启动子序列和相关产物及其用途的制作方法

启动子序列和相关产物及其用途
1.相关申请
2.本技术要求2019年4月24日提交的美国临时专利申请号62/838,063的优先权，将该申请通过引用以其全文特此并入。
3.关于联邦政府资助研究的声明
4.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的批准号u01 dk089569在政府支持下进行。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
5.本披露总体上涉及生物技术领域，特别涉及启动子序列和相关产物及其用途。


背景技术：

6.在病毒载体中使用最广泛的强遍在(ubiquitous)启动子(cmv、cag等)是相当大的(约1,000bp)。就可以表达的转基因而言，这可能是受限的。例如，aav的包装极限(packaging limit)为约4.8kb。减去当前使用的启动子后，单链aav中的转基因仅留下约3.7kb，而自身互补raav仅留下约1.2kb。需要允许表达更大的转基因的启动子。


技术实现要素：

7.本文提供了遍在小启动子元件，其能够在具有医学意义的多种哺乳动物细胞类型中驱动高产量的基因表达。此外，启动子在人胰腺内分泌细胞(β细胞和α细胞)以及原代人肝细胞中发挥良好作用。它们与极强遍在启动子cmv和cag的强度相当。
8.启动子可与质粒和病毒载体一起使用。启动子可允许在单链aav中插入约4kb转基因以及在自身互补aav中插入约1.6kb转基因。对于自身互补载体，大小优势特别显著。
附图说明
9.图1a描绘了分化为β样细胞的人胚胎干(es)细胞的显微镜图像。上方分图描绘了在示例性ins84启动子下用表达mrfp的aav
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kp1转导的细胞的图像。下方分图描绘了未用aav转导的细胞。左侧分图显示了es
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β样细胞的明视野显微镜图像，而中间分图描绘了表达指示胰岛素表达的绿色荧光蛋白(gfp)的细胞的图像。右侧分图描绘了红色荧光蛋白(rfp)的图像，其表明ins84启动子的转基因表达。
10.图1b是测量rfp和c肽(c
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pep，一种在成熟β细胞中表达的肽)的facs分析的图示。
11.图2描绘了在示例性ins84启动子(左侧分图)或全长胰岛素启动子(右侧分图)下用表达mrfp的aav转导的源自尸体的原代人胰岛的显微镜图像。上方分图描绘了rfp的落射荧光显微镜图像，而下方分图描绘了明视野显微镜图像。
12.图3是用示例性aav
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ins84
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mrfp转导的人胰岛细胞的facs分析图。左侧分图是表示测试的总细胞群中rfp表达的图。右侧分图是表示rfp阳性细胞中c
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pep和胰高血糖素(gcg)的测量值的图。这表明在α和β细胞中都有转基因表达。
13.图4是用示例性aav
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ins84
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mrfp(左侧分图)或aav
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insx1
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mrfp(右侧分图)转导的原代人胰岛细胞的facs分析的图示。上方分图是表示侧向散射相对rfp的测量值的图。下方分图显示了细胞群的定量值。
14.图5描绘了用示例性aav
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ins84
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mrfp转导的人胚胎干细胞衍生的β细胞的显微镜图像。由左至右是明视野显微镜图像、gfp绘图和mrfp绘图。
