一种半乳糖地质杆菌BWTGW1.1及其应用的制作方法

一种半乳糖地质杆菌bwtgw1.1及其应用
技术领域：
1.本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一株半乳糖地质杆菌bwtgw1.1及其在畜禽 养殖固体有机废弃物处理中的应用。


背景技术：

2.近年来，国内外养殖有机废物处理的经验表明，养殖废弃物经高温好氧堆肥化处理生产 优质有机肥是资源化利用该类废弃物的重要途径。在好氧堆肥过程中，一方面可被生物降解 的高分子有机物通过微生物迅速繁殖而分解，并合成新的稳定的高分子有机物
‑‑‑
腐殖质(构 成土壤肥力的重要活性因子)；另一方面微生物大量繁殖释放热量使堆体短时间内持续升温从 而杀灭堆肥中多种虫卵、病原菌等。
[0003][0004]
传统的堆肥方式主要是利用有机废物内土著微生物发酵，存在自然发酵耗时过长、臭气 污染严重、无害化程度和肥力低等诸多弊端。已有研究结果表明，在有机废弃物的无害化处 理中，适当添加微生物菌剂可以加快堆肥进程，提高堆肥品质。然而在外源添加的微生物菌 剂中，嗜热高温菌类微生物是十分重要的一类，对整个堆肥发酵的时间控制和堆肥品质的提 升具有决定性作用。
[0005]
养殖有机废弃物好养堆肥发酵时，当堆体进入高温阶段后，嗜温性微生物受到抑制甚至 死亡，嗜热高温菌类微生物逐渐上升为主导微生物，他们对堆体中复杂的有机物如纤维素、 半纤维素、高分子脂肪、蛋白质及复杂碳水化合物的进一步分解具有重要作用，也是推动和 维持堆体高温的主要类群，但同时它们也是资源比较匮乏的一类微生物。因此，挖掘出新的 高温或耐高温菌种资源，并将其应用于好养堆肥发酵中，有助于突破传统堆肥限制，加快堆 肥进程，缩短堆肥时间，有利于提高堆肥品质。因此，从自然界分离新型、高效的耐高温菌， 对畜禽养殖有机废弃物资源化利用的发展具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的提供一株对畜禽养殖有机废弃物好养堆肥发酵有促进作用的半乳糖地质杆 菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1，为畜禽养殖有机废弃物资源化利用提供了一种 良好的生物材料。
[0007]
为实现上述目的，本发明公布了一株嗜高温半乳糖地质杆菌，其为半乳糖地质杆菌 (geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1，菌株名为bwtgw1.1，该菌株已保藏于广东省 微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编： 510070，保藏编号为gdmcc no：61374，保藏日期为2020年11月11日。
[0008]
本发明的半乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1是由发明人于2020 年3月从东莞市中心定点屠宰场股份有限公司的猪粪泥堆肥中分离得到，该菌株生理生化特 征为：革兰氏阳性菌，细胞形状为短杆状，大小为0.5～1.0
×
1.5～2.0μm(见图1)；菌落呈白 褐色、表面粗糙，边缘不规则，适宜生长温度为55～65℃。
[0009]
提取上述嗜高温半乳糖地质杆菌bwtgw1.1的基因组dna，利用27f/1492r引物扩增 其16s rdna基因，测序后得到的基因序列见seq id no.1。将该序列在ncbi及ezbiocloud 网站上进行同源性比对分析、构建系统发育树，并结合形态学观察，结果表明，该菌株为半 乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)。
[0010]
本发明的第二个目的是提供上述半乳糖地质杆菌bwtgw1.1在畜禽养殖固体有机废弃 处理中的应用。
[0011]
优选，是在畜禽粪便、畜禽屠宰场污泥等类型畜禽养殖固体有机废弃处理中的应用。
[0012]
优选，半乳糖地质杆菌bwtgw1.1以液态发酵菌液或喷雾干燥后的粉剂剂型应用于畜禽 养殖固体有机废弃处理中。
[0013]
优选，半乳糖地质杆菌bwtgw1.1在畜禽养殖固体有机废弃堆肥发酵或者罐体发酵中的 应用。
[0014]
优选，所述的半乳糖地质杆菌bwtgw1.1，其以菌液与畜禽养殖固体有机废弃物料混合 的重量百分比为0.1
‑
0.2％。
[0015]
优选，所述的半乳糖地质杆菌bwtgw1.1，其以菌粉形式与畜禽养殖固体有机废弃物料 混合的重量百分比为0.02
‑
0.05％。
[0016]
本发明的第三个目的是提供半乳糖地质杆菌bwtgw1.1在产耐高温蛋白酶中的应用。
[0017]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018]
(1)本发明的半乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1是个喜高温菌 株，在温度为65℃的环境条件下也能旺盛生长。
[0019]
