性。例如，研究表明，皮下注射经遗传修饰为表达ccl3的中国仓鼠卵巢细胞，导致肿瘤抑制和中性粒细胞浸润。在另一项研究中，重组溶瘤腺病毒表达ccl5(ad
‑
rantes
‑
e1a)在乳腺癌小鼠模型中导致原发肿瘤消退并阻止转移(lechner et al.(2011)immunotherapy 3(11):1317
‑
1340)。
[0642]
在结肠直肠癌的转化研究中，ccl5在巨噬细胞中诱导“抗病毒应答模式”。作为cxcr3介导的淋巴细胞在结直肠癌肝转移浸润边缘迁移的结果，产生了ccl5。阻断ccr5(ccl5受体)导致肿瘤死亡，这是由产生ifn的巨噬细胞和活性氧驱动的。虽然巨噬细胞存在于肿瘤微环境中，但ccr5抑制诱导从m2至m1的表型转变。ccr5阻断还导致结直肠癌患者的临床反应(halama et al.(2016)cancer cell 29(4):587
‑
601)。
[0643]
ccl3、ccl4和ccl5可用于治疗包括淋巴肿瘤、膀胱癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌或肝癌的病况(美国专利公开号us 2015/0232880；国际专利公开号wo 2015/059303、wo 2017/043815、wo 2017/156349和wo 2018/191654)。
[0644]
cxcl9，cxcl10，cxcl11
[0645]
cxcl9(mig)、cxcl10(ip10)和cxcl11(itac)由ifn
‑
γ的产生而诱导。这些趋化因子结合cxcr3，优先在活化的t细胞上表达，并在血管生成抑制和白细胞的募集和活化中起作用。结直肠癌的预后与肿瘤浸润性t细胞密切相关，尤其是th1和cd8
效应t细胞；cxcl9、cxcl10和cxcl11的高肿瘤内表达表明预后良好。例如，在163名结肠癌患者的样本中，具有高水平cxcl9或cxcl11的患者显示术后生存率增加，而cxc高表达患者的cd3
t细胞、cd4
t辅助细胞和cd8
细胞毒性t细胞数量显著增加。在结直肠癌患者的肝转移中，cxcl9和cxcl10水平在浸润边缘增加，并且与效应t细胞密度相关。通过cxcl9和cxcl10对cxcr3的作用刺激淋巴细胞迁移导致在浸润边缘产生ccl5(halama et al.(2016)cancer cell 29(4):587
‑
601；kistner et al.(2017)oncotarget 8(52):89998
‑
90012)。
[0646]
在体内，cxcl9对肿瘤浸润淋巴细胞、活化的外周血淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞和th1淋巴细胞起到化学引诱物的作用。cxcl9对于t细胞介导的皮肤肿瘤抑制也至关重要。例如，当与全身性il
‑
2组合时，cxcl9已被证实可通过增加cxcr3
单核细胞的肿瘤内浸润来抑制肿瘤生长。在结肠癌的小鼠模型中，huks1/4
‑
il
‑
2融合蛋白与cxcl9基因疗法的组合通过cd8
和cd4 t淋巴细胞的化学吸引和激活获得了优异的抗肿瘤效果和延长寿命(dubinett et al.(2010)cancer j.16(4):325
‑
335；ruehlmann et al.(2001)cancer res.61(23):8498
‑
8503)。
[0647]
cxcl10由活化的单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞产生，对活化的t细胞具有趋化性，并可作为体内血管生成的抑制剂。cxcl10在结直肠肿瘤中的表达已示出有助于细胞毒性t淋巴细胞的趋化作用和更长的生存期。已示出施用免疫刺激性细胞因子如il
‑
12增强cxcl10产生的抗肿瘤作用。用肿瘤细胞裂解物引发及用cxcl10转染的dc疫苗在小鼠中具有增强的免疫保护作用和有效性；所述动物表现出对肿瘤挑战的抵抗力、肿瘤生长减慢和更长的存活时间。与未用融合蛋白治疗的肿瘤相比，使用cxcl10
‑
粘蛋白
‑
gpi融合蛋白在小鼠中进行的体内和体外研究导致肿瘤具有更高水平的募集的nk细胞。干扰素(可由浆细胞样树突细胞产生；这些细胞与原发性黑色素瘤病变相关，以及可以被ccl20募集到肿瘤部位)可以作用于肿瘤dc亚群，例如cd103
dc，已示出在小鼠黑色素瘤模型中产生cxcl9/10，及在人疾病中与cxcl9/10相关。相对于原发性黑色素瘤样品，cxcl10在人转移性黑色素瘤样品中也显示出更高的表达。在治疗上，辅助ifn
‑
α黑色素瘤疗法上调cxcl10的产生，而化学治疗剂顺铂诱导cxcl9和cxcl10(dubinett et al.(2010)cancer j.16(4):325
‑
335；kuo et al.(2018)front.med.(lausanne)5:271；li et al.(2007)scand.j.immunol.65(l):8
‑
13；muenchmeier et al.(2013)plos one 8(8):e72749)。
[0648]
已经确立cxcl10/11和cxcr3在源自基底细胞癌(bcc)的人角质形成细胞中表达。cxcl11在人基底细胞癌中还能促进免疫抑制性吲哚胺2,3
‑
双加氧酶(ido)的表达以及增强角质形成细胞的增殖，这可以降低任何浸润性cxcr3
效应t细胞的抗肿瘤活性(kuo et al.(2018)front.med.(lausanne)5:271)。
[0649]
cxcl9、cxcl10和cxcl11可以在溶瘤病毒中编码以治疗癌症(美国专利公开号us 2015/0232880；国际专利公开号wo 2015/059303)。假型溶瘤病毒或编码cxcl10基因的遗传工程化细菌可用于治疗癌症(国际申请公开号wo 2018/006005和wo 2018/129404)。
[0650]
共刺激分子
[0651]
共刺激分子增强对肿瘤细胞的免疫应答，以及肿瘤细胞抑制共刺激途径而促进肿瘤发生。本文的免疫刺激性细菌可以被工程化为表达共刺激分子，例如cd40、cd40l、4
‑
1bb、4
‑
1bbl、ox40(cd134)、ox40l(cd252)、tnfr超家族的其它成员(例如cd27、gitr、cd30、fas受体、trail
‑
r、tnf
‑
r、hvem、rank)、b7和cd28。本文中的免疫刺激性细菌也可以被工程化为表达针对共刺激分子的激动抗体以增强抗肿瘤免疫应答。
[0652]
tnf受体超家族
[0653]
tnf配体超家族(tnfsf)及其受体(tnfrsf)参与肿瘤和免疫效应细胞的增殖、分化、活化和存活。这个家族的成员包括诱导细胞凋亡的cd30、fas
‑
l、trail
‑
r和tnf
‑
r，以及调节b和t细胞免疫应答的cd27、ox40l、cd40l、gitr
‑
l和4
‑
1bbl。其它成员包括疱疹病毒进入介导物(hvem)。本文的免疫刺激性细菌表达tnfsf和tnfrsf可增强抗肿瘤免疫应答。例如，已经表明，4
‑
1bbl在小鼠肿瘤中的表达增强了免疫原性，以及肿瘤内注射ox40l表达增加的树突状细胞(dc)可导致小鼠模型中的肿瘤排斥。研究还表明，将表达重组gitr的腺病毒注射进b16黑色素瘤细胞中促进t细胞浸润并减少肿瘤体积。针对分子(例如4
‑
1bb、ox40和gitr)的刺激性抗体也可由免疫刺激性细菌编码以刺激免疫系统。例如，已显示激动性抗4
‑
1bb单克隆抗体增强抗肿瘤ctl应答，而激动性抗ox40抗体已示出增加可移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性。此外，激动性抗gitr抗体已示出增强抗肿瘤应答和免疫性(lechner et al.(2011)immunotherapy 3(11):1317
‑
1340；peggs et al.(2009)clinical and experimental immunology 157:9
‑
19)。
[0654]
cd40和cd40l
[0655]
cd40是tnf受体超家族的成员，由apc和b细胞表达，而其配体cd40l(cd154)由活化的t细胞表达。cd40和cd40l之间的相互作用刺激b细胞产生细胞因子，导致t细胞活化和肿瘤细胞死亡。研究表明，抗肿瘤免疫应答因t细胞上cd40l或树突细胞上cd40的表达减少而受损。cd40在一些b细胞肿瘤如滤泡性淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、成淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病的表面上表达，并且其与cd40l的相互作用已示出在cd40
肿瘤细胞中增加b7.1/cd80、b7.2/cd86和hla ii类分子的表达，以及增强其抗原呈递能力。cd40l在多发性骨髓瘤小鼠模型中的转基因表达导致cd4
和cd8
t细胞的诱导、局部和全身抗肿瘤免疫应答以及肿瘤生长减少。抗cd40激动性抗体也诱导抗肿瘤t细胞应答(marin
‑
acevedo et al.(2018)journal of hematology&oncology 11:39；dotti et al.(2002)blood 100(1):200
‑
207；murugaiyan et al.(2007)j immunol.178:2047
‑
2055)。
[0656]4‑
1bb和4
‑
1bbl
[0657]4‑
1bb(cd137)是一种可诱导的共刺激受体，由t细胞、nk细胞和apc包括dc、b细胞和单核细胞表达，其结合其配体4
‑
1bbl触发免疫细胞增殖和激活。4
‑
1bb导致活化t细胞的应答时间更长以及范围更广。抗4
‑
1bb激动剂和4
‑
1bbl融合蛋白已示出增加免疫介导的抗肿瘤活性，例如由cd4
和cd
t细胞介导的针对肉瘤和肥大细胞瘤的免疫介导的抗肿瘤活性，以及肿瘤特异性ctl活性(lechner et al.(2011)immunotherapy 3(11):1317
‑
1340；marin
‑
acevedo et al.(2018)journal of hematology&oncology 11:39)。
[0658]
ox40和ox40l
[0659]
ox40(cd134)是tnf受体超家族的成员，其在激活的效应t细胞上表达，而其配体ox40l在apc包括dc、b细胞和巨噬细胞上表达，随后由tlr激动剂及cd40
‑
cd40l信号传导激
活。ox40
‑
ox40l信号传导导致t细胞的激活、增强、增殖和存活，以及调节nk细胞功能和抑制treg的抑制活性。通过ox40的信号传导还导致细胞因子(il
‑
2、il
‑
4、il
‑
5和ifn
‑
γ)的分泌，增强th1和th2细胞应答。til对肿瘤抗原的识别导致通过til的ox40的表达增加，这与改善的预后相关。研究表明，用抗ox40激动抗体或fc
‑
ox40l融合蛋白的治疗在黑色素瘤、肉瘤、结肠癌和乳腺癌小鼠模型中增强肿瘤特异性cd4
t细胞应答及增加存活率，而掺入肿瘤细胞疫苗中的fc
‑
ox40l保护小鼠免受乳腺癌细胞的后续攻击(lechner et al.(2011)immunotherapy 3(11):1317
‑
1340；marin
‑
acevedo et al.(2018)journal of hematology&oncology 11:39)。
[0660]
b7
‑
cd28家族
[0661]
cd28是在t细胞表面表达的共刺激分子，其充当b7
‑
1(cd80)和b7
‑
2(cd86)的受体，其是在抗原呈递细胞上表达的共刺激分子。cd28
‑
b7信号传导是t细胞活化和存活以及防止t细胞无效能所需的，并导致白细胞介素如il
‑
6的产生。
[0662]
最佳的t细胞引发需要两个信号：(1)mhc呈递的抗原的t细胞受体(tcr)识别，和(2)得自t细胞cd28与在apc上表达的b7
‑
1(cd80)或b7
‑
2(cd86)连接的共刺激信号。在t细胞激活后，ctla
‑
4受体被诱导，然后在与b7
‑
1和b7
‑
2配体的结合方面胜过cd28。由于肿瘤细胞缺乏共刺激分子(例如b7
‑
1/cd80和b7
‑
2/cd86)的表达，导致无法激活t细胞受体复合物，因此肿瘤细胞的抗原呈递较差。结果，在肿瘤细胞表面上调这些分子可以增强其免疫原性。b7已成功诱导实体瘤和血液恶性病的免疫疗法，例如通过b7或可溶性b7免疫球蛋白融合蛋白的肿瘤细胞表达而实现。b7的病毒介导的肿瘤表达与其它共刺激配体如icam
‑
3和lfa
‑
3组合，已在治疗慢性淋巴细胞白血病和转移性黑色素瘤的临床前和临床实验中取得成功。此外，可溶的b7融合蛋白作为单药免疫疗法在实体瘤的免疫疗法中已示出有希望的结果(lechner et al.(2011)immunotherapy 3(11):1317
‑
1340；dotti et al.(2002)blood 100(1):200
‑
207)。
[0663]
f.编码蛋白质的免疫刺激性细菌以及示例质粒和递送载具的构建
[0664]
包括上述那些在内的治疗性产物在本文提供的免疫刺激性细菌中在质粒上编码，并且通常在宿主识别的调节信号的控制下。本文提供的免疫刺激性细菌经修饰以增加在肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境中的累积。其包括如上述对细菌基因组、细菌表达和宿主细胞侵润的修饰，例如改善或增加靶向于肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境或在肿瘤、肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤微环境中累积，以及还包括编码产物的质粒，所述产物通过包含细菌启动子在细菌中表达，或通过包含适当的真核启动子和其它适当的调节区在宿主中表达。所述免疫刺激性细菌如上所述被修饰，例如通过鞭毛的缺失和其它修饰，使所述细菌是asd
‑
、msbb
‑
和pagp
‑
中之一或多种，以及是腺苷营养缺陷型。
[0665]
为了导入质粒，使用标准方法转化细菌，例如用常规分子生物学工具和方法(dna合成、pcr扩增、dna限制性内切酶消化和用连接酶连接相容的粘性末端片段)构建的纯化的dna质粒进行电穿孔。如下文和本文别处所讨论的，质粒在宿主识别的启动子的控制下编码蛋白质，例如免疫刺激性蛋白如白介素，和/或修饰的功能获得性蛋白。这些编码的蛋白质刺激免疫系统，特别是在肿瘤微环境中。
[0666]
所述细菌可以在质粒上编码其它产物，通常在真核启动子的控制下表达，如rna聚合酶(rnap)ii或iii启动子。通常，rnapiii(也称为poliii)启动子是组成型的，而rnapii
(也称为polii)是可以被调控的。如本文所提供的，细菌菌株例如沙门氏菌菌株，包括鼠伤寒沙门氏菌，被修饰或鉴别为在肿瘤微环境中对于腺苷是营养缺陷的，并且携带编码治疗性蛋白质的质粒，例如sting及是导致i型ifn表达的胞质dna/rna传感器途径的一部分的其它免疫刺激性蛋白，以及还有这些蛋白质的变体，其增加i型ifn的表达或导致i型ifn的组成型表达。
[0667]
例如在本文提供的免疫刺激性细菌中在质粒上编码的治疗性产物包括诱导i型ifn的胞质dna/rna传感器及其组成型活性变体。这些治疗性产物包括例如sting、rig
‑
i、mda5、irf
‑
3和irf
‑
7，以及其gof变体，其组成型诱导i型干扰素，和/或在没有配体刺激的情况下被激活并诱导i型干扰素，所述配体是例如胞质核酸，包括cdn。编码的sting蛋白包括人sting的野生型和gof变体(包括等位基因变体)，以及来自其它物种的野生型或修饰的sting(例如gof变体)，例如来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、野猪、蝙蝠、海牛、朱鹮、腔棘鱼、小鼠和鬼鲨，其可以表现出较低的nf
‑
κb活性，并且任选地增加的irf3/i型ifn信号传导。其它治疗性产物包括免疫刺激性蛋白，如细胞因子、趋化因子和共刺激分子。
[0668]
细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌，可以感染多种细胞类型，包括肿瘤细胞和巨噬细胞。对于用免疫刺激性细菌如鼠伤寒沙门氏菌感染的细胞，质粒被释放，以及编码的蛋白质被宿主rna聚合酶转录并分泌到肿瘤微环境和肿瘤中。
[0669]
1.复制起点和质粒拷贝数
[0670]
质粒是自主复制的染色体外环状双链dna分子，其通过复制起点的方式维持在细菌内。拷贝数影响质粒稳定性。当随机分区发生在细胞分裂时，高拷贝数通常导致质粒的稳定性更高。大量质粒通常会降低生长速度，因此可能允许含有少量质粒的细胞在培养中占主导地位，因为其生长得更快。复制起点也决定了质粒的兼容性：即其在同一细菌细胞内与另一个质粒一起复制的能力。利用相同复制系统的质粒不能共存于同一细菌细胞中。据说其属于同一个兼容组。以来自同一兼容组的第二个质粒的形式导入新起点，模拟了驻留质粒的复制结果。因此，在将两个质粒分离到不同细胞以产生正确的复制前拷贝数之前，阻止任何进一步的复制。
[0671]
复制起点拷贝数seq id no.pmb115
‑
20254pl5a10
‑
12255psc101～5256pbr32215
‑
20243colel15
‑
20257pps1015
‑
20258rk2～5259r6k(α起点)15
‑
20260r6k(β起点)15
‑
20261r6k(γ起点)15
‑
20262p1(orir)低263r1低264pwsk低265
cole210
‑
15266puc(pmb1)500
‑
700267f1300
‑
500268
[0672]
许多细菌复制起点是本领域技术人员已知的，包括上表所列的那些。可以选择起点以获得期望的拷贝数。复制起点包含由dna依赖性dna聚合酶识别为质粒复制起始位点的序列(del solar et al.(1998)microbiology and molecular biology reviews 62(2):434
‑
464)。不同的复制起点提供了每个细胞内不同的质粒拷贝水平，并且可以每个细胞的拷贝数从一到数百不等。常用的细菌质粒复制起点包括但不限于pmb1衍生起点，其具有非常高的拷贝衍生物，cole1起点，p15a，psc101，pbr322，及其它具有低拷贝数的起点。这种起点是本领域技术人员熟知的。puc19起点导致每个细胞的拷贝数为500至700个拷贝。pbr322起点的已知拷贝数为15至20个。这些起点仅因单个碱基对而不同。cole1起点拷贝数为15至20个，而衍生物(例如pbluescript)的拷贝数范围为300至500个。例如，pacyc184中的p15a起点产生大约10的拷贝数。psc101起点赋予大约5的拷贝数。可以从中获得起点的其它低拷贝数载体包括例如pwsk29、pwks30、pwks129和pwks130(见wang et al.(1991)gene 100:195
‑
199)。中等至低拷贝数小于150，或小于100。低拷贝数是小于20、25或30。本领域技术人员可以鉴别具有低拷贝数或高拷贝数的质粒。例如，通过实验确定拷贝数是高还是低的一种方法是进行小量制备。高拷贝质粒每1ml的lb培养物应产生3
‑
5μg的dna；低拷贝质粒每1ml的lb培养物将产生0.2
‑
1μg的dna。
[0673]
细菌质粒的序列，包括复制起点的鉴别和序列，是熟知的(见例如snapgene.com/resources/plasmid_files/basic_cloning vectors/pbr322/)。选择高拷贝质粒用于体外蛋白质的异源表达，因为基因剂量相对于染色体基因增加和蛋白质的特异性产量更高，而对于治疗性细菌，编码的治疗剂的治疗剂量更高。然而，本文示出对于通过本文提供的免疫刺激性细菌递送编码治疗性产物的质粒，较低的拷贝数更有效。
[0674]
如果表达的分子对生物体有毒性，则要求细菌维持高拷贝质粒可能是一个问题。维持这些质粒的代谢要求可能以体内复制适应性为代价。用于递送编码治疗性产物的质粒的最佳质粒拷贝数可以取决于被工程化用于递送质粒的菌株的减毒机制。如果需要，鉴于本文的公开内容，本领域技术人员可以为特定免疫刺激物种和细菌菌株选择合适的拷贝数。在此表明，低拷贝数可能是有利的。
[0675]
2.质粒维持/选择组分
[0676]
通常通过在质粒上包含抗生素抗性基因并在生长培养基中使用抗生素来确保质粒在实验室环境中的维持。如上所述，在质粒上使用与功能性asd基因互补的asd缺失突变体允许在不使用抗生素的情况下在体外进行质粒选择，并且允许在体内进行质粒选择。asd基因互补系统提供了这样的选择(gal
á
n et al.(1990)gene 94(1)：29
‑
35)。使用asd基因互补系统将质粒维持在肿瘤微环境中提高了鼠伤寒沙门菌的效力，这些菌株被工程化以递送编码治疗性蛋白质或干扰rna的质粒。
[0677]
3.rna聚合酶启动子
[0678]
在真核细胞中，dna由三种类型的rna聚合酶转录，即rna pol i、ii和iii。rna pol i仅转录核糖体rna(rrna)基因，rna pol ii将dna转录为mrna和小核rna(snrna)，以及rna pol iii将dna转录为核糖体5s rrna(i型)、转运rna(trna)(ii型)和其它小rna如u6 snrna
(iii型)。当在细菌细胞中发生转录时，可以利用原核启动子，包括t7、pbad和pept启动子(guo et al.(2011)gene therapy 18:95
‑
105；美国专利公开号2012/0009153、2016/0369282；国际专利申请公开号wo 2015/032165、wo 2016/025582)。由于本文提供的细菌被设计成将质粒递送至肿瘤驻留免疫细胞中以通过宿主细胞转录/翻译机制表达，因此编码治疗性蛋白质/产物的核酸可操纵地连接于真核启动子，例如rnapii和rnapiii启动子。
[0679]
rna pol iii启动子通常用于组成型表达。对于可诱导的表达，使用rna pol ii启动子。示例包括可由l
‑
阿拉伯糖诱导的pbad启动子；四环素可诱导的启动子，如tre
‑
tight、ipt、tre
‑
cmv、tet
‑
on和tet
‑
off；逆转录病毒ltr；iptg可诱导的启动子，如laci、lac
‑
o应答启动子；loxp
‑
stop
‑
loxp系统启动子(美国专利号8,426,675；国际专利申请公开号wo 2016/025582)；和pept，其是一种缺氧诱导的启动子(yu et al.(2012)scientific reports 2:436)。这些启动子是熟知的。这些启动子的示例是人u6(seq id no:73)和人h1(seq id no:74)。
[0680][0681]
组织特异性启动子包括黑色素瘤细胞和黑色素细胞的trp2启动子；乳腺和乳腺癌细胞的mmtv启动子或wap启动子，肠细胞的villin启动子或fabp启动子，胰腺β细胞的rip启动子，角质形成细胞的角蛋白启动子，前列腺上皮的probasin启动子，cns细胞/癌症的巢蛋白(nestin)启动子或gfap启动子，神经元的酪氨酸羟化酶s100启动子或神经丝启动子，肺癌的clara细胞分泌蛋白启动子，以及心肌细胞的α肌球蛋白启动子(美国专利号8,426,675)。控制编码的治疗性产物表达的其它启动子包括例如ef
‑
1α启动子、cmv、sv40、pgk、eif4a1、cag和cd68启动子，所述治疗性产物例如是通过增加表达或使其成为组成型以诱导i型干扰素的蛋白质的功能获得性变体。
[0682]
4.dna核靶向序列
[0683]
dna核靶向序列(dts)如sv40 dts，介导dna序列通过核孔复合物的易位。据报道，这种转运机制依赖于包含核定位序列的dna结合蛋白的结合。已示出在质粒上包含dts以增加核转运和表达(见例如dean,d.a.et al.(1999)exp.cell res.253(2):713
‑
722)，并已被用于增加鼠伤寒沙门菌递送的质粒的基因表达(见例如kong et al.(2012)proc.natl.acad.sci.usa 109(47):19414
‑
19419)。
[0684]
rho非依赖性的或i类转录终止子，例如大肠杆菌的rrnb基因的t1终止子，包含dna序列，其形成导致转录延伸复合物的解离的二级结构。质粒中可包含转录终止子，以防止鼠伤寒沙门氏菌转录机制表达编码的治疗产物。这确保了编码的产物的表达仅限于宿主细胞转录机制。
[0685]
作为本文所述的癌症疗法，用于转化沙门菌属例如鼠伤寒沙门菌的质粒包含以下所有或部分属性：1)cpg岛，2)细菌复制起点，3)用于质粒维持的asd基因选择标记，4)一个或多个表达盒，5)dna核靶向序列和6)转录终止子。
[0686]
5.crispr
[0687]
编码crispr盒的免疫刺激性细菌可用于感染人免疫细胞、髓样细胞或造血细胞，以位点特异性地敲除感兴趣的靶基因。所使用的菌株可以是asd
‑
，并且可以包含缺少互补asd盒及包含kan盒的质粒。为了使菌株在液体培养基中体外生长，加入dap以互补asd
‑
遗传缺陷。感染人细胞后，所述菌株将不再复制，并递送crispr盒编码的质粒。所述菌株也可以是减少或防止吞噬细胞的细胞焦亡(炎症介导的细胞死亡)的hila
‑
或缺乏spi
‑
1的一个或多个部分、或缺乏鞭毛蛋白或其任何组合。
[0688]
g.编码非人sting蛋白和组成型诱导i型干扰素的功能获得性修饰的蛋白质和其它治疗性产物的其它递送载具
[0689]
如本文所述，提供了免疫刺激性细菌、溶瘤病毒和其它递送载具，例如外泌体、脂质体和纳米颗粒，其含有编码治疗性产物的核酸，所述治疗性产物例如是通过途径直接或间接诱导i型干扰素(ifn)包括干扰素
‑
β和干扰素
‑
α的蛋白质。这种蛋白质包括人和非人sting，以及其它蛋白质，例如rig
‑
1和mda5蛋白质，及其gof突变体，这些突变体包含使其活性为组成型的突变，从而使i型干扰素组成型表达。其它治疗性产物如细胞因子和其它免疫刺激性蛋白，也可以由这些递送载具编码和/或递送。这些载具在肿瘤细胞或肿瘤微环境累积，例如在肿瘤驻留免疫细胞中。
[0690]
1.外泌体、胞外囊泡及其它囊泡递送载具
[0691]
制备和使用以及靶向外泌体和纳米颗粒的众多方法为本领域技术人员已知(见例如公开的美国专利申请2013/0337066；2014/0093557、2018/0104187、2018/0193266和206104)。外泌体是由各种细胞类型分泌的30
‑
100nm囊泡。其被改变为用于递送核酸的递送载具。其可以靶向肿瘤。例如，其可以被工程化为在其表面表达靶向肿瘤的配体。
[0692]
外泌体是内吞来源的小膜囊泡，在多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体的直径范围在30到100nm之间。其表面由来自供体细胞细胞膜的脂质双层组成，并且包含来自产生外泌体的细胞的胞质，及在表面呈现来自亲本细胞的膜蛋白。
[0693]
外泌体是由多种类型细胞在体外和体内内源性分泌的纳米颗粒，并通常可以从体液例如血液、尿液和恶性腹水中分离。外泌体是杯状多泡体(mvb)，可通过囊泡从限制膜向内腔向内出芽和断裂形成。在mvb形成期间，跨膜蛋白和外周膜蛋白被吸收到囊泡膜中，并同时胞质组分也包埋在囊泡中。随着这个过程的进行，mvb最终与细胞膜融合，触发外泌体从细胞中释放。
[0694]
外泌体根据其来源的细胞类型表现出不同的组成和功能。外泌体由许多细胞产生，包括上皮细胞、b和t淋巴细胞、肥大细胞(mc)和树突状细胞(dc)。在人体中，外泌体存在于血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液、肠上皮细胞和肿瘤组织中。外泌体已被用于将核酸转移到细胞中，且可以靶向体内的任何细胞，包括免疫系统中的细胞。外泌体可以分离自不同来源的细胞，包括分离自体外生长的细胞，及分离自人体。可以产生外泌体使得其缺乏其自身遗传物质。产生不含遗传物质的外泌体的方法为本领域技术人员已知。它们包括紫外线照射、突将携带rna进入外泌体的蛋白质突变、电穿孔和化学处理以打开外泌体膜上的孔。所
述方法包括可修饰任何核酸负载于外泌体中任何蛋白质的突变/缺失。可以使用常规分子生物学技术如体外转化、转染和显微注射将rna或dna的遗传构建体导入外泌体。
[0695]
本文提供了外泌体和其它细胞外囊泡以及含有核酸、dna或rna的其它递送载具，其在细胞中编码功能获得性修饰的蛋白质，或包含编码的蛋白质，导致胞质ifn信号传导途径的组成型激活/对胞质核酸配体的敏感性增加(例如rig
‑
i、mda5和sting中的功能获得性突变，如本文所述)。这些递送载具可以编码其它蛋白质，例如增强免疫应答的免疫刺激性蛋白，包括例如细胞因子。外泌体和其它载具可以设计为靶向或积聚在肿瘤微环境中的细胞中，包括在肿瘤驻留免疫细胞和肿瘤细胞中。
[0696]
2.溶瘤病毒
[0697]
溶瘤病毒在肿瘤中累积和复制，可导致肿瘤细胞裂解，以及对释放的肿瘤抗原和病毒产物的免疫应答，导致肿瘤消退。溶瘤病毒通过在肿瘤细胞(包括转移性肿瘤细胞例如循环的肿瘤细胞)中定植或累积来实现治疗。溶瘤病毒可以被工程化为编码在肿瘤细胞中表达的治疗性产物。
[0698]
溶瘤病毒包括天然存在和工程重组的病毒，例如但不限于痘病毒例如痘苗病毒(vaccinia virus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno
‑
associated virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼肠孤病毒(reovirus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、塞内卡河谷病毒(seneca valley virus)、新城疫病毒(newcastle disease virus)、仙台病毒(sendai virus)、登革热病毒(dengue virus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、细小病毒(parvovirus)、逆转录病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、甲病毒(alphavirus)、黄病毒(flavivirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、流感病毒(influenza virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemia virus)和辛德比斯病毒(sindbis virus)等。在许多情况下，肿瘤选择性是病毒的固有性质，例如痘苗病毒和其它溶瘤病毒。溶瘤病毒包括但不限于本领域技术人员已知的那些及包括例如水泡性口炎病毒(见例如美国专利号7,731,974，7,153,510和6,653,103；美国专利公开号2010/0178684，2010/0172877，2010/0113567，2007/0098743，2005/0260601和2005/0220818；及欧洲专利号1385466，1606411和1520175)；单纯疱疹病毒(见例如美国专利号7,897,146，7,731,952，7,550,296，7,537,924，6,723,316和6,428,968；及美国专利公开号2011/0177032，2011/0158948，2010/0092515，2009/0274728，2009/0285860，2009/0215147，2009/0010889，2007/0110720，2006/0039894和2004/0009604)；逆转录病毒(见例如美国专利号6,689,871，6,635,472，6,639,139，5,851,529，5,716,826和5,716,613；及美国专利公开号2011/0212530)；及腺相关病毒(家里如美国专利号8,007,780，7,968,340，7,943,374，7,906,111，7,927,585，7,811,814，7,662,627，7,241,447，7,238,526，7,172,893，7,033,826，7,001,765，6,897,045和6,632,670)。本领域技术人员已知如何生长、选择和修饰肉瘤病毒以用于疗法。
[0699]
本文提供的溶瘤病毒被修饰为编码诱导i型干扰素表达的产物，例如激活i型干扰素信号传导途径和/或nf
‑
κb信号传导的多肽。这些蛋白质包括人和非人sting，以及sting的功能获得性突变体，以及其它这种蛋白质，包括rig
‑
i和mda5，以及其功能获得性突变体，
包括本文所述的那些。溶瘤病毒还可以编码免疫刺激性蛋白，如细胞因子，包括白细胞介素2(il
‑
2)。这些蛋白质受病毒启动子的控制，或可以受其它rna聚合酶ii启动子的控制。溶瘤病毒还可以编码其它治疗性产物，例如rnai，例如靶向受体或抑制免疫应答的其它靶标例如trex1的shrna或microrna。通过任何合适的方法施用所述病毒，包括但不限于胃肠外施用，例如静脉内、肿瘤内和腹膜内施用。病毒可以是本领域技术人员已知的任何病毒，并且可以编码额外的治疗性产物。所述病毒可以与适用于肿瘤的其它疗法联合，例如用于卵巢肿瘤的顺铂(cisplatin)或用于胰腺肿瘤的吉西他滨(gemcitabine)。示例性溶瘤病毒是下面讨论的那些。
[0700]
a.腺病毒
[0701]
腺病毒(ad)是具有线性基因组的无包膜ds
‑
dna病毒。人腺病毒根据交叉易感性分为57个血清型(ad1
‑
ad57)及根据毒力和组织嗜性分为7个亚群(a
‑
g)。腺病毒血清5型(ad5)是溶瘤病毒疗法中最常用的腺病毒。在人体中感染较轻微，并导致感冒样症状(yokoda et al.(2018)biomedicines 6,33)，并且全身施用导致肝嗜性及可能导致肝毒性(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837)，但出于治疗目的认为腺病毒是安全的。腺病毒通过附着于柯萨奇病毒和腺病毒受体(car)进入细胞，随后是细胞表面的αvβ3和αvβ5整联蛋白与腺病毒五联碱基的arg
‑
gly
‑
asp三肽基序(rgd)相互作用(jiang et al.(2015)curr.opin.virol.13:33
‑
39)。car在大多数正常细胞的表面表达，但在癌细胞类型之间的表达高度不同。另一方面，rgd相关的整联蛋白由癌细胞高表达，但在正常细胞中的表达水平要低得多(jiang et al.(2015))。因此，腺病毒可以通过rgd基序靶向癌细胞。
[0702]
由于腺病毒在转化的细胞中具有高转导效率，其缺乏与宿主基因组的整合/缺乏插入诱变，其基因组稳定性，将大的治疗基因插入到其基因组中的能力，以及通过基因操作而对肿瘤选择性的能力，例如用癌症组织选择性启动子取代病毒启动子，因此腺病毒作为溶瘤病毒具有吸引力(yokoda et al.(2018)biomedicines 6,33；choi et al.(2015)j.control.release 10(219):181
‑
191)。
[0703]
具有肿瘤特异性启动子的溶瘤腺病毒的示例包括用于前列腺癌治疗的cv706，其具有在前列腺特异性抗原启动子控制下的腺病毒早期区域1a(e1a)基因，以及obp
‑
301，其利用端粒酶逆转录酶(tert)启动子调节e1a基因表达(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837)。另一种诱导肿瘤选择性的方法是在ad基因组的el区导入突变，其中缺失的基因由肿瘤细胞中常见的基因突变在功能上补充，例如视网膜母细胞瘤(rb)途径中的异常或p53突变(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837)。例如，溶瘤腺病毒onyx
‑