15.图6是在示例性ins84启动子(左侧分图)下用表达mrfp的aav或在cag启动子(右侧分图)下用表达tdtomato的aav转导的人肝细胞的荧光显微镜图像。
16.图7描绘了用示例性aav
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ins84
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mrfp转导的人胚胎肾细胞(左侧分图)、小鼠胰岛素瘤细胞(中间分图)和小鼠α细胞(右侧分图)中rfp强度的落射荧光显微镜图像。
具体实施方式
17.本披露提供了遍在短启动子元件，其能够在具有医学意义的多种哺乳动物细胞类型中驱动基因表达。它可以与极强遍在启动子cmv和cag的强度相当。
18.本文披露了用于在克隆载体(包括质粒和病毒表达载体)中转录基因和dna元件的启动子。示例启动子(在本文中称为“ins84”)由源自人胰岛素启动子的84个碱基对组成，并且包含核心启动子tata盒和位于转录起始点 1上游的上游caat盒区域。
19.在重组腺相关病毒(aav)载体中测试了ins84的转录活性，用于在基因疗法中的潜在用途。测试的细胞是人胰岛细胞、人胚胎干(es)细胞和由es细胞分化的β细胞、人肝细胞以及几种永生细胞系细胞。ins84在所有测试的细胞中都有活性，可将其潜在地分类为强通用启动子。它在人胰岛的所有细胞类型(包括α、β和其他类型)中表达红色荧光报告转基因mrfp。另外，ins84在胰岛中显示出比全长人胰岛素启动子(363bp)更高的活性。因此，ins84启动子可用作aav介导的基因表达和其他表达载体的有用工具。
20.如本文所用，“启动子”涵盖指导rna聚合酶结合从而促进rna合成的dna序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白或多肽表达可能遍在，这意味着在多种细胞、组织和物种中具有很强的活性或者具有细胞类型特异性、组织特异性、或物种特异性。启动子可以是“组成型”的，意味着活性持续，或“诱导型”的，意味着启动子可以通过生物或非生物因素的存在或不存在来激活或失活。
21.如本文所用，“同一性”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分比。术语“实质同一性”在指核酸或其片段时表示，当与另一核酸(或其互补链)以适当的核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，比对序列的核苷酸序列同一性为约90％至100％。术语“实质同一性”在指多肽或其片段时表示，当与另一多肽以适当的缺口、插入或缺失进行最佳比对时，比对序列的核苷酸序列同一性为约90％至100％。术语“高度保守”意指至少80％的同一性、优选至少90％的同一性、更优选大于97％的同一性。在某些情况下，高度保守可以指100％的同一性。本领域技术人员通过例如使用本领域技术人员已知的算法和计算机程序来容易地确定同一性。
22.如本文所述，使用多种公开或商购可得的多序列比对程序(如“clustal w”，其可通过互联网上的web服务器访问)中的任一种进行核酸或多肽序列间的比对。可替代地，也可以使用vector nti实用程序。还有许多本领域已知的算法可用于测量核苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的那些算法。
23.多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这意味着当比对时，当比较两个序列时碱基或氨基酸的百分比是相同的。序列相似性可以通过多种不同方式确定。为了确定序列同一性，可以使用通过万维网ncbi.nlm.nih.gov/blast/获得的方法和计算机程序(包括blast)比对序列。另一比对算法是fasta，可从美国威斯康辛州麦迪逊(madison,wis.,usa)的遗传学计算机集团(genetics computing group，gcg)软件包中获得，该集团是牛津分子集团公司(oxford molecular group,inc.)的一个全资子公司。用于比对的其他技术在以下文献中描述：methods in enzymology[酶学方法],第266卷:computer methods for macromolecular sequence analysis[大分子序列分析的计算机方法](1996),doolittle编辑,academic press,inc.[美国学术出版社](哈考特
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布雷斯公司(harcourt brace&co.)的一个部门),美国加利福尼亚州圣地亚哥市。特别令人感兴趣的是允许序列中存在缺口的比对程序。史密斯
