一种ALS突变蛋白及其应用的制作方法

一种als突变蛋白及其应用
技术领域
1.本技术属于植物蛋白质技术领域，更具体地说，它涉及als突变蛋白、核酸、表达盒、重组载体、细胞及应用。


背景技术：

2.农田杂草是导致农作物减产的最主要原因之一，与传统的栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是人们公认的防除农田杂草最高效的、简便的和经济的方法。
3.乙酰乳酸合成酶（als）（也称乙酰羟酸合成酶，ahas；ec 4.1.3.18）是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成的第一酶。以als为靶点来研制开发的除草剂目前已有五大类，即磺酰脲类（su）、咪唑啉酮类（imi）、磺酰氨基
‑
羰基三唑啉酮（sct）、嘧啶水杨酸类（ptb）和三唑并嘧啶类（tp）。在本文中，除草剂抗性指的是对包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶水杨酸类在内的除草剂具有耐受性。als抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效、对哺乳动物毒性低等优点，目前已大面积推广使用。
4.als为靶点来研制开发的除草剂的作用机理是通过抑制乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，als）的活性，破坏蛋白质合成，干扰dna合成及细胞分裂与生长，最终造成植株死亡达到杀死植物的目的。而植物对这类除草剂的抗性则来自als基因一个或多个氨基酸突变而导致酶的结构变化。