015和h101在e1b55k基因中有缺失，从而使p53失活。这些突变体不能阻断正常的凋亡防御途径，通过感染具有缺陷的p53肿瘤阻抑途径的赘生细胞导致肿瘤选择性(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837；uusi
‑
kerttula et al.(2015)viruses 7:6009
‑
6042)。e1aδ24是一种溶瘤腺病毒，在e1a基因中包含24bp突变，破坏rb结合结构域及促进具有rb途径突变的癌细胞中的病毒复制。icovir
‑
5是一种溶瘤腺病毒，组合了通过e2f启动子的e1a转录控制、e1a的δ24突变和rgd
‑
4c插入腺病毒纤维中(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837；uusi
‑
kerttula et al.(2015))。delta
‑
24
‑
rgd或dnx
‑
2401是一种溶瘤腺病毒，其中δ24骨架通过插入rgd基序而被修饰，证实在体外和体内均增强的溶瘤作用(jiang et al.(2015))。
[0704]
改良肿瘤选择性的另一种策略是通过靶向细胞外基质(ecm)来克服实体瘤中的物理障碍。例如，表达透明质酸酶的溶瘤腺病毒如vcn
‑
01可用于促进编码产物和病毒在整个肿瘤中的递送。腺病毒也已经被工程化为表达松弛肽以破坏ecm(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837；shaw and suzuki(2016)curr.opin.virol.21:9
‑
15)。表达自杀基因如胞嘧啶脱氨酶(cd)和hsv
‑
1胸苷激酶(tk)的腺病毒已经示出在体内增强的抗肿瘤效力，具有表达免疫刺激性细胞因子的腺病毒如oncos
‑
1 02，其表达gm
‑
csf(yamamoto et al.(2017)cancer sci.108:831
‑
837；shaw and suzuki(2016)curr.opin.virol.21:9
‑
15)。表达抗ctla4抗体的基于δ24的溶瘤腺病毒在临床前研究中已经示出成功的希望(jiang et al.(2015))。
[0705]
腺病毒h101(商标为)是2005年中国第一个获批用于临床与化疗联合用于治疗晚期鼻咽癌患者的溶瘤腺病毒。临床实验已证实溶瘤腺病毒在治疗各种癌症中的用途。例如，已经并且正在进行临床实验的是：溶瘤细胞ad5，其编码il
‑
12，用于患有转移的胰腺癌的患者(nct03281382)；免疫刺激性ad5(load703)，其表达tmx
‑
cd40l和41bbl，用于患有胰腺癌、卵巢癌、胆管癌和结直肠癌患者(nct03225989)；load703联合吉西他滨(gemcitabine)和白蛋白结合型紫杉醇(nab
‑
paclitaxel)，用于患有胰腺癌的患者(nct02705196)；编码人ph20透明质酸酶(vcn
‑
01)的溶瘤腺病毒联合吉西他滨和用于患有晚期实体瘤包括胰腺腺癌的患者(nct02045602，nct02045589)；(obp
‑
301)，一种具有肿瘤选择性的溶瘤ad，含有人端粒酶逆转录酶(htert)启动子，用于患有肝细胞癌的患者(nct02293850)；e1b基因缺失的ad5，联合经动脉化疗栓塞术(tace)，用于患有肝细胞癌的患者(nct01869088)；cg0070，一种表达gm
‑
csf的溶瘤ad，并含有癌症特异性e2f
‑
1启动子以驱动e1a的表达，用于患有膀胱癌的患者(nct02365818，nct01438112)；enadenotucirev(colo
‑
ad1)，一种ad11p/ad3嵌合的b组溶瘤病毒，用于结肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌患者(nct02053220)；以及dnx
‑
2401(ad5 e1aδ24rgd)，联合替莫唑胺(temozolomide)(nct01956734)，或联合ifnγ(nct02197169)，用于患有胶质母细胞瘤的患者。
[0706]
b.单纯疱疹病毒
[0707]
单纯疱疹病毒(hsv)属于疱疹病毒科，并具有较大的线性双链dna基因组，包括许多对病毒复制非必需的基因，使其成为基因操作的理想候选者。其它优势包括其感染广泛的细胞类型的能力，对阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(ganciclovir)等抗病毒药物的敏感性，以及其缺乏插入诱变(sokolowski et al.(2015)oncolytic virotherapy 4:207
‑
219；yin et al.(2017)front.oncol.7:136)。hsv有两种类型，hsv i型(hsv
‑
1)和ii型(hsv
‑
2)，其中大多数溶瘤hsv来源于hsv
‑
1。在人中，hsv
‑
1通过与细胞表面的粘连蛋白、糖蛋白和疱疹病毒进入介导物(hvem)结合而引起热病性疱疹及感染上皮细胞、神经元和免疫细胞(kohlhapp and kaufman(2016)clin.cancer res.22(5):1048
‑
1054)。
[0708]
迄今为止，已经产生了许多不同的溶瘤hsv
‑
1病毒。任何这些可以进一步修饰以编码修饰的dna/rna功能获得性蛋白，如本文所述，以便在肿瘤和肿瘤微环境中累积时，如此修饰的hsv表达编码的蛋白质以组成型表达免疫应答介导物，如i型干扰素。例如，hsv
‑
1已被工程化为表达抗her
‑
2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)，靶向过表达her
‑
2的肿瘤，如乳腺癌和卵巢癌、胃癌和胶质母细胞瘤。将编码曲妥珠单抗的基因插入hsv
‑
1gd糖蛋白基因内的
两个区域，产生两种溶瘤hsv，r
‑
lm113和r
‑
lm249。r
‑
lm113和r
‑
lm249示出针对人乳腺癌和卵巢癌以及针对her2
胶质母细胞瘤鼠模型的临床前活性。另一种溶瘤hsv
‑
1，dlsptk hsv
‑
1，在独特的长23(ul23)基因中包含缺失，该基因编码胸苷激酶(tk)的病毒同源物，而hrr3 hsv
‑
1突变体包含核糖核苷酸还原酶(rr)的大亚基的lacz插入突变，也称为icp6，其由基因ul39编码。因此，dlsptk和hrr3 hsv
‑
1突变体仅分别在过表达tk和rr的癌细胞中复制(sokolowski et al.(2015)oncolytic virotherapy 4:207
‑
219)。
[0709]
hf10是一种自发突变的溶瘤hsv
‑
1，缺乏编码ul43、ul49.5、ul55、ul56和潜伏期相关转录物的基因，并过表达ul53和ul54。hf10在临床前研究中示出令人鼓舞的结果，并显示出高肿瘤选择性、高病毒复制、强力的抗肿瘤活性和良好的安全性(eissa et al.(2017)front.oncol.7:149)。研究hf10的临床实验包括：在难治性头颈癌、皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤的患者中的i期研究(nct01017185)，以及hf10联合化疗(吉西他滨、nab
‑
paclitaxe、ts
‑
1)在不可切除的胰腺癌患者中的i期研究(nct03252808)。hf10还与抗ctla
‑
4抗体伊匹单抗(ipilimumab)联合，从而改善了iiib、iiic或iv期不可切除或转移的黑色素瘤患者的治疗功效(nct03153085)。一项ii期临床研究正在研究hf10与抗pd
‑
1抗体纳武单抗(nivolumab)联合在可切除的iiib、iiic和iv期黑色素瘤的患者中(nct03259425)以及联合伊匹单抗(ipilimumab)在不可切除或转移的黑色素瘤的患者中(nct02272855)。与单独治疗相比，紫杉醇(paclitaxel)和hf10联合疗法在腹膜结直肠癌模型中获得较好的存活率，而hf10与厄洛替尼(erlotinib)联合治疗在体外和体内比单独使用hf10或厄洛替尼改良了对胰腺异种移植物的活性(eissa et al.(2017)front.oncol.7:149)。
[0710]
talimogene laherparepvec(t
‑
vec)，之前称为oncovex
gm
‑
csf
，是fda批准的用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤单纯疱疹病毒，其由hsv
‑
1的js1毒株产生并通过基因工程化为表达粒细胞巨噬细胞刺激因子(gm
‑
csf；aref et al.(2016)viruses 8:294)。在t
‑
vec中，gm
‑
csf表达增强抗肿瘤细胞毒性免疫应答，同时缺失感染的细胞蛋白34.5(icp34.5)基因的两个拷贝抑制在正常组织中的复制，并且缺失icp47基因增加mhc i类分子的表达，允许在感染细胞上抗原呈递(eissa et al.(2017))。t
‑
vec通过与癌细胞表面的粘连蛋白(nectin)结合而表现出肿瘤选择性，并通过利用破坏的致癌和抗病毒信号传导途径(特别是蛋白激酶r(pkr)和i型ifn途径)，优先在肿瘤细胞中复制。在正常细胞中，pkr通过病毒感染被激活，然后磷酸化真核起始因子
‑
2a蛋白(eif
‑
2a)，使其失活，进而抑制细胞蛋白质合成，阻断细胞增殖，并阻止病毒复制。由于icp34.5蛋白的表达导致野生型hsv逃避了抗病毒应答，其激活磷酸酶使eif
‑
2a去磷酸化，从而恢复受感染细胞中的蛋白质合成。因此，icp34.5的缺失阻止了t
‑
vec在正常细胞中的病毒复制。然而，癌细胞中的pkr
‑
eif
‑
2a途径被破坏，允许细胞持续生长和不受抑制的病毒复制(kohlhapp and kaufman(2016)clin.cancer res.22(5):1048
‑
1054；yin et al.(2017)front.oncol.7:136)。gm
‑
csf的表达通过导致树突细胞累积、促进抗原呈递和引发t细胞应答而改良t
‑
vec的免疫原性(kohlhapp and kaufman(2016)clin.cancer res.22(5):1048
‑
1054)。
[0711]
t
‑
vec在多种不同的癌细胞系中示出优先复制，包括乳腺癌、结直肠腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和胶质母细胞瘤。临床实验包括例如研究t
‑
vec在胰腺癌(nct03086642、nct00402025)、复发的乳腺癌(nct02658812)、儿童晚期非cns肿瘤(nct02756845)、非黑色素瘤皮肤癌(nct03458117)、非肌层浸润性膀胱移行细胞癌(nct03430687)和恶性黑色素瘤
(nct03064763)中的那些，以及t
‑
vec联合阿特朱单抗(atezolizumab)在伴肝转移的转移的三阴性乳腺癌和伴肝转移的转移的结直肠癌的患者(nct03256344)、联合紫杉醇在三阴性乳腺癌患者(nct02779855)、联合纳武单抗(nivolumab)在难治性淋巴瘤或晚期/难治性非黑色素瘤皮肤癌的患者(nct02978625)、联合顺铂和放疗在晚期头颈癌的患者(nct01161498)以及联合派姆单抗(pembrolizumab)在肝肿瘤(nct02509507)、头颈癌(nct02626000)、肉瘤(nct03069378)和黑色素瘤(nct02965716，nct02263508)的患者中的那些。
[0712]
除gm
‑
csf外，许多其它免疫刺激基因已插入溶瘤hsv中，包括编码il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18、tnfα、ifnα/β和fms样酪氨酸激酶3配体的那些，导致提高治疗功效(sokolowski et al.(2015)；yin et al.(2017))。
[0713]
另一种溶瘤hsv
‑
1，r3616，其在rl1(也称为γ134.5)基因的两个拷贝中均含有缺失，其编码icp34.5，靶向具有破坏的pkr途径的癌细胞。nv1020(或r7020)是一种hsv
‑
1突变体，其在ul55、ul56、icp4、rl1和rl2基因中含有缺失，导致神经毒力和癌症选择性降低。nv1020在头颈部鳞状细胞癌、表皮样癌和前列腺腺癌的小鼠模型中显示出有希望的结果(sokolowski et al.(2015))。此外，临床实验还研究了nv1020在结直肠癌肝转移中的安全性和有效性(nct00149396和nct00012155)。
[0714]
g207(或mgh
‑
1)是另一种hsv
‑
1突变体，在ul39神经毒力基因中具有rl1(γ134.5)缺失和lacz失活插入。利用g207的临床研究包括在患有进行性或复发性幕上脑肿瘤的儿童中单独施用g207或与单次放射剂量一起施用g207的研究(nct02457845)，在复发性脑癌(胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)的患者中g207的安全性和功效的研究(nct00028158)，以及在患有恶性胶质瘤的患者中施用g207以及随后放疗的效果研究(nct00157703)。
[0715]
g207用于产生g47δ，其在编码icp47的基因中包含进一步的缺失。其它hsv
‑
1衍生的溶瘤病毒包括hsv1716，其在rl1中包含缺失，但具有完整的ul39基因及在活跃分裂的细胞中选择性复制，以及包括km100突变体，其在ul48和rl2基因中具有插入，导致丧失立即早期病毒基因的表达和癌细胞的选择性(sokolowski et al.(2015)；yin et al.(2017)front.oncol.7:136)。
[0716]
溶瘤病毒也源自hsv
‑
2。例如，fuson
‑
h2是一种hsv
‑
2溶瘤病毒，其在编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(pk)结构域的icp10基因的n末端区域具有缺失。这个pk负责磷酸化gtpase激活蛋白ras
‑
fap，其激活ras/mek/mapk有丝分裂途径并诱导和稳定c
‑
fos，这是有效hsv
‑
2复制所需的。正常细胞通常具有失活的ras信号传导途径。因此，fuson
‑
h2通过仅在具有激活的ras信号传导途径的肿瘤细胞中复制而表现出肿瘤选择性(fu et al.(2006)clin.cancer res.12(10):3152
‑
3157)。fuson
‑
h2已示出对胰腺癌异种移植物具有活性(fu et al.(2006)clin.cancer res.12(10):3152
‑
3157)，联合环磷酰胺对lewis肺癌异种移植物具有活性，以及对于同基因鼠乳腺肿瘤和成神经细胞瘤具有活性(li et al.(2007)cancer res.67:7850
‑
7855)。
[0717]
c.痘病毒
[0718]
痘苗病毒是痘病毒的示例。痘苗病毒是一种细胞质病毒，因此在其生命周期中不将其基因组插入宿主基因组中。痘苗病毒具有长度约180,000个碱基对的线性双链dna基因组，由一条连续的多核苷酸链构成(baroudy et al.(1982)cell 28:315
‑
324)。所述结构是
由于存在10,000碱基对反向末端重复序列(itr)而致。itr参与基因组复制。基因组复制涉及自引发，导致形成高分子量串联体(分离自受感染的细胞)，随后被切割和修复以制造病毒基因组(见例如traktman,p.,chapter 27,poxvirus dna replication,pp.775
‑
798,in dna replication in eukaryotic cells,cold spring harbor laboratory press(1996))。基因组包含大约250个基因。一般来说，对非节段的非感染性基因组进行排列，以使得位于中心的基因对于病毒复制是必不可少的(并因此是保守的)，而靠近两个末端的基因影响更多的外围功能，如宿主范围和毒力。痘苗病毒通过利用排列成组的开放读框(orf)来实现差异基因表达，其在一般原则上不重叠。
[0719]
痘苗病毒具有多种用于癌症基因疗法和疫苗接种的特性，包括广泛的宿主和细胞类型范围以及低毒性。例如，虽然大多数溶瘤病毒是天然病原体，但痘苗病毒在其作为天花疫苗的广泛用途方面有着独特的历史，这导致在人中确定的安全性追踪记录。不足0.1％的病例出现与痘苗病毒施用相关的毒性，并可以通过施用免疫球蛋白有效解决。此外，痘苗病毒具有较大的外来基因的携带能力(在痘苗基因组中可插入高达25kb的外源dna片段，约占痘苗基因组大小的12％)，以及不同毒株之间的高序列同源性，用于在其它毒株中设计和产生修饰的病毒。通过遗传工程化产生修饰的痘苗毒株的技术已经成熟(moss(1993)curr.opin.genet.dev.3:86
‑
90；broder and earl(1999)mol.biotechnol.13:223
‑
245；timiryasova et al.(2001)biotechniques 31:534
‑
540)。痘苗病毒毒株已示出特异性定植实体瘤，而不感染其它器官(见例如zhang et al.(2007)cancer res.67:10038
‑
10046；yu et al.(2004)nat.biotech.22:313
‑
320；heo et al.(2011)mol.ther.19:1170
‑
1179；liu et al.(2008)mol.ther.16:1637
‑
1642；park et al.(2008)lancet oncol.9:533
‑
542)。
[0720]
痘苗病毒的示例包括但不限于lister(也称作elstree)，new york city board of health(nycbh)，dairen，ikeda，lc16m8，western reserve(wr)，copenhagen(cop)，tashkent，tian tan，wyeth，dryvax，ihd
‑
j，ihd
‑
w，brighton，ankara，modified vaccinia ankara(mva)，dairen i，lipv，lc16m0，livp，wr65
‑
16，em63，bern，paris，cva382，nyvac，acam2000和connaught毒株。痘苗病毒是溶瘤病毒，其具有多种特征，使其特别适用于创伤和癌症基因疗法。例如，痘苗病毒是一种细胞质病毒，因此在其生命周期中不将其基因组插入宿主基因组中。与需要宿主转录机制的许多其它病毒不同，痘苗病毒可以使用在病毒基因组中编码的酶支持其在宿主细胞质中的自身基因表达。痘苗病毒还具有广泛的宿主和细胞类型范围。特别地，痘苗病毒可在免疫豁免细胞或免疫豁免组织中累积，包括肿瘤和/或转移瘤，并也包括受伤的组织和细胞。然而，与其它溶瘤病毒不同，痘苗病毒通常可以通过对象免疫系统的活性从施用该病毒的对象中清除，并因此毒性低于其它病毒例如腺病毒。因此，虽然病毒通常可以通过对象的免疫系统活性从施用病毒的对象中清除，但病毒仍然可以在免疫豁免细胞和组织如肿瘤中累积、存活和增殖，因为这种免疫豁免区域独立于宿主的免疫系统。
[0721]
痘苗病毒也可以容易地通过插入异源基因进行修饰。这可导致病毒减毒和/或允许治疗性蛋白质的递送。例如，痘苗病毒基因组具有较大的外来基因的携带能力，最多可以插入25kb的外源dna片段(约占痘苗基因组大小的12％)。一些痘苗菌株的基因组已经完全测序，并鉴别了许多必需和非必需基因。由于不同毒株之间的高度序列同源性，因此来自一
种痘苗毒株的基因组信息可用于在其它毒株中设计和产生修饰的病毒。最后，通过遗传工程化产生修饰的痘苗毒株的技术已经成熟(moss(1993)curr.opin.genet.dev.3:86
‑
90；broder and earl(1999)mol.biotechnol.13:223
‑
245；timiryasova et al.(2001)biotechniques 31:534
‑
540)。
[0722]
多种痘苗病毒已显示展示出抗肿瘤活性。在一项研究中，例如为携带非转移性结肠腺癌细胞的裸鼠经全身注射痘苗病毒wr毒株，所述毒株通过具有痘苗生长因子缺失和插入胸苷激酶基因座的增强的绿色荧光蛋白而修饰。尽管在修饰的病毒中缺乏外源治疗性基因，但观察到所述病毒具有抗肿瘤作用，包括一种完全应答(mccart et al.(2001)cancer res.1:8751
‑
8757)。在另一项研究中，在黑色素瘤患者的iii期临床实验中，将痘苗黑色素瘤溶瘤物(vmo)注射至黑色素瘤阳性淋巴结附近的部位。作为对照，将new york city board of health毒株痘苗病毒(vv)施用于黑色素瘤患者。用vmo治疗的黑色素瘤患者的生存率优于未接受治疗的患者，但与接受vv对照治疗的患者相似(kim et al.(2001)surgical oncol.10:53
‑
59)。
[0723]
痘苗病毒的livp毒株也已用于肿瘤的诊断和疗法，以及用于治疗受伤和炎症的组织和细胞(见例如lin et al.(2007)surgery 142:976
‑
983；lin et al.(2008)j.clin.endocrinol.metab.93:4403
‑
7；kelly et al.(2008)hum.gene ther.19:774
‑
782；yu et al.(2009)mol.cancer ther.8:141
‑
151；yu et al.(2009)mol.cancer 8:45；美国专利号7,588,767；美国专利号8,052,968；及美国专利公开号2004/0234455)。例如，当经静脉内施用时，livp毒株已被证实在体内不同部位的内部肿瘤累积，并已被证实有效治疗各种组织来源的人肿瘤，包括但不限于乳腺肿瘤、甲状腺肿瘤、胰腺肿瘤、胸膜间皮瘤的转移性肿瘤、鳞状细胞癌、肺癌和卵巢肿瘤。痘苗病毒的livp毒株，包括其减毒形式，呈现出低于痘苗病毒wr毒株的毒性，并导致经治疗的荷瘤动物模型的存活率增加和存活时间更长(见例如美国专利公开号2011/0293527)。
[0724]
d.麻疹病毒
[0725]
麻疹病毒(mv)是一种有包膜的单链rna病毒，具有负义基因组，属于副粘病毒科。其非节段的基因组是稳定的，突变和回复到其致病形式的风险较低，并且由于它在细胞质中复制导致在受感染细胞中没有插入dna突变的风险。mv于1954年首次从称作edmonston的患者中分离出来，并发展成为安全性极佳的活疫苗，通过多次体外传代减毒，在50年来已成功保护全球超过10亿人(aref et al.(2016)viruses 8:294；hutzen et al.(2015)oncolytic virotherapy 4:109
‑
118)。这个菌株的衍生物表示为mv
‑
edm，在溶瘤疗法研究中是最常用的mv毒株。schwarz/moraten麻疹疫苗株比edm衍生物具有更强的减毒和免疫原性，这使其更安全且更具免疫调节作用(veinalde et al.(2017)oncoimmunology 6(4):e1285992)。野生型mv的溶瘤作用在20世纪70年代就有记载，有报道称改善急性淋巴细胞白血病、burkitt's淋巴瘤和hodgkin's淋巴瘤的患者(aref et al.(2016))。
[0726]
mv使用三种主要受体进入靶细胞：cd46、粘连蛋白
‑
4和信号传导淋巴细胞活化分子(slam)(aref et al.(2016)；hutzen et al.(2015))。然而，slam在活化的b和t细胞、未成熟胸腺细胞、单核细胞和树突细胞上表达，是野生型毒株的主要受体，减毒和肿瘤选择性mv
‑
edm毒株主要靶向cd46受体，这是在许多肿瘤细胞中过表达的补体激活的调节物(aref et al.(2016)；hutzen et al.(2015)；jacobson et al.(2017)oncotarget 8(38):63096
‑
63109；msaouel et al.(2013)expert opin.biol.ther.13(4):483
‑
502)。粘连蛋白
‑
4主要在呼吸道上皮中表达，被野生型和减毒mv毒株利用(aref et al.(2016)；msaouel et al.(2013)expert opin.biol.ther.13(4):483
‑
502)。与其它溶瘤病毒一样，在肿瘤细胞ifn抗病毒应答中的缺陷也促进了mv的肿瘤选择性(aref et al.(2016)；jacobson等人(2017)oncotarget 8(38)：63096
‑
63109)。已进行mv治疗多种癌症的临床实验，包括多发性骨髓瘤(nct02192775，nct00450814)、头颈癌(nct01846091)，间皮瘤(nct01503177)和卵巢癌(nct00408590，nct710814)。
[0727]
mv已被遗传工程化以表达免疫刺激性和免疫调节基因，包括例如编码il
‑
13、ifn
‑
β、gm
‑
csf和幽门螺杆菌(helicobacter pylori)中性粒细胞激活蛋白(nap)的那些(aref et al.(2016)；hutzen et al.(2015)；msaouel et al.(2013)expert opin.biol.ther.13(4):483
‑
502)。使用溶瘤mv与抗ctla
‑
4和抗pd
‑
l1抗体的联合疗法已在黑色素瘤小鼠模型中有效(aref et al.(2016)；hutzen et al.(2015))。
[0728]
mv
‑
cea通过遗传工程化为表达肿瘤标志物癌胚抗原(cea)，导致在癌细胞感染后cea释放到患者的血流中，允许检测cea水平并因此追踪体内病毒感染(aref et al.(2016)；hutzen et al.(2015))。mv
‑
cea的治疗性用途已在临床前研究中得到证实，以及处于治疗卵巢癌的i期临床实验中(nct00408590)。
[0729]
e.呼肠孤病毒
[0730]
呼吸道肠道孤儿病毒，通常称为呼肠孤病毒，是呼肠孤病毒科的无包膜双链rna病毒，对人无致病性。野生型呼肠孤病毒在整个环境中无处不在，导致一般人群中70
‑
100％的血清阳性(gong et al.(2016)world j.methodol.6(1)：25
‑
42)。呼肠孤病毒有3种血清型，包括1型lang、2型jones、3型abney和3型dearing(t3d)。t3d是临床前研究和临床研究中最常用的天然发生的溶瘤呼肠孤病毒血清型。
[0731]
溶瘤呼肠孤病毒由于癌细胞特有的激活的ras信号传导而具有肿瘤选择性(gong et al.(2016))；zhao et al.(2016)mol.cancer ther.15(5):767
‑
773)。ras信号传导途径的激活通过抑制dsrna依赖性蛋白激酶(pkr)的磷酸化而破坏细胞的抗病毒应答，pkr是一种通常负责阻止病毒蛋白质合成的蛋白质(zhao et al.(2016))。ras激活还增强病毒的脱壳和解体，导致病毒后代的产生和感染性增强，并通过增强细胞凋亡加速后代的释放(zhao et al.(2016))。据估计，所有人肿瘤的大约30％显示出异常的ras信号传导(zhao et al.(2016))。例如，大多数恶性神经胶质瘤具有激活的ras信号传导途径，其中呼肠孤病毒在体外83％的恶性胶质瘤细胞以及在体内人恶性胶质瘤模型中以及100％的离体胶质瘤标本中显示出抗肿瘤活性(gong et al.(2016)world j.methodol.6(1):25
‑
42)。此外，胰腺癌显示出非常高的ras突变发生率(约90％)，呼肠孤病毒在体外测试的100％胰腺细胞系中显示出强力的细胞毒性，并在体内100％的皮下肿瘤小鼠模型中诱导消退(gong et al.(2016))。
[0732]
呼肠孤病毒表现出广泛的临床前抗癌活性，在一系列的恶性肿瘤包括结肠、乳腺、卵巢、肺、皮肤(黑色素瘤)、神经系统、血液系统、前列腺、膀胱和头颈部的癌症中(gong et al.(2016))。呼肠孤病毒疗法已与放射疗法、化学疗法、免疫疗法和手术联合进行了测试。呼肠孤病毒联合放疗已被证实在体外治疗头颈部、结直肠癌和乳腺癌细胞系，以及在体内治疗结直肠癌和黑色素瘤模型中是有益的(gong et al.(2016))。呼肠孤病毒和吉西他滨
的联合以及呼肠孤病毒、紫杉醇和顺铂的联合已在小鼠肿瘤模型中被证实是成功的(zhao et al.(2016))。在b16黑色素瘤小鼠模型的临床前研究表明，与单独的呼肠孤病毒相比，溶瘤呼肠孤病毒和抗pd
‑
1疗法的联合显示出改良的抗癌功效(gong et al.(2016)；zhao et al.(2016)；kemp et al.(2015)viruses 8,4)。
[0733]
呼肠孤病毒示出的有希望的临床前结果已导致许多临床实验。由加拿大oncolytics biotech inc.公司开发的呼肠孤病毒是临床开发中唯一的治疗性野生型呼肠孤病毒，已在许多恶性肿瘤中单独及与其它治疗剂联合示出抗癌活性。例如，呼肠孤病毒治疗复发性恶性胶质瘤的i期临床研究(nct00528684)发现呼肠孤病毒耐受性良好，而i/ii期实验发现呼肠孤病毒在对铂类化疗无反应的卵巢上皮癌、原发性腹膜癌或输卵管癌患者中杀死肿瘤细胞而不损伤正常细胞(nct00602277)。呼肠孤病毒的ii期临床实验证实在治疗骨和软组织肉瘤肺转移的患者中的安全性和有效性(nct00503295)。已经进行呼肠孤病毒联合folfiri和贝伐单抗(bevacizumab)在转移性结直肠癌的患者的i期临床实验(nct01274624)。在晚期胰腺癌患者中进行呼肠孤病毒联合化学治疗药物吉西他滨(gemcitabine)的ii期临床实验(nct00998322)，在转移性去势抗性前列腺癌中进行联合多西他赛(docetaxel)的治疗潜力的ii期临床研究(nct01619813)，及在晚期/转移性乳腺癌患者中进行呼肠孤病毒联合紫杉醇(paclitaxel)治疗的ii期临床实验(nct01656538)。一项iii期临床实验研究了联合紫杉醇和卡铂(carboplatin)在铂类难治性头颈癌中的疗效(nct01166542)，同时在非小细胞肺癌(nct00861627)和转移性黑色素瘤(nct00984464)的患者中进行采用这种联合疗法的ii期临床研究。联合卡非佐米(carfilzomib)和地塞米松(dexamethasone)在复发或难治性多发性骨髓瘤患者中的i期临床实验正在进行中(nct02101944)。
[0734]
f.水疱性口炎病毒(vsv)
[0735]
水泡性口炎病毒(vsv)是弹状病毒科(rhabdoviridae)水泡病毒属(vesiculovirus)的成员。其基因组由具有负义极性的单链rna组成，由11,161个核苷酸组成，并编码5个基因：核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、糖蛋白(g)和大聚合酶蛋白(bishnoi et al.(2018)viruses 10(2),90)。vsv通过昆虫媒介传播，并且疾病限于其自然宿主，包括马、牛和猪，其中在人体中轻度且无症状感染(bishnoi et al.(2018)viruses 10(2),90)。vsv在感染的细胞中是一种强力且快速的细胞凋亡诱导剂，并已示出使化疗抗性的肿瘤细胞敏化。vsv已示出感染肿瘤血管系统，导致流向肿瘤的血流减少、血液凝固和新血管系统的溶解。这个病毒还能在缺氧组织中复制和诱导细胞病变效应和细胞裂解。此外，wt vsv在多种组织培养细胞系中生长至高滴度，有利于大规模病毒生产，其基因组小且易于操作，且在细胞质中复制而没有宿主细胞转化的风险(bishnoi et al.(2018)；felt and grdzelishvili(2017)journal of general virology 98:2895
‑
2911)。这些因素，再加上其对人没有致病性，而且通常人对于vsv没有已经存在的免疫性，使其成为病毒性肿瘤治疗的良好候选者。
[0736]
尽管vsv可以附着在泛素表达的细胞表面分子上，使其具有“泛嗜性”，但wt vsv对i型ifn应答敏感，并因此显示出基于肿瘤i型ifn信号传导缺陷或抑制的肿瘤选择性(felt and grdzelishvili(2017))。由于其对正常细胞的感染性，vsv可引起神经病理性，但可通
过修饰其基质蛋白和/或糖蛋白可以减弱。例如，可以缺失基质蛋白或可以缺失在基质蛋白第51位的蛋氨酸残基或可以用精氨酸取代在基质蛋白第51位的蛋氨酸残基(bishnoi et al.(2018)；felt and grdzelishvili(2017))。另一种方法是用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白取代vsv的糖蛋白(rvsv
‑
gp)(bishnoi et al.(2018)；felt and grdzelishvili(2017))。vsv也可以被遗传修饰为包含自杀基因，如疱疹病毒胸苷激酶(tk)，或表达免疫刺激性细胞因子，如il
‑
4、il
‑
12和ifnβ，或共刺激剂如粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子1(gm
‑
csf1)，来增强溶瘤活性(bishnoi et al.(2018))。编码nis和ifnp的vsv
‑
ifnβ
‑
碘化钠同向转运物(vsv
‑
ifn(3
‑
nis))正在美国进行多项i期临床实验(详情见clinicaltrials.gov关于实验nct02923466、nct03120624和nct03017820所述)。
[0737]
水泡性口炎病毒(vsv)当在多种小鼠癌症模型中静脉内(iv)施用时是一种有效的溶瘤治疗剂。在一项研究中，rvsv
‑
gp在免疫缺陷小鼠模型中成功地对皮下移植的g62人胶质母细胞瘤细胞进行了瘤内治疗，以及对原位u87人胶质瘤细胞进行了静脉内治疗。rvsv
‑
gp的瘤内注射对颅内ct2a鼠神经胶质瘤细胞也有效(muik et al.(201.4)cancer res.74(13)：3567
‑
3578)。发现rvsv
‑
gp不引发可检测的中和抗体应答，并且这种遗传修饰的溶瘤病毒对人补体不敏感，在整个实验过程中保持稳定(muik et al.(2014))。在另一个实例中，发现瘤内施用rvsv
‑
gp有效感染和杀死移植到小鼠模型中的人a375恶性黑色素瘤细胞，以及鼠b16黑色素瘤细胞系(kimpel et al.(2018)viruses 10,108)。溶瘤病毒的静脉内注射未成功，并且即使在瘤内施用组中，由于i型干扰素应答，肿瘤最终也全部生长(kimpel et al.(2018))。在另一项研究中，通过瘤内注射rvsv
‑
gp治疗a2780人卵巢癌细胞的皮下异种移植小鼠模型，以及虽然最初观察到肿瘤缓解且没有神经毒性，但缓解是暂时的，且肿瘤会复发。这被发现是由于i型ifn应答所致，观察到通过将rvsv
‑
gp与jak1/2抑制剂鲁索替尼(ruxolitinib)联合的逆转抗病毒状态(dold et al.(2016)molecular therapy
‑
oncolytics 3,16021)。
[0738]
g.新城疫病毒
[0739]
新城疫病毒(ndv)是一种具有负极性单链rna基因组的禽副粘病毒，可感染家禽，并对人体一般无致病性，但可引起流感样症状(tayeb et al.(2015)oncolytic virotherapy 4:49
‑
62；cheng et al.(2016)j virol.90:5343
‑
5352)。由于其细胞质复制、缺乏宿主基因组整合和重组以及高基因组稳定性，ndv及其它副粘病毒与其它溶瘤病毒如逆转录病毒或一些dna病毒相比提供了更安全更有吸引力的替代品(matveeva et al.(2015)molecular therapy