(2)本发明的半乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1能产生少量耐 高温蛋白酶，菌株在55℃高温条件下能在蛋白质培养基上形成水解圈。
[0020]
(3)本发明的半乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1能明显促进猪 粪泥废弃物好养堆肥发酵进程和高温阶段持续时间。
[0021]
综上所述，本发明的半乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1在猪粪 泥废弃物高温堆肥中生长适应性强，在高温阶段活性，可产生耐高温蛋白酶，在畜禽养殖有 机废弃物好养堆肥中有较大的应用潜力。
[0022]
geobacillus galactosidasius bwtgw1.1，于2020年11月11日保藏于广东省微生物菌种 保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编： 510070，保藏编号为：gdmcc no：61374。
附图说明
[0023]
图1为半乳糖地质杆菌bwtgw1.1经结晶紫染色后在光学显微镜下(100
×
)的照片。
[0024]
图2为60℃下半乳糖地质杆菌bwtgw1.1产耐高温蛋白酶能力评估的平板结果，菌落 周围有水解透明圈则说明菌株有产耐高温蛋白酶的能力。
[0025]
图3为温度条件对半乳糖地质杆菌bwtgw1.1生长影响的曲线示意图。
[0026]
图4为盐浓度条件对半乳糖地质杆菌bwtgw1.1生长影响的曲线示意图。
[0027]
图5为在40吨的猪粪泥好养罐体发酵中，接种普通菌剂和接种普通菌剂 半乳糖地
质杆 菌bwtgw1.1两种处理堆体温度曲线图。
[0028]
图6为半乳糖地质杆菌bwtgw1.1及相近菌株的系统进化树；其中，使用nj法建树， 图中仅显示＞70％的bootstrap系数(重复1000次)。
具体实施方式
[0029]
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对 结果并无实质性影响。若无特别说明，实施例中所述方法均为常规方法，所用试剂均为常规 试剂或按常规方式配制的试剂。
[0030]
实施例1半乳糖地质杆菌bwtgw1.1的分离纯化及保存
[0031]
2020年3月从东莞市中心定点屠宰场股份有限公司，猪粪泥有机废弃物堆肥发酵高温阶 段(50℃)采集了3个中层样品。
[0032]
高温菌分离纯化及保存：将采集的3个样品称10g分别用50ml pbs(ph 7.4，浓度0.2mol/l) 悬浮，剧烈震荡5min后，1000r/min离心3次，每次5min，收集上清至离心管。将上清液稀 释不同浓度，取10
‑3、10
‑4、10
‑5梯度的菌液涂布lb琼脂平板上，60℃恒温培养48h。挑取 生长较好菌落较大的菌株，在lb琼脂平板上继续划线分离，反复纯化。
[0033]
将纯化后的菌落菌体分散置于25％的甘油管中，
‑
80℃保存备用。由此获得菌株 bwtgw1.1。
[0034]
实施例2半乳糖地质杆菌bwtgw1.1的16s rdna鉴定
[0035]
(1)形态学鉴定：将筛选获得的菌株bwtgw1.1涂布于lb平板上，60℃培养24h后， 观察其菌落特征；取单菌落涂片，革兰氏染色，显微镜下观察其细胞形态，结果见图1。
[0036]
(2)16s rrna基因分子鉴定：
[0037]
提取菌株bwtgw1.1的基因组dna，用细菌16s rdna基因扩增通用引物27f/1492r (5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
和5
’‑
tacgacttaaccccaatcgc
‑3’
)扩增得到pcr 产物，并送至上海美吉生物医药科技有限公司(广州分公司)进行序列测序，测序后得到的 16s rrna序列长度为1447bp，序列见seq id no.1。将测序结果与ncbi及ezbiocloud数 据库中的16s rdna序列进行同源性比对分析，然后，选取菌株bwtgw1.1及相近菌株使用mega 6.0、kimura 2
‑
parameter模型、nj算法建系统进化树(bootstrap重复1000次)，得到 的进化树结果见图6。
[0038]
结果分析表明其与菌株geobacillus galactosidasius的16s rdna基因序列相似性最高 (99.4％)。
[0039]
将其命名为：半乳糖地质杆菌(geobacillus galactosidasius)bwtgw1.1，该菌株于2020 年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市先烈中路 100号大院59号楼，保藏编号为gdmcc no：61374。
[0040]
实施例3半乳糖地质杆菌bwtgw1.1的产耐高温蛋白酶能力评估
[0041]
产耐高温蛋白酶能力评估采用平板水解圈检测法：
[0042]
主要用到的培养基及试剂如下：
[0043]