技术实现要素：

5.目前，已经发现als突变蛋白在不同植物（包括玉米、小麦、水稻、油菜和向日葵等）的同源蛋白的第122、155、197、205、574、653、654等位点会产生突变，从而使得相应植物对咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶类类和嘧啶水杨酸类等除草剂产生抗性（tan s，evzns r r, dahmerm l, et al.1midazoiinone
‑
tolerant crops: history, current status and future.pest management science. 2005, 61: 246
‑
257 ；tan s, evzns r r, dahmer m l, etal.1midazolinone
‑
tolerant crops: history, current status and future [j]. pestmanagement science. 2005, 61: 246
‑
257）。然而，目前没有报道表明，普通小麦als基因在629位点发生从s到n的氨基酸突变，会使得小麦具有除草剂抗性。
[0006]
本技术的发明人经过长期艰苦的研究实践，通过对大量的航麦247种子进行ems化学诱变处理和除草剂筛选，从一系列突变植株中，最终获得一株对als抑制剂类除草剂不敏感的小麦，从而使得该小麦具有咪唑啉酮类除草剂抗性（耐受性），使得小麦能够在喷施除草剂的情况下保持原有蛋白的正常植物生理功能。该小麦中的als蛋白可用于培育具有抗除草剂活性的植物，尤其是农作物。
[0007]
本技术是通过以下方案实现的：本技术提供一种als突变蛋白，所述als突变蛋白带有s629n突变。
[0008]
本技术中，als突变蛋白的第629位的丝氨酸变为天冬酰胺，使得als突变蛋白具有
抗除草剂活性，关于此，目前还未报道过。
[0009]
在本技术的一个具体实施方式中，所述als突变蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。该蛋白突变使得植物具有抗咪唑啉酮类除草剂活性。
[0010]
在本技术的一个具体实施方式中，所述als突变蛋白来源于普通小麦（triticum aestivum l.）。
[0011]
在本技术的一个具体实施方式中，所述小麦为航麦247。
[0012]
在本技术的一个具体实施方式中，所述als突变蛋白能够使小麦耐受8倍浓度（720g ai/ha）的甲咪唑烟酸。
[0013]
本技术另一方面提供一种核酸，所述核酸编码上述als突变蛋白。
[0014]
在本技术的一个具体实施方式中，所述核酸序列的第1886位核苷酸g发生了突变。
[0015]
在本技术的一个具体实施方式中，所述核酸序列的第1886位核苷酸由鸟嘌呤g突变成了腺嘌呤a。
[0016]
在本技术的一个具体实施方式中，所述als突变蛋白位于小麦b基因组的6bl染色体上。
[0017]
在本技术的一个具体实施方式中，所述核酸的序列如seq id no:1所示。
[0018]
本技术另一方面提供一种表达盒，所述表达盒包括上述核酸。
[0019]
本技术另一方面提供一种重组载体，所述重组载体包括上述核酸。
[0020]
本技术另一方面提供一种细胞，所述细胞包括上述核酸。
[0021]
本技术另一方面提供上述als突变蛋白，或上述核酸，或上述表达盒，或上述重组载体，或上述细胞在植物抗除草剂中的应用。
[0022]
在本技术一个具体实施方式中，所述除草剂为咪唑啉酮类除草剂。
[0023]
在本技术一个具体实施方式中，所述除草剂包含但不限于甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、灭草烟、灭草喹以及他们的衍生物中的一种或多种。
[0024]
在本技术一个具体实施方式中，所述除草剂为甲咪唑烟酸。
[0025]
在本技术的一个具体实施方式中，所述植物为小麦、烟草、拟南芥、水稻、玉米或高粱等。
[0026]
本技术另一方面提供一种获得具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）使植物包含上述所述的核酸；和/或，2）使植物表达上述所述的als突变蛋白。
[0027]
在本技术的一个具体实施方式中，获得具有除草剂抗性的植物的方法包括转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤。
[0028]
本技术提供的als突变蛋白至少具有以下有益效果之一：本技术提供的als突变蛋白的第629位的丝氨酸变为天冬酰胺，使得突变体小麦具有抗除草剂活性，能够耐受8倍浓度（720g ai/ha）的甲咪唑烟酸。
附图说明
[0029]
图1为本技术实施例中提供的筛选到的j401突变体的照片。
[0030]
图2为本技术实施例中提供的j401突变体的琼脂糖凝胶电泳实验结果图，其中，
6a
‑
als为野生型植株的a基因组pcr产物；j6a
‑
als为j401突变植株的a基因组pcr产物；6b
‑
als为野生型植株的b基因组pcr产物；j6b
‑
als为j401突变植株的b基因组pcr产物；6d
‑
als为野生型植株的d基因组pcr产物；j6d
‑
als为j401突变植株的d基因组pcr产物；m为dna marker。
[0031]
图3为本技术实施例中提供的j401突变体后代在田间对甲咪唑烟酸耐受性的实验结果图，其中，1、2行植株为j401突变体，3、4行植株为航麦247对照。
[0032]
图4为本技术实施例中提供的j401突变体后代在温室下培养2周时对不同浓度甲咪唑烟酸的耐受性的实验结果图，其中，“ck0”为野生型小麦不喷施甲咪唑烟酸作为对照；“ck2
×”
为野生型小麦喷施2倍浓度的甲咪唑烟酸作为对照；“0
×”
为实验组小麦不喷施甲咪唑烟酸；“2
×”
为实验组小麦喷施2倍浓度的甲咪唑烟酸，以此类推。
具体实施方式
[0033]
除非另有定义，本技术中使用的所有技术和科学术语具有与本技术所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0034]
下面将结合本技术实施例，对本技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0035]
实施例1 小麦诱变群体构建和抗除草剂小麦的筛选2018年10月，将120kg航麦247种子（审定编号为国审麦2016029，购自北京顺鑫国际种业有限公司）分装在12个纱网袋中，每袋10kg，用自来水冲洗干净。室温下，用清水浸泡12小时后，将种子捞出，控干水分。
[0036]
配制10mmpbs（上海生工，产品编号b040100
‑
0005，粉剂，ph7.0）溶液，以pbs溶液为母液配制0.4%（w/w）的ems（产品编号m0880 | cas号62
‑
50
‑
0 | sigma甲磺酸乙酯，浓度：1.206g/ml）溶液。
[0037]