‑
oncolytics 2,150017)。ndv已证实具有肿瘤选择性，其在肿瘤细胞中是在正常细胞中复制的10,000倍，由于直接的细胞病变效应和免疫应答的诱导而导致溶瘤发生(tayeb et al.(2015)；lam et al.(2011)journal of biomedicine and biotechnology,article id:718710)。尽管ndv的肿瘤选择性机制尚不完全清楚，但肿瘤细胞中干扰素的产生和对ifn信号传导的应答缺陷使病毒可以复制和传播(cheng et al.(2016；ginting et al.(2017)oncolytic virotherapy 6:21
‑
30)。副粘病毒对癌细胞的高亲和性也可能是由于癌细胞表面上病毒受体包括唾液酸的过表达所致(cheng et al.(2016)；matveeva et al.(2015)；tayeb et al.(2015))。
[0740]
非工程化的ndv毒株根据其在鸡中的致病性分为弱毒型(无毒)、中发型(中等)或强毒型(剧毒)，其中强毒型和中发型毒株能在多种人癌细胞系中复制(和裂解多种人癌细
胞系)，但弱毒型毒株则否(cheng et al.(2016)；matveeva et al.(2015))。ndv毒株也分为裂解株和非裂解株，只有裂解株才能产生可存活和有感染性的后代(ginting et al.(2017)；matveeva et al.(2015))。另一方面，非裂解毒株的溶瘤作用主要源于其刺激免疫应答的能力，从而产生抗肿瘤活性(ginting et al.(2017)oncolytic virotherapy 6:21
‑
30)。肿瘤治疗中常用的中发型裂解毒株包括pv701(mk107)、mth
‑
68/h和73
‑
t，并且常用的弱毒型非裂解毒株包括huj、ulster和hitchner
‑
b1(tayeb et al.(2015)；lam et al.(2011)；freeman et al.(2006)mol.ther.13(1):221
‑
228)。
[0741]
ndv毒株pv701在i期实验中显示出抗结肠直肠癌的活性(laurie et al.(2006)clin.cancer res.12(8):2555
‑
2562)，以及ndv毒株73
‑
t已证实在体外对多种人癌细胞系具有溶瘤活性，包括纤维肉瘤、骨肉瘤、成神经细胞瘤和宫颈癌，以及在体内对携带人成神经细胞瘤、纤维肉瘤异种移植物和一些癌瘤异种移植物包括结肠癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌异种移植物的小鼠具有治疗作用(lam et al.(2011))。ndv毒株mth
‑
68/h导致肿瘤细胞系显著消退，包括pc12、mcf7、hct116、du
‑
145、ht
‑
29、a431、hela和pc3细胞，并当通过吸入施用时在晚期癌症患者中显示出良好的反应(lam et al.(2011))。非裂解株ulster显示出对结肠癌的细胞毒性作用，而裂解株italien则有效地杀死人黑色素瘤(lam et al.(2011))。弱毒型ndv毒株huj在通过静脉内施用于患者时表现出对复发性多形性胶质母细胞瘤的溶瘤活性，而弱毒型毒株lasota延长结直肠癌患者的生存期(lam et al.(2011)；freeman et al.(2006)mol.ther.13(1):221
‑
228)，并能感染和杀死非小细胞肺癌(a549)、胶质母细胞瘤(u87mg和t98g)、乳腺腺癌(mcf7和mda
‑
mb
‑
453)和肝细胞癌(huh7)细胞系(ginting et al.(2017)oncolytic virotherapy 6:21
‑
30)。
[0742]
经遗传工程化的ndv毒株也已被评估用于溶瘤疗法。例如，将干扰素拮抗剂流感病毒ns1基因导入ndv毒株hitchner
‑
b1的基因组，在多种人肿瘤细胞系和b16黑色素瘤小鼠模型中产生增强的溶瘤作用(tayeb et al.(2015))。ndv的抗肿瘤/免疫刺激作用已通过将il
‑
2或gm
‑
csf基因导入病毒基因组而增强(lam et al.(2011))。利用瘤内注射ndv与全身施用ctla
‑
4抗体一起导致对预先建立的远处肿瘤的有效排斥作用(matveeva et al.(2015))。
[0743]
h.细小病毒
[0744]
h
‑
1细小病毒(h
‑
1pv)是属于细小病毒科(parvoviridae)的一种小型无包膜单链dna病毒，其天然宿主是大鼠(angelova et al.(2017)front.oncol.7:93；angelova et al.(2015)frontiers in bioengineering and biotechnology 3:55)。h
‑
1pv对人体无致病性，并且由于其良好的安全性、人没有已经存在的h
‑
1pv免疫力以及缺乏宿主细胞基因组整合，因此作为溶瘤病毒很有吸引力(angelova et al.(2015))。h
‑
1pv已对实体瘤表现出广泛的肿瘤抑制活性，包括乳腺癌、胃癌、宫颈癌、脑癌、胰腺癌和结直肠癌的临床前模型，以及包括淋巴瘤和白血病在内的血液恶性病(angelova et al.(2017))。h
‑
1pv通过增加肿瘤相关抗原的呈递、树突状细胞的成熟和促炎细胞因子的释放来刺激抗肿瘤应答(moehler et al.(2014)frontiers in oncology 4:92)。h
‑
1pv还表现出肿瘤选择性，这被认为是由于细胞复制和转录因子的可用性、与ns1细小病毒蛋白相互作用的细胞蛋白的过表达以及参与肿瘤细胞而不是正常细胞中ns1功能调节的代谢途径的激活所致。由于h
‑
1pv的无害性质，经常使用野生型毒株，不需要通过遗传工程化进行减毒(angelova et al.(2015))。
[0745]
研究表明，人神经胶质瘤细胞的溶瘤h
‑
1pv感染导致有效的细胞杀伤，以及高级神经胶质瘤干细胞模型也允许溶瘤h
‑
1pv感染。在肿瘤细胞照射后不久应用所述病毒时，观察到对神经胶质瘤细胞的杀伤力增强，表明这个方案可用于不可切除的复发性胶质母细胞瘤(angelova et al.(2017))。在具有原位rg
‑
2肿瘤的免疫活性大鼠中以及在植入人u87神经胶质瘤的免疫缺陷动物中，脑内或全身注射h
‑
1pv导致神经胶质瘤消退，而没有毒副作用(angelova et al.(2015))。del h
‑
1pv是一种在人转化的细胞系中具有更高感染性和传播性的适应性变体，在胰腺癌和宫颈癌异种移植模型中证实了体内溶瘤作用(geiss et al.(2017)viruses 9,301)。h
‑
1pv对于一组五种人骨肉瘤细胞系(cal 72、h
‑
os、mg
‑
63、saos
‑
2、u
‑
20s)(geiss et al.(2017)viruses 9,301)和人黑色素瘤细胞(sk29
‑
mel
‑
1，sk29
‑
mel
‑
1.22)(moehler et al.(2014)frontiers in oncology 4:92)也示出溶瘤活性。在另一项研究中，携带宫颈癌异种移植物的裸鼠在用h
‑
1pv治疗后表现出剂量依赖性的肿瘤生长停滞和消退(angelova et al.(2015))。经肿瘤内和静脉内施用h
‑
1pv也显示出对免疫功能低下小鼠的人乳腺癌异种移植物的显著生长抑制作用(angelova et al.(2015))。在携带人胃癌或人burkitt淋巴瘤的小鼠中经瘤内注射h
‑
1pv导致肿瘤消退和生长抑制(angelova et al.(2015))。
[0746]
溶瘤性h
‑
1pv(parvoryx01)在复发性多形性胶质母细胞瘤患者中的i/iia期临床实验(临床实验nct01301430)，证实瘤内或静脉内注射的无进展生存期、临床安全性和患者耐受性(angelova et al.(2017)；geiss et al.(2017)viruses 9,301；geletneky et al.(2017)mol.ther.25(12):2620
‑
2634)。这个实验证实h
‑
1pv以剂量依赖性方式穿过血脑屏障并建立免疫原性抗肿瘤应答的能力，其特征在于白细胞浸润，主要是cd8
和cd4
t淋巴细胞，以及局部治疗的肿瘤中几种免疫细胞激活标志物的检测，包括穿孔素、颗粒酶b、ifnγ、il
‑
2、cd25和cd40l(geletneky et al.(2017)mol.ther.25(12):2620
‑
2634)。
[0747]
h
‑
1pv在体外也显示出对高度侵润性胰腺导管腺癌(pdac)细胞的有效杀伤，包括对吉西他滨(gemcitabine)耐药的那些，以及在原位pdac大鼠模型中，瘤内注射h
‑
1pv导致肿瘤消退并延长动物存活期等(angelova et al.(2017)；angelova et al.(2015))。在免疫缺陷裸鼠pdac模型中观察到类似的结果，包括选择性肿瘤靶向和无毒性(angelova et al.(2015))。h
‑
1pv与细胞抑制药物(顺铂、长春新碱)或靶向药物(舒尼替尼(sunitinib))联合导致协同诱导人黑色素瘤细胞的细胞凋亡(moehler et al.(2014))。h
‑
1pv与hdac抑制剂丙戊酸联用对宫颈癌细胞和胰腺癌细胞产生协同细胞毒性(angelova et al.(2017))，当在两步方案中与h
‑
1pv联合时改良吉西他滨(gemcitabine)的治疗效率。(angelova et al.(2015))。与其它病毒一样，h
‑
1pv可以被工程化为表达抗癌分子。例如，研究表明表达凋亡蛋白apoptin的细小病毒
‑
h1衍生的载体比野生型h
‑
1pv具有更大的诱导细胞凋亡能力(geiss et al.(2017))。
[0748]
i.柯萨奇病毒
[0749]
柯萨奇病毒(cv)属于肠道病毒属(enterovirus)和小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，并具有不整合到宿主细胞基因组中的正义单链rna基因组。根据对小鼠的影响，cv分为a组和b组，并在人体中可引起轻度上呼吸道感染(bradley et al.(2014)oncolytic virotheraphy 3:47
‑
55)。用于溶瘤病毒疗法的常用柯萨奇病毒包括减毒柯萨奇病毒b3(cv
‑
b3)、cv
‑
b4、cv
‑
a9和cv
‑
a21(yla
‑
pelto et al.(2016)viruses 8,57)。cv
‑
a21通过icam
‑
1(或cd54)和daf(或cd55)受体感染细胞，这些受体在肿瘤细胞中的表达水平更高，包括黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、胰腺癌和肺癌，以及在多发性骨髓瘤和恶性胶质瘤中。cv
‑
a21在体外对于恶性骨髓瘤、黑色素瘤和前列腺、肺、头颈部和乳腺癌细胞系以及在体内在携带人黑色素瘤异种移植物的小鼠中以及在小鼠中对原发性乳腺癌肿瘤以及其转移癌中显示出有希望的临床前抗癌活性(yla
‑
pelto et al.(2016)；bradley et al.(2014))。cv
‑
a21的衍生物cv
‑
a21
‑
dafv，也称为cavatak
tm
，是从野生型kuykendall毒株中通过cv
‑
a21在表达daf的icam
‑
1阴性横纹肌肉瘤(rd)细胞上系列传代而产生的，并发现其与亲本毒株相比具有增强的溶瘤性质。cavatak
tm
仅与daf受体结合，这有助于其对癌细胞增强的趋向性(yla
‑
pelto et al.(2016))。
[0750]
cv
‑
a21也与盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)联合进行了研究，与单独地治疗人乳腺癌、结肠直肠癌和胰腺癌细胞系以及在人乳腺癌的异种移植小鼠模型中相比，显示出更高的溶瘤效率(yla
‑
pelto et al.(2016))。由于相当一部分人群已经产生针对cv的中和抗体，因此cv
‑
a21疗法已与免疫抑制剂如环磷酰胺联合(bradley et al.(2014))，并且这是通过载具细胞的递送的良好候选者。
[0751]
临床实验研究了cavatak
tm
在iiic或iv期恶性黑色素瘤的患者中的用途(nct01636882；nct00438009；nct01227551)及cavatak
tm
单独或与低剂量丝裂霉素c联合用于患有非肌层浸润性膀胱癌的患者(nct02316171)。临床实验也研究了静脉内施用cv
‑
a21治疗实体瘤包括黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌的效果(nct00636558)。正在进行的临床实验包括研究cavatak
tm
单独或联合派姆单抗(pembrolizumab)治疗非小细胞肺癌(nct02824965、nct02043665)和膀胱癌(nct02043665)的患者；cavatak
tm
联合易普利姆玛(ipilimumab)用于患有葡萄膜黑色素瘤和肝转移的患者(nct03408587)和用于患有晚期黑色素瘤的患者(nct02307149)；以及cavatak
tm
联合派姆单抗(pembrolizumab)用于患有晚期黑色素瘤的患者(nct02565992)。
[0752]
j.塞内卡河谷病毒
[0753]
塞内卡河谷病毒(svv)是小核糖核酸病毒科(picornaviridae)塞内卡河谷病毒属(senecavirus)的成员，具有正义单链rna基因组，并且对神经内分泌癌具有选择性，包括成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤、wilms瘤、胶质母细胞瘤和小细胞肺癌(miles et al.(2017)1clin.invest.127(8):2957
‑
2967；qian et al.(2017)j virol.91(16):e00823
‑
17；burke,m.j.(2016)oncolytic virotherapy 5:81
‑
89)。研究已确定炭疽毒素受体1(antxr1)是svv的受体，与正常细胞相比，其经常在肿瘤细胞表面表达，但先前的研究在小儿胶质瘤模型中也表明唾液酸可以是svv受体的组分(miles et al.(2017))。svv分离株001(svv
‑
001)是一种强力的溶瘤病毒，在经静脉内施用后可以靶向并穿透实体瘤，并由于其缺乏插入突变以及对癌细胞的选择性趋向性和在人和动物中无致病性而具有吸引力。此外，在人中的先前暴露很少，导致较低的已经存在的免疫(burke,m.j.(2016)oncolytic virotherapy 5:81
‑
89)。
[0754]
svv
‑
001已显示出对小细胞肺癌、肾上腺皮质癌、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤和ewing肉瘤细胞系的有希望的体外活性，以及在小儿gbm、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤和成神经细胞瘤的原位异种移植小鼠模型中的体内活性(burke(2016))。ntx
‑
010是开发的溶瘤svv
‑
001，用于单独或与环磷酰胺联合治疗患有复发/难治性实体
瘤的小儿患者，但由于中和抗体的产生而限制了其治疗效果(burke et al.(2015)pediatr.blood cancer 62(5):743
‑
750)。临床实验包括使用sv
‑
001用于具有神经内分泌特征的实体瘤的患者(nct00314925)，ntx
‑
010/svv
‑
001联合环磷酰胺用于复发或难治性成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、wilms斯瘤、视网膜母细胞瘤、肾上腺皮质癌或类癌瘤的患者(nct01048892)以及ntx
‑
010/svv
‑
001用于患有化疗后小细胞肺癌的患者(nct01017601)。
[0755]
h.药物生产、组合物和制剂
[0756]
本文提供了制备包含本文提供的任何免疫刺激性细菌和药学上可接受的赋形剂或添加剂的药物组合物和制剂的方法。所述药物组合物可用于治疗疾病，如过度增生性疾病或病况，例如肿瘤或癌症。所述免疫刺激性细菌可以在单剂疗法中施用，也可以在与其它试剂或治疗的组合疗法中施用。可以将组合物配制成单剂量施用或多剂量施用。可以将试剂配制为直接施用。所述组合物可以液体或干燥制剂形式提供。
[0757]
1.生产
[0758]
a.细胞库生产
[0759]
由于本文所述免疫治疗剂的活性成分由工程化的自我复制细菌组成，因此所选的组合物将扩展为一系列细胞库，这些细胞库将维持长期保存并用作制备原料药的起始材料。根据美国联邦法规(cfr)21第211部分或其它相关监管机构的规定，在适当的生产工厂中在现行原料药生产质量管理规范(cgmp)下生产细胞库。由于所述免疫治疗剂的活性剂是活细菌，因此从定义上讲本文所述的产物是未经灭菌的且不能进行最终灭菌。必须注意确保在整个制备过程中使用无菌程序以防止污染。因此，在制备过程中使用之前，必须对所有原材料和溶液进行灭菌。
[0760]
通过对所选细菌菌株进行连续系列单集落分离来生产主细胞库(mcb)，以确保起始材料中不存在污染物。用单个充分分离的细菌集落接种含有无菌培养基(可以是复合培养基，例如lb或msbb或定义的培养基，例如补充有适当营养素的m9)的无菌培养容器，并使细菌可以复制，例如通过在37℃摇动孵育。然后通过将细菌悬浮在含有一种或多种冷冻保护剂的溶液中制备细菌用于低温贮存。
[0761]
冷冻保护剂的实例包括：蛋白质如人或牛血清白蛋白、明胶、和免疫球蛋白；碳水化合物，包括单糖(半乳糖、d
‑
甘露糖、山梨糖等)及其非还原性衍生物(例如甲基葡葡萄糖甙)、二糖(海藻糖、蔗糖等)、环糊精、和多糖(棉子糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐等)；氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或组氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)；甲胺，如甜菜碱；多元醇，如三羟或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇、和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；表面活性剂，例如普朗尼克(pluronic)；或有机硫化合物，如二甲亚砜(dmso)，及其组合。低温贮存溶液可以在溶液中包含一种或多种冷冻保护剂，其也可以包含盐(例如氯化钠、氯化钾、硫酸镁)，和/或缓冲剂，如磷酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、4
‑
(2
‑
羟基乙基)
‑1‑
哌嗪乙烷磺酸(hepes)，以及其它本领域技术人员已知的这种缓冲剂。
[0762]
可以通过在培养材料中加入一种或多种浓缩的冷冻保护剂以达到在冷冻和解冻期间保持细菌的活力的最终浓度(例如0.5％至20％丙三醇最终浓度)，或通过收获细菌(例如通过离心)并将其悬浮在含有适当终浓度的一种或多种冷冻保护剂的低温贮存液中，从而实现将细菌悬浮在低温贮存液中。然后将在低温贮存溶液中的细菌悬浮液装入具有容器
封闭系统的合适的无菌小瓶(塑料或玻璃)中，该容器封闭系统可以在冷冻条件下保持封闭完整性(例如丁基医用螺旋帽和压接密封)。然后将主细胞库的小瓶冷冻(通过控制速率的冷冻机缓慢地冷冻，或通过直接放入冷冻机快速地冷冻)。然后将mcb冷冻贮存在保持长期活力的温度(例如
‑
60℃或更低)。对解冻的主细胞库材料进行彻底鉴定，以确保相同性、纯度和活性符合相应当局的规定。
[0763]
工作细胞库(wcb)以与主细胞库相同的方式生产，但起始材料来自mcb。mcb材料可以直接转移到含有无菌培养基的发酵容器中，并如上所述扩增。然后将细菌悬浮在低温贮存液中，装入容器中，密封并在
‑
20℃或以下冷冻。可以由mcb材料生产多个wcb，且wcb材料可以用于制备另外的细胞库(例如制造商的工作细胞库mwcb)。将wcb冷冻保存并鉴定以确保相同性、纯度和活性。wcb材料通常是用于生产例如工程化细菌的生物学样品的起始材料。
[0764]
b.原料药(drug substance)制备
[0765]
如上所述，在cgmp下使用无菌工艺制备原料药。工作细胞库材料通常用作在cgmp下制备原料药的起始材料，然而也可以使用其它细胞库(例如mcb或mwcb)。无菌加工用于所有细胞疗法的生产，包括基于细菌细胞的疗法。来自细胞库的细菌通过发酵扩增；这可以通过产生预培养物(例如在摇瓶中)或通过直接接种发酵罐来实现。发酵是在无菌的生物反应器或烧瓶中完成的，该反应器或烧瓶可以是一次性使用的或可重复使用的。通过浓缩(例如通过离心、连续离心或切向流过滤)收获细菌。通过用缓冲剂交换培养基(例如通过渗滤)从培养基组分和细菌代谢物中纯化浓缩的细菌。散装药物产品被配制并保存为中间体(例如通过冷冻或干燥)或直接加工成药物产品。检测原料药的相同性、强度、纯度、效价和质量。
[0766]
c.药物产品制备
[0767]
药物产品定义为其最终容器中所含活性物质的最终制剂。药物产品是根据cgmp使用无菌工艺制备的。药物产品是由原料药生产的。如有必要，可将原料药解冻或重建，然后以适当的目标强度配制。因为药物产品的活性组分是活的工程化细菌，所以强度取决于悬浮液中所含cfu的数量。如下所述，将散装产品稀释成适合于储存和使用的最终制剂。填充于容器中，并用容器封闭系统密封，对药物产品贴标签。将药物产品贮存在适当的温度下以保持稳定性，检测其相同性、强度、纯度、效价和质量，并如果符合指定的接受标准则发布以供人使用。
[0768]
2.组合物
[0769]
药学上可接受的组合物是经监管机构或其它机构批准而制备的，根据公认的用于动物和人体的药典制备。所述组合物可以制备为溶液剂、混悬剂、粉剂或缓释制剂。通常，使用本领域熟知的技术和规程将化合物配制成药物组合物(见例如ansel introduction to pharmaceutical dosage forms,fourth edition,1985,126)。所述制剂应适合于施用模式。
[0770]
可以将组合物配制为通过本领域技术人员已知的任何途径施用，包括肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、皮下、瘤内、硬膜外、鼻腔、口服、阴道、直肠、表面、局部、耳道、吸入、颊(例如舌下)和经皮施用或任何施用途径。也可以考虑其它施用模式。取决于治疗的部位，施用可以是局部、表面或全身的。可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、表面应用例如与手术后的伤口敷料联合、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入
物来局部施用到需要治疗的区域。组合物也可以与其它生物活性剂相继、间歇地或以在相同组合物中一起施用。施用还可以包括控释系统，包括控释制剂和装置控释，例如通过泵。
[0771]
在任何给定情况下，最合适的途径取决于多种因素，例如疾病的性质、疾病的进展、疾病的严重程度以及所使用的特定组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。特别地，可以将组合物配制成用于全身、局部腹膜内、口服或直接施用的任何合适的药物制剂。例如，可以将组合物配制成用于皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内施用。可以采用施用方法来减少活性剂暴露于降解过程，例如通过抗原和免疫原性应答的免疫干预。这种方法的实例包括在治疗部位的局部施用或连续输注。
[0772]
可以将免疫刺激性细菌配制成合适的药物制备物，例如用于口服施用的溶液剂、混悬剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂或酏剂，以及透皮贴剂制备物和粉吸入剂。通常，使用本领域熟知的技术和规程将化合物配制成药物组合物(见例如ansel introduction to pharmaceutical dosage forms,fourth edition,1985,126)。通常，制剂的模式取决于施用途径。可以将组合物配制成干燥(冻干的或其它玻璃化形式)或液体形式。当组合物以干燥形式提供时，其可以在即将使用之前通过加入适当的缓冲剂例如无菌盐溶液而重建(reconstitute)。
[0773]
3.制剂
[0774]
a.流体、注射剂、乳剂
[0775]
制剂通常被制成适于施用途径的模式。本文考虑到胃肠外施用通常特征在于以皮下、肌内、瘤内、静脉内或皮内注射或输注。用于胃肠外施用的细菌制备物包括备用于注射(直接施用)的悬浮液或在使用前解冻的冷冻悬浮液、备用于在使用前与再悬浮溶液组合的干燥的可溶性产品如冻干粉，以及乳剂。干燥的热稳定制剂例如冻干试剂可用于单位剂量的储存以备后用。
[0776]
药物制备物可以是冷冻液体形式，例如悬浮液。如果以冷冻液体形式提供，则药物产品可以以浓缩制备物形式提供，以在使用前解冻并稀释至治疗有效浓度。
[0777]
药物制备物也可以以不需要解冻或稀释而使用的剂型提供。这种液体制备物可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂适当制备，例如悬浮剂(例如山梨糖醇、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载具(例如杏仁油、油性酯或分馏植物油)；以及适用于微生物治疗剂的防腐剂。所述药物制备物可以干燥形式存在，例如冻干或喷雾干燥的，在使用前用水或其它无菌的合适载具重建。
[0778]
合适的赋形剂是例如水、盐水、葡聚糖、或甘油。溶液可以是水性或非水性的。如果静脉内施用，则合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)，以及用于静脉内水合作用的其它缓冲溶液。对于瘤内施用，包含增稠剂例如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇的溶液，油乳剂及其混合物可以适合于维持注入物的定位。
[0779]
药物组合物可以包括载体或其它赋形剂。例如，本文提供的药物组合物可包含以下的任何一种或多种：稀释剂、佐剂、抗粘剂、粘合剂、包衣、填充剂、调味剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、清洁剂、或吸附剂及其组合或施用修饰的治疗性细菌的载具。例如，胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载体或赋形剂包括水性载体、非水性载体、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、隐蔽剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂或赋形剂制备包括液体制备物在
内的制剂。
[0780]
药物组合物可以包括载体，例如稀释剂、佐剂、赋形剂或与施用所述组合物的载具。合适的药物载体的实例在e.w.martin的“remington
′
s pharmaceutical sciences”中进行了描述。这样的组合物将包含治疗有效量的通常为纯化形式或部分纯化形式的化合物或试剂，以及合适量的载体，以提供适当施用于患者的形式。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、和芝麻油。水是典型的载体。盐溶液和葡聚糖及丙三醇水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。组合物除了活性成分还可包含：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙、或羧甲基纤维素；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、和滑石；和粘合剂，例如淀粉、天然树胶例如阿拉伯胶、明胶、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交聚维酮和其它本领域技术人员已知的这种粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、和乙醇。例如，合适的赋形剂是例如水、盐水、葡聚糖、丙三醇或乙醇。如果需要的话，组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其它这种试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。
[0781]
胃肠外制备物中使用的药学上可接受的载体包括水性载具、非水性载具、抗菌剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、掩蔽剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。水性载具的实例包括氯化钠注射液、林格注射液(ringers injection)、等渗葡聚糖糖注射液、无菌水注射液、葡聚糖和乳酸林格注射液。非水性胃肠外载具包括植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。等渗剂包括氯化钠和葡聚糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括例如聚山梨酯，例如聚山梨酯80(tween 80)。可以包括金属离子的掩蔽剂或螯合剂，例如edta。药物载体还包括用于水混溶性载具的聚乙二醇和丙二醇，以及用于调节ph值的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可以包括非抗微生物防腐剂。
[0782]
药物组合物还可包含其它少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂，以及其它这种试剂，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺和环糊精。本文还预期植入缓释或持续释放系统，以维持恒定剂量水平(见例如美国专利号3,710,795)。这种胃肠外组合物中包含的活性化合物的百分比高度依赖于其特定性质以及化合物的活性和对象的需求。
[0783]
b.干燥的热稳定制剂
[0784]
可以对细菌进行干燥。干燥的热稳定制剂，例如冻干或喷雾干燥的粉末和玻璃化的玻璃制品(vitrified glass)，可以重建为以溶液、乳剂和其它混合物形式施用。干燥的热稳定制剂可以由任何液体制剂例如上述悬浮液制备。药物制备物可以冻干或玻璃化形式存在，在使用前用水或其它合适的载具重建。
[0785]
通过用无菌溶液重建干燥的化合物来制备施用的热稳定制剂。溶液可以包含赋形剂，其可以改善由粉末制备的活性物质或重建溶液的稳定性或其它药理学性质。通过将赋形剂例如葡聚糖糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适试剂
溶解于合适的缓冲剂例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它本领域技术人员已知的这种缓冲剂中以制备热稳定制剂。然后，将原料药加入所得混合物中，并搅拌直至混合。将所得混合物分配到小瓶中以进行干燥。每个小瓶将包含单个剂量，包含每小瓶l
×
105至l
×
10
11
个cfu。干燥后，将产品小瓶用容器封闭系统密封，防止水分或污染物进入密封的瓶中。干燥的产品可以在适当的条件下存储，例如
‑
20℃、4℃或室温下。用水或缓冲溶液重建所述干燥的制剂提供了用于胃肠外施用的制剂。精确量取决于所治疗的适应症和所选化合物。这种量可以根据经验确定。
[0786]
4.用于其它施用途径的组合物
[0787]
取决于所治疗的病况，本文还考虑了除胃肠外以外的其它施用途径，例如表面施用、透皮贴剂，口服和直肠施用。上述悬浮液和粉剂可以口服施用，或者可以重建以口服施用。用于直肠施用的药物剂型是直肠栓剂、胶囊和片剂以及用于全身作用的凝胶胶囊。直肠栓剂包括插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，释放一种或多种药学或治疗活性成分。直肠栓剂中的药学上可接受的物质是基质或载具以及提高熔点的试剂。基质的实例包括可可脂(可可油)、甘油
‑
明胶、碳蜡(聚氧乙二醇)和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模制来制备。直肠栓剂的典型重量为约2至3克。用于直肠施用的片剂和胶囊是使用与口服施用制剂相同的药学上可接受的物质制备的及通过与口服施用制剂相同的方法制备的。适于直肠施用的制剂可以以单位剂量的栓剂提供。可以通过将原料药与一种或多种常规固体载体例如可可脂混合，并然后对所得混合物塑形而制备。
[0788]
对于口服施用，药物组合物可以采取通过常规方式用药学上可接受的赋形剂制备的例如片剂或胶囊形式，所述赋形剂例如是粘合剂(例如预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁，滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羧乙酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法将片剂包被。
[0789]
适用于颊(舌下)施用的制剂包括例如在调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中含有所述活性化合物的锭剂(lozenges)；以及在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中含有所述化合物的糖锭剂(pastilles)。
[0790]
如针对局部和全身施用所述制备局部表面施用混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等，以及配制成霜剂、凝胶、软膏剂、乳剂、溶液剂、酏剂、洗剂、悬浮剂、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、灌洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或其它适合局部表面施用的制剂。
[0791]
所述组合物可以配制成用于局部用途的气雾剂，例如通过吸入(见例如美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，描述了递送用于治疗肺部疾病的类固醇的气雾剂)。这些施用于呼吸道的制剂可以是单独或与惰性载体如乳糖组合以用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式或以用于吹入的微粉形式。在这种情况下，所述制剂的颗粒直径通常小于50微米或小于10微米。
[0792]
可以将化合物配制成用于局部或表面施用，例如以凝胶、霜剂和洗剂形式表面应用于皮肤和粘膜例如眼中，以及应用于眼或脑池内或椎管内应用。预期表面施用是透皮递送，以及也施用于眼或粘膜，或用于吸入疗法。活性化合物的鼻用溶液也可以单独或与其它药学上可接受的赋形剂组合施用。
[0793]
提供了适于透皮施用的制剂。其可以以任何合适的形式提供，例如适合于与接受者的表皮长时间保持紧密接触的分立贴剂。这种贴剂含有在任选缓冲水溶液中的活性化合物，所述缓冲水溶液例如对于活性化合物而言是0.1至0.2m的浓度。适于透皮施用的制剂也可以通过电离子透入疗法递送(见例如tyle,p,(1986)pharmaceutical research 3(6):318