蛋白质培养基：脱脂奶粉40.0g、可溶性淀粉10.0g、酵母膏3.0g、马铃薯粉2.0g，琼 脂15.0g，加蒸馏水定容到1000ml，ph 7.0～7.2。121℃高温高压灭菌20min，倒平板。
[0044]
将活化后的半乳糖地质杆菌bwtgw1.1分别点接到蛋白质培养基平板上，置于60℃培 养箱中培养48h后，观察其菌落周围是否有水解的透明圈产生，可定性的直接反映出菌株是 否有分泌产生耐高温蛋白酶的能力。
[0045]
通过上述方法观察得到半乳糖地质杆菌bwtgw1.1在蛋白质培养基上高温培养有水解 的透明圈产生，结果见图2，说明菌株bwtgw1.1确实有产生耐高温蛋白酶的能力。
[0046]
实施例4温度对半乳糖地质杆菌bwtgw1.1生长适应性评估
[0047]
(1)lb培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，调ph至7.0，121℃、 20min高压灭菌。
[0048]
(2)接种培养：将半乳糖地质杆菌bwtgw1.1接种至盛有50ml lb液体培养基的250ml 三角瓶中，分别于50、55、60、65、70℃下，恒温培养，在培养24h后取样，检测od
600
值，结果见图3。
[0049]
如图3所示，半乳糖地质杆菌bwtgw1.1在55
‑
65℃温度范围内生长适应性较好，在培 养温度为60℃时生长最好，培养24h时od
600
值已经超过了0.45；但在温度为50和70℃时， 菌体生长受到明显抑制。
[0050]
实施例5盐度对半乳糖地质杆菌bwtgw1.1生长适应性评估
[0051]
(1)不同盐度梯度的lb培养基配制：使用lb作为基础培养基，每100ml基础培养 基分别添加0g、0.5g、1g、1.5g、2g、3g和5g氯化钠，配成盐度分别为0、0.5％、1％、 1.5％、2％、3％和5％的培养基，调ph为7.2，121℃下高温高压灭菌。
[0052]
(2)接种培养：将半乳糖地质杆菌bwtgw1.1接种至不同盐度梯度的lb培养基中， 于60℃恒温培养，在培养0、8、12、24、48h后取样，检测od
600
值，结果见图4。
[0053]
如图4所示，半乳糖地质杆菌bwtgw1.1在一定盐度范围内有很好的适应性，在盐度为 0
‑
2％的条件下生长的均较好，在盐度为1.5％条件下生长的最好，培养48h时od
600
值已经超 过了1.1；而在盐度超过2％后，菌体生长明显受到限制，生长速率也迅速下降。
[0054]
实施例6半乳糖地质杆菌bwtgw1.1的制备
[0055]
本发明还提供了半乳糖地质杆菌bwtgw1.1的制备方法，包括如下步骤：
[0056]
(1)种子液的培养：将所述半乳糖地质杆菌bwtgw1.1接种于lb培养基中，在60℃、 120r/min的恒温水浴振荡器培养24h，得到bwtgw1.1种子液；
[0057]
(2)在发酵罐中装入占总体积60％的发酵培养基，在培养基温度为60℃时，接入占所 述发酵培养基体积1％的所述半乳糖地质杆菌bwtgw1.1种子液，转速180～200rpm、通气搅 拌培养36h，使所述bwtgw1.1菌株的菌数达到1
×
109cfu/ml；
[0058]
所述发酵培养基的ph为7.0，包括如下按照质量百分比计的组分：葡萄糖1～2％、大豆 蛋白胨0.5～1％、酵母膏0.5～1％、氯化钠1.5％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％，余量为 水。
[0059]
实施例7半乳糖地质杆菌bwtgw1.1大罐发酵屠宰场猪粪泥的发酵效果
[0060]
将40吨含水量为63％～65％的屠宰场猪粪泥和发酵剂充分混匀，通过立式投料仓投入116 吨大通气发酵罐体内，通气发酵。其中对照发酵剂为质量含量0.1％普通菌剂(枯草芽孢杆菌： 粪肠球菌：酿酒酵母为质量比5:1:1)，试验发酵菌剂为质量含量0.1％普通菌剂 质量含量0.1％ 半乳糖地质杆菌bwtgw1.1菌液(活菌数≥1
×
108cfu/ml)。当堆体温度没有达到50℃时，通 气量为15min/60min，搅拌同步；温度达到50℃后，通气量调为30min/
60min，同时搅拌同步。 每天测定猪粪泥堆体温度并记录，发酵时长共168h，结束后取中间层样检测已发酵猪粪泥水 分含量，最后测得实验组和对照组猪粪泥水分含量分别为45％和35％；具体温度检测数据见 图5。图5结果表明，普通菌剂 半乳糖地质杆菌bwtgw1.1菌液处理，猪粪泥堆体温度24h 即达到58℃，且持续108h的60
‑
70℃高温，最高温度达到70℃。而只用普通菌剂的对照处 理，猪粪泥堆体温度上升到50℃以上需要48h，且50℃以上的温度仅仅持续60h，最高温度 为60℃。结合水分数据，结果表明，普通菌剂 半乳糖地质杆菌bwtgw1.1菌液处理比普通 菌剂处理无害化和减量化都有明显优势。
[0061]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明 的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。