利用0.4%ems溶液浸泡种子（种子与ems溶液比的w/v=1:2），每隔1小时翻动一次种子或摇动溶液桶。12小时后弃去ems溶液，换自来水浸泡种子，每次浸泡5分钟，重复5次。最后，取出种子用流水冲洗2小时，冲洗过程中翻动种子，将ems冲洗干净。之后，沥干水分，稍微晾晒，运输到田间机械播种，并进行常规肥水管理。2019年6月，将种子分区收获，晾干，这些种子为m1代。
[0038]
2019年9月初将小麦种子（m1代）分畦播种，厢面宽80cm，沟宽40cm，待小麦生长至一叶一心时，用240g/l甲咪唑烟酸（imazamox，cas号114311
‑
32
‑
9, 2
‑
(4
‑
异丙基
‑4‑
甲基
‑5‑
氧
‑2‑
咪唑啉
‑2‑
基)
‑5‑
甲基烟酸，水剂），扇形喷头喷雾，喷施剂量50ml/亩（2倍大田使用浓度，180g ai/ha）。2周后查看幼苗枯死情况，发现其中有绿色存活幼苗（见图1），其余小麦均死亡。将这些绿色幼苗移栽至育苗盆中，在室外春化30天后，转移到温室管理，收种，这些种子为m2代。
[0039]
实施例2 抗除草剂小麦的突变位点分析上述实施例1中筛选获得的抗除草剂小麦的突变体植株进行分子检测。具体步骤
如下：取突变体及野生型植株的叶片20mg，放入离心管中，加入钢珠后，置于液氮速冷，用组织研磨机将叶片充分震荡研磨至粉末状，采用ctab法提取样品dna进行基因组测序。
[0040]
普通小麦是六倍体，含有a、b、d三个基因组，有3个als基因，分别为6a
‑
als、6b
‑
als和6d
‑
als。根据参考序列分别设计特异性引物进行扩增，具体引物序列如表1所示。
[0041]
表1 特异性引物（1）采用kod fx（购于东洋纺(上海)生物科技有限公司）扩增基因6a
‑
als，其反应体系如下：2x pcr buffer for kod fx 25.0ul；2mm dntp 10ul；kod fx 1ul；10μm正向引物1.5ul；10μm反向引物 1.5ul；30ng/μl小麦基因组dna 5.0ul；补加无菌水至总体积50ul。
[0042]
pcr扩增反应程序如下：预变性：98℃ 2min；35个循环：变性98℃ 30sec；退火58℃ 30sec；延伸68℃ 2.5min；保温：68℃ 3min。将扩增后的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，以野生型pcr产物为对照，实验结果如图2所示。
[0043]
（2）采用q5
®ꢀ
high
‑
fidelity 2x master mix (购于biolabs公司)扩增基因6b
‑
als和6d
‑
als，其反应体系如下：q5
®ꢀ
high
‑
fidelity 2x master mix 25.0ul；10μm正向引物1.0ul；10μm反向引物1.0ul；30ng/μl小麦基因组dna 5.0ul；补加无菌水至总体积50ul。
[0044]
pcr扩增反应程序如下：预变性：98℃ 2min；35个循环：变性98℃ 20sec；退火57℃ 20sec；延伸72℃ 90sec；保温：72℃ 2min。将扩增后的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，以野生型pcr产物为对照，实验结果如图2所示。
[0045]
将上述的剩余的pcr产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序，获得小麦突变体j401的6a
‑
als、6b
‑
als、6d
‑
als基因序列。
[0046]
测序比对结果显示，相对于野生型航麦247，其中编号为j401的突变株在a、d基因组中的乙酰乳酸合成酶基因没有发生任何碱基变化，在b基因组中的乙酰乳酸合成酶第1886位核酸发生了突变，由g变成了a，相应的编码蛋白的氨基酸的第629位由丝氨酸变成天冬酰胺，基因型为纯合。j401的核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0047]
实施例3：抗除草剂植株在田间对咪唑啉酮类除草剂抗性的测试2020年10月，在田间按30
×
10cm行株距，1.5m行长小区种植，野生型作为对照。待小麦生长至一叶一心时，按照1倍大田使用浓度（90g ai/ha）的剂量喷施甲咪唑烟酸。喷施14天后调查植株枯死情况，发现野生型对照在喷施甲咪唑烟酸之后停止生长，整株枯死，而
筛选到的抗除草剂植株j401对甲咪唑烟酸完全耐受，其生长发育没有受到影响，与野生型未喷药一致，试验结果如图3所示。其后期正常分蘖、拔节、扬花、结实。这表明我们筛选到的抗除草剂突变体能够稳定地遗传咪唑啉酮类除草剂抗性。
[0048]
实施例4：抗除草剂植株在温室对咪唑啉酮类除草剂抗性的测试2021年4月，将航麦247对照、j401突变体在育苗盆播种。对照组设置不喷施甲咪唑烟酸（0
×
）和喷施2
×
甲咪唑烟酸，试验组设0
×
、2
×
、4
×
、8
×
、10
×
、12
×
甲咪唑烟酸，共计6个浓度梯度，每个浓度播种4盆，每处理设3次重复。喷施甲咪唑烟酸前，去除不正常苗，每处理留苗不少于10株。小麦在两叶一心期喷施除草剂，分别在用药后1周和2周调查和记录药害症状、受害株数，植株高度，2周后的实验结果如图4和表2所示。
[0049]
对小麦除草剂药害，采用五级目测法，分级标准为：0 级：作物生长正常，无任何受害症状；1 级：作物轻微药害，药害少于10%；2级：作物中等药害，以后能恢复，不影响产量；3 级：作物药害较重，难以恢复，造成减产；4 级：作物药害严重，不能恢复，造成明显减产或绝产。
[0050]
计算药害公式为：受害株率=（受害株数/测试总株数）
×
100%药害指数=∑（分级目测法得到的药害级别
×
相应级别的药害株数）
×
100/(总株数
×
分级目测法的最高级别)，其中5级目测法的最高级别为4。
[0051]
表2 不同处理的实验结果注：“ck0”为野生型小麦不喷施甲咪唑烟酸作为对照；“ck2
×”
为野生型小麦喷施2倍浓度的甲咪唑烟酸作为对照；“0
×”
为实验组小麦不喷施喷施甲咪唑烟酸；“2
×”
为实验组小麦喷施2倍浓度的甲咪唑烟酸，以此类推。
[0052]
从图4和表2可知，喷药2周后，喷施8倍浓度以内的甲咪唑烟酸的突变体j401没有药害发生，仍能正常生长，株高不受影响，由此可见，该als突变蛋白至少能够使小麦耐受8倍浓度（720g ai/ha）的甲咪唑烟酸。
[0053]
综上，本技术提供的als突变蛋白，其第629位的丝氨酸变为天冬酰胺，使得als突
变蛋白具有抗除草剂活性，该蛋白能够使小麦耐受8倍浓度（720g ai/ha）（该浓度远超于田间的正常使用浓度）的甲咪唑烟酸，因此，利用该突变蛋白能够培育抗除草剂的植物，例如，小麦、烟草或拟南芥等，尤其是农作物，以减少农作物药害，拓宽除草剂的使用范围。
[0054]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。