‑
326)，以及通常采取活性化合物的任选缓冲水溶液的形式。
[0794]
药物组合物也可以通过控释试剂和/或递送装置施用(见例如美国专利号3,536,809，3,598,123，3,630,200，3,845,770，3,916,899，4,008,719，4,769,027，5,059,595，5,073,543，5,120,548，5,591,767，5,639,476，5,674,533和5,733,566)。
[0795]
5.剂量和施用
[0796]
可以将所述组合物配制成用于单剂量或多剂量施用的药物组合物。所述免疫刺激性细菌可以以对所治疗的患者不产生不良副作用的情况下足以发挥治疗有效作用的量包含于其中。例如，调节所述药物活性化合物的浓度，使得注射提供有效量以产生所需的药理作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统中检测免疫刺激性细菌而凭经验确定，例如通过使用本文所述或本领域已知的测定法。例如，可以采用标准的临床技术。可以采用体外测定法和动物模型以帮助确定最佳剂量范围。可以根据经验确定的精确剂量可以取决于患者或动物的年龄、体重、体表面积和病况、施用的特定免疫刺激性细菌、施用途径、待治疗的疾病类型和疾病的严重性。
[0797]
因此，应理解的是，精确的剂量和治疗持续时间取决于所治疗疾病，以及可以使用已知的检测方案凭经验确定或通过从体内或体外检测数据推断。浓度和剂量值也可以随待减轻的病症的严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定的对象，应根据个体需要及施用或监督施用所述组合物的人员的专业判断，随时间调整具体的剂量方案，本文列出的浓度范围仅作为示例，并不意图限制组合物及包含其的组合的范围或用途。所述组合物可以每小时、每天、每周、每月、每年施用一次或仅施用一次。通常，选择剂量方案以限制毒性。应注意的是，主治医生知道根据毒性、骨髓、肝、肾或其它组织功能障碍如何以及何时终止、中断或调整疗法至更低剂量。相反，如果临床反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也知道如何以及何时将治疗调整到更高的水平。
[0798]
所述免疫刺激性细菌以足以发挥治疗有效作用的量包含在组合物中。例如，所述量是在治疗过度增殖性疾病或病况例如癌症中达到治疗效果的量。
[0799]
药物和治疗活性化合物及其衍生物通常以单位剂型或多剂型配制和施用。每个单位剂量包含预定量的足以产生所需治疗效果的治疗活性化合物，结合所需的药物载体、载具或稀释剂。单位剂量形式包括但不限于包含合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胃肠外混悬剂和口服溶液剂或混悬剂，以及水包油乳剂。单位剂量形式可以包含于小瓶、安瓿瓶和注射器中，或者是独立包装的片剂或胶囊剂。单位剂量形式可以其部分或多个施用。多剂量形式是包装在单个容器中以便以单独的单位剂型施用的多个相同的单位剂量形式。多剂量形式的实例包括片剂或胶囊小瓶或瓶或品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是未在包装中分开的多个单位剂量。通常，可以制备包含0.005％至100％范围的活性成分，其余部分由无毒载体平衡的剂型或组合物。可以将药物组合物配制成适合每种施用途径的剂型。
[0800]
单位剂量的胃肠外施用制备物包装在安瓿瓶、小瓶或带针头的注射器中。含有药
物活性化合物的液体溶液或重建的粉末制备物的体积取决于要治疗的疾病和选择用于包装的特定制备产品。如本领域已知和实践的，用于胃肠外施用的所有制备物必须是无菌的。
[0801]
如所指出的，本文提供的组合物可以配制为本领域技术人员已知的任何途径，包括但不限于皮下、肌肉内、静脉内、皮内、病灶内、腹膜内注射、硬膜外、阴道、直肠、局部、耳道、透皮施用或任何施用途径。适用于这种途径的制剂为本领域技术人员已知。组合物也可以与其它生物活性物质相继、间歇地或在相同组合物中一起施用。
[0802]
药物组合物可以通过控释制剂和/或递送装置来施用(见例如美国专利号3,536,809，5,674,533和5,733,566)。已知各种递送系统，并可以用于施用预期在本文中使用的选择的组合物，并且这种颗粒可以容易地制备。
[0803]
6.包装和制备产品
[0804]
还提供了包含包装材料、本文提供的任何药物组合物和标示组合物用于治疗本文所述的疾病或病况的标签的制备产品。例如，标签可以标示治疗是针对肿瘤或癌症。
[0805]
本文所述的免疫刺激性细菌和另一种治疗剂的组合也可以包装在制备产品中。在一个实例中，所述制备产品包含含有所述免疫刺激性细菌组合物的药物组合物，且不再包含其它试剂或治疗。在其它实例中，所述制备产品还包括另外治疗剂，例如不同的抗癌剂。在这个实例中，可以将所述试剂一起或分开提供，以包装为制备产品。
[0806]
本文提供的制备产品包含包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利号5,323,907、5,052,558和5,033,252，每个专利均以其全部内容并入本文作参考。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适于选择的制剂和指定施用和治疗模式的任何包装材料。制备产品的示例是包括单室和双室容器的容器。所述容器包括但不限于管、瓶和注射器。容器可以进一步包括用于静脉内施用的针。
[0807]
包装的选择取决于所述试剂，以及这些组合物是一起包装还是分开包装。通常，所述包装与其中所含的组合物不反应。在其它实例中，某些组分可以以混合物包装。在其它实例中，所有成分均单独包装。因此，例如可以将各组分包装为单独的组合物，在即将施用前混合，可以将其直接一起施用。可选地，可以将各组分包装为单独的组合物以分别施用。
[0808]
包括选择的组合物的其制备产品的也可以以试剂盒提供。试剂盒可包括本文所述的药物组合物和以制备产品形式供施用的物品。所述组合物可以包含在用于施用的物品中，或者可以单独提供以随后加入。所述试剂盒可任选地包括使用说明，包括剂量、施用方案和施用方式说明。试剂盒还可以包括本文所述的药物组合物和用于诊断的物品。
[0809]
i.治疗方法和用途
[0810]
本文提供的方法包括施用或使用免疫刺激性细菌用于治疗患有疾病或病况的对象的方法，所述对象的症状可通过施用这种细菌来改善或减轻，例如癌症。在特定的实例中，所述疾病或病况是肿瘤或癌症。另外，还提供了与一种或多种额外的试剂如抗癌剂或抗透明质酸剂的组合疗法的方法。所述细菌可以通过任何合适的途径施用，包括但不限于胃肠外、全身、表面和局部，例如通过瘤内、静脉内、直肠、口服、肌肉内、粘膜和其它途径。提供了适合于每种的制剂。本领域技术人员可以确立合适的方案和剂量及选择途径。
[0811]
1.肿瘤
[0812]
本文提供的免疫刺激性细菌、组合、用途和方法适用于治疗所有类型的肿瘤，包括
癌症，特别是实体瘤，包括肺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、胃癌、头颈癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。所述方法也可用于血液学癌症。
[0813]
通过本文提供的用途和方法进行治疗的肿瘤和癌症包括但不限于源自免疫系统、骨骼系统、肌肉和心脏、乳房、胰腺、胃肠道、中枢和周围神经系统、肾脏系统、生殖系统、呼吸系统、皮肤、结缔组织系统包括关节、脂肪组织以及循环系统包括血管壁的那些。可以用本文提供的免疫刺激性细菌治疗的肿瘤的实例包括癌(carcinoma)、神经胶质瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤(liposarcoma))、腺癌(adenocarcinomas)、腺肉瘤(adenosarcomas)、和腺瘤(adenomas)。这种肿瘤几乎可以发生在身体的所有部位，包括例如乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨骼、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈、或肝脏。
[0814]
骨骼系统的肿瘤包括例如肉瘤和母细胞瘤(blastomas)，例如骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)和软骨母细胞瘤(chondroblastoma)。肌肉和心脏肿瘤包括骨骼肌和平滑肌的肿瘤，例如平滑肌瘤(leiomyomas)(平滑肌的良性肿瘤)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcomas)、横纹肌瘤(rhabdomyomas)(骨骼肌的良性肿瘤)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcomas)、和心脏肉瘤(cardiac sarcoma)。胃肠道的肿瘤包括例如口腔、食道、胃、小肠、结肠和结肠直肠的肿瘤，以及胃肠道分泌器官(例如唾腺、肝、胰腺和胆道)的肿瘤。中枢神经系统的肿瘤包括脑、视网膜和脊髓的肿瘤，也可以起源于相关的结缔组织、骨骼、血管或神经组织。还考虑了周围神经系统肿瘤的治疗。周围神经系统的肿瘤包括恶性周围神经鞘肿瘤(malignant peripheral nerve sheath tumors)。肾脏系统的肿瘤包括肾脏的那些，例如肾细胞癌(renal cell carcinoma)，以及输尿管和膀胱的肿瘤。生殖系统的肿瘤包括子宫颈、子宫、卵巢、前列腺、睾丸和相关分泌腺的肿瘤。免疫系统的肿瘤包括基于血液的肿瘤和实体瘤，包括淋巴瘤，例如霍奇金(hodgkin
′
s)和非霍奇金(non
‑
hodgkin
′
s)。呼吸系统的肿瘤包括鼻道、细支气管和肺的肿瘤。乳腺肿瘤包括例如小叶癌和导管癌(lobular and ductal carcinoma)。
[0815]
可以通过本文提供的免疫刺激性细菌和方法治疗的肿瘤的其它实例包括卡波西肉瘤(kaposi
′
s sarcoma)、中枢神经系统肿瘤(cns neoplasms)、成神经细胞瘤(neuroblastomas)、毛细血管性血管母细胞瘤(capillary hemangioblastomas)、脑膜瘤(meningiomas)和转移性脑肿瘤(cerebral metastases)、黑素瘤、胃肠道和肾癌和肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(glioblastoma)(例如多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme))和平滑肌肉瘤。如本文提供的可以治疗的其它癌症的实例包括但不限于淋巴瘤、母细胞瘤(blastoma)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors)、间皮瘤(mesothelioma)、神经鞘瘤(schwannoma)、脑膜瘤(meningioma)、黑素瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。这种癌症的实例包括恶性血液肿瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin
′
s lymphoma)；非霍奇氏金淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤(burkitt’s lymphoma)、小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)/慢性淋巴细胞白血病、蕈样真菌病(mycosis fungoides)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuse large b
‑
cell lymphoma)、边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)和淋巴浆细胞白血病(lymphoplasmacytic leukemia))；淋巴细胞前体细胞的肿瘤，包括b细胞型急性
淋巴母细胞白血病(b
‑
cell acute lymphoblastic leukemia)/淋巴瘤，和t细胞型急性淋巴母细胞白血病(t
‑
cell acute lymphoblastic leukemia)/淋巴瘤，胸腺瘤(thymoma)，成熟t和nk细胞的肿瘤，包括外周t细胞白血病(peripheral t
‑
cell leukemias)、成年t细胞白血病(adult t
‑
cell leukemia)/t细胞淋巴瘤以及巨粒淋巴细胞白血病(large granular lymphocytic leukemia)；朗格汉斯细胞组织细胞增多症(langerhans cell histocytosis)；骨髓瘤形成(myeloid neoplasias)例如急性髓性白血病(acute myelogenous leukemias)，包括成熟型aml(aml with maturation)、无分化型aml(aml without differentiation)、急性前髓细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia)、急性骨髓单核细胞性白血病(acute myelomonocytic leukemia)和急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemias)；骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes)和慢性骨髓增生性病症(chronic myeloproliferative disorders)，包括慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)；中枢神经系统的肿瘤，例如神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤(astrocytoma)、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、室管膜瘤(ependymoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)；头颈部的实体瘤(例如，鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、唾腺癌(salivary gland carcinoma)和食道癌(esophageal cancer))、肺癌(例如，小细胞肺癌(small
‑
cell lung cancer)、非小细胞肺癌、肺腺癌(adenocarcinoma of the lung)和肺鳞癌(squamous carcinoma of the lung))、消化系统癌症(例如胃或胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠道癌(gastrointestinal cancer)、胆管或胆道癌(cancer of the bile duct or biliary tract)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、结肠直肠癌和肛门癌(anal carcinoma))、生殖系统癌(例如睾丸、阴茎或前列腺癌，子宫、阴道、外阴、子宫颈、卵巢和子宫内膜癌)、皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、光化性角化病(actinic keratosis)、皮肤黑素瘤(cutaneous melanom))、肝癌(例如肝癌(liver cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)和肝细胞瘤(hepatoma))、骨癌(例如破骨细胞瘤(osteoclastoma)和溶骨性骨癌(osteolytic bone cancers))，其它组织和器官的癌症(例如胰腺癌、膀胱癌、肾脏癌或肾癌(kidney或renal cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、乳腺癌、腹膜癌(cancer of the peritoneum)和卡波西肉瘤)、血管系统的肿瘤(例如血管肉瘤(angiosarcoma)和血管外皮细胞瘤(hemangiopericytoma))、威尔姆斯瘤(wilms
′
tumor)、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤(osteosarcoma)和尤因氏肉瘤(ewing
′
s sarcoma)。
[0816]
2.施用
[0817]
在实践本文的用途和方法中，可以将本文提供的免疫刺激性细菌施用于对象，包括患有肿瘤或具有赘生性细胞的对象或待免疫的对象。可以在向对象施用免疫刺激性细菌之前、同时或之后进行一个或多个步骤，包括但不限于以适合于施用免疫刺激性细菌的条件诊断对象，确定对象的免疫能力，对对象进行免疫，用化学治疗剂治疗对象，用放射治疗对象或手术治疗对象。
[0818]
对于包括出于治疗目的而向荷瘤对象施用免疫刺激性细菌的实施方案，通常先前已经诊断出该对象患有赘生病况。诊断方法还可包括确定赘生病况的类型，确定赘生病况的阶段，确定对象中一种或多种肿瘤的大小，确定对象的淋巴结中存在或不存在转移性或
肿瘤细胞，或确定对象存在转移。
[0819]
为对象施用免疫刺激性细菌的治疗方法的一些实施方案可以包括确定原发肿瘤的大小或赘生性疾病的阶段的步骤，以及如果原发肿瘤的大小等于或大于阈值体积，或如果赘生性疾病的阶段处于或超过阈值阶段，则为对象施用免疫刺激性细菌。在相似的实施方案中，如果原发肿瘤的大小低于阈值体积，或者如果赘生性疾病的阶段处于或低于阈值阶段，则免疫刺激性细菌尚未施用于对象；这种方法可包括监测对象直至肿瘤大小或赘生性疾病阶段达到阈值量，并然后将免疫刺激性细菌施用于对象。阈值大小可以根据一些因素而变化，包括肿瘤的生长速率、免疫刺激性细菌感染肿瘤的能力以及对象的免疫能力。通常，阈值大小将是足以使免疫刺激性细菌在肿瘤内或附近累积和复制而不会被宿主的免疫系统完全去除的大小，且通常还是足以维持细菌感染足够长的时间以使宿主对肿瘤细胞产生免疫应答的大小，通常约一周或更长时间，大约十天或更长时间或大约两周或更长时间。示例性阈值阶段是超过最低阶段的任何阶段(例如，i阶段或等同阶段)，或者是原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或者是检测到转移性细胞的任何阶段。
[0820]
可以使用为对象施用微生物的任何方式，条件是施用方式允许免疫刺激性细菌进入肿瘤或转移灶。施用方式可包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、肿瘤内、多次穿刺、吸入、鼻内、口服、腔内(例如通过导管施用于膀胱，通过栓剂或灌肠剂施用于肠道)、耳、直肠和眼部施用。
[0821]
本领域技术人员可以选择与对象和细菌相容以及也有可能导致细菌到达肿瘤和/或转移灶的任何施用方式。本领域技术人员可以根据多种因素中的任何一种来选择施用途径，包括疾病的性质、肿瘤的类型以及药物组合物中所含的特定细菌。可以例如通过弹道式递送以胶体分散系统的形式施用于靶部位，或者可以通过注射入动脉来进行全身施用。
[0822]
剂量方案可以是多种方法和量中的任一种，以及可以由本领域技术人员根据已知的临床因素确定。对于治疗其中免疫刺激影响治疗的疾病或病症，单剂量可以是治疗有效的。这种刺激的示例是免疫应答，其包括但不限于特异性免疫应答和非特异性免疫应答之一或二者、特异性和非特异性应答、先天应答、初级免疫应答、适应性免疫、次级免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。
[0823]
如医学领域所知，施用于对象的剂量可以取决于许多因素，包括对象的物种、体格、体表面积、年龄、性别、免疫能力和一般健康状况、施用的特定细菌、施用持续时间和途径、疾病的种类和阶段例如肿瘤大小以及同时施用的其它化合物例如药物。除了上述因素之外，如本领域技术人员可以确定的，这种水平还可以受到细菌的感染性和细菌的性质的影响。在本发明的方法中，细菌的合适的最小剂量水平可以是足以使细菌在肿瘤或转移灶中存活、生长和复制的水平。对于为65kg人施用细菌的示例的最低水平可包括至少约5
×
106集落形成单位(cfu)、至少约1
×
107cfu、至少约5
×
107cfu、至少约1
×
108cfu、或至少约1
×
109cfu。在本发明的方法中，细菌的合适的最大剂量水平可以是对宿主无毒的水平、不引起3倍或更大的脾肿大的水平、和/或在约1天后或约3天后或约7天后不会在正常组织或器官中产生集落或菌斑的水平。为65kg人施用细菌的示例的最大水平可包括不超过约5
×
10
11
cfu、不超过约1
×
10
11
cfu、不超过约5
×
10
10
cfu、不超过约1
×
10
10
cfu，或不超过约1
×
109cfu。
[0824]
本文提供的方法和用途可包括为对象单次施用免疫刺激性细菌或为对象多次施
用免疫刺激性细菌或其它各种方案，包括与其它抗肿瘤治疗剂和/或治疗的组合疗法。这些包括细胞疗法，例如施用经修饰的免疫细胞，car
‑
t疗法，crispr疗法，免疫检查点抑制剂，如抗体(例如抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1或抗ctla
‑
4抗体)，化疗/化学治疗性化合物，例如核苷类似物，手术和放疗。
[0825]
在一些实施方案中，单次施用足以在肿瘤中建立免疫刺激性细菌，其中细菌可以定植及可以在对象中引起或增强抗肿瘤应答。在其它实施方案中，可以在不同的时机施用供本文方法中使用的免疫刺激性细菌，时间间隔通常至少一天。在之前的施用可能无法有效地将细菌递送到肿瘤或转移灶的情况下，分开施用可以增加将细菌递送到肿瘤或转移灶的可能性。在实施方案中，分开施用可以增加肿瘤或转移灶上可能发生细菌定植/增殖的位置，或者可以以其它方式增加肿瘤中累积的细菌的滴度，这可以增加引发或增强宿主抗肿瘤免疫应答。
[0826]
当进行分开施用时，每次施用可以是相对于其它施用剂量的量相同或不同剂量的量。在一个实施方案中，所有施用剂量的量是相同的。在其它实施方案中，第一剂量的量可以是比一个或多个后续剂量的量更大的剂量的量，例如，比后续剂量的量大至少10
×
，大至少100
×
或大至少1000
×
。在其中第一剂量的量大于一个或多个后续剂量的量的分开施用方法的一个实例中，所有后续剂量的量可以是相对于第一次施用而言相同的、较小的量。
[0827]
分开施用可以包括两次或更多次施用中的任意数目，包括两次、三次、四次、五次或六次施用。根据本领域已知的用于监测治疗方法的方法和本文提供的其它监测方法，本领域技术人员可以容易地确定进行的施用次数，或进行一种或多种其它施用的需求。因此，本文提供的方法包括为对象提供免疫刺激性细菌的一次或多次施用的方法，其中可以通过监测对象，并基于监视的结果确定是否要提供一次或多次其它施用来确定施用的次数。可以基于多种监测结果来决定是否提供一种或多种额外的施用，包括但不限于肿瘤生长的指示或肿瘤生长的抑制、新转移灶的出现或转移灶的抑制、对象的抗细菌抗体滴度、对象的抗肿瘤抗体滴度、对象的整体健康状况和对象的体重。
[0828]
施用之间的时间段可以是多种时间段中的任何一个。施用之间的时间段可以取决于多种因素中的任何一个，包括关于施用次数所述的监测步骤、对象产生免疫应答的时间段，对象清除正常组织中的细菌的时间段，或者肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段。在一个实例中，时间段可以取决于对象产生免疫应答的时间段；例如，该时间段可以大于对象产生免疫应答的时间段，例如大于约一周，大于约十天，大于大约两周或大于约一个月；在另一个实例中，该时间段可以小于对象产生免疫应答的时间段，例如小于约一周，小于约十天，小于约两周或小于约一个月。在另一个实例中，时间段可以取决于肿瘤或转移灶中细菌定植/增殖的时间段；例如，该时间段可以大于施用表达可检测标记的微生物后在肿瘤或转移灶中产生可检测信号的时间量，例如约3天，约5天，约一周，约十天，约两周或约一个月。
[0829]
也可以通过施用含有本文提供的免疫刺激性细菌的组合物例如混悬液和其它制剂来进行本文所用的方法。这种组合物包含如本文提供的或本领域技术人员已知的细菌和药学上可接受的赋形剂或载具。
[0830]
如上所述，本文所提供的用途和方法除了为对象施用免疫刺激性细菌外，还包括为对象施用一种或多种治疗性化合物，例如抗肿瘤化合物或其它癌症治疗剂。治疗性化合
物可以独立地或与免疫刺激性细菌一起发挥作用，用于肿瘤治疗作用。可以独立起作用的治疗性化合物包括各种已知的化学治疗性化合物中的任一种，所述化学治疗性化合物可以抑制肿瘤生长、抑制转移灶生长和/或形成、减小肿瘤或转移灶的尺寸、或消除肿瘤或转移灶，而不降低免疫刺激性细菌在肿瘤中积累、在肿瘤中复制，以及引起或增强对象的抗肿瘤免疫应答的能力。这种化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和对哌泊舒凡(piposulfan)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carubicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6
‑
重氮基
‑5‑
氧
‑
l
‑
正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链霉黑素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗雌激素包括，例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香化酶的4(5)
‑
咪唑、4
‑
羟基它莫西芬(4
‑
hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)和托米芬(toremifine，fareston)；抗代谢物例如甲氨喋呤(methotrexate)和5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fluorouracil，5
‑
fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、喋罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙基蜜胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylmelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫化磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylol melamine)；叶酸补充物(folic acid replenisher)，例如亚叶酸；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophos
‑
phamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧二氯甲基二乙胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫
司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；铂类似物，例如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；蛋白质类如精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)和天冬酰胺酶(asparaginase)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6
‑
巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6
‑
氮鸟苷(6
‑
azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)和5
‑
fu；紫杉烷类(taxanes)，例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel)以及其白蛋白化形式(即nab
‑
紫杉醇和nab
‑
多烯紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；胸苷酸合酶抑制剂(如tomudex)；及其它化学治疗剂，包括乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，dmfo)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2
‑
乙基酰胼(2
‑
ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)；丙亚胺(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2
′2′
,2
″‑
三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside，“ara
‑
c”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6
‑
硫鸟嘌呤；巯嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；依托泊苷(etoposide，vp
‑
16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素c、米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)、去甲长春碱(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；xeloda；伊班膦酸盐(ibandronate)；cpt
‑
ll；视黄酸；esperamycin；卡培他滨(capecitabine)；和扑异构酶抑制剂如伊立替康(irinotecan)。可以使用上述中任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0831]
与免疫刺激性细菌联合起作用的治疗性化合物包括例如通过例如增加细菌的免疫应答引发性质的化合物。例如，改变基因表达的化合物可以诱导或增加细菌中基因(例如外源基因，例如sting蛋白)的转录。可以改变基因表达的多种化合物中的任何一种都是本领域已知的，包括iptg和ru486。其表达可被上调的示例基因包括蛋白质和rna分子，包括毒素、可将前药转化为抗肿瘤药的酶、细胞因子、转录调节蛋白、shrna、sirna和核糖酶。在其它实施方案中，可以与免疫刺激性细菌联合起作用以增加细菌的定植/增殖或免疫应答引发性质的治疗性化合物是可以与细菌表达的基因产物相互作用的化合物，以及这种相互作
用可以导致对象中增加的肿瘤细胞杀死或增加的抗肿瘤免疫应答。可以与细菌表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可以包括例如前药或其它化合物，其在施用于对象的形式几乎没有或没有毒性或具有其它生物活性，但是在与细菌表达的基因产物相互作用之后，所述化合物可产生导致肿瘤细胞死亡的性质，包括但不限于细胞毒性、诱导凋亡的能力或触发免疫应答的能力。本领域已知多种前药样物质，包括更昔洛韦(ganciclovir)、5
‑
氟尿嘧啶、6
‑
甲基嘌呤脱氧核苷、头孢菌素
‑
阿霉素(ganciclovir)、4
‑
[(2
‑
氯乙基)(2
‑
甲硫氧基乙基))氨基]苯甲酰
‑
l
‑
谷氨酸、对乙酰氨基酚、吲哚
‑3‑
乙酸、cb1954、7
‑
乙基l0
‑
[4
‑
(l
‑
哌啶基)
‑
l
‑
哌啶基]羰基氧喜树碱、双
‑
(2
‑
氯乙基)氨基
‑4‑
羟基苯基氨基甲酮28、1
‑
氯甲基
‑5‑
羟基
‑
1,2
‑
二羟基
‑
3h
‑
苯并[e]吲哚、表柔比星
‑
葡糖苷酸(epirubicin
‑
glucoronide)、5
’‑
脱氧5
‑
氟尿苷、胞嘧啶阿糖胞苷和亚麻苦苷(linamarin)。
[0832]
3.监测
[0833]
本文提供的方法可进一步包括以下的一个或多个步骤：监测对象、监测肿瘤和/或监测为对象施用的免疫刺激性细菌。本文提供的方法中可以包括多种监测步骤中的任一个，包括但不限于监测肿瘤大小、监测转移灶的存在和/或大小、监测对象的淋巴结、监测对象的体重或其它健康指标包括血液或尿液标记物、监测抗菌抗体滴度、监测可检测基因产物的细菌表达以及直接监测对象的肿瘤、组织和器官中的细菌滴度。
[0834]
监测的目的可以是简单地评估对象的健康状态或对象的治疗性处理的进展，或者可以确定是否需要进一步施用相同或不同的免疫刺激性细菌，或者确定何时或是否将化合物施用于对象，其中所述化合物可起到增加治疗方法的功效的作用，或者化合物可起到降低施用于对象的细菌的致病性的作用。
[0835]
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括监测一种或多种细菌表达的基因。细菌如本文提供的或本领域其它已知的那些细菌，可以表达一种或多种可检测的基因产物，包括但不限于可检测的蛋白质。
[0836]
如本文所提供的，在细菌中表达的可检测基因产物的测量可以提供对象中存在的细菌水平的准确测定。如本文进一步提供的，测量可检测基因产物的位置(例如通过包括断层成像方法的成像方法)可以确定细菌在对象中的定位。因此，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定对象的一个或多个器官或组织中细菌的存在与否，和/或对象的肿瘤或转移灶中细菌的存在与否。此外，本文提供的包括监测可检测细菌基因产物的方法可用于确定存在于一个或多个器官、组织、肿瘤或转移灶中的细菌的滴度。包括监测对象中细菌的定位和/或滴度的方法可用于确定细菌的致病性，因为正常组织和器官的细菌感染，以及特别是感染水平可指示细菌的致病性。可以在多个时间点进行包括监测对象中免疫刺激性细菌的定位和/或滴度的方法，并因此可以确定对象中的细菌复制速率，包括对象的一个或多个器官或组织中的细菌复制速率；因此，包括监测细菌基因产物的方法可以用于确定细菌的复制能力。本文提供的方法还可以用于定量存在于各种器官或组织以及肿瘤或转移灶中的免疫刺激性细菌的量，并从而可以指示细菌在对象中优先累积的程度；因此，细菌基因产物监测可用于确定细菌优先于正常组织或器官而在肿瘤或转移灶中累积的能力的方法。由于本文提供的方法中使用的免疫刺激性细菌可以在整个肿瘤中累积或可以在肿瘤中的多个部位累积，并可以在转移灶中积累，本文提供的用于监测细菌基因产物的方法可用于确定肿瘤的大小或存在于对象中的转移灶的数目。这种监测一段时间内肿瘤