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沃特曼算法(smith
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waterman)是一种允许序列比对中存在缺口的算法。参见meth.mol.biol.[分子生物学方法]70:173
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187(1997)。此外，使用尼德曼(needleman)和翁施(wunsch)比对方法的gap程序可用于比对序列。参见j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443
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453(1970)。
[0024]
在特定的实施例中，本文披露的启动子包含seq id no.1的序列或与seq id no.1具有80％同一性的序列；并且该启动子不包含组织特异性转录因子结合位点序列。在一些实施例中，启动子与seq id no.1具有至少85％的序列同一性、至少90％的序列同一性、至少95％的序列同一性、至少98％的序列同一性、或至少99％的序列同一性。在一些实施例中，启动子包含少于200个核苷酸、少于150个核苷酸、少于100个核苷酸、少于90个核苷酸、或具有84个核苷酸。特别地，启动子包含具有80至89个核苷酸、90至99个核苷酸、100至149个核苷酸或150至199个核苷酸。
[0025]
表达载体可包含本文所述的启动子元件。表达载体可以是质粒或病毒载体，如aav载体、单链aav、自身互补aav、腺病毒、莫洛尼鼠肉瘤病毒、鼠干细胞病毒、人类免疫缺陷病毒、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、委内瑞拉马脑炎病毒、昆津病毒(kunjinvirus)、西尼罗河病毒、登革病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、痘苗病毒、巨细胞病毒、或柯萨奇病毒。如本文所用，术语“aav载体”意指包含或衍生自aav组分并适合感染哺乳动物细胞(包括多种组织类型(如脑、心脏、肺、骨骼肌、肝脏、肾脏、脾脏或胰腺)中任一种的人细胞，无论是体外还是体内)的任何载体。术语“aav载体”可用于指包含编码目的蛋白的核酸分子的aav型病毒颗粒(或病毒粒子)。
[0026]
此外，本文披露的aav可源自各种血清型，包括血清型的组合(例如，“假型(pseudotyped)”aav)，或源自各种基因组(例如，单链或自身互补aav)。在特定的实施例中，本文披露的aav载体可编码所需蛋白或蛋白变体。
[0027]
在特定的实施例中，病毒载体进一步包含至少3.7kb转基因、至少3.8kb转基因、至少3.9kb转基因、或至少4.0kb转基因。在一些实施例中，衣壳包含本文所述的病毒载体。
[0028]
在raav载体中使用最广泛的强遍在启动子(cmv、cag等)是相当大的(约1,000bp)。鉴于raav的包装极限，就可以表达的转基因而言这是受限的。aav的包装极限为约4.8kb。减去当前使用的启动子后，单链aav中的转基因仅留下约3.7kb，而自身互补raav仅留下约1.2kb。本文披露的启动子可允许在单链aav中插入约4kb转基因以及在自身互补aav中插入约1.6kb转基因，连同插入两个反向末端重复序列(itr)和polya转录终止信号序列。在一些
实施例中，单链aav包含约3.75kb至约4.6kb转基因、约3.8kb至约4.6kb转基因、约3.9kb至约4.6kb转基因、或约4.0kb至约4.6kb转基因。在一些实施例中，自身互补raav包含约1.15kb至约2.0kb转基因、约1.2kb至约2.0kb转基因、约1.3kb至约2.0kb转基因、约1.4kb至约2.0kb转基因、或约1.5kb至约2.0kb转基因。
[0029]
然而，在一些实施例中，单链aav或自身互补raav进一步包含本文所述的启动子。在一些实施例中，进一步包含启动子的单链aav或自身互补raav包含控制元件或控制序列。
[0030]