或转移灶中细菌基因产物的存在可用于评估肿瘤或转移灶的变化，包括肿瘤的生长或缩小，或新转移灶的进展或转移灶的消失，并可以用于确定肿瘤的生长或缩小的速率，或新转移灶的进展或转移灶的消失，或肿瘤的生长或缩小的速率变化，或新转移灶的进展或转移灶的消失。因此，通过确定肿瘤的生长或缩小的速率、或新转移灶的发展或转移灶的消失、或肿瘤的生长或缩小的速率变化、或新转移灶的进展或转移灶的消失，监测细菌基因产物可用于监测对象的赘生性疾病，或确定治疗赘生性疾病的功效。
[0837]
可以通过监测来检测多种可检测蛋白质的任一种，其示例是多种荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质)中的任一种、多种荧光素酶中的任一种、转铁蛋白或其它铁结合蛋白质；或受体、结合蛋白质、和抗体，其中特异性结合受体、结合蛋白或抗体的化合物可以是可检测物质或者可以用可检测物质(例如放射性核素或显像剂)进行标记。
[0838]
肿瘤和/或转移灶大小可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种进行监测，包括外部评估方法或断层扫描或磁成像方法。除了本领域已知的方法，本文提供的方法例如监测细菌基因表达可用于监测肿瘤和/或转移灶大小。
[0839]
在一些时间点监测大小可以提供有关肿瘤或转移灶的大小增加或缩小的信息，并还可以提供有关对象中存在额外的肿瘤和/或转移灶的信息。在多个时间点监测肿瘤大小可以提供有关对象中赘生性疾病进展的信息，包括治疗对象中赘生性疾病的功效。
[0840]
本文提供的方法还可以包括监测对象中的抗体滴度，包括应答为对象施用免疫刺激性细菌而产生的抗体。本文提供的方法中施用的细菌可以引发对内源性细菌抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对由细菌表达的外源基因的免疫应答。本文提供的方法中施用的细菌还可以引发对肿瘤抗原的免疫应答。监测针对细菌抗原、细菌表达的外源基因产物或肿瘤抗原的抗体滴度可用于监测细菌的毒性，治疗方法的功效或用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。
[0841]
监测抗体滴度可用于监测细菌的毒性。在将细菌施用于对象后的一段时间内，针对细菌的抗体滴度可能会有变化，其中在某些特定时间点，较低的抗(细菌抗原)抗体滴度可表示较高的毒性，而在其它时间点，高的抗(细菌抗原)抗体滴度可表示较高的毒性。本文提供的方法中使用的细菌可以是免疫原性的，并因此可以在将细菌施用于对象后立即引发免疫应答。通常，当对象的免疫系统可以从所有正常器官或组织中去除细菌时，对象的免疫系统可以对免疫刺激性细菌产生强烈免疫应答的免疫刺激性细菌可以是具有低毒性的细菌。因此，在一些实施方案中，在将细菌施用于对象之后不久，针对细菌抗原的高抗体滴度可以表明细菌的低毒性。
[0842]
在其它实施方案中，监测抗体滴度可用于监测治疗方法的功效。在本文提供的方法中，抗体滴度如抗(肿瘤抗原)抗体滴度可以指示治疗方法例如治疗赘生性疾病的治疗方法的功效。本文提供的治疗方法可包括引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答。因此，通过监测抗(肿瘤抗原)抗体的滴度，可以监测治疗方法引起或增强针对肿瘤和/或转移灶的免疫应答的功效。
[0843]
在其它实施方案中，监测抗体滴度可用于监测用于生产和/或收获的基因产物或抗体的水平。如本文所提供的，通过在肿瘤中累积的微生物中表达外源基因，本发明方法可用于产生蛋白质、rna分子如shrna或其它化合物。监测针对蛋白质、rna分子或其它化合物的抗体滴度可以指示肿瘤累积的微生物产生的蛋白质、rna分子或其它化合物的水平，以及
可以直接指示特异于这种蛋白质、rna分子或其它化合物的抗体的水平。
[0844]
本文提供的方法还可以包括监测对象健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括赘生性疾病治疗方法。如本领域中已知的，监测对象的健康可以用于确定治疗方法的功效。本文提供的方法还可以包括为对象施用本文提供的免疫刺激性细菌的步骤。监测对象的健康可以用于确定施用于对象的免疫刺激性细菌的致病性。如本领域中已知的，可以监测用于监测疾病例如赘生性疾病、感染性疾病或免疫相关疾病的多种健康诊断方法的任一种。例如，对象的体重、血压、脉搏、呼吸、面色、温度或其它可观察到的状态均可以指示对象的健康。另外，来自对象的样品中一种或多种组分的存在或不存在或水平可以指示对象的健康。典型的样品可以包括血液和尿液样品，其中一种或多种组分的存在或不存在或水平可以通过进行例如血液全系或尿液全系诊断测试来确定。指示对象健康的示例组分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容和c
‑
反应蛋白浓度。
[0845]
本文提供的方法可以包括监测疗法，其中治疗决策可以基于监测的结果。本文提供的治疗方法可以包括为对象施用免疫刺激性细菌，其中细菌可以优先在肿瘤和/或转移灶中累积，及其中细菌可以引起或增强抗肿瘤免疫应答。这种治疗方法可以包括多个步骤，包括多次施用特定的免疫刺激性细菌，施用第二种免疫刺激性细菌或施用治疗性化合物。可以基于监测对象的一种或多种结果来确定施用于对象的免疫刺激性细菌或化合物的量、时间或类型。例如，对象中的抗体滴度可用于确定是否需要施用免疫刺激性细菌和任选地化合物，施用的细菌和/或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如，低抗体滴度可指示期望施用额外的免疫刺激性细菌、不同的免疫刺激性细菌和/或治疗性化合物，例如诱导细菌基因表达的化合物或独立于免疫刺激性细菌有效的治疗性化合物。
[0846]
在另一个实例中，对象的总体健康状况可以用于确定是否需要施用免疫刺激性细菌和任选地化合物、施用的细菌或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如确定对象是健康的可表示需要施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物如诱导细菌基因表达的化合物。在另一个实例中，监测可检测的细菌表达的基因产物可以用于确定是否需要施用免疫刺激性细菌和任选地化合物、施用的细菌或化合物的量以及施用的细菌和/或化合物的类型，其中例如确定对象是健康的可指示需要施用额外的细菌、不同细菌或治疗性化合物如诱导细菌基因表达的化合物。这种监测方法可以用于确定治疗方法是否有效，治疗方法对于对象是否是致病性的，细菌是否已在肿瘤或转移灶中累积，以及细菌是否在正常组织或器官中累积。基于这种确定，可以得出进一步治疗方法的期望和形式。
[0847]
在另一个实例中，监测可以确定免疫刺激细菌是否已经在对象的肿瘤或转移灶中累积。基于这种确定，可以决定为对象进一步施用额外的细菌、不同的免疫刺激性细菌和任选地化合物。
实施例
[0848]
仅用于说明目的包括以下实施例，并不旨在限制本发明的范围。
[0849]
一些示例性工程化的免疫刺激性细菌菌株和命名的总结：
[0850]
[0851][0852]
实施例1
[0853]
鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株
[0854]
沙门氏菌菌株ys1646对于腺苷是营养缺陷型
[0855]
本文提供的菌株被工程化为对于腺苷是营养缺陷的。结果，其在体内是减毒的，因为其不能在正常组织的低腺苷浓度中复制，以及定植主要发生在腺苷水平高的实体瘤微环境(tme)中。沙门氏菌菌株ys1646是野生型菌株atcc#14028的衍生物，由于puri基因(与purm同义)的破坏而被工程化为对于嘌呤是营养缺陷型(low et al.(2004)methods mol.med 90:47
‑
60)。随后对ys1646整个基因组的分析表明，puri基因实际上并未缺失，而是被染色体倒位破坏(broadway et al.(2014)1biotechnol.192:177
‑
178)，整个基因仍包含在ys1646染色体的两部分中，其侧翼是插入序列，其中一个具有活性转座酶。puri基因的完整基因序列的存在通过染色体再联锁方式被破坏，留下回复为野生型基因的可能性。虽然之前已经证实ys1646的嘌呤营养缺陷型在体外连续传代>140次之后仍是稳定的，但不清楚回复率是多少(clairmont et al.(2000)j.infect.dis.181:1996
‑
2002)。
[0856]
本文表明，当提供腺苷时，ys1646能在基本培养基中复制，而野生型亲本菌株
atcc#14028可以在未补充腺苷的基本培养基中生长。将ys1646在溶原性肉汤(lb)培养基中生长过夜，用m9基本培养基洗涤，然后在不含腺苷或增加浓度的腺苷的m9基本培养基中稀释。使用m3分光光度计(molecular devices)在37℃下测量生长，每15分钟读取一次od
600
。
[0857]
结果表明，与能在所有腺苷浓度下生长的野生型菌株(atcc#14028)不同，ys1646菌株仅在提供11至300微摩尔浓度的腺苷时才能复制，但在单独的m9或补充有130纳摩尔腺苷的m9中完全无法复制。这些数据表明puri突变体在肿瘤微环境中发现的腺苷浓度下能复制，但在正常组织中发现的浓度下不能复制。本文举例说明的工程化的腺苷营养缺陷型菌株包括其中从染色体中缺失全部或部分puri开放读框的菌株，以防止回复为野生型。这种基因缺失可通过本领域技术人员已知的任何方法实现，包括如下所述的λred系统。
[0858]
沙门氏菌菌株ys1646对于atp是营养缺陷型
[0859]
除了嘌呤和腺苷营养缺陷外，还确定了puri缺失的菌株是否也能清除atp。由于垂死的肿瘤细胞的渗漏，atp在肿瘤微环境中累积到高水平。如本文所示，当提供atp时，菌株ys1646能在基本培养基中复制，但在不补充atp时无法生长。为了证实这一点，将菌株ys1646在lb培养基中生长过夜，用m9基本培养基洗涤，然后在不含atp或增加浓度的atp(fisher)的m9基本培养基中稀释。使用m3分光光度计(molecular devices)在37℃测量生长，每15分钟读取一次od
600
。结果表明，当以0.012毫摩尔浓度提供atp或仅在m9中时，菌株ys1646能复制。
[0860]
实施例2
[0861]
胞内复制缺陷归因于msbb突变
[0862]
ys1646菌株在puri中包含突变，这样将复制限于含有高浓度嘌呤、腺苷或atp的位点，及在msbb中，其改变脂多糖(lps)表面包被以减少tlr4介导的促炎信号传导。也已经确定，与野生型沙门氏菌不同，菌株ys1646无法在巨噬细胞中复制。进行实验以确定这些基因突变中的哪一个突变导致在野生型菌株atcc 14028中赋予这个表型。
[0863]
在这个测定中，将小鼠raw巨噬细胞(invivogen,san diego,ca.)用含有puri、msbb或这两者缺失的野生型沙门氏菌菌株感染，感染复数(moi)为30分钟每个细胞约5个细菌，然后用pbs洗涤细胞，加入含有庆大霉素的培养基杀死胞外细菌。庆大霉素不能杀死细胞内细菌，因为其不能穿过细胞膜。在感染后的不同时间点，将细胞单层用水渗透压休克裂解，将细胞裂解物稀释并铺在lb琼脂上，以计算存活的集落形成单位(cfu)。
[0864]
如下表所示，仅包含puri突变的野生型沙门氏菌菌株仍然能复制。这解释了为什么单独突变仅观察到耐受性的适度改善，同时实现了对肿瘤微环境的高度特异性。仅包含msbb
‑
突变的菌株以及包含puri
‑
和msbb
‑
突变的菌株不能复制且在48小时内从细胞中迅速清除。
[0865]
[0866]
实施例3
[0867]
沙门氏菌asd基因敲除菌株工程化和鉴定
[0868]
制备菌株ys1646δasd。其是衍生自菌株ys1646(可从atcc，目录号202165购得)的减毒鼠伤寒沙门菌菌株，已被工程化为具有asd基因缺失。在这个实施例中，将鼠伤寒沙门菌菌株ys1646δasd使用如下文所述的datsenko和wanner方法(proc.natl.acad.sci.usa 97:6640
‑
6645(2000))的修饰进行工程化。
[0869]
在ys1646菌株中导入λ
‑
red辅助质粒
[0870]
如先前所述(sambrook j.,(1998)molecular cloning,a laboratory manual,2nd ed.cold spring harbor,ny:cold spring harbor laboratory)通过在lb中生长培养物并浓缩100倍，然后用冰冷的10％丙三醇洗涤三次将ys1646菌株制备为电感受态。使用λ
‑
red辅助质粒pkd46(seq id no:218)在以下设置下使用0.2cm间隙比色皿对所述电感受态菌株进行电穿孔：2.5kv，186ohms，50μf。在30℃将携带pkd46的转化株在具有氨苄青霉素和1mm l
‑
阿拉伯糖的5ml soc培养基中生长。然后如以上针对ys1646菌株所述将含有λ
‑
red辅助质粒pkd46的ys1646克隆制备电感受态。
[0871]
构建asd基因敲除盒
[0872]
来自ys1646的基因组的asd基因(broadway et al.(2014)j.biotechnology 192:177
‑
178)用于设计asd基因敲除盒。将含有分别与asd基因的左侧和右侧区域同源的204和203bp的质粒转化到dh5
‑
α感受态细胞中(thermo fisher scientific)。将侧翼是lox p位点的卡那霉素基因盒克隆到这个质粒中。然后使用引物asd
‑
l和asd
‑
2(表1)对asd基因敲除盒进行pcr扩增，并进行凝胶纯化。
[0873]
asd基因的缺失
[0874]
用凝胶纯化的线性asd基因敲除盒对携带质粒pkd46的ys1646菌株进行电穿孔。在soc培养基中回收电穿孔的细胞，并将其铺板于补充有卡那霉素(20μg/ml)和二氨基庚二酸(dap，50μg/ml)的lb琼脂平板上。在这个步骤期间，λ
‑
red重组酶诱导染色体asd基因与kan盒的同源重组(由于存在于染色体asd基因上游和下游的同源侧翼序列所致)，并且发生asd基因的染色体拷贝的敲除。通过用来自断裂位点侧翼的ys1646基因组的引物(引物asd
‑
3)和来自多克隆位点的引物(引物scfv
‑
3)进行pcr扩增证实了选择的卡那霉素抗性克隆中存在被破坏的asd基因(表1)。将集落也复制地铺板于有和没有补充dap的lb平板上，以证实dap营养缺陷。在没有补充dap的情况下，所有具有asd基因缺失的克隆均无法生长，这表明dap营养缺陷。
[0875]
表1：引物信息
[0876]
引物名称引物序列seq.id no.asd
‑
1ccttcctaacgcaaattccctg219asd
‑
2ccaatgctctgcttaactcctg220asd
‑
3gcctcgccatgtttcagtacg221asd
‑
4ggtctggtgcattccgagtac222scfv
‑
3cataatctgggtccttggtctgc223apr
‑
001aaaaaagcttgcagctctggcccgtg226apr
‑
002aaaaaagcttttagaaaaactcatcgagcatcaaatga227
id no：246)。通过用spei和xhoi进行限制性消化并连接和克隆到大肠杆菌dh5
‑
α中，将靶向鼠trex1的shrna导入这个载体。所得的质粒称作pati
‑
shtrex1。
[0885]
将质粒电穿孔进免疫刺激性细菌菌株中
[0886]
使用btx600电穿孔仪，使用0.2cm间隙比色皿(btx,san diego,calif)在以下设置下将包含编码免疫刺激性蛋白和功能性asd基因的表达盒的选择的质粒电穿孔到缺乏asd基因的鼠伤寒沙门氏菌菌株中：2.5kv，186ohms，50μf。将净电穿孔的细胞加入补加50μm二氨基庚二酸(dap)的1ml soc中，在37℃孵育1小时，然后播布于不含dap的琼脂平板上，选择接受具有功能性asd基因质粒的菌株。在分离单集落后，将一个充分分离的鼠伤寒沙门氏菌集落接种在无菌溶原性肉汤(lb)的烧瓶中，在37℃以250rpm搅拌孵育，从而产生细胞库。将培养物生长至稳定期后，将细菌在含有10％甘油的pbs中洗涤，在低于
‑
60℃的条件下等份冷冻保存。
[0887]
将质粒pati
‑
shtrex1在大肠杆菌中扩增并纯化以通过电穿孔转化进ys1646δasd菌株中，在lb amp平板上克隆选择，以产生菌株ys1646δasd
‑
shtrex1。用patiu6衍生的质粒互补的ys1646δasd突变体能在没有dap的情况下在lb琼脂和液体培养基上生长。
[0888]
在随后的迭代中，将来自pat1
‑
shtrex1的氨苄青霉素抗性基因(ampr)用卡那霉素抗性基因取代。这是通过用hindiii消化pati
‑
shtrex1质粒，然后进行凝胶纯化以去除ampr基因而实现的。使用引物apr
‑
001和apr
‑
002(分别为seq id no:226和seq id no:227)通过pcr扩增卡那霉素抗性(kanr)基因，然后用hindiii消化并连接到凝胶中纯化的、消化的patiu6质粒中。
[0889]
在随后的迭代中，使用q50定向位点诱变试剂盒(new england biolabs)和引物apr
‑
003(seq id no:228)和apr
‑
004在puc19复制起点将单点突变导入patikan质粒(seq id no:229)中，以将第148位核苷酸t变为c。这个突变使复制起点与pbr322复制起点同源，后者是低拷贝复制起点，以减少质粒拷贝数。
[0890]
使用asd互补系统在体内证实质粒维持
[0891]
在这个实施例中，将ct26荷瘤小鼠用含有表达靶向trex1的shrna(ys1646
‑
shtrex1)的质粒的菌株ys1646或含有带有功能性asd基因和靶向trex1的shrna(ys1646δasd
‑
shtrex1)的质粒的asd缺失的ys1646菌株处理。
[0892]
ct26(结肠肿瘤#26)是一种肿瘤模型，源自将balb/c小鼠暴露于n
‑
硝基
‑
n
‑
甲基氨基甲酸乙酯(nmu)，导致高度转移癌，重现侵润性、未分化和检查点难治性人结直肠癌(castle et al.(2014)bmc genomics 15(1)：190)。当经皮下植入侧腹时，与原位植入结肠相反，肿瘤免疫表型更具免疫抑制性和检查点难治性。虽然大量缺乏t细胞浸润，但肿瘤富含如巨噬细胞和髓源性抑制细胞(mdsc)等骨髓细胞(zhao et al.(2017)oncotarget 8(33):54775
‑
54787)。由于这个模型更类似于人微卫星稳定(mss)结直肠癌，因此是评估本文提供的治疗方法的理想模型。
[0893]
对于这个实验，为6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠(每组3只)在右侧腹部经皮下(sc)接种ct26(购自atcc)肿瘤细胞(在100μl pbs中2
×
105个细胞)。在第8、15和23天，为对带有8天龄植入的侧腹部肿瘤的小鼠经静脉注射3剂5
×
106cfu的ys1646δasd
‑
shtrex1菌株或亲本菌株ys1646。所述质粒编码shtrex1作为示例的治疗性产物；任何其它希望的治疗性产物均可取代。
[0894]
每周测量两次体重和肿瘤。使用电子卡尺(fowler,newton,ma)进行肿瘤测量。肿瘤体积采用修正的椭圆体公式1/2(长
×
宽2)计算。根据iacuc规定，当肿瘤大小达到体重的>20％或坏死崩解时，对小鼠实施安乐死。
[0895]
在最后一次注射沙门氏菌后12天，将肿瘤匀浆，并将匀浆连续稀释及铺板于lb琼脂平板上，以计算存在的集落形成单位(cfu)的总数，或铺板于含有卡那霉素的lb平板上以计算卡那霉素抗性集落数量。
[0896]
结果表明，鼠伤寒沙门氏菌ys1646
‑
shtrex1没有选择压力以维持shrna质粒，并且表现出显著的质粒损失，因为卡那霉素抗性(kanr)集落百分比小于10％。使用asd基因互补系统进行质粒维持的菌株ys1646δasd
‑
shtrex1具有几乎相同数量的卡那霉素抗性和卡那霉素敏感性cfu。这些数据表明，asd基因互补系统足以在小鼠肿瘤微环境的背景下维持质粒。
[0897]
使用asd互补系统增强的抗肿瘤效力
[0898]
asd互补系统被设计为防止质粒缺失及增强鼠伤寒沙门氏菌菌株在体内递送治疗性产物的抗肿瘤功效。为了测试这一点，将含有shtrex1质粒(ys1646δasd
‑
shtrex1)或含有功能性asd基因盒的乱序对照(ys1646δasd
‑
shscr)的ys1646δasd菌株在鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效与含有pequ6
‑
shtrex1的ys1646菌株(ys1646
‑
shtrex1)进行比较，pequ6
‑
shtrex1是一种缺乏asd基因盒的质粒，因此没有质粒维持机制。shtrex1是示例的治疗性产物。
[0899]
对于这个实验，为6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠(每组8只)经皮下在右侧腹部接种ct26细胞(在100μl pbs中2
×
105个细胞)。在第8天和第18天，为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉注射5
×
106cfu的ys1646δasd
‑
shtrex1或ys1646
‑
shtrex1，并与pbs对照组进行比较。
[0900]
与pbs相比，ys1646
‑
shtrex1菌株表现出增强的肿瘤控制(70％肿瘤生长抑制(tgi)，第28天)，尽管其质粒随着时间的推移而缺失。与pbs相比，含有具有asd基因互补系统的质粒和shtrex1的δasd菌株(ys1646δasd
‑
shtrex1)显示出优于pbs的肿瘤生长抑制(82％tgi，p＝0.002，第25天)。这些数据表明，与包含不具有asd基因互补系统的质粒的ys1646相比，通过防止质粒缺失、使用asd互补系统和shtrex1的递送，可以提高效力。因此，具有asd互补系统的菌株是优良的抗癌治疗剂。
[0901]
实施例4
[0902]
具有包含cpg元件的质粒的修饰的鼠伤寒沙门氏菌证实与ys1646亲本菌株相比增强的抗肿瘤活性
[0903]
toll样受体(tlr)是用于感测病原体相关分子模式(pamp)和激活针对病原体的先天免疫的关键受体(akira et al.(2001)nat.immunol.2(8):675
‑
680)。其中tlr9负责识别致病dna中的低甲基化cpg基序，该基序在哺乳动物dna中不是天然存在的(mckelvey et al.(2011)j.autoimmunity 36:76)。在病原体吞噬到免疫细胞亚群中的胞内体后，cpg基序的识别诱导irf7依赖性i型干扰素信号传导，并激活先天性和适应性免疫。本文显示，与不含质粒的ys1646菌株相比，携带含有cpg基序质粒的经修饰的鼠伤寒沙门菌(ys1646 pequ6乱序)的鼠伤寒沙门菌菌株ys1646类似地激活tlr9并诱导i型ifn介导的先天性和适应性免疫。
[0904]
表2示出了本文使用的工程化质粒中的cpg基序。ast
‑
103菌株中的pequ6 shscr(非同源shrna)质粒具有362个cpg基序，表明与缺乏用这种质粒转化的相同沙门菌属相比，基于沙门菌属的质粒递送可以是免疫刺激性的并具有抗肿瘤作用。为了评估ys1646内含cpg的质粒在鼠结肠癌模型中诱导肿瘤生长抑制的能力，将6
‑
8周龄的雌性balb/c小鼠(每组9只小鼠)在右侧腹部经皮下(sc)接种ct26细胞(100μl pbs中2
×
105个细胞)。对带有已建立的腹部肿瘤的小鼠每周经静脉内注射3剂5
×
106cfu的ys1646(ast
‑
100)或含有具有cpg基序的shrna乱序质粒的ys1646(ast
‑
103)，并与pbs对照组进行比较。
[0905]
表2：工程化质粒中的cpg基序
[0906]
序列名称cpg基序数seq id no.pbr322origin80243pequ6(shscr)362244asd gene orf234242pati
‑
2.0538245
[0907]
与pbs相比，ys1646(ast
‑
100)菌株表现出适度的肿瘤控制(32％tgi，p＝ns，第28天)。ast
‑
103菌株，其与ys1646的区别仅在于加入编码非同源乱序shrna的含cpg的质粒，与单独的未转化且因此缺乏质粒的ys1646相比，表现出非常显著的肿瘤生长抑制作用(p＝0.004，第32天)。
[0908]
asd基因具有234个cpg基序(见表2)，表明包含其的质粒可以具有免疫刺激性质。与单独的pbs相比，ast
‑
109(具有乱序shrna的ys1646
‑
asd)具有51％的肿瘤生长抑制，表明具有强烈的免疫刺激作用。
[0909]
这些数据证实在靶向肿瘤的减毒鼠伤寒沙门菌菌株中含有激活tlr9的cpg基序的质粒dna的强力免疫刺激性质。
[0910]
实施例5
[0911]
载体合成
[0912]
通过质粒的asd表达互补asd缺失
[0913]
化学合成质粒(patiu6)并组装(seq id no:225)。所述质粒包含以下特征：高拷贝(puc19)复制起点、驱动短发夹表达的u6启动子、侧翼是随后去除的hindiii限制性位点的氨苄青霉素抗性基因，以及包含起始密码子上游序列的85个碱基对的asd基因(seq id no：246)。通过用spei和xhoi进行限制性消化并连接和克隆于大肠杆菌dh5
‑
α中，将靶向鼠trex1的shrna或乱序的非同源shrna序列导入这个载体。所得质粒分别命名为pati
‑
shtrex1和pati
‑
shscr，将其在大肠杆菌中扩增并纯化，并通过电穿孔以转化进asd敲除菌株ast
‑
101中，在lb amp平板上进行克隆选择以分别产生菌株ast
‑
108和ast
‑
107。或者，将编码其它治疗性产物的其它核酸分子，包括本文所述的胞质dna/rna传感器的功能获得性变体，导入这个载体在没有dap的情况下，用patiu6衍生质粒互补的asd
‑
突变体能在lb琼脂和液体培养基上生长。
[0914]
在随后的迭代中，将来自pati
‑
shtrex1的氨苄青霉素抗性基因(ampr)取代为卡那霉素抗性基因。这通过如下程序实现的：用hindiii消化pati
‑
shtrex1质粒，随后通过凝胶纯化以去除ampr基因，使用引物apr
‑
001和apr
‑
002(seq id no:226和seq id no:227)进行卡那霉素抗性基因(kanr)的pcr扩增，用hindiii消化和连接到凝胶纯化消化的patiu6质粒
中。
[0915]
在随后的迭代中，使用定点诱变(site
‑
directed mutagenesis)试剂盒(new england biolabs)和引物apr
‑
003(seq id no:228)和apr
‑
004((seq id no:229)将第148位的核甘酸t改变为c，从而将单点突变在puc19复制起点导入patikan质粒。这个突变使复制起点与pbr322复制起点同源，以减少质粒拷贝数。
[0916][0917]
pati2.0
[0918]
设计并合成了包含以下特征的质粒：pbr322复制起点、sv40 dna核靶向序列(dts)、rrnb终止子、驱动shrna表达随后侧接克隆启动子和shrna或microrna的限制性位点的u6启动子、asd基因、rrng终止子，以及侧翼是hindiii位点以处理的卡那霉素抗性基因以及多克隆位点(seq id no：247)。另外，设计并合成了质粒，用于表达两个单独的shrna或microrna。这个质粒包含以下特征：pbr322复制起点、sv40 dna核靶向序列(dts)、rrnb终止子、驱动shrna表达随后侧接克隆启动子和shrna或microrna的限制性位点的u6启动子、驱动第二个shrna或microrna表达的h1启动子、位于h1和u6启动子之间的450bp随机生成的填充序列、asd基因、rrng终止子，以及侧翼是hindiii位点以处理的卡那霉素抗性基因以及多克隆位点(seq id no:245)。
[0919]
实施例6
[0920]
通过缺失flic和fljb基因的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白敲除菌株工程化和鉴定
[0921]
在本文的实施例中，将包含asd基因缺失的活的减毒的鼠伤寒沙门菌菌株ys1646进一步工程化以缺失flic和fljb基因，以除去两个鞭毛蛋白亚基。这样消除了促炎tlr5激活，以减少促炎信号传导和改良抗肿瘤适应性免疫。
[0922]
flic基因的缺失
[0923]
在这个实施例中，如上文详细描述的使用datsenko和wanner(proc.natl.acad.sci.usa 97:6640
‑
6645(2000))的修饰方法将flic从ys1646δasd菌株的染色体中缺失。简而言之，将在flic基因侧翼包含224和245个碱基的同源序列的合成的flic基因同源臂序列，克隆进称为psl0147的质粒中(seq id no:230)。然后将侧翼是cre/loxp位点的卡那霉素基因盒克隆到psl0147中，然后用引物flic
‑
l(seq id no:232)和flic
‑
2(seq id no:233)对flic基因敲除盒进行pcr扩增，凝胶纯化，然后通过电穿孔导入带有温度敏感性λ
‑
red重组质粒pkd46的ys1646δasd菌株中。在soc dap培养基中回收电穿孔的细胞，并铺板于补充有卡那霉素(20μg/ml)和二氨基庚二酸(dap，50μg/ml)的lb琼脂板上。选择集落并筛选以通过使用引物flic
‑
3(seq id no:234)和flic
‑
4(seq id no:235)进行pcr以插入敲除片段。然后通过在42℃培养选择的卡那霉素抗性菌株及筛选氨苄青霉素抗性丧失以处理pkd46。然后，通过电穿孔表达cre重组酶的温度敏感质粒(pjw1680)处理卡
那霉素抗性标记，在30℃选择amp
r
集落；随后通过在42℃生长培养物以消除pjw1680。然后通过使用在破坏位点侧翼的引物(flic
‑
3和flic
‑
4)进行pcr和琼脂糖凝胶上的电泳迁移率的评估，以检测选择的flic敲除克隆的卡那霉素标记缺失。
[0924]
fljb基因的缺失
[0925]
然后，使用上述修饰方法，在ys1646δasd/δflic菌株中缺失fljb。合成的fljb基因同源臂序列，包含flib基因侧翼的分别为249和213个碱基的左手侧和右手侧序列，将其合成并克隆到称为psl0148的质粒中(seq id no:231)。然后将侧翼是cre/loxp位点的卡那霉素基因盒克隆到psl0148中，然后用引物fljb
‑
l(seq id no:236)和fljb
‑
2(seq id no:237)(见表1)对fljb基因敲除盒进行pcr扩增及凝胶纯化，通过电穿孔导入带有温度敏感性λ
‑
red重组质粒pkd46的ys1646δasd菌株中。然后如上所述通过cre
‑
介导的重组以处理卡那霉素抗性基因，通过在非容许温度下生长以处理温度敏感性质粒。通过分别使用引物flic
‑
3和flic
‑
4或fljb
‑
3(seq id no:238)和fljb
‑
4(seq id no:239)进行pcr以扩增flic和fljb基因敲除序列，通过dna测序进行验证。将ys1646的这个突变衍生物命名为ys1646δasd/δflic/δfljb，或简短称作ys1646δasd/δflg。
[0926]
工程化的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白敲除菌株的体外鉴定
[0927]
通过将10μl的过夜培养物点样于游泳平板(含有0.3％琼脂和50mg/ml的dap的lb)上以评估具有flic和fljb缺失的ys1646衍生的asd
‑
突变菌株(在本文称为ys1646δasd/δflg)的游泳运动性。虽然观察到了ys1646δasd菌株的运动性，但ys1646δasd/δflg菌株明显没有运动性。然后将ys1646δasd/δflg菌株用含有asd基因的质粒电穿孔，评估其在没有dap下的生长速率。具有asd互补质粒的ys1646δasd/δflg菌株在不存在补充dap的情况下能在lb中复制，并且以与包含asd互补质粒的ys1646δasd菌株相当的速率生长。这些数据表明，鞭毛蛋白的消除不降低鼠伤寒沙门菌在体外的适应性(fitness)。
[0928]
消除鞭毛蛋白降低鼠巨噬细胞中的细胞焦亡
[0929]
在庆大霉素保护试验中以moi约100用均具有asd互补质粒的ys1646δasd/δflg菌株或亲本ys1646δasd菌株感染5
×
105个小鼠raw巨噬细胞(invivogen,san diego,ca.)。感染24小时后，使用pierce
tm
ldh细胞毒性测定试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma.)，收集培养物上清液并评估作为细胞死亡的标志的乳酸脱氢酶释放。ys1646δasd菌株诱导75％的最大ldh释放，而ys1646δasd/δflg菌株诱导54％的最大ldh释放，表明鞭毛蛋白基因的缺失降低了感染的巨噬细胞的鼠伤寒沙门菌诱导的细胞焦亡。
[0930]
鞭毛缺失的突变体导致感染的人单核细胞中较少的细胞焦亡
[0931]
为了证实ys1646δasd/δflg菌株引起巨噬细胞中细胞死亡的能力降低，将thp
‑
1人巨噬细胞(atcc目录号#202165)用鼠伤寒沙门氏菌菌株ys1646和ys1646δasd/δflg菌株感染，δasd菌株包含编码功能性asd基因的质粒以确保质粒维持。将5
×
104个细胞置于具有dmem和10％fbs的96孔培养皿中。将细胞用洗涤的鼠伤寒沙门氏菌对数期培养物感染1小时，mot为100cfu/细胞，然后用pbs洗涤细胞，并将培养基替换为含有50μg/ml庆大霉素和50ng/ml的ifnγ的培养基，庆大霉素用以杀死细胞外细菌，ifnγ用以将单核细胞转化为巨噬细胞表型。24小时后，将thp
‑
1细胞用试剂(promega)染色，存活细胞的百分比使用发光细胞存活测定法确定，使用平板读器以量化发光。感染ys1646菌株的细胞只有38％的存活率，而感染ys1646δasd/δflg菌株的细胞有51％的存活率，这表明
鞭毛蛋白基因的缺失导致人巨噬细胞的细胞死亡减少，尽管具有非常高的超生理性moi。
[0932]
在全身性施用后鞭毛不在为肿瘤定植所需要
[0933]
为了评估鞭毛蛋白敲除菌株的影响，将其施用于结肠癌小鼠模型中，为6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠(每组5只小鼠)经皮下在右侧腹部接种ct26细胞(100μl pbs中的2
×
105个细胞)。带有10天已建立的侧腹肿瘤的小鼠经静脉注射单剂量3
×
105cfu的ys1646δasd/δflg
‑
shtrex1菌株或亲本ys1646δasd
‑
shtrex1菌株。在肿瘤植入后第35天，对小鼠实施安乐死，将肿瘤均质化及铺板于lb平板上以计算每克肿瘤组织的集落形成单位(cfu)数。ys1646δasd
‑
shtrex1菌株定植的肿瘤的平均值为每克肿瘤组织5.9
×
107cfu，而鞭毛缺失的ys1646δasd/δflg
‑
shtrex1菌株定植的肿瘤的平均值几乎增加了2倍，为每克肿瘤组织1.1
×
108cfu。ys1646δasd
‑
shtrex1菌株的脾定植计算为平均值每克脾组织1.5
×
103cfu，而鞭毛缺失的ys1646δasd/δflg
‑
shtrex1菌株的脾定植略低，平均为每克脾组织1.2
×
103cfu。
[0934]
这些数据表明，在静脉内施用后，鞭毛的缺失不仅不会对肿瘤定植产生负面影响，而且与鞭毛完整菌株相比增强肿瘤定植。重要的是，鞭毛的缺失略微减少脾定植，使肿瘤与脾的比率是100,000倍。这些数据表明，与本领域的预期相反，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且其消除增强了肿瘤定植同时减少了脾定植。
[0935]
鞭毛缺失的菌株在小鼠中证实增强的抗肿瘤活性
[0936]
为了评估施用在结肠癌小鼠模型中鞭毛蛋白敲除菌株的影响，将6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种ct26细胞(在100μl pbs中2
×
105个细胞)。为带有已建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射单剂量3
×
105cfu的ys1646δasd/δflg
‑
shtrex1菌株或ys1646δasd
‑
shtrex1菌株，并与pbs对照组进行比较。通过卡尺测量监测小鼠的肿瘤生长。
[0937]
结果表明，与亲本ys1646δasd
‑
shtrex1菌株相比，无法产生鞭毛的ys1646δasd/δflg
‑
shtrex1菌株显示出增强的肿瘤控制(27％tgi，第24天)，与pbs对照组相比具有显著的肿瘤控制作用(73％tgi，p＝0.04，第24天)。这些数据表明，鞭毛不仅不是肿瘤定植所必需的，而且鞭毛的缺失可以增强抗肿瘤功效。
[0938]
缺失鞭毛的菌株在鼠肿瘤模型中证实增强的适应性免疫
[0939]
评估了鞭毛缺失对免疫应答的影响，以及肿瘤骨髓细胞向sting检查点基因trex1递送shrna而激活sting是否会促进适应性i型ifn免疫特征。使用ct26结肠癌小鼠模型，其中为6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠(每组5只)皮下接种ct26细胞(100μl pbs中2
×
105个细胞)。携带已建立的侧腹肿瘤的小鼠在肿瘤植入后11天用5
×
106cfu的ys1646δasd/δflg
‑
shtrex1菌株、亲本ys1646δasd
‑
shtrex1或乱序质粒对照菌株ys1646δasd
‑
shscr进行静脉注射，并与pbs对照组进行比较。
[0940]
在肝素钠涂层管(beckton dickinson)上给药后7天对小鼠进行放血。然后用等体积的pbs稀释未凝固的血液，使用细胞分离试剂(cedarlane)从全血的中间层中分离外周血单核细胞(pbmc)。通过在室温以1300rpm离心3分钟，用pbs 2％fbs洗涤分离的pbmc，并重新悬浮在流动缓冲液中。在v形底96孔板的每个孔中接种100万个pbmc。将细胞在室温(rt)下以1300rpm离心3分钟，然后在室温避光重悬于100μl流动缓冲液中45分钟，所述缓冲液中含有荧光染料缀合的ah1肽:mhc i类四聚体(mbl international)和细胞表
et al.(2017)oncotarget 8(33):54775
‑
54787)。mc38具有比ct26更高的突变负荷，cd8
t细胞可以检测类似的病毒衍生的gp70抗原(p15e)，尽管其不被视为排斥抗原。虽然已发现mc38的变体对检查点疗法有部分反应，但大多数细胞系变体被认为是检查点难治性的及t细胞排除的(mariathasan et al.(2018)nature 555:544
‑
548)，包括本文使用的mc38细胞。
[0948]
为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种mc38细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第34天，为带有较大的建立的侧腹肿瘤的小鼠静脉注射l
×
106cfu的ys1646δasd/δflg
‑
mcherry菌株。静脉给药后7天切除肿瘤并切成2至3毫米的小块，放入装有2.5ml酶混合物(rpmi
‑
1640 10％fbs和1mg/ml胶原酶iv和20μg/ml dnase i)的gentlemacs
tm c管(miltenyi biotec)中。使用octomacs
tm
(miltenyi biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离肿瘤块，将整个细胞制备物在37℃搅拌孵育45分钟。孵育45分钟后，使用octomacs
tm
(小鼠植入肿瘤程序)进行第二轮解离，所得单细胞悬浮液通过70μm尼龙网过滤到50ml管中。将尼龙网用5ml的rpmi
‑
1640 10％fbs洗涤一次，然后使用新的70μm尼龙网将细胞再次过滤到新的50ml管中。将尼龙网用5ml的rpmi
‑
1640 10％fbs洗涤，然后将过滤的细胞以1000rpm离心7分钟。将所得解离的细胞重新悬浮在pbs中并在染色之前在冰上保持。
[0949]
对于流式细胞术染色，将100μl的单细胞悬浮液接种在v形底的96孔板的孔中。每孔加入100μl含有死/活染色剂(zombie aqua
tm
，biolegend)和fc封闭试剂(bd biosciences)的pbs，并在冰上避光孵育30分钟。30分钟后，通过以1300rpm离心3分钟，将细胞用pbs 2％fbs洗涤两次。然后将细胞重悬于pbs 2％fbs中，其中含有荧光染料缀合的抗体(cd4 fitc克隆rm4
‑
5、cd8a bv421克隆53
‑
6.7、f4/80apc克隆bm8、cd11b pe
‑
cy7克隆m1/70、cd45 bv570克隆30
‑
f11、cd3 pe克隆145
‑
2c11、ly6c bv785克隆hk1.4、i
‑
a/i
‑
e apc
‑
cy7克隆m5/114.15.2、ly6g bv605克隆1a8和cd24 percp
‑
cy5.5克隆m1/69，均得自biolegend)，在冰上避光孵育30分钟。30分钟后，将细胞通过以1300rpm离心3分钟用pbs 2％fbs洗涤两次，然后重悬在流式细胞术固定缓冲液(thermofisher scientific)中。流式细胞术数据使用flow cytometer(acea biosciences,inc.)获取，并使用flowjo
tm
软件(tree star,inc.)进行分析。
[0950]
结果表明，7.27％的肿瘤浸润单核细胞在肿瘤微环境中摄取了鞭毛缺失的mcherry菌株。相似地，8.96％的肿瘤相关巨噬细胞(tam)和3.33％的肿瘤浸润树突状细胞(dc)摄取了鞭毛缺失的mcherry菌株。相反，在cd45
‑
群体中，对应于基质细胞和肿瘤细胞，只有0.076％的mcherry表达呈阳性(与0.067％的背景染色相比)。这些数据表明鞭毛及其下游信号传导对spi
‑
1的影响是必要的，使上皮细胞具有感染性，并且其缺乏将细菌的摄取限于仅肿瘤微环境(即肿瘤驻留免疫/骨髓细胞)的吞噬免疫细胞区室。
[0951]
鞭毛的缺失赋予免疫刺激性鼠伤寒沙门氏菌菌株多种益处，包括消除tlr5诱导的抑制适应性免疫的炎性细胞因子，减少巨噬细胞焦亡，以及在全身施用时维持(或增强)肿瘤特异性富集，其中摄取被限于肿瘤驻留吞噬细胞。
[0952]
实施例7
[0953]
被工程化为表达cytollo以增强质粒递送的鼠伤寒沙门菌
[0954]
在这个实施例中，实施例3中所述的ys1646的asd缺失菌株(ast
‑
101)被进一步修
饰以表达缺乏信号序列的listeriolysin o(llo)蛋白(在本文中称为cytollo)，其在沙门菌属菌株的细胞质中积累。llo是一种胆固醇依赖性成孔溶细胞素，其由单核细胞增生李斯特菌(listeria)分泌，并介导细菌的吞噬体逃逸。利用经优化以在沙门菌属中表达的密码子来合成编码llo的基因，其具有密码子2
‑
24缺失。cytollo的开放读框的序列示于seq id no:240。将cytollo基因置于诱导在鼠伤寒沙门菌中转录的启动子的控制下(seq id no:241，在下面再现)。使用datsenko和wanner(proc.natl.acad.sci.usa(2000)97:6640
‑
6645)的修饰方法，将cytollo表达盒以单拷贝插入asd缺失菌株ast
‑
101的敲除的asd基因座中。
[0955]
驱动cytollo表达的启动子序列
[0956]
llo启动子attatgtettgacatgtagtgagtgggctggtataatgcagcaagseq id no:241
[0957]
带有在asd基因座插入的cytollo表达盒的asd缺失菌株(在本文中称为asd/llo或ast
‑
114)通过用编码asd基因的pati质粒进行电穿孔被进一步修饰，其允许所述菌株在没有外源性dap下生长并且选择用于质粒维持，还包含如上述驱动shtrex1表达的u6启动子(本文称为asd/llo(pati
‑
shtrex1)或ast
‑
115)。asd/llo(pati
‑
shtrex1)菌株ast
‑
115以与含有相同质粒(pati
‑
shtrex1)的asd缺失菌株ast
‑
110相当的速率生长，证实llo敲入不会影响体外细菌适应性。
[0958]
工程化为产生cytollo的鼠伤寒沙门菌表现出强大的抗肿瘤活性
[0959]
为了确定cytollo基因敲入是否提供抗肿瘤功效，在鼠结肠癌模型中评估了asd/llo(pati
‑
shtrex1)菌株ast
‑
115。对于本研究，将6
‑
8周龄的雌性balb/c小鼠(每组8只小鼠)的右侧腹部皮下接种ct26(100μl pbs中2
×
105个细胞)。用单剂量的5
×
106cfu的ast
‑
115经静脉内注射具有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠，并与pbs对照组进行比较。
[0960]
与pbs对照组相比，在asd/llo(pati
‑
shtrex1)中加入cytollo基因显示出了显著高的肿瘤控制(76％tgi，p＝0.002，第28天)，并且在单次剂量后与先前的研究(其中含有trlxl shrna质粒的菌株以多剂施用)具有相当的功效。这些数据证实了将更多的质粒递送到细胞质中的cytollo介导的优势，导致更大的基因敲低，从而提高了rnai对靶如trlx1的治疗功效。
[0961]
实施例8
[0962]
鼠伤寒沙门菌的腺苷营养缺陷型菌株
[0963]
将本文提供的菌株工程化为对腺苷呈营养缺陷型。结果，其在体内是减毒的，因为其不能在正常组织的低腺苷浓度下复制，因此定植主要发生在腺苷水平高的实体瘤微环境中。沙门菌属菌株ys1646(ast
‑
100)是野生型菌株atcc 14028的衍生物，由于puri基因的破坏而被工程化为对嘌呤呈营养缺陷型(low et al.,(2004)methods mol.med.90:47
‑
60)。随后对ys1646的整个基因组进行的分析表明puri基因(与purm同义)实际上并未缺失，而是被染色体倒位破坏(broadway et al.(2014)j.biotechnol.20:177
‑
178)，并且整个基因仍包含在侧翼是插入序列的ys1646染色体的两个部分中(其中一个具有活性转座酶)。通过染色体再联锁(reengagement)被破坏的puri基因的完整遗传序列的存在为回复至野生型基因提供了可能性。尽管先前已经证实ys1646的嘌呤营养缺陷型在体外连续传代后是稳定的，但是不清楚回复率是多少(clairmont et al.(2000)j.infect.dis.181:1996
‑
2002)。
[0964]
本文显示，当提供腺苷时，ys1646能够在基本培养基中复制；而野生型亲代菌株
atcc 14028可以在不补充腺苷的基本培养基中生长。ys1646在lb培养基中过夜生长，用m9基本培养基洗涤，并稀释到不含腺苷或腺苷浓度增加的m9基本培养基中。使用m3分光光度计(molecular devices)在37℃测量生长，每15分钟读取od
600
。
[0965]
当以11至300微摩尔的浓度提供腺苷时，菌株ys1646能够复制，但是在单独的m9或补充有130纳摩尔腺苷的m9中完全不能复制。这些数据表明，puri突变体能够在肿瘤微环境中发现的腺苷浓度下复制，但在正常组织中发现的浓度下不能复制。本文示例的工程化的腺苷营养缺陷型菌株包括其中所有或部分的puri开放读框均从染色体上缺失以防止回复至野生型的菌株。可以使用如上述的λ
‑
red系统来实现这种基因缺失。
[0966]
还评估了以下含有puri破坏的沙门菌属菌株在m9基本培养基中的生长：其如上述被进一步工程化为包含asd基因缺失(asd)，或者如实施例6所述含有asd基因缺失及被进一步工程化为具有flic和fljb缺失(asd/flg)，或如实施例7所述asd突变体被进一步工程化为表达cytollo(asd/llo)，和用表达asd的低拷贝数质粒(patilow)互补(分别为菌株ast
‑
117、ast
‑
118和ast
‑
119)。数据表明，当以11至300微摩尔的浓度提供腺苷时，每个菌株都能够复制，但是在单独的m9或补充有130纳摩尔的腺苷的m9中完全不能复制。
[0967]
实施例9
[0968]
具有asd基因互补的菌株的asd基因互补系统体外生长的鉴定和用途
[0969]
为了评估含有质粒的细菌菌株的适应性，在37℃使用平板读器在lb液体培养基中绘制生长曲线，每15分钟读取od
600
。含有低拷贝质粒pequ6
‑
shtrex1的菌株ys1646(ast
‑
104)与不含质粒的菌株ys1646(ast
‑
100)相当地生长。具有高拷贝shtrex1质粒(其带有可以与asd营养缺陷互补的asd基因)的asd突变体菌株(ast
‑
110)在不存在dap的情况下能在lb中复制，但生长速度慢于菌株ys1646。包含shtrex
‑
1表达质粒(其具有低拷贝数复制起点和可与asd营养缺陷互补的asd基因)(patilow
‑
shtrex1)的asd缺失菌株ast
‑
117，生长速度快于ast
‑
110。这些数据表明，与asd基因营养缺陷互补的低拷贝数质粒优于高拷贝数质粒，因为其允许鼠伤寒沙门菌在体外的更快复制速率。
[0970]
asd互补菌株的细胞内生长
[0971]
为了测量用高拷贝和低拷贝质粒上的asd互补的asd突变体的适应性，使用庆大霉素保护测定评估所述细菌菌株在小鼠肿瘤细胞系中的细胞内复制能力。在这个测定中，将小鼠黑素瘤b16.f10细胞或小鼠结肠癌ct26细胞用含有包含互补性asd基因并具有高拷贝数复制起点的质粒的asd突变体沙门菌属菌株ast
‑
110(asd pati
‑
shtrex1)或具有低拷贝数复制起点的质粒的asd突变体沙门菌属菌株ast
‑
117(asd pati low copy
‑
shtrex1)感染。以每个细胞约5个细菌的复数感染细胞30分钟，然后用pbs洗涤细胞，并加入含有庆大霉素的培养基以杀死细胞外细菌。庆大霉素不能杀死细胞内细菌，因为其不能穿过细胞膜。在感染后的各个时间点，通过用水进行渗透休克来裂解细胞单层，将细胞裂解物稀释并铺板在lb琼脂上，以计数存活的集落形成单位(cfu)。
[0972]
有高拷贝质粒的互补的asd突变体菌株ast
‑
110具有最初的cfu下降，但能在b16.f10细胞而不是ct26细胞中生长，表明asd基因互补系统足以支持在哺乳动物肿瘤细胞内部的生长。包含低拷贝质粒的asd突变体菌株ast
‑
117能侵入并在这两种细胞类型中复制，表明低拷贝质粒上的asd基因互补使asd突变体在哺乳动物细胞内强劲生长。与具有高拷贝质粒的菌株相比，具有低拷贝质粒的菌株在这两种肿瘤细胞类型中均以较高数量复
制。这表明具有低拷贝质粒的沙门菌属菌株比具有高拷贝质粒的菌株具有增强的适应性。
[0973]
使用asd互补系统在肿瘤中的质粒维持
[0974]
在这个实施例中，用含有表达靶向trex1的shrna的质粒(pequ6
‑
trex1)的ys1646，菌株ast
‑
104，或含有具有功能性asd基因和靶向trex1的shrna的质粒(pati
‑
shtrex1)的ys1646的asd缺失菌株，菌株ast
‑
110，对ct26荷瘤小鼠进行处理。在最后一次沙门菌属注射后第12天，将肿瘤均质化，将均质连续稀释并铺板在lb琼脂平板上以对存在的cfu的总数进行计数，或铺板在含有卡那霉素的lb板上以对卡那霉素抗性集落的数量进行计数。
[0975]
由于卡那霉素抗性(kanr)集落的百分比小于10％，因此没有选择性压力来维持shrna质粒的鼠伤寒沙门菌ast
‑
104表明质粒丢失。使用asd基因互补系统进行质粒维持的菌株ast
‑
110具有几乎相同数量的卡那霉素抗性和卡那霉素敏感性cfu。这些数据证实，asd基因互补系统足以在小鼠肿瘤微环境的环境中维持质粒。
[0976]
使用asd互补系统增强的抗肿瘤功效
[0977]
asd互补系统设计为防止质粒丢失及增强鼠伤寒沙门菌菌株体内抑制性rna递送的抗肿瘤功效。为了对此进行测试，将含有功能性asd基因盒的含有shtrex1质粒的asd缺失菌株(ast
‑
110)或含有乱序对照的asd缺失菌株(ast
‑
109)与含有pequ6
‑
shtrex1(一种缺少asd基因盒及因此不具有质粒维持机制的质粒)的菌株ys1646(ast
‑
104)针对鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效进行了比较。对于这个实验，将6
‑
8周龄的雌性balb/c小鼠(每组8只小鼠)在右侧腹部经皮下接种ct26(在100μl pbs中2
×
105个细胞)。在第8天和第18天，对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠经静脉内注射两次5
×
106cfu的ast
‑
109(用pati
‑
sh乱序转化的asd)、ast
‑
110(用pati
‑
shtrex1转化的asd)或ast
‑
104(用pequ6
‑
shtrex1转化的ys1646)，并与pbs对照组进行比较。
[0978]
与pbs相比，ys1646菌株ast
‑
104表现出肿瘤控制(70％tgi，第28天)，尽管其表现出随时间的质粒丢失。与pbs相比，包含具有asd基因互补系统的pati质粒的乱序对照的asd
‑
菌株(ast
‑
109)显示出肿瘤控制(51％tgi，第25天)，表明cpg质粒的维持递送刺激了抗肿瘤应答。与pbs相比，含有带有asd基因互补系统和shtrex1的质粒的asd
‑
菌株(ast
‑
110)显示出最高的肿瘤生长抑制(82％tgi，p＝0.002，第25天)。这些数据表明，与包含不具有基因互补系统或shtrex1(治疗性产物)的质粒的ys1646相比，通过使用asd互补系统和递送shtrex1防止质粒丢失实现了改善的功效。
[0979]
与具有高拷贝质粒的菌株相比，具有低拷贝质粒的鼠伤寒沙门菌菌株显示出优异的抗肿瘤功效和肿瘤定植
[0980]
为了比较具有asd互补系统的低拷贝shtrex1质粒相对于高拷贝shtrex1质粒在鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效，为6
‑
8周龄的雌性balb/c小鼠(每组10只小鼠)在右侧腹部皮下接种ct26细胞(在100μl pbs中2
×
105个细胞)。为具有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠每周经静脉内注射两次5
×
106cfu的ast
‑
117(asd(pati low
‑
shtrex1))或ast
‑
110(asd(pati
‑
shtrex1)，并与作为阴性对照的pbs注射组进行比较。与具有高拷贝质粒的菌株ast
‑
110相比，具有低拷贝质粒的菌株ast
‑
117表现出优异的抗肿瘤功效(高：59％tgi，低：79％tgi，p＝0.042，第25天)。
[0981]
在这个肿瘤生长抑制研究结束时，对每组的4只小鼠实施安乐死，如上所述对肿瘤和脾进行均质，以评估肿瘤定植和肿瘤与脾定植的比率。含有低拷贝质粒的菌株ast
‑
117以
比具有高拷贝质粒的菌株ast
‑
110以高100倍的水平定植于肿瘤中。当计算从肿瘤和脾中回收的集落比率时，与ast
‑
110相比，ast
‑
117具有高10倍以上的肿瘤与脾定植比率，表明具有低拷贝质粒的菌株比具有高拷贝质粒的菌株具有更高的对肿瘤定植的特异性。
[0982]
这些数据证实了以前未知的属性，即经工程化以递送质粒的鼠伤寒沙门菌具有改善的肿瘤定植能力和抗肿瘤功效。
[0983]
实施例10
[0984]
工程化用于提高耐受性的示例菌株
[0985]
adra或csgd缺失
[0986]
在这个实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株，含有puri缺失、msbb缺失、asd基因缺失，及工程化为递送编码干扰rna的质粒，将其进一步修饰以缺失adra，adra是鼠伤寒沙门菌生物被膜形成所需的基因。不能形成生物被膜的沙门菌属被宿主吞噬细胞更迅速摄取，并被更迅速清除。细胞内定位的这种增加增强了质粒递送和通过rna干扰的基因敲低的有效性。从肿瘤/组织清除的增加速率增加了疗法的耐受性，以及缺乏生物被膜形成阻止了患者假体和胆囊的定植。
[0987]
在另一个实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株，含有puri缺失、msbb缺失、asd基因缺失，及工程化为递送编码治疗性产物的质粒，将其也修饰以缺失csgd(具有csgd缺失的菌株的工程化在下文描述)。这个基因负责adra的活化，并诱导curli菌毛(一种tlr2激动剂)的表达。csgd的丢失也阻止了生物被膜的形成，具有抑制tlr2活化的额外益处，从而进一步降低细菌毒力并增强编码的治疗性产物的递送。
[0988]
pagp缺失
[0989]
在这个实施例中，鼠伤寒沙门菌的活的减毒菌株，含有puri缺失、msbb缺失和asd基因缺失，及工程化为递送编码干扰rna的质粒，将其进一步修饰以缺失pagp。pagp基因在鼠伤寒沙门菌的感染性生命周期中被诱导，并编码使脂质a棕榈酸酯化的酶。在野生型鼠伤寒沙门菌中，pagp的表达产生七酰化的脂质a。在msbb
‑
突变体中，其中无法加入脂质a的末端酰基链，pagp的表达产生六酰化的lps。六酰化的lps已被证实是最具促炎性的。在这个实施例中，缺失pagp和msbb的菌株仅可产生五酰化的lps，从而当细菌被工程化以递送干扰rna或其它治疗性产物时，允许较低的促炎细胞因子、增强的耐受性和增强的适应性免疫。
[0990]
实施例11
[0991]
pagp缺失突变体具有五酰化的lps并诱导减少的炎性细胞因子
[0992]
沙门氏菌pagp基因敲除菌株工程化和鉴定
[0993]
使用前述实施例中描述的修饰方法，从ys1646δasd/δflg菌株中缺失pagp基因。pagp基因在鼠伤寒沙门氏菌的感染性生命周期中被诱导，并编码用棕榈酸酯修饰脂质a的一种酶(脂质a棕榈酰转移酶)。在野生型鼠伤寒沙门氏菌中，pagp的表达产生七酰化的脂质a。在msbb
‑
突变体中，其中不能加入脂质a的末端酰基链，因此pagp的表达产生六酰化lps。六酰化的lps已示出具有高度的促炎性，并且对tlr4具有高亲和性(在野生型中发现的七酰化lps对tlr4的亲和性最高)。在这个实施例中，缺失pagp和msbb的菌株只能产生五酰化lps，因此当所述细菌被工程化为递送编码免疫调节蛋白的质粒时可以由于其对tlr4的亲和性较低而减少促炎细胞因子，增强耐受性，以及增加适应性免疫。
[0994]
δpagp菌株构建
[0995]
合成的pagp基因同源臂序列在pagp基因的侧翼分别包含左侧和右侧序列的203和279个碱基，其被合成及克隆到称为psl0191(seq id no:315)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxp位点的卡那霉素基因盒克隆到psl0191中，使用引物pagp
‑
1(seq id no:321)和pagp
‑
2(seq id no:322)对pagp基因敲除盒进行pcr扩增(见表1)、凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ
‑
red重组质粒pkd46的菌株ys1646δasd。然后如上所述通过cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，及通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。使用引物pagp
‑
3(seq id no:323)和pagp
‑
4(seq id no:324)通过pcr扩增pagp基因敲除序列，通过dna测序验证。所得ys1646突变衍生物被命名为ys1646δasd/δflg/δpagp。
[0996]
pagp缺失突变体具有五酰化lps及诱导减少的炎性细胞因子
[0997]
使用datsenko and wanner(proc.natl.acad.sci.usa97:6640
‑
6645(2000))及上文所述的λ衍生的red重组系统，从ys1646δasd菌株中缺失pagp基因，产生菌株ys1646δasd/δpagp。然后用含有功能性asd基因的质粒对这个菌株进行电穿孔，以补充缺失的asd基因并确保体内质粒维持。然后从这个菌株中提取脂质a并通过基质辅助激光解吸/电离质谱(maldi ms)进行评估，并与来自野生型鼠伤寒沙门氏菌菌株atcc 14028、ys1646菌株(缺失msbb和puri)以及ys1646δasd菌株的脂质a进行比较。由于存在功能性msbb基因，野生型沙门氏菌具有质量为2034的次要脂质a峰和质量为1796的主要峰，分别对应于七酰化和六酰化物质。msbb缺失菌株ys1646和ys1646δasd在1828和1585处有主要峰，对应于六酰化和五酰化lps的混合物。msbb和pagp缺失菌株ys1646δasd/δpagp只有一个质量为1585的单峰，对应于五酰化lps。这些数据表明pagp的缺失阻止lps的棕榈酰化，从而将其限制为单一的五酰化物质。
[0998]
为了表明来自δpagp突变株的五酰化lps降低tlr4信号传导，将4μg来自野生型菌株、ys1646菌株或ys1646δasd/δpagp菌株的纯化lps加入thp
‑
1人单核细胞中，在24小时后使用cytometric bead array(cba)试剂盒(bd biosciences)评估上清液中炎症细胞因子的存在。结果显示，与野生型lps相比，来自ys1646δasd/δpagp菌株的lps诱导的tnfα量是野生型lps的25％，诱导的il
‑
6比野生型lps少7倍。来自ys1646δasd/δpagp菌株的lps诱导的il
‑
6比菌株ys1646少22倍，表明来自δpagp突变体的五酰化lps物质在人细胞中的炎症显著降低，并表明δpagp突变体在人体中的耐受性更好。
[0999]
在原代人m2巨噬细胞中pagp缺失诱导显著减少的il
‑6[1000]
为了证实ys1646δasd/δflg/δpagp菌株在原代人m2巨噬细胞中也引起较少的炎症和剂量限制性il
‑
6，对这个菌株进行了评估，并与ys1646δasd/δflg和亲本ys1646菌株进行了比较。来自人供体的m2巨噬细胞代表了在排除t细胞的实体瘤中高度富集的免疫抑制表型。将从健康人供体中分离的冷冻人pbmc在完全培养基(rpmi
‑
1640 1
×
非必需氨基酸 5％人ab血清)中解冻，并在室温下以800rpm离心10分钟进行洗涤。将pbmc重悬于pbs 2％fbs中，使用cd16耗竭试剂盒(stemcell technologies)负分离单核细胞。然后通过在pbs 2％fbs中离心洗涤分离的未接触的单核细胞，并重新悬浮在含有100ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf)和10ng/ml人il
‑
4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(每孔3e5)接种到24孔板中，终体积为750μl。接种两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/ml人m
‑
csf和10ng/ml人il
‑
4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入500μl含有细胞因子的完全培养基，持续48小时。在第6天，将细胞培养基完全吸出并替换为仅不含
biosciences,inc.)获取数据，并使用mfi f1owjo
tm
软件(tree star,inc.)进行分析。
[1007]
为评价流式细胞术的结果，选择所有组中具有信号的最高稀释度(1250
×
血清稀释度)，并绘制相应的平均荧光强度(mfi)值。在mfi为1000选择检测限度(lod)，因为这是在没有染色以及仅使用山羊抗小鼠fc af488 ab背景染色的情况下获得的mfi。因此，mfi大于1000被认为是阳性信号，尽管具有mfi值，但所有等于或低于这个值均被认为是阴性结果。
[1008]
这个测定的结果揭示了来自用3
×
106cfu的ys1646菌株的处理的小鼠的抗鼠伤寒沙门氏菌血清抗体的高mfi滴度(29196.3
±
20730)，与先前公布的ys1646能产生血清抗体(非中和)的数据一致。用ys1646δasd/δflg菌株处理的小鼠中检测到的抗体较少(11257
±
9290)，这可能是由于缺乏鞭毛佐剂活性所致。在用ys1646δasd/δpagp菌株处理的小鼠中，与菌株ys1646(p＝0.033)相比，产生的抗体显著减少(4494
±
3861)，这可能是由于lps表面包被改变所致。表明ys1646δasd/δflg/δpagp治疗组中血清抗体降低最显著(1930
±
2445)，其中一些小鼠的mfi滴度低于1000，因此被认为血清抗体阴性(p＝0.021，相对于菌株ys1646)。因此，鞭毛和pagp基因的组合缺失既能提高安全性，又能显著降低免疫原性，这将可以在人体中重复给予高cfu剂量。
[1009]
与ys1646相比，pagp和鞭毛缺失的菌株及其组合在人血清中表现出显著更高的存活力
[1010]
菌株ys1646(vnp20009)在全身性施用中在人中呈现出受限的肿瘤定植。本文示出菌株ys1646被人血液中的补体因子灭活。为了证实这一点，将菌株ys1646和大肠杆菌d10b与本文提供的包含改变细菌表面的额外的突变的示例免疫刺激性细菌进行比较。这些示例的修饰的菌株是ys1646δasd/δpagp、ys1646δasd/δflg和ys1646δasd/δflg/δpagp。除了ys1646和大肠杆菌d10b培养物外，将这三个菌株与来自集合的小鼠血液或集合的健康人供体(n＝3)的血清或热灭活(hi)血清在37℃孵育3小时。与血清孵育后，将细菌连续稀释，铺板于lb琼脂平板上，测定集落形成单位(cfu)。
[1011]
在小鼠血清中，所有菌株都保持100％的存活率，并且对补体失活完全抗性。在人血清中，所有菌株在热灭活血清中均100％存活。3小时后，在全人血清中完全消除了大肠杆菌d10b菌株。在全人血清中，ys1646菌株仅显示6.37％的活集落，表明ys1646临床菌株的肿瘤定植由于人血中的补体失活而受到限制。对于ys1646δasd/δflg菌株，在与人血清孵育3小时后，31.47％的活集落保留，而对于ys1646δasd/δpagp菌株，72.9％的活集落保留。组合的ys1646δasd/δflg/δpagp菌株对人血清中的补体完全抗性。
[1012]
这些数据解释了菌株ys1646(vnp20009)在全身施用时为什么具有非常低的肿瘤定植。本文示出菌株ys1646对人血清中的补体失活高度敏感，但对小鼠血清中的补体失活不敏感。这些数据解释了为什么在人体中观察到的肿瘤定植有限，而小鼠肿瘤定植水平很高。fljb/flic或pagp缺失或这些突变的组合，部分或完全挽救了这个表型。因此，在用ys1646δasd/δpagp、ys1646δasd/δflg和ys1646δasd/δflg/δpagp菌株在人血清中观察到的增强的稳定性提供了增加的人肿瘤定植。
[1013]
这些数据以及本文提供的其它数据表明，鞭毛和/或pagp的缺失增加了肿瘤定植，改善了耐受性，并增加了免疫刺激性细菌的抗肿瘤活性。例如，本文显示来自pagp
‑
免疫刺激性细菌的lps比来自ys1646的lps诱导的il
‑
6少22倍，因此在人细胞中的炎症较少。此外，flg、hila和pagp中每个及所有缺失的突变体均比ys1646更多减毒(参见下面的实施例12)。
免疫刺激性细菌，例如沙门氏菌菌株，包括野生型菌株，其是鞭毛蛋白
‑
和pagp
‑
中的一种或两种，表现出增加的肿瘤/肿瘤微环境定植和增加抗肿瘤活性的性质。这种菌株可用于递送治疗性有效载荷，例如免疫治疗性产物和/或其它抗肿瘤产物，还可以包括改善治疗性质的修饰，例如hila和/或msbb的缺失、腺苷营养缺陷以及如本文别处所述的其它性质。通过在肿瘤环境中提供的改变感染性、对某些细胞的毒性和营养需求例如嘌呤营养缺陷型的修饰，由此产生的菌株更有效地靶向肿瘤/肿瘤微环境。
[1014]
实施例12
[1015]
小鼠中flg和pagp缺失突变体比菌株ys1646更多减毒
[1016]
为了确定上述修饰的菌株是否比菌株ys1646更多减毒，进行了半数致死量(ld
50
)研究。向c57bl/6小鼠静脉内注射浓度递增的菌株ys1646、flg/asd(pati
‑
trex1)、hila/asd(pati
‑
trex1)或pagp/asd(pati
‑
trex1)。发现ys1646的ld
50
为1.6
×
106cfu，与这个菌株的公开报道一致。确定hila/asd(pati
‑
trex1)菌株的ld
50
为5.3
×
106cfu，表明毒力降低了3倍。确定pagp/asd(pati
‑
trex1)菌株的ld
50
为6.9
×
106cfu，表明毒力降低了4倍。确定flg/asd(pati
‑
trex1)菌株的ld
50
为>7
×
106cfu，表明与菌株ys1646相比毒力降低了>4.4倍。这些数据表明，上述基因修饰降低了鼠伤寒沙门菌疗法的毒力，并将导致在人中的耐受性增加。在vnp20009的i期临床试验中(toso et al.(2002)j clin.oncol.20(1):142
‑
152)，仅在以下两个测试的最高剂量部分观察到了患者肿瘤中细菌的存在：3e8 cfu/m2(33％存在)和1e9 cfu/m2(50％存在)，表明vnp20009的耐受剂量太低，无法实现定植。通过上述修饰改进了菌株的耐受性，可以施用比vnp20009更高的剂量。这改善其肿瘤被定植的患者比例和每个肿瘤的治疗性定植水平。
[1017]
实施例13
[1018]
鼠伤寒沙门菌免疫调节菌株证实在人单核细胞中表达异源蛋白
[1019]
如上所述，从具有asd基因缺失的鼠伤寒沙门菌的ys1646菌株中缺失hila基因和鞭毛蛋白基因fljb和flic，从而分别产生菌株hila/asd和flg/asd。此外，进一步修饰flg/asd菌株，以表达缺乏信号序列的listeriolysin o(llo)蛋白，其在沙门菌属菌株的细胞质中积累(flg/asd/cllo)。用含有ef1α启动子和鼠细胞因子il
‑
2的表达盒的质粒对这些菌株进行电穿孔。另外，用il
‑
15δ的表达质粒作为非同源细胞因子的对照对flg/asd菌株进行电穿孔。使用cmv启动子产生额外的构建体。
[1020]
为了确定这些含有表达质粒的菌株是否可以感染人单核细胞并诱导其产生鼠il
‑
2，在感染前一天将thp
‑
1人单核细胞以50,000个细胞/孔铺板在rpmi(coming) 10％nu serum(gibco)中。在rpmi中以50的moi将细胞感染1小时，然后用pbs洗涤3次，并重悬于rpmi 100μg/ml庆大霉素(sigma)中。48小时后，从96孔板收集上清液，并通过elisa(r&d systems)评估鼠il
‑
2的浓度。发现在flg/asd
‑