本文还描述了制备单链aav的方法，该单链aav包含约3.75kb至约4.6kb转基因、约3.8kb至约4.6kb转基因、约3.9kb至约4.6kb转基因、或约4.0kb至约4.6kb转基因，该方法包括与病毒载体一起使用或插入本文所述的启动子。本文还描述了制备自身互补raav的方法，该自身互补raav包含约1.15kb至约2.0kb转基因、约1.2kb至约2.0kb转基因、约1.3kb至约2.0kb转基因、约1.4kb至约2.0kb转基因、或约1.5kb至约2.0kb转基因，该方法包括与病毒载体一起使用或插入本文所述的启动子。
[0031]
提供了增强哺乳动物细胞中的基因表达的方法，该方法包括使用本文所述的启动子促进特定基因的表达。哺乳动物细胞可以是人细胞。在特定的实施例中，人哺乳动物细胞可以是胰腺内分泌细胞、胰腺内分泌α细胞、胰腺内分泌β细胞、人胰岛β细胞、肝细胞、或原代人肝细胞。病毒载体的开发提高了病毒在各种器官和组织中的转导效率。病毒载体可以成为临床应用中很有前景的基因递送工具，并且可以开发用于将基因递送至细胞。将基因递送至细胞的其他方式是本领域公知且在本领域中描述的，包括各种转染技术。转染和转导方法可导致dna在宿主细胞中的瞬时或稳定表达。病毒载体可以是整合型载体或非整合型载体。例如，一些慢病毒载体具有整合能力，而一些aav载体可以以附加体(episomal)的形式存在于细胞中。病毒载体可提供瞬时的、短期到长期的转基因表达。在一些实施例中，经修饰的细胞可包含本文所述的启动子。
[0032]
实例
[0033]
以下实例仅用于说明。根据本披露，本领域技术人员将认识到，无需进行过多实验就可以实现这些实例以及所披露主题的其他实施例的变体。
[0034]
实例1
‑
细胞、病毒载体和抗体材料
[0035]
非糖尿病供体的人胰岛获自希望之城(city of hope)的综合胰岛分配计划(integrated islet distribution program，iidp)。人肝细胞获自俄勒冈健康与科学大学(oregon healthand science university)，由grompe实验室的bin li博士提供。抗体小鼠抗胰高血糖素(gcg)抗体和大鼠抗c肽(c
‑
pep)分别用于标记α和β细胞。人胰岛培养基和原代培养肝细胞培养基的方案在grompe实验室得到了很好的确立。全长胰岛素启动子(seq id no:2)获自宾夕法尼亚大学klaus kaestner博士的实验室。含有cag
‑
tdtomato的aav由ohsu病毒载体中心(viral vector core)生产。
[0036]
实例2
‑
克隆
[0037]
含有ins84(seq id no:1)启动子和胰岛素全长启动子(称为insx1)的aav载体被克隆到具有红色荧光报告转基因(mrfp)的单链aav(ssaav)载体中。ins84序列位于更大的insx1序列内。使用单链dna的合成寡聚体通过形成双链体dna随后插入ssaav载体来克隆ins84 dna片段。
[0038]
实例3
‑
aav生产
[0039]
aav生产使用标准方法。简而言之，大量培养hek293细胞。汇合后，通过聚乙烯亚胺(pei)方法用三个质粒(编码启动子
‑
mrfp的ssaav质粒、来自腺病毒的辅助质粒和rep/cap质粒pkp1(mark kay实验室))转染hek293细胞。转染五天后，从细胞培养基中收集新包装和释放的aav。然后使用peg8000浓缩aav并储存在
‑
80℃。
[0040]
实例4
‑
人胰岛中的启动子活性
[0041]
将500个人胰岛/样本与aav混合，目标感染复数(moi)为105。转导在4℃下进行1小时。然后将胰岛置于含有人胰岛培养基的24孔悬浮培养板的孔中。然后将胰岛在37℃下在加湿的co2培养箱中孵育4天。如图2所示，使用倒置落射荧光显微镜记录胰岛的rfp表达。转基因mrfp在ins84(图2，左侧分图)和胰岛素363bp(insx1)启动子下从aav表达。
[0042]
在对胰岛细胞进行facs分析之前，使用胰蛋白酶将胰岛解离成单个细胞并固定在4％多聚甲醛中。然后将细胞用0.1％皂苷/pbs透化，用于抗体的内化。然后将一抗添加到解离的胰岛细胞中。大鼠抗c肽用作β细胞标记物，以标记胰岛素原切割产物c肽。α细胞产生并分泌胰高血糖素(gcg)，在本实验中，胰高血糖素与小鼠抗gcg用于标记α细胞。二抗alexa
‑
488和alexa
‑
647分别用于标记抗c
‑
pep和抗gcg。如图3所示，使用symphony流式细胞仪进行facs分析，并使用flowjo软件分析数据。
[0043]
将总细胞群的rfp阳性细胞和rfp细胞分为α和β细胞组进行数据分析。α和β细胞是胰岛中的两种主要细胞类型，占总群体的约80％。因此，在我们的分析中，胰岛细胞分为三组，即α、β和其他细胞组。
[0044]
实例5
‑
具有ins84和insx1(胰岛素全长启动子)活性的aav的比较分析
[0045]
用aav
‑
ins84