il15δ对照孔中检测到的il
‑
2浓度正如预期那样非常低，可能反映了与内源性人il
‑
2的一些交叉反应性(6.52pg/ml)。相反，flg/asd
‑
il
‑
2菌株诱导的平均值为35.1pg/ml，而flg/asd/cllo菌株甚至更高为59.8pg/ml。在hila/asd
‑
il
‑
2菌株中检测到最高水平，为103.4pg/ml。这些数据证实从鼠伤寒沙门菌免疫调节因子平台菌株表达和分泌功能性异源蛋白质如il
‑
2的可行性。
[1021]
实施例14
[1022]
用δhila突变体的细胞感染导致更少的人上皮细胞感染
[1023]
为了证实hila缺失的鼠伤寒沙门菌菌株感染上皮细胞的能力降低，将hela宫颈癌细胞用以下鼠伤寒沙门菌菌株进行感染：ys1646、ys1646δasd和ys1646δasd/δhila，其包含编码用于质粒维持的功能性asd基因的质粒。将1
×
106hela细胞置于带有dmem和10％fbs的24孔培养皿中。用鼠伤寒沙门菌的对数期培养物感染细胞1小时，然后用pbs洗涤细胞，并将培养基用含有50μg/ml庆大霉素的培养基进行替换以杀死细胞外细菌。4小时后，将hela细胞单层用pbs洗涤并用1％triton
×
100裂解缓冲剂裂解以释放细胞内细菌。将裂解物连续稀释并铺板在lb琼脂平板上以定量细胞内细菌的数量。与具有功能性hila基因的菌株相比，具有hila缺失的菌株具有降低90％的回收cfu，这表明hila的缺失显著降低了鼠伤寒沙门菌对上皮衍生的细胞的感染。
[1024]
实施例15
[1025]
用δhila或δfljb/flic突变体感染细胞导致人巨噬细胞中较少细胞焦亡
[1026]
为了证实δhila或δfljb/δflic鼠伤寒沙门菌菌株导致巨噬细胞中细胞死亡的能力降低，将thp
‑
l人巨噬细胞用以下鼠伤寒沙门菌菌株进行感染：ys1646、ys1646δasd、ys1646δasd/δfljb/δflic和ys1646δasd/δhila，其包含编码用以确保质粒维持的功能性asd基因的质粒。将5
×
104个细胞置于带有dmem和10％fbs的96孔培养皿中。以每细胞100cfu的moi用洗涤的鼠伤寒沙门菌的对数期培养物感染细胞1小时，然后用pbs洗涤细胞，并将培养基用含有50μg/ml的用以杀死细胞外细菌的庆大霉素和50ng/ml干扰素γ的培养基进行替换。24小时后，用试剂(promega)对thp
‑
l细胞染色，并使用发光细胞活力测定使用spectramax平板读器量化发光以确定存活细胞的百分比。感染了hila缺失菌株的细胞具有约72％存活细胞，而感染ys1646的细胞仅具有38％存活力，表明hila的缺失防止人巨噬细胞的细胞死亡。用含质粒的菌株ys1646δasd和ys1646δasd/δfljb/δflic感染的细胞分别具有40％和51％存活力，这表明鞭毛蛋白基因的缺失也防止人巨噬细胞的细胞死亡。
[1027]
实施例16
[1028]
用包含编码il
‑
2表达盒的质粒的免疫刺激性鼠伤寒沙门菌感染人巨噬细胞导致il
‑
2的分泌用以下鼠伤寒沙门菌菌株感染人thp
‑
l巨噬细胞：ys1646δasd/δfljb/δflic、ys1646δasd
‑
cytollo和ys1646δasd/δhila，其含有在真核启动子控制下编码鼠il
‑
2表达盒的质粒，和确保质粒维持的功能性asd基因。将5
×
104个细胞置于带有dmem和10％fbs的96孔培养皿中。以每细胞50cfu的moi用洗涤的鼠伤寒沙门菌的对数期培养物感染细胞1小时，然后用pbs洗涤细胞，并将培养基用含有50μg/ml庆大霉素的培养基进行替换以杀死细胞外细菌。48小时后，取出细胞上清液，并使用r&d systems
tm
mouse il
‑
2quantikine elisa试剂盒检测鼠il
‑
2。其余的细胞用试剂(promega)进行染色，并使用发光细胞活力测定使用spectramax平板读器量化发光以来确定存活细胞的百分比。ys1646δasd/δfljb/δflic、ys1646δasd
‑
cytollo和ys1646δasd/δhila菌株(含有编码鼠il
‑
2的表达盒的质粒)分别表达35pg/ml、60pg/ml和103pg/ml的il
‑
2。
[1029]
实施例17
[1030]
表达鼠il
‑
2的鼠伤寒沙门菌菌株在体内表现出强力的肿瘤生长抑制
[1031]
将在鼠伤寒沙门菌ys1646菌株中包含hila或鞭毛蛋白基因fljb和flic缺失的免疫刺激鼠伤寒沙门菌菌株与asd基因缺失相组合以分别形成菌株ys1646δasd/δhila和
ys1646δasd/δfljb/δflic。用含有ef1α启动子和鼠细胞因子il
‑
2的表达盒的质粒对这些菌株进行电穿孔。
[1032]
为了显示含有il
‑
2表达质粒的鼠伤寒沙门菌菌株诱导抗肿瘤功效，将含有muil
‑
2质粒的δasd/δhila菌株或含有muil
‑
2质粒的δasd/δfljb/δflic菌株与载具对照进行比较。将6
‑
8周龄的雌性c57bl/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种mc38细胞(在100μl pbs中5
×
105个细胞)。将带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠在第8天用5
×
105cfu的δasd/δhila(pati
‑
muil
‑
2)、δasd/δfljb/δflic(pati
‑
muil
‑
2)或pbs载具对照进行静脉内注射。每周两次测量体重和肿瘤。使用电子卡尺(fowler，newton，ma)进行肿瘤测量。使用修改的椭圆体公式1/2(长
×
宽2)计算肿瘤体积。根据iacuc法规，当肿瘤尺寸达到>20％的体重或变得坏死时，将小鼠安乐死。
[1033]
实验证实，与pbs相比，δasd/δhila(pati
‑
muil
‑
2)菌株引发显著的肿瘤控制(p＝0.003，第21天)。这些数据与δasd/δfljb/δflic(pati
‑
muil
‑
2)菌株观察到的数据相当，该菌株与pbs相比也显示出显著的肿瘤生长抑制(p＝0.005，第21天)。因此，在结肠直肠癌模型中，这两种菌株均显示出表达的il
‑
2强力抑制肿瘤生长抑制的能力。
[1034]
实施例18
[1035]
沙门氏菌csgd基因敲除菌株工程化和鉴定
[1036]
δansb菌株构建
[1037]
使用前述实施例中描述的方法的修饰，从ys1646δasd/δflg/δpagp菌株中缺失编码l
‑
天冬酰胺酶ii的ansb基因。合成的ansb基因同源臂序列分别含有位于ansb基因的侧翼的左侧和右侧序列的236和251个碱基，将其合成并克隆到称为psl0230(seq id no:377)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxp位点的卡那霉素基因盒克隆到psl0230中，并用引物ansb
‑
1(seq id no:372)和ansb
‑
2(seq id no:373)对ansb基因敲除盒进行pcr扩增，进行凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ
‑
red重组质粒pkd46的菌株ys1646δasd中。然后如上所述通过cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，并且通过在非许可温度下生长来处理温度敏感质粒。ansb基因敲除序列使用引物ansb
‑
3(seq id no:374)和ansb
‑
4(seq id no:375)(见表1)通过pcr扩增，并通过dna测序验证。所得ys1646突变衍生物被命名为ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb。
[1038]
将菌株ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb进一步修饰以缺失csgd，csgd是控制鼠沙门氏菌curli纤毛形成、纤维素产生和c
‑
di
‑
gmp产生的主宰基因。csgd缺失消除了纤维素介导的生物被膜形成的可能性，减少了促炎信号传导，并增强了宿主吞噬细胞的吸收。细胞内定位的这种增加将因此增强质粒递送和免疫调节蛋白产生的有效性。
[1039]
δcsgd菌株构建
[1040]
使用前述实施例中描述的方法的修饰，从ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb菌株中缺失csgd基因。合成的csgd基因同源臂序列分别包含位于csgd基因的侧翼的左侧和右侧序列的207和209个碱基，将其合成并克隆到称为psl0196(seq id no:316)的质粒中。然后将侧翼为cre/loxp位点的卡那霉素基因盒克隆到psl0196中，用引物csgd
‑
1(seq id no:317)和csgd
‑
2(seq id no:318)对csgd基因敲除盒进行pcr扩增，凝胶纯化并通过电穿孔导入携带温度敏感λ
‑
red重组质粒pkd46的菌株ys1646δasd中。然后如上所述通过cre介导的重组处理卡那霉素抗性基因，通过在非许可温度下生长以处理温度敏感质粒。使用引物
csgd
‑
3(seq id no:319)和csgd
‑
4(seq id no:320)通过pcr扩增csgd基因敲除序列，并通过dna测序验证。亲本菌株ys1646的所得突变衍生物被命名为ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd。
[1041]
引物序列信息
[1042]
引物引物序列seq.id no.csgd
‑
1cacttgctttaagatttgtaatggctag317csgd
‑
2ggtgtattcgctttcccatttgtc318csgd
‑
3tgtgctgtccaggttaatgcc319csgd
‑
4gacgacggttttctcgaagtctc320
[1043]
csgd缺失菌株在刚果红(congo red)平板上不能形成rdar集落
[1044]
在刚果红平板上生长后形成粗糙干燥和红色(rdar)集落的能力是一种经过充分验证的细菌生物被膜形成试验。粗糙和干燥的质地是通过产生纤维素而发生的，红色是由于curli纤毛表面结构积累的色素所致。对于这个试验，将ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb菌株与ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd菌株比较在刚果红琼脂平板上孵育后形成rdar表型的能力。刚果红琼脂平板用大豆蛋白(10g/l)和酵母提取物(5g/l)(改良的lb，不含nacl)制备，并补充刚果红(40mg/l)和考马斯亮蓝g
‑
250(20mg/l)。将5微升固定相细菌培养物点印在刚果红平板上并在37℃孵育16小时，然后转移至30℃再孵育120小时。进行集落形态和颜色的目测分析，每天记录以确认rdar集落形态型的存在或不存在。
[1045]
比较这两种菌株的集落形态，ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd菌株表型平滑，集落缺少色素。相比之下，ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb菌株仍然含有csgd基因，表现出经典的粗糙和干燥外观，以及色素吸收的明显证据。因此，功能性测定证实δcsgd菌株无法形成生物被膜，因为其缺乏curli纤毛和纤维素产生。
[1046]
csgd缺失的菌株在三阴性乳腺癌的高度难治性小鼠模型中显示出卓越的抗肿瘤功效
[1047]
评估了csgd缺失在免疫刺激性细菌疗法定植肿瘤但显示功效有限的模型中的影响。这可以表明细菌产生的纤维素的存在可以限制肿瘤驻留骨髓细胞的摄取，从而限制治疗效果(crull et al.(2011)cellular microbiology 13(8):1223
‑
1233)。采用难治性emt6模型，这是人三阴性乳腺癌的代表性模型(yu et al.(2018)plos one 13(11):e0206223)。当emt6肿瘤细胞原位施用于乳腺脂肪垫时，与在侧腹部皮下注射相反，所述模型是t细胞排除的、高度转移及对免疫疗法包括对所有批准的检查点抗体而言是高度难治的模型(mariathasan et al.(2018)nature 554:544
‑
548)。
[1048]
对于这个实验，将6
‑
8周龄雌性balb/c小鼠(每组5只)在左侧乳腺脂肪垫中接种emt6肿瘤细胞(100μl pbs中2
×
105个细胞)。为携带13天龄已建立的乳腺肿瘤(～55mm3)的小鼠静脉注射单剂量1
×
107cfu的csgd缺失菌株ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd或亲本ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb菌株，并与pbs对照组比较。所述细菌菌株含有表达组成型活性鼠sting(ef1a musting r283g，详见下文实施例)的质粒。
[1049]
在pbs处理的小鼠中的肿瘤生长均匀，在第35天达到最大肿瘤体积(1199.0
±
298.1mm3)。用csgd完整菌株ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb处理的小鼠在这个模型中没有表现出抗肿瘤功效的迹象，在第35天也达到最大肿瘤体积(1689.1
±
537.0)。这些肿瘤
的离体lb铺板显示所有肿瘤都被定植。然而，csgd缺失的菌株ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd导致5只小鼠中有3只完全治愈了其原发性和任何转移性疾病(第60 天)。总体tgi为45.7％，另外两个肿瘤之一在最终生长出之前部分应答。这两种细菌菌株含有相同的质粒有效载荷，但只有一种表现出显著功效。因此，在最难治疗和高度转移的同基因肿瘤模型之一中，原位具有csgd缺失的菌株emt6能诱导全身抗肿瘤功效并导致60％的完全应答。
[1050]
csgd缺失的菌株证实体内细胞内摄取增强
[1051]
为了确定csgd缺失菌株是否因肿瘤驻留骨髓细胞更多的细菌摄取而表现出改善的功效，进行了离体庆大霉素保护试验(见crull et al.(2011)cellular microbiology 13(8):1223
‑
1233)。对于这个试验，为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组4只小鼠)皮下接种mc38细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第17天，为带有较大侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射1
×
107cfu的csgd缺失的ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd菌株(n＝12)或亲本ys1646菌株(n＝4)。在静脉内给药后7天切除肿瘤，称重并在补充有1mg/ml胶原酶iv和20mg/ml dnase i的rpmi中切碎，在37℃振荡孵育30分钟以产生单细胞悬浮液。30分钟后，将所述悬浮液通过70mm过滤器，回收的体积被分成两个独立的相同样品。将200mg/ml的庆大霉素(thermo fisher scientific)加入每对样品之一中以杀死细胞外细菌，将样品在37℃振荡培养90分钟。然后将细胞悬浮液样品用0.05％triton x洗涤和裂解，并根据cfu铺板。
[1052]
结果表明，与未经庆大霉素处理的ys1646处理肿瘤的cfu(11925
±
19859cfu)相比，庆大霉素处理导致从肿瘤中检测到的cfu非常少(51
±
45cfu)。这表明细菌主要存在于这些肿瘤中的细胞外，因此对庆大霉素消除敏感。在csgd缺失的ys1646δasd/δflg/δpagp/δansb/δcsgd处理组中，非庆大霉素处理的肿瘤产生高cfu，正如对定植良好的肿瘤所预期的那样，庆大霉素处理产生更少cfu(1276
±
2410cfu)，远高于亲本ys1646菌株处理的肿瘤。这是由于更多csgd缺失的细菌驻留于细胞内，因此受到了庆大霉素的保护。这些数据表明csgd缺失改善了细菌的细胞内摄取，这可以增强体内免疫调节蛋白的质粒递送。
[1053]
实施例19
[1054]
质粒构建
[1055]
设计并合成了称作pati
‑
1.75的质粒；其包含以下特征：pbr322复制起点、asd基因、侧翼是hindiii位点用以处理的卡那霉素抗性基因，以及用于插入表达盒的多克隆位点。所述载体被命名为pati
‑
1.75。表达盒包含多个元件，包括真核启动子、开放读框、转录后调节元件和聚腺苷酸化信号，将其以各种构型装配。
[1056]
示例的启动子包括直接在cmv立即早期增强子序列下游编码的人巨细胞病毒(cmv)立即早期核心启动子和人延伸因子
‑
1α(ef
‑
1α)的核心启动子。开放读框(orf)可以包含一个或多个序列，每个序列都被翻译成蛋白质，并且可以通过插入2a序列将其分离成不同的多肽，从而真核核糖体无法在2a序列内的gly和pro残基之间插入肽键。2a序列的示例是来自thosea asigna病毒(tav)衣壳蛋白的t2a肽和来自猪teschovirus(ptv)的p2a肽。上游弗林蛋白酶(furin)裂解位点(rrkr)和其它增强子元件被置于上游以促进表达蛋白的裂解。
[1057]
转录后调节元件(pre)的示例包括土拨鼠肝炎病毒pre(wpre)和乙型肝炎病毒pre
(hpre)，其通过促进mrna向细胞质的核输出，增强3'末端加工和稳定性。聚腺苷酸化信号序列的示例包括sv40聚腺苷酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化信号，二者均是3'调节元件，用于促进转录终止并包含由rna裂解复合物识别的序列基序。
[1058]
实施例20
[1059]
鉴别促进干扰素疾病的基因中的功能获得性突变
[1060]
出现具有严重自身炎症性病况和病因不明的血管病变的对象病例，并且通常源自突变。可以确定这些病症的原因。确定这种病理的突变基础的步骤如下。第一步，从出现症状的患者和健康个体中获取完整的基因组dna。进行全外显子测序，然后分析内含子和外显子。对与i型干扰素(ifn)表达相关的途径中的产物进行基因分析和突变鉴定。下表(以及详细说明)列出了已知导致编码的蛋白质组成型功能激活以及随后i型ifn持续表达的基因中的突变。在鉴别突变后，将编码全长基因的cdna(带有或不带有已鉴别的突变)转染到报告细胞系中，以测量i型ifn的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达处于ifn
‑
β启动子的控制之下。组成型活性的功能获得性突变体将促进ifn
‑
β的表达，而未受刺激的野生型(wt)蛋白则否。在已知的sting savi(sting相关的婴儿期发病血管病变)突变体的情况下，ifn
‑
β的wt
‑
sting刺激需要增加cgamp的外源性水平以直接激活wt
‑
sting。组成型活性突变以cgamp非依赖性方式刺激ifn
‑
β的表达。每个sting、rig
‑
1、mda5、irf3和irf7的示例的功能获得性突变在下文中阐述。可以在对象中鉴别或通过体外突变和筛选产生的功能获得性突变的其它这种基因包括但不限于：sting，rig
‑
i，mda
‑
5，irf
‑
3，irf
‑
5，irf
‑
7，trim56，rip1，sec5，traf3，traf2，traf6，stat1，lgp2，ddx3，dhx9，ddx1，ddx9，ddx21，dhx15，dhx33，dhx36，ddx60和snrnp200。
[1061]
导致i型ifn持续表达的功能获得性突变
[1062][1063][1064]
通过参照如seq id no:305
‑
309所示人sting的序列，氨基酸残基r197、d205、r310、r293、t294、e296、s272、q273、e316、d231、8232、k236、5358、e360、s366和r238，分别对应于通过参照如seq id no:351所示鼠sting序列的氨基酸残基r196、d204、r309、r292、t293、e295、5271、q272、e315、d230、8231、k235、s357、e359、5365和r237。
[1065]
还包括每个取代的保守型取代(见定义章节部分中的表，列出了每个氨基酸的示例保守型突变，即ser取代ala，其中野生型不是ser)。
[1066]
在鉴别突变后，将编码全长基因的cdna(带有或不带有已鉴别的突变)转染到报告细胞系中，以测量i型ifn的表达。例如，可以产生报告细胞系，其中荧光素酶的表达置于ifn
‑
β启动子的控制之下。具有组成型活性的功能获得性(gof)突变体促进ifn
‑
β的表达，而未受刺激的野生型(wt)蛋白质则否。在已知sting savi(sting相关的婴儿期发病血管病变)突变体的情况下，ifn
‑
β的wt
‑
sting刺激需要增加外源性水平的cgamp以直接激活wt
‑
sting。组成型活性突变以cgamp非依赖性方式刺激ifn
‑
β的表达。sting、rig
‑
1、mda5、irf3和irf7中的每一个中的示例性功能获得性突变在上文中阐述并在本文别处讨论。可以在对象中鉴定或通过体外突变和筛选产生的功能获得性突变的其它这种基因包括但不限于sting、rig
‑
i、mda
‑
5、irf
‑
3、irf
‑
5、irf
‑
7、trim56、rip1、sec5、traf3、traf2、traf6、stat1、lgp2、ddx3、dhx9、ddx1、ddx9、ddx2l、dhx15、dhx33、dhx36、ddx60和snrnp200。功能获得性突变增加i型inf表达或使得组成型表达。
[1067]
功能组成型i型ifn突变体在人细胞中的表达
[1068]
将特异性人sting(等位基因r232)和irf3功能获得性(gof)突变体克隆到pati
‑
1.75载体中，通过pcr确认序列。为了确定sting和irf3 gof表达质粒是否能在人细胞中诱导功能性i型干扰素，使用不含内源性sting的hek293t sting null reporter细胞(invivogen)对质粒进行评估。这些细胞表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)，置于内源性干扰素刺激的应答元件(isre)启动子的控制下，其中isre的编码序列已经使用敲入技术由seap orf取代。可以通过监测细胞上清液中i型干扰素刺激的seap产生来评估i型干扰素活性。
[1069]
为了检测gof突变体产生的i型ifn的相对产量，前一天将1
×
10
5 293t
‑
dual
tm null细胞铺板在涂有聚l
‑
赖氨酸的平板上，以在24孔板中达到80％的汇合度。在转染当天，将编码一组sting和irf3 gof突变体，包括sting野生型(wt)和irf3 wt对照以及文献中报道的在人细胞中无功能的阴性对照(nc)突变(v155r，在sting中)的200ng质粒在无血清培养基中稀释，并以适当的试剂:dna比率加入转染试剂(promega)。过夜孵育后收集每个样品的细胞培养上清液，将10μl细胞培养上清液加入50μl quanti
‑
blue
tm
试剂(invivogen)(用于测量seap)。i型干扰素激活通过在m3分光光度计(molecular devices)上在650nm吸光度下测量isre诱导的seap活性来确定。
[1070]
如下表所示，与不诱导i型ifn活性的野生型和阴性对照相比，所有gof突变体均能在人细胞中以sting配体非依赖性方式诱导i型ifn活性。在人sting r284g和irf3 s396d拟磷变体中观察到最高水平的i型ifn诱导。这些数据支持编码gof突变体的质粒产生功能性的、组成型的sting和组成型的拟磷酸irf3的能力，其以cgamp非依赖性方式诱导i型干扰素。
[1071]
gof突变体平均吸光度(650nm)标准误差质粒对照0.0490.002husting wt0.1440.004husting v147l1.3990.015husting n154s1.3820.008husting v155m1.3600.048husting c206y1.5660.121
husting r281q1.5460.132husting r284g1.8310.039husting v155r(nc)0.1810.014huirf3 wt0.7810.073huirf3 s396d1.9220.131
[1072]
感染含有编码组成型i型ifn突变体的质粒的鞭毛缺失菌株将人m2巨噬细胞转化为产生i型ifn的m1巨噬细胞
[1073]
确定了用包含编码组成型i型ifn gof变体的质粒的鞭毛缺失的菌株感染的原代人m2巨噬细胞，是否可以转化为i型ifn和下游趋化因子如cxcl10(也称为ip
‑
10)的生产物。
[1074]
将从健康人供体中分离的冷冻人pbmc在完全培养基(rpmi
‑
1640 1
×
非必需氨基酸 5％人ab血清)中解冻，在室温以800rpm离心10分钟进行洗涤。将pbmc重悬于pbs 2％fbs中，使用cd16耗竭试剂盒(stemcell technologies)负分离单核细胞。然后通过在pbs 2％fbs中离心洗涤分离的未接触的单核细胞，并重新悬浮在含有100ng/ml人m
‑
csf和10ng/ml人il
‑
4的完全培养基中。然后将分离的单核细胞(每孔3e5)接种于终体积为750μl的24孔板中。接种两天后，将细胞培养基完全吸出并更换为含有100ng/ml人m
‑
csf和10ng/ml人il
‑
4的新鲜完全培养基。两天后(第4天)，每孔加入500μl的含有细胞因子的完全培养基，孵育48小时。在第6天，将细胞培养基完全吸出并替换为不含细胞因子的新鲜完全培养基。重复孔以450的moi在rpmi中用以下菌株感染1小时：含有编码野生型(wt)人(hu)sting的质粒的ys1646δasd/δflg；含有编码husting r284g变体的质粒的ys1646δasd/δflg；含有编码wt huirf3的质粒的ys1646δasd/δflg；含有编码huirf3 s396d变体的质粒的ys1646δasd/δflg；或含有对照质粒的菌株。然后用pbs洗涤细胞3次，并重悬于rpmi 100μg/ml庆大霉素(sigma)中。作为对照，将临床化合物adu
‑
s100的类似物sting激动剂3'5'rprp c
‑
di
‑
amp(invivogen)以10μg/ml加入细胞中。
[1075]
24小时后，用具有β
‑
me(qiagen)的350μl缓冲液rlt裂解细胞，使用qiagen rneasy mini kit做以下修改进行rna提取。基因组dna去除步骤，包括使用rnase
‑
free dnase试剂盒(qiagen)从总rna中去除基因组dna。使用nanodrop
tm one
c
紫外
‑
可见分光光度计(thermo scientific)测量总rna浓度。每个样品的纯度也根据a
260
/a
230
吸收比进行评估。将rna储存在
‑
80℃，无需冻融直到进行逆转录。使用c1000 touch thermal cycler(bio
‑
rad)和superscript
tm vilo
tm master mix(invitrogen)在30μl反应中根据制造商的说明从0.4
‑
1μg模板rna合成cdna。
[1076]
使用cfx96实时系统(bio
‑
rad)进行qpcr。hucxcl10(qhsaced0046619)、huirf3(qhsacid0013122)、husting(qhsacid0010565)和huifnb1(qhsaced0046851)的引物购自bio
‑
rad。按照方案进行qpcr反应(20μl)，使用itaq universalgreen supermix(bio
‑
rad)。biorad cfx96实时系统上的标准热循环程序包括在95℃变性30秒，然后进行在95℃5秒和在60℃30秒的40个循环。每个平板上的每组引物均包括与无模板对照反应。所有样品均一式两份操作，计算平均c
q
值。使用gapdh参考mrna(bio
‑
rad，qmmuced0027497)对靶mrna定量进行标准化。以靶基因和参考基因之间的差异计算δc
q
。δδc
q
是通过将处理的δc
q
值根据非处理对照的δc
q
值标准化而获得的。倍数增加以2^
‑
δδc
q
计算。这些值在下表中示出，作为重复孔的平均值。
[1077]
如下表所示，与对照质粒的感染相比，含有编码husting wt和husting r284g的质粒的ys1646δasd/δflg菌株诱导高水平的sting表达，与小分子sting激动剂相比显著更高。同样，含有编码huirf3 wt和huirf3
‑
s396d质粒的菌株诱导高水平的irf3表达，显著高于对照质粒或小分子sting激动剂。与包含编码husting wt的质粒的菌株相比，包含编码husting r284g变体的质粒的细菌菌株诱导更高的ifnβ和cxcl10表达。这证实含有编码组成型sting gof变体的质粒的菌株将人原代免疫抑制性m2巨噬细胞转化为m1 i型ifn产生细胞的能力。虽然含有编码huirf3 wt和huirf3
‑
5396d的质粒的菌株均诱导了更多的ifnβ，但与husting
‑
r284g变体相比，其诱导的cxcl10更少。
[1078][1079]
nd＝无数据
[1080]
这些数据证实组成型gof i型ifn变体在人原代m2巨噬细胞中表达，并将这些细胞转化为m1样i型ifn产生细胞。
[1081]
实施例21
[1082]
蛋白质工程筛选以鉴别sting、rig
‑
i、mda5、irf3、irf7及其它干扰素途径基因中改进的功能获得性突变
[1083]
如实施例20所述，从人体中鉴别组成型活性并促进干扰素疾病的功能获得性(gof)氨基酸突变体。许多gof突变是由于单个碱基对核苷酸的变化而发生的，这些变化改变了基因中特定位置的氨基酸密码子。例如，在sting中，v147l突变是由于c.439g
→
c的突变而发生的；n154s是由于c.461a
→
g的突变而发生的；v155m是由于c.463g
→
a的突变而发生的。筛选的目的是鉴别导致高水平i型干扰素表达的组成型活性突变体。在已知当突变时促进干扰素疾病的位点上设计的突变使得可以检测更多数量的氨基酸取代。在这个实施例中，在已知突变的位置(如上表(实施例20)所示)进行具有设计的氨基酸的定点诱变，以鉴别具有增强活性的突变，其导致高水平i型干扰素表达。
[1084]
pcr引物是用在来自所述基因的同源cdna序列5'和3'末端侧翼设计的取代产生的。定点诱变试剂盒(agilent)或其它类似的可商购试剂盒用于产生掺入设计的突变的pcr产物。将pcr扩增的质粒用dpni处理，然后在感受态大肠杆菌细胞中进行电穿孔。分离单个克隆，进行质粒小量制备(mini
‑
preps)，并确认所需突变的序列相同性。然后进行更大规模的质粒制备(使用qiagen试剂盒)并将dna转染到不含内源性sting的hek293t sting报道细胞(invivogen)中。这些细胞表达lucia
tm
荧光素酶，这是一种分泌的荧光素酶，置于内源性ifn
‑
β启动子的控制之下；ifn
‑
β的编码序列已使用敲入技术由lucia
tm
荧光素酶orf取代。然后通过测量ifn
‑
β启动子诱导的荧光素酶活性表达来鉴别和分级组成型激活的突变体。
[1085]
实施例22
[1086]
编码组成型活性免疫刺激性蛋白的质粒转化进免疫刺激性细菌菌株
[1087]
将含有编码免疫刺激性蛋白和功能性asd基因的表达盒的选择的质粒通过btx600电穿孔仪使用0.2cm间隙比色皿(btx,san diego,ca)在以下设置下电穿孔进入缺乏asd基因的鼠伤寒沙门氏菌菌株：2.5kv，186ohms，50μf。将电穿孔的细胞加入补充50μm二氨基庚二酸(dap)的1ml soc中，在37℃孵育1小时，然后铺板在不含dap的琼脂平板上，选择接受具有功能性asd基因的质粒的菌株。分离单菌落后，将单个充分分离的鼠伤寒沙门氏菌菌落接种于具有无菌溶原性肉汤(lb)的培养瓶中，在37℃以250rpm搅拌孵育，从而产生细胞库。培养物生长到稳定期后，将细菌在含有10％甘油的pbs中洗涤，以低于
‑
60℃的冷冻等分试样储存。
[1088]
实施例23
[1089]
质粒证实功能性sting功能获得性突变体在人细胞中的表达
[1090]
将所述免疫刺激性细菌菌株用含有互补asd基因和带有控制sting功能获得性(gof)突变体表达的真核启动子的表达盒的质粒进行电穿孔。
[1091]
为了确定sting gof表达质粒是否能转染进人细胞并表达功能性sting蛋白，使用不含内源性sting的hek293t sting报道细胞(invivogen)。这些细胞表达lucia
tm
荧光素酶，这是一种分泌的荧光素酶，置于内源性ifn
‑
β启动子的控制之下；ifn
‑
β的编码序列已使用敲入技术由lucia
tm
荧光素酶orf取代。环状二核苷酸(cdn)刺激可以在293t
‑
dual
tm sting(isg/ki
‑
ifnb)细胞(invivogen)中评估，通过监测ifn刺激的应答元件(isre)诱导的分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)的产生和/或lucia
tm
荧光素酶的ifn
‑
β依赖性表达进行评估。分别使用quanti
‑
blue
tm
和quanti
‑
luc
tm
测量细胞培养上清液中的两种报告蛋白seap和lucia
tm
荧光素酶。
[1092]
为此，将含有husting(人wt sting)、husting
‑
null(人null sting)或wt msting(小鼠sting)的5
×
105hek293t
‑
dual细胞在前一天接种于聚l
‑
赖氨酸包被的平板上，以达到80％汇合。在转染当天，将编码一组sting变体的质粒(在实施例20或书面说明中概述，或如实施例21设计)在无血清培养基中稀释，并在适当的试剂:dna比率下加入转染试剂(promega)，将细胞在存在或不存在cgamp的情况下孵育，以直接激活sting信号传导。孵育过夜后收集每个样品的细胞培养上清液，将10μl细胞培养上清液加入50μl quanti
‑
luc
tm
试剂(invivogen)中。i型干扰素激活通过在m3分光光度计(molecular devices)上测量分泌的荧光素酶水平来确定。这些数据支持转染的质粒产生功能性、组成性sting的能力，所述功能性、组成性sting可以以cgamp非依赖性的方式诱导i型干扰素。
[1093]
实施例24
[1094]
msting功能获得性(gof)编码菌株证实在小鼠中显著的抗肿瘤活性
[1095]
msting gof菌株编码胞质dna/rna传感器的组成型突变体，其导致组成型i型ifn表达，所述msting gof菌株增强了含有质粒的靶菌株在体内的抗肿瘤功效。为了证实这一点，针对鼠结肠癌模型中的抗肿瘤功效，将包含实施例23中检测的msting gof突变体的表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌菌株与鼠伤寒沙门氏菌质粒载体对照菌株和载具对照进行比较。为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组9只小鼠)在右侧腹部皮下接种mc38细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第8天，为带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5