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mrfp或aav
‑
胰岛素全长启动子(insx1)转导人胰岛，moi为105。培养4天后，胰岛被解离并固定用于α和β细胞标记物的胞内染色。facs分析显示，与具有更强rfp强度的insx1的aav(10.3％)相比，具有ins84启动子的aav(57.4％)更有效地转导胰岛细胞群(参见图4)。数据来自代表性实验。单个细胞的rfp强度显示在点阵图(561
‑
a)的rfp轴中。rfp强度取决于细胞中存在的rfp蛋白分子的数量。因此，高rfp强度反映了大量mrna分子，并相应表明了强启动子。大多数rfp细胞在ins84细胞中检测到的范围在103到104之间，在insx1细胞中检测到的范围在102到103之间。这些数据表明ins84的活性比insx1的活性高约10倍。
[0046]
实例6
‑
人es细胞中的ins84启动子活性
[0047]
由我们的合作者加利福尼亚大学旧金山分校的matthias hebrok博士和youngjin kim博士进行es细胞中的aav转导。es细胞在胰岛素启动子的下游具有gfp基因的基因组整合。胰岛素基因仅在β细胞中表达。在细胞分化过程中确定β细胞的特征后，胰岛素启动子变得活跃，从而从这些细胞中表达gfp。简而言之，如下进行aav测试。富集es细胞，并且将球体在β细胞分化培养基中孵育20天。通过facs分选完全分化的β细胞以选择表达gfp的细胞。然后用aav
‑
ins84
‑
mrfp转导这些细胞(eβ细胞)，moi为105。如图5所示，转导后四天，固定细胞，用抗c
‑
pep和抗gcg标记抗体，然后通过facs分析细胞。人胚胎干(es)细胞分化为β样细胞。gfp基因仅在β细胞中从来自染色体的胰岛素基因启动子表达。用ins84启动子转导aav在所有eβ细胞中以高强度表达mrfp。还显示了在ins84启动子下用表达mrfp的aav kp1转导的eβ细胞，其中大多数细胞是rfp阳性的(参见图1a和1b)。
[0048]
实例7
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人肝细胞中的ins84启动子活性
[0049]
人肝细胞测试由grompe实验室的bin li博士进行。按照实验室标准方案，将供体肝脏细胞解离并接种到24孔板的孔中。将aav、aav
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ins84
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mrfp和aav
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cag
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tdtomato添加到孔中至moi为105。为了监测和记录细胞生长过程中来自转基因的红色荧光，将培养板置于37℃下加湿的co2培养箱中，该培养箱在ohsu的高级光学显微镜中心(advanced light microscopy core)中配备有自动显微镜(培养箱显微镜)。第5天培养物的图像显示在图6中。在人肝细胞原代培养物中将ins84启动子与cag启动子进行比较。具有ins84启动子的aav表达mrfp，具有cag启动子的aav表达tdtomato。表达水平同样强。
[0050]
实例8
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细胞系中的ins84启动子活性
[0051]
细胞系在它们各自的培养条件下生长。在aav转导前一天，将细胞接种于12孔中至细胞密度为50％。为了转导，将aav
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ins84
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mrfp直接添加到培养基中至moi为105。如图7所示，在第4天至第6天期间使用倒置落射荧光显微镜拍摄图像。用aav
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ins84
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mrfp转导细胞系细胞。虽然rfp强度不同，但ins84在所有测试的细胞中都有活性。这些差异可能是由于细胞表面病毒受体的可用性或不同细胞类型中启动子活性的差异造成的，这在其他已知启动子中常见。