×
105cfu的用msting gof编码变体转化的鼠伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌质粒对照或pbs载具对照。每周测量两次体重和肿瘤。使用电子卡尺(fowler,newton,ma)进行肿瘤测量。使用修改的椭球公式
1/2(长
×
宽2)计算肿瘤体积。根据iacuc规定，当肿瘤大小达到体重的20％以上或坏死时，对小鼠实施安乐死。
[1096]
实验表明，编码msting功能获得性产物的免疫刺激性细菌如沙门氏菌例如如鼠伤寒沙门氏菌与不表达msting功能获得的对照组及与pbs相比，可诱导强力的肿瘤控制作用。
[1097]
实施例25
[1098]
全身施用的编码组成型活性sting变体的细菌在体内抑制mc38结肠肿瘤的生长
[1099]
为了证实含有编码组成型活性sting的表达质粒的免疫刺激性细菌菌株诱导抗肿瘤功效，将菌株ys1646
‑
δasd/δflg(鞭毛蛋白基因fljb和flic均敲除)用质粒电穿孔，所述质粒包含在人延伸因子
‑
1α(ef
‑
1α)启动子后的具有等位基因r232和gof突变v155m的人sting(sting r232
‑
v155m)的表达盒，并与单独的ys1646和pbs载具对照进行比较。使用dna合成技术产生编码sting r232
‑
v155m的基因。为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种mc38细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第8天为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠(n＝5)静脉注射如下：(1)pbs；(2)5
×
105cfu的ys1646；和(3)5
×
105cfu的的ys1646
‑
δasd/δflg sting r232
‑
v155m。使用卡尺进行肿瘤测量，并使用修改的椭球公式1/2(长
×
宽2)计算肿瘤体积。
[1100]
结果如下表所示，显示与pbs相比(p<0.05)，ys1646
‑
δasd/δflg人sting r232
‑
v155m菌株引起显著的肿瘤控制作用(60％tgi)，并具有20％的即时完全应答。因此，递送组成型活性sting变体的免疫刺激性细菌菌株可以有效地抑制肿瘤生长抑制作用，并在结直肠癌模型中显示出20％的治愈率。
[1101][1102]
n.s.＝不显著
[1103]
实施例26
[1104]
编码组成型活性sting变体的免疫刺激性细菌刺激从干扰素调节因子(irf)启动子的增强的表达
[1105]
干扰素调节因子(irf)如irf
‑
3和irf
‑
7，是调节ifn转录的蛋白质。为了证实编码组成型活性sting的免疫刺激细菌对irf激活的影响，使用由raw 264.7鼠巨噬细胞产生的双重irf
‑
lucia和mip
‑2‑
seap(分泌的胚胎碱性磷酸酶)鼠报道细胞系(raw
‑
dual
tm
；invivogen)。这些巨噬细胞表达多种模式识别受体(prr)，包括toll样受体(tlr)、cgas和sting。报道细胞稳定表达编码seap(分泌的胚胎碱性磷酸酶)和lucia荧光素酶的两种报道基因。lucia荧光素酶报道基因在isg54(干扰素刺激的基因54)最小启动子和五个干扰素刺激的应答元件(isre)的控制下。当irf如irf
‑
3和irf
‑
7被激活时，其与isre结合以诱导i型ifn应答。因此，lucia荧光素酶的表达报道了irf的激活。
[1106]
将raw
‑
dual
tm
(irf
‑
lucia/ki
‑
[mip
‑
2]seap)报道细胞(invivogen，cat.code：rawd
‑
ismip)以每孔2
×
105个细胞接种于不含抗生素的培养基(含葡萄糖、l
‑
谷氨酰胺和10％fbs的dmem)中的96孔组织培养板中，并在37℃在5％co2中孵育过夜。将含有50μg/ml卡
那霉素的3ml改良的lb培养物(胰蛋白胨用大豆蛋白取代)用直接来自甘油原液的细菌菌株接种，并在37℃下振荡孵育过夜。将菌株ys1646
‑
δasd/δflg和ys1646
‑
δasd/δhila用在人延伸因子
‑
1α(ef
‑
1α)启动子之后的编码带有r232等位基因的人sting(husting)或带有gof突变v147l(husting v147l)或v155m(husting v155m)的sting变体的质粒转化。表达盒通过dna合成方法产生。
[1107]
第二天，通过od600nm分析过夜培养物，通过在真核细胞培养基(含葡萄糖、l
‑
谷氨酰胺和10％fbs及不含抗生素的dmem)中稀释，将培养体积调节为4
×
108cfu/ml浓度。细菌菌株感染以moi为200进行，通过在每孔中加入100μl稀释培养物并以1000rcf离心5分钟，然后在37℃孵育1小时。然后用100μl/孔无菌pbs将感染物洗涤两次，并加入含有50μg/ml庆大霉素的新鲜培养基，以杀死胞外细菌。环状二核苷酸2'3'
‑
c
‑
di
‑
am(ps)2(rp,rp)(invivogen,cat.code：tlrl
‑
nacda2r
‑
01，tlrl
‑
nacda2r)加入未感染的孔中作为干扰素调节因子(irf)诱导的阳性对照(cdn阳性对照)。通过加入10μl的100μg/ml原液，在每孔中加入1μg环状二核苷酸。感染在37℃持续48小时。未感染的报道细胞用作阴性对照，报道细胞用编码mu
‑
il
‑
2的菌株ys1646
‑
δasd/δflg感染。
[1108]
在感染后48小时分析irf途径诱导。每孔收集20μl上清液，并与50μl新鲜配制的quanti
‑
luc
tm
检测培养基(一种lucia荧光素酶检测试剂；invivogen，cat.code：rep
‑
qlc1、rep
‑
qlc2)在黑色平底透明瓶96孔平板中混合，并在m5微板读器(molecular devices)上检测到发光。结果如下表所示。未感染的细胞和用编码的mu
‑
il
‑
2的ys1646
‑
δasd/δflg(阴性对照)感染的细胞显示出最低的irf发光量。加入cdn的未感染细胞(cdn阳性对照)表现出最高的irf发光量。在ys1646
‑
δasd/δflg菌株中，与husting相比，带有v147l突变的husting的irf发光增加了258％，以及与husting相比，带有v155m突变的husting的irf发光增加了282％。在ys1646
‑
δasd/δhila菌株中，与husting相比，带有v147l突变的husting的irf发光增加了1086％，以及与husting相比，带有v155m突变的husting的irf发光增加了201％。因此，组成型活性的sting变体可以通过感染免疫刺激性细菌被递送到巨噬细胞，以激活下游irf途径信号传导。
[1109]
在感染后48小时的raw
‑
dual
tm
细胞irf发光
[1110][1111]
实施例27
[1112]
含有编码组成型i型ifn变体的免疫刺激性细菌证实在鼠结肠直肠癌模型中强力的抗肿瘤免疫性
[1113]
人gof sting突变体示出在小鼠模型中的抗肿瘤活性
[1114]
为了证实含有编码组成型活性sting变体的表达质粒的免疫刺激性细菌菌株诱导抗肿瘤功效，将菌株ys1646δasd/δflg(鞭毛蛋白基因fljb和flic均敲除)用在人延伸因
子
‑
1α(ef
‑
1α)启动子之后包含具有等位基因r232和gof突变v155m的人sting(husting v155m)的表达盒的质粒电穿孔，并与单独的菌株ys1646和pbs载具对照进行比较。编码husting v155m的基因使用dna合成方法产生并克隆到pati
‑
1.75载体中。为了评估组成型人sting变体是否能在小鼠中具有抗肿瘤活性，为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种mc38结直肠腺癌细胞(在100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第8天为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5
×
105cfu的ys1646δasd/δflg husting v155m菌株、ys1646菌株或pbs对照。
[1115]
结果表明，ys1646亲本菌株作为抗肿瘤疗法仅轻微有效，且不能治愈(35％tgi，p＝ns，第28天)，与先前公布的数据一致。然而，与pbs相比，含有编码组成型活性人sting的质粒的减毒程度更高的菌株ys1646δasd/δflg husting v155m引起了显著的肿瘤控制(60％tgi，p<0.05，第28天)，且治愈率为20％。因此，递送组成型活性sting变体的免疫刺激性细菌菌株有效抑制肿瘤生长抑制作用，并在结直肠腺癌模型中显示出疗效。
[1116]
鼠拟磷酸irf3示出体内疗效
[1117]
设计了拟磷酸人irf3变体的鼠版本，命名为muirf3
‑
5388d，并在鼠结肠直肠腺癌模型中进行评估。将菌株ys1646δasd/δflg用在人延伸因子
‑
1α(ef
‑
1α)启动子后的含有具有gof突变s388d的鼠irf3(muirf3
‑
s388d)的表达盒的质粒电穿孔，并与pbs载具对照进行比较。使用dna合成方法产生编码muirf3
‑
5388d的基因并克隆到pati
‑
1.75载体中。为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种mc38结直肠腺癌细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第10天对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5
×
105cfu的菌株ys1646δasd/δflg
‑
ef
‑
1α
‑
muirf3
‑
s388d，并与pbs载具对照进行比较。
[1118]
所述疗法的耐受性非常好，最初的体重减轻最低点仅为0.3％。与pbs相比，含有编码muirf3
‑
5388d gof突变体的质粒的细菌菌株具有高效和治愈性(81.8％tgi，60％治愈率，第42天)。这些数据证实以肿瘤特异性方式递送组成型i型ifn诱导变体的效力和安全性。
[1119]
鼠sting gof变体显示出强力和治愈性的抗肿瘤活性
[1120]
设计一组在人患者中发现的人sting变体的鼠直向同源物。这些直向同源物与人变体有一个密码子不同，并将其克隆到ef
‑
1α启动子控制下的pati
‑
1.75载体中，以产生以下一组突变体：musting n153s，v154m，r280q，v146l，r283g和c205y等。在鼠腺癌mc38模型中评估sting变体的抗肿瘤功效。在研究中，为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种mc38结直肠腺癌细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第10天，为带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5
×
105cfu的ys1646δasd/δflg菌株，所述菌株含有带有驱动mustingn153s、v154m、r280q、v146l或r283g表达的ef
‑
1α的质粒，或乱序的shrna对照质粒，并与pbs载具对照组相比。
[1121]
在这个实验中，ys1646δasd/δflg ef
‑
1α对照质粒(shscr)与pbs对照相比表现出抗肿瘤功效(73％tgi，第26天)，这比ys1646亲本菌株历史上显示的更有效。这可能是由于质粒上固有的免疫刺激元件例如cpg和rnai刺激元件所致。这种疗法是组中耐受性最差的，示出9.9％的体重减轻最低点，仅在研究最终时恢复。相反，组成型鼠sting突变体导致较低的体重减轻，这种减轻是暂时的并在几天内恢复。这些变体的相对抗肿瘤功效揭示了有趣的活性差异，其中只有两个变体n153s和r283g表现出疗效和超过质粒对照的增强的功
效。
[1122][1123]
在后续研究中，对鼠sting c205y变体与r283g和n153s变体一起进行检测，以比较其抗肿瘤功效。为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只)在右侧腹部皮下接种mc38结直肠腺癌细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)。在第9天，为携带已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉注射5
×
105cfu的ys1646δasd/δflg菌株，所述菌株含有具有驱动musting n153s、r283g或c205y表达的ef
‑
1α的质粒，并与pbs载具对照进行比较。与之前一样，sting变体的耐受性良好，并仅观察到体重减轻的短暂下降并迅速恢复。这可能是由于靶向疗法所致，因为在小分子sting激动剂中也观察到了这一点。两种组成型活性鼠sting变体n153s和r283g的功效与之前的研究几乎相同，但不明原因地体重减轻要少得多。c205y变体也非常有效，但不能治愈。
[1124][1125]
来自这些研究的sting治愈的小鼠在初始肿瘤植入后第40天用mc38结肠直肠腺癌细胞(100μl pbs中5
×
105个细胞)皮下在对侧腹部进行再次挑战。与其中所有肿瘤均长出的天然小鼠(n＝5)相比，所有sting治愈的小鼠均排斥肿瘤，证实适应性免疫的参与。
[1126]
这些数据验证了人组成型sting变体的鼠版本在鼠结肠直肠癌模型中的安全性和效力，并揭示了与其它sting变体相比具有增强效力的一个小组。这些高度活性的变体还引发保护性免疫，证实i型干扰素的肿瘤特异性产生的效力。
[1127]
鼠sting gof变体证实在静脉内给药后的显著的肿瘤重塑
[1128]
接下来确定含有编码组成型sting变体的质粒的细菌菌株在静脉内给药后是否表现出重塑肿瘤微环境(tme)的能力的差异。为了检测这一点，为6
‑
8周龄雌性c57bl/6小鼠(每组5只小鼠)在右侧腹部皮下接种mc38结肠直肠腺癌细胞(100μlpbs中5
×
105个细胞)。在第8天，对带有已建立的侧腹部肿瘤的小鼠静脉内注射5
×
105cfu的ys1646δasd/δflg菌株，所述菌株含有带有驱动musting n153s、v154m、r280q、v146l、r283g表达的ef
‑
1α的质粒或质粒对照，并与pbs载具对照进行比较。
[1129]
在肿瘤植入后第28天，切除肿瘤用于分析。将肿瘤切成2至3毫米的小块，放入装有2.5ml酶混合物(rpmi
‑
1640 10％fbs和1mg/ml胶原酶iv和20μg/ml dnase i)的gentlemacs
tm c管(miltenyi biotec)中。将肿瘤块使用octomacs
tm
(miltenyi biotec)特异性解离程序(小鼠植入肿瘤)解离，并将整个细胞制备物在37℃搅拌孵育45分钟。孵育45
分钟后，使用octomacs
tm
(小鼠植入肿瘤程序)进行第二轮解离，并且所得单细胞悬浮液通过70μm尼龙网过滤到50ml管中。将尼龙网用5ml的rpmi
‑
1640 10％fbs洗涤一次，并使用新的70μm尼龙网将细胞再次过滤到新的50ml管中。将尼龙网用5ml具有10％fbs的rpmi
‑
1640洗涤，以及然后将过滤的细胞以1000rpm离心7分钟。将所得解离的细胞重新悬浮在pbs中并在染色过程之前保持在冰上。
[1130]
通过流式细胞术在施用包含编码各种gof musting突变体的质粒的ys1646δasd/δflg菌株后，确定活的肿瘤浸润白细胞(til)的百分比，包括cd4
tregs、cd4
th1细胞、cd8
t细胞、中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞(dc)、m1巨噬细胞和m2巨噬细胞。对于流式细胞术染色，将100μl的单细胞悬浮液接种在v型底96孔平板的孔中。每孔加入100μl含死/活染色剂(zombie aquatm，biolegend)和fc封闭试剂(bd biosciences)的pbs，并在冰上避光孵育30分钟。30分钟后，通过以1300rpm离心3分钟，将细胞用pbs 2％fbs洗涤两次。然后将细胞重悬于pbs 2％fbs中，其含有荧光染料缀合的抗体(cd4 fitc克隆rm4
‑
5；cd8a bv421克隆3
‑
6.7；f4/80apc克隆bm8；cd11b pe
‑
cy7克隆m1/70；cd45 bv570克隆30
‑
f11；cd3 pe克隆145
‑
2c11；ly6c bv785克隆hk1.4；i
‑
a/i
‑
e apc
‑
cy7克隆m5/114.15.2；ly6g bv605克隆1a8；和cd24 percp
‑
cy5.5克隆m1/69；均来自biolegend)，并在冰上避光孵育30分钟。30分钟后，将细胞用pbs 2％fbs以1300rpm离心3分钟洗涤两次，并重悬于流式细胞仪固定缓冲液(thermo fisher scientific)中。流式细胞术数据使用acea流式细胞仪(acea biosciences,inc.)采集，并使用f1owjo
tm
软件(tree star,inc.)进行分析。
[1131]
如下表所示，带有ef
‑
1α质粒对照的菌株ys1646δasd/δflg表现出主要是高嗜中性粒细胞浸润，尽管有一些cd8
t细胞募集，这可能是由于质粒上的免疫刺激元件所致。相反，不同的musting变体具有独特的肿瘤浸润免疫细胞特征，其中一些例如musting v146l和musting r283g，导致比pbs对照更少的免疫抑制性中性粒细胞。在施用musting突变体r283g和n153s的小鼠肿瘤中观察到最有利的免疫特征，其具有大量cd4
th1细胞和cd8
t细胞，以及少量中性粒细胞，这表示用于产生适应性免疫的高度有利的条件。这些趋势也在总细胞计数中得到了重述，如下所示。因此，将组成型活性sting变体递送至肿瘤驻留骨髓细胞导致免疫抑制性肿瘤微环境的完全重塑，朝向适应性抗肿瘤表型，并远离特征在于促进先天免疫性和抑制适应性免疫的细菌表型。
[1132]
活肿瘤侵润白细胞(til)的百分比％
[1133][1134]
总细胞计数
[1135][1136][1137]
实施例28
[1138]
经修饰以表达比人sting诱导更强i型ifn信号传导和/或更弱nf
‑
κb信号传导的脊椎动物sting变体的免疫刺激性细菌
[1139]
sting信号传导激活两种信号传导途径。第一种是tank结合激酶(tbk1)/irf3轴，导致i型干扰素的诱导，以及树突状细胞(dc)的激活和肿瘤抗原的交叉呈递以激活cd8
t细胞介导的抗肿瘤免疫。第二种是激活的b细胞的核因子κ
‑
轻链增强子(nf
‑
κb)信号传导轴，导致促炎反应，但不激活抗肿瘤免疫所需的dc和cd8
t细胞。基于细菌的癌症免疫疗法在诱导i型ifn以募集和激活促进肿瘤抗原交叉呈递和持久抗肿瘤免疫所必需的cd8
t细胞方面的能力有限。因此，本文提供了诱导和/或增加i型ifn信号传导并且具有降低的nf
‑
κb信号传导的免疫刺激性细菌，从而增加cd8
t细胞介导的抗肿瘤免疫的诱导，并增强细菌的治疗功效。上述免疫刺激性细菌编码修饰的sting蛋白，这些蛋白是sting的功能获得性突变体，其与野生型sting相比，可以增加i型ifn的诱导，或使i型ifn的表达成为组成型。在本实施例中(且也在详细说明中描述)，sting蛋白被修饰以降低或消除nf
‑
κb信号传导活性，并保留诱导i型ifn的能力，和/或sting蛋白被修饰为增加i型干扰素表达或组成型表达i型干扰素。这导致产生免疫刺激性细菌，其诱导抗肿瘤免疫，并且不诱导(或诱导较少)通常由细菌病原体感染引起的nf
‑
κb信号传导。
[1140]
来自不同物种的sting蛋白表现出不同水平的i型ifn和nf
‑
κb信号传导活性。例如，人和小鼠细胞中的sting信号传导导致强i型ifn应答和弱促炎nf
‑
κb应答。相比之下，鳍鱼类(ray
‑
finned fish)如鲑鱼和斑马鱼中的sting信号传导引起主要是nf
‑
κb驱动的应答的强烈激活，与irf3驱动的(即i型ifn诱导的)应答相比高100倍以上。在其它物种中，例如袋獾(tasmanian devil)中，sting信号传导导致i型ifn应答，但基本上没有nf
‑
κb应答。本文提供的免疫刺激性细菌编码来自非人物种的sting例如袋獾sting，以便利用sting诱导i型ifn应答的能力，但不会同时诱导nf
‑
κb应答。如本文所述，这些非人sting蛋白也通过突变修饰以增加i型ifn应答，或使其成为组成型。在人sting中鉴别的具有这种效应的突变被引入到非人sting蛋白中。通过比对鉴定相应的残基。
[1141]
还提供了嵌合体，其中sting的c末端尾部(ctt)在一个物种(例如人)中用来自表
现出很少或没有nf
‑
κb信号传导活性的第二个(例如，非人)物种的ctt替换。ctt是一个约40个氨基酸的非结构化片段，其含有sting磷酸化和irf3募集所需的序列基序。其可以通过改变i型ifn和nf
‑
κb信号传导之间的平衡来塑造下游免疫。这通过ctt中的独立模块控制，包括irf3、tbk1和traf6结合模块。例如，人sting残基s366(见例如seq id no:305
‑
309)是主要的tbk1磷酸化位点，其是irf3结合所需的ctt中lxis基序的一部分，而第二个pxplr基序，包括残基l374，是tbk1结合所需的。lxis和pxplr基序在所有脊椎动物sting等位基因中高度保守。用例如袋獾sting的ctt取代人sting的ctt产生诱导i型ifn应答但不诱导nf
‑
κb应答的sting。
[1142]
在本实施例中，免疫刺激性细菌被设计成表达与野生型(wt)人sting(seq id no:305
‑
309)相比具有增加的i型ifn信号传导和/或减少的nf
‑
κb信号传导的sting变体。sting变体可以来自非人脊椎动物，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类物种。非人sting蛋白所来自的物种包括但不限于袋獾(sarcophilus harrisii；seq id no:331)，狨猴(callithrix jacchus；seq id no:341)，牛(bos taurus；seq id no:342)，猫(fells catus；seq id no:338)，鸵鸟(struthio camelus australis；seq id no:343)，朱鹭(nipponia nippon；seq id no:344)，腔棘鱼(latimeria chalumnae；seq id no:345和346)，野猪(sus scrofa；seq id no:347)，蝙蝠(rousettus aegyptiacus；seq id no:348)，海牛(trichechus manatus latirostris；seq id no:349)，鬼鲨(callorhinchus milli；seq id no:350)，和小鼠(mus musculus；seq id no:351)。这些脊椎动物sting蛋白很容易激活人细胞中的免疫信号传导，表明sting信号传导的分子机制在脊椎动物之间是共享的(参见例如de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175)。与人sting相比，来自这些物种的sting蛋白诱导更少的nf
‑
κb信号激活和/或更多的i型干扰素信号激活(参见例如de oliveira mann et al.(2019)cell reports 27:1165
‑
1175,fig.1a)。来自不同非人物种的野生型或修饰的sting蛋白可以由本文的免疫刺激性细菌表达，其可以是人和非人sting蛋白的嵌合体。
[1143]
各种非人sting蛋白被修饰，使得非人sting具有比人sting更低的nf
‑
κb激活，并且任选地具有更高的i型干扰素激活。这些非人sting蛋白被修饰以包括一个或多个突变，以便它们具有增加的i型ifn活性，或在没有胞质核酸配体(例如cdn)的情况下组成性地起作用。突变通常是与人干扰素疾病相关的氨基酸突变，例如功能获得性突变。相应的突变被引入非人物种sting蛋白，其中相应的氨基酸残基通过比对而鉴别。例如，突变包括但不限于s102p，v147l，v147m，n154s，v155m，g166e，c206y，g207e，s102p/f279l，f279l，r281q，r284g，r284s，r284m，r284k，r284t，r197a，d205a，r310a，r293a，t294a，e296a，r197a/d205a，s272a/q273a，r310a/e316a，e316a，e316n，e316q，s272a，r293a/t294a/e296a，d231a，r232a，k236a，q273a，s358a/e360a/s366a，d231a/r232a/k236a/r238a，s358a，e360a，s366a，r238a，r375a，和s324a/s326a，其参照seq id no:305
‑
309所示的人sting序列。下表列出了来自其它物种的sting中的相应突变。所产生的非人sting蛋白的变体包括这些突变的一种或多种，和任选地ctt替换，以及任选地traf6结合位点中的缺失。
[1144]
sting变体包括磷酸化位点处的氨基酸丝氨酸(s)或苏氨酸(t)用拟磷的天冬氨酸(d)进行的一个或多个取代，由此产生增加的或组成的活性。其它突变包括缺失或取代一个或多个磷酸化位点，例如sting中的324
‑
326sls
→
ala，以及其它取代以消除磷酸化位点，来
降低sting中的nf
‑
κb信号传导。此外，还提供了人sting与来自其它物种的sting的嵌合体，其中人sting的c末端尾部(ctt)用来自另一个物种的具有更低nf
‑
κb信号传导活性和/或更高i型ifn信号活性的sting的ctt取代。变体sting蛋白可以包括ctt的traf6结合位点中的缺失，以降低nf
‑
κb信号传导。
[1145]
[1146][1147]
例如，修饰的sting变体包括具有突变c206y(seq id no:332)或r284g(seq id no:333)的袋獾sting；其中人sting的ctt被袋獾sting的ctt取代的一种变体(seq id no:334)；具有突变c206y(seq id no:335)或r284g(seq id no:336)的人sting，并且其中ctt被袋獾sting的ctt取代；具有traf6结合结构域中的缺失(对应于残基377
‑
379，dfs))的野生型人sting(seq id no:337)；具有突变的c205y(seq id no:339)或r283g(seq id no:340)的猫sting；和其它这种修饰的sting变体。
[1148]
为了确定sting突变的相应氨基酸残基，将来自各种非人物种的野生型sting序列各自与野生型人sting序列(seq id no:305(r232等位基因)或seq id no:306(h232等位基因)的等位基因变体的)进行比对。使用可从ebi.ac.uk/tools/msa/kalign/获得的kalign
序列比对工具，或者可从ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/获得的emboss needle序列比对工具进行比对。图1
‑
13中描绘了人sting与来自袋獾、狨猴、牛、猫、鸵鸟、朱鹭、腔棘鱼、斑马鱼、野猪、蝙蝠、海牛、鬼鲨和小鼠物种的sting蛋白的示例性序列比对。
[1149]
sting gof杂合变体证实在树突细胞中的显著提高的i型干扰素与nf
‑
κb比率
[1150]
为了确定在小鼠中引起最高水平cd8
t细胞趋化因子cxcl10的优化sting gof突变体，在小鼠原代骨髓衍生的树突细胞(bmdc)中测试了一组突变体。这些包括具有组成型人gof突变c206y(seq id no:332)或r284g(seq id no:333)的袋獾sting；鼠sting gof突变体c205y或r283g；以及其中人sting的ctt被袋獾sting(seq id no:334)的ctt取代并含有野生型人sting或人sting突变c206y(seq id no:335)或r284g(seq id no:336)的变体。还包括具有突变c205y(seq id no:339)或r283g(seq id no:340)的猫sting和具有突变c206y或r284g的人sting。
[1151]
为了测试这些，分离鼠骨髓并冲入1.5ml eppendorf管并以1200rpm旋转5分钟以收集骨髓细胞。细胞在rpmi
‑
1640 10％fbs中洗涤一次，然后接种在6孔tc处理的板中的具有20ng/ml gm
‑
csf的rpmi
‑
1640 10％fbs中。每2天用新鲜的完全培养基替换50％的培养基。6天后，将非贴壁细胞从孔中吸出并以每孔1e5个细胞重新接种在96孔板中的rpmi
‑
1640 10％fbs中用于转染。根据制造商的说明，使用red转染细胞。简而言之，将来自一组sting gof突变体的200ng质粒dna以及未转染对照在提供的缓冲液中稀释，并与0.08μl的red混合并在室温下孵育15分钟以允许形成复合物。然后将dna/red复合物缓慢加入96孔板的每个孔中(一式两份)，并将板在co2保温箱中在37℃孵育。根据制造商的方案，在48小时收集上清液并使用基于流式细胞术的细胞因子珠阵列(cba)测定鼠cxcl10(ip
‑
10)。
[1152]
如下表所示，诱导鼠cxcl10最高表达的构建体含有人sting的ctt被替换为袋獾sting的ctt，并含有人sting gof突变r284g(husting r284g tazctt)。次高的是具有gof突变c206y的人sting(husting c206y)和含有人sting gof突变r284g的袋獾sting(tazsting r284g)。令人感兴趣的是，在原代鼠树突细胞中，人sting gof突变体比鼠sting gof突变体(musting c205y和musting r283g)更强效，后者甚至不如含有c205y和r283g gof突变的猫sting强效。
[1153]
构建体cxcl10 pg/ml未转染的11.48
±
3.889husting c206y861.0
±
58.48husting r284g769.7
±
95.16msting c205y194
±
27.15msting r283g230.1
±
1.018husting c206y taz ctt366.6
±
42.61husting r284g taz ctt1326
±
137.9tazsting c206y808.8
±
95.78tazsting r284g831.3
±
30.15catsting c205y480.7
±
24.94catsting r283g376.2
±
6.682
[1154]
这些数据证实利用从其它物种(例如袋獾)获得的sting并将其与组成型gof人sting突变组合以引发强效的t细胞募集趋化因子的可行性。
[1155]
sting gof杂合变体证实在人单核细胞中的显著提高的i型干扰素与nf
‑
κb比率
[1156]
为了证实使用来自其它物种的sting gof杂合变体可以改变sting诱导的i型干扰素与nf
‑
κb信号传导比率，在人单核细胞系中测试了一个小组。该小组包括野生型人sting，或具有组成型gof突变c206y或r284g的人sting；野生型袋獾sting或具有组成型gof突变c206y或r284g的袋獾sting；其中人sting的ctt被取代为袋獾sting的ctt并含有野生型人sting或人sting突变c206y或r284g的变体；以及具有突变c205y或r283g的鼠sting。还包括在traf6结合结构域具有缺失(相应于残基377
‑
379，dfs)的野生型人sting、猫野生型sting和斑马鱼野生型sting。
[1157]
对于这个实验，使用了thp1
‑
dual
tm
ko sting细胞，这些细胞已经被改变为缺乏内源性sting，并且还表达lucia
tm
萤光素酶，其是一种分泌型萤光素酶，被置于内源性ifn
‑
β启动子的控制之下。然后通过测量ifn
‑
β启动子诱导的萤光素酶活性表达鉴别和分级组成型活性的sting gof突变体。这些细胞还表达置于内源性nf
‑
κb启动子控制之下的分泌型胚胎碱性磷酸酶(seap)，其中nf
‑
κb的编码序列已使用敲入技术被seap orf取代。sting gof突变体诱导的nf
‑
κb活性可以通过监测细胞上清液中的seap产生来评估。
[1158]
对于这个实验，根据制造商指导，用red转染thp1
‑
dual
tm
ko sting细胞。简而言之，将来自一组sting gof突变体的200ng质粒dna以及未转染的对照在提供的缓冲液中稀释，与0.08μl的red混合并在室温下孵育15分钟以允许形成复合物。然后将dna/red复合物缓慢加入96孔板的每个孔中(一式两份)，并将板在co2保温箱中在37℃孵育。此外，野生型sting变体用或不用sting激动剂3'5'rprp c
‑
di
‑
amp(cdn,invivogen)处理，该激动剂是临床化合物adu
‑
s100的类似物，在孵育24小时后以10μg/ml加入到细胞。根据制造商的方案，在48小时收集上清液并测定nf
‑
κb
‑
seap和ifn
‑
lucia报告分子信号。简而言之，将10μl细胞培养上清液加入到50μl quanti
‑
blue
tm
试剂(invivogen)(用于测量seap)。nf
‑
κb激活是通过在m3分光光度计(molecular devices)上在吸光度(abs)为650nm测量nf
‑
κb诱导的seap活性而确定。为了测量来自ifn
‑
lucia的i型干扰素活性，将10μl细胞培养上清液加入50μl含有用于萤光素酶反应的腔肠素底物的quanti
‑
luc
tm
，其产生光信号，使用m3分光光度计定量所述光信号，并表示为相对光单位(rlu)。
[1159]
如下表所示，最高的i型ifn应答在其中人sting的ctt被袋獾sting的ctt取代并且含有人sting gof突变r284g的变体(husting r284g tazctt)中观察到，以及在具有cdn sting激动剂的野生型斑马鱼sting(zfsting wt cdn)中观察到。然而，与具有非常高的nf
‑
κb信号传导的野生型斑马鱼sting不同，husting r284g tazctt变体具有高i型ifn信号传导，而nf
‑
κb信号传导活性低得多。在含有人sting gof突变r284g的袋獾sting变体(tazsting r284g)中发现了较高i型ifn与较低nf
‑
κb信号传导的最佳比率。
[1160][1161]
这些数据进一步证实使用非人sting蛋白(例如来自袋獾的sting蛋白)并将其与人组成型功能获得性sting突变组合的可行性，以在人单核细胞中增强有益的i型干扰素活性，同时最小化免疫抑制性nf
‑
κb活性。
[1162]
由于修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，因此本发明旨在仅由所附权利要求的范围来限制。
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