流通池上的三维聚合物结构的制作方法

流通池上的三维聚合物结构
1.相关申请
2.本技术要求2019年11月27日提交的名称为“on
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flow cell three
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dimensional polymer structures”的美国临时专利申请号62/941,197的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
3.本技术还要求2019年11月27日提交的名称为“on
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flow cell three
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dimensional sequencing matrices”的美国临时专利申请号62/941,215的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
4.本技术还要求2019年11月27日提交的名称为“on
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flow cell three
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dimensional polymer structures having functionalized surfaces”的美国临时专利申请号62/941,242的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
5.本技术还要求2019年12月20日提交的名称为“on
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flow cell three
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dimensional polymer structures”的荷兰专利申请号n2024527的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
6.本技术还要求2019年12月31日提交的名称为“on
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flow cell three
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dimensional sequencing matrices”的荷兰专利申请号n2024596的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
7.本技术还要求2019年12月20日提交的名称为“on
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flow cell three
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dimensional polymer structures having functionalized surfaces”的荷兰专利申请号n2024528的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
8.电子格式的序列表
9.本技术连同电子格式的序列表一起提交。序列表以创建于2020年11月20日且在当日最后一次保存的名称为illumina0737385sequencelisting_st25.txt的文件提供，该文件的大小为1千字节。序列表的电子格式的信息全文以引用方式并入本文。


背景技术：

10.下一代测序(“ngs”)是能够以快速且高性价比的方式对整个基因组进行测序的高通量测序技术。在至少一种实施方式中，ngs始于创建测序文库，该测序文库包括已随机片段化、提取和纯化的基因组dna。然后，可以利用ngs方法(诸如边合成边测序)对整个基因组文库进行大规模平行测序。单细胞测序对单细胞的基因组和转录组中的变化进行解码，从而有助于阐明健康和疾病两者的潜在机制。关于细胞间变化的许多问题需要对数百个至数千个细胞进行测序。然而，高通量单细胞测序可能受到处理数百个至数千个单细胞同时实现(i)有效的文库制备、(ii)对文库分子的索引以及(iii)最小损失中的困难的限制。区室化策略可以通过在独立的区室中分配单细胞来克服这些挑战，这些独立的区室不但(i)将细胞彼此分离，而且(ii)允许有效的试剂交换，使得文库制备可以跨数百个至数千个样品并行地发生并且无交叉污染。
11.一些ngs平台可以依赖于对表面结合的核酸簇的光学询问，并且以相当静态的速
率和每个基因组比较显著的成本产生数据。增加核酸测序方法的通量对于降低测序成本和提高总体测序准确性可能是重要的。这种期望的结果可以能够通过对更多数量的核酸簇进行测序来实现。因此，在一些情况下，可以实施更大的流通池表面积或更高的簇密度，以增加可以测序的簇的数量。然而，就测序流通池接近尺寸和簇密度的极限而言，使用传统的表面结合测序方法对通量进行显著改进可能越来越具有挑战性。因此，克服这些限制将是有益的。
12.在一些情况下，通过全基因组测序生成的大量数据可能使数据处理和分析复杂化。因此，作为变通方案，可以使用各种技术富集基因组的多个部分，以聚焦于感兴趣的基因或其他特定的感兴趣靶标。然而，一些目前用于文库制备和文库富集的方法可能需要多次手动操作和试剂转移，这导致靶向文库的损失。因此，用于减轻与当前的测序文库制备和富集方法相关联的损失的自动化系统和方法可能是有益的；并且公开于本文中。


技术实现要素：

13.以下提供了某些示例的概述。本发明内容不是广泛的概述，并且不旨在识别本发明所公开的系统、装置和方法的关键或重要方面或要素，也不旨在界定它们的范围。应当理解，如本文所述的本公开的每个方面的任何相应特征/示例可以以任何组合一起实施以实现如本文所述的结果，并且来自这些方面中的任何一个或多个方面的任何特征/示例可以与如本文所述的其他方面的任何特征一起以任何组合实施以实现如本文所述的有益效果。
14.一种实施方式涉及用于制备流通池上的三维聚合物结构的方法，包括：将聚合物前体溶液装载到流通池上，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂和光引发剂，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；以及使用波长足以活化光引发剂的光，透过图案化光掩模照射所述聚合物前体溶液，其中所述光引发剂的活化使所述图案化光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液中的至少一些聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构。
15.存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括将未聚合的聚合物前体溶液从所述流通池中洗出。
16.存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使用热、切割用化学品或者热和切割用化学品的组合从所述流通池切割所述三维聚合物结构中的至少一些。
17.存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池在所述至少一个通道的上部表面和下部表面两者上具有预定长度的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸包括引物。
18.存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物为水凝胶。
19.存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0020][0021]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0022]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0023][0024]
其中：
[0025]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0026]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0027]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或它们的组合。
[0028]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为丙烯酰胺，所述交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)，并且所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。
[0029]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯、乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。
[0030]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)，或它们的组合。
[0031]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模包括聚对苯二甲酸乙二醇酯、碳墨、化学蚀刻的金属膜或它们的组合。
[0032]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模层合至所述流通池的上部外表面。
[0033]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中照射所述聚合物前体包括使用紫外光源来发射光。
[0034]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为圆柱形的。
[0035]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为倒c形的。
[0036]
另一种实施方式涉及用于制备流通池上的三维聚合物结构的方法，包括：将聚合物前体溶液装载到流通池上，其中所述聚合物前体溶液包含含有遗传物质的生物细胞或生物细胞集落、单体、交联剂和光引发剂，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面，并且其中引物结合到所述至少一个通道的上部表面和下部表面两者；以及使用发射活化所述光引发剂的波长的光的光源，透过图案化光掩模照射所述聚合物前体溶液，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液中的至少一些聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构，并且其中所述生物细胞或生物细胞集落在所述三维聚合物结构中区室化。
[0037]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括将未聚合的聚合物前体溶液从所述流通池中洗出。
[0038]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括将试剂扩散到所述三维聚合物结构中，其中所述试剂包括裂解生物细胞并从中释放遗传物质的裂解试剂，并且其中所述遗传物质包括核酸。
[0039]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使所释放的核酸片段化，并且将衔接子连接到核酸片段的末端。
[0040]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括通过以下方式将所述核酸片段接种在至少一个测序通道的上部表面和下部表面上：将扩散阻挡层引入所述至少一个通道中，将所述流通池加热到切割所述聚合物结构并从中释放所述核酸片段的温度，使所述核酸片段与所述至少一个通道的上部表面和下部表面上的寡核苷酸杂交，以及将切割的聚合物结构从所述流通池中洗出。
[0041]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使用桥式扩增来克隆扩增所述杂交的核酸，以产生核酸簇。
[0042]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物为水凝胶并且其中所述扩散阻挡层包括疏水性液体或粘稠的水性溶液，其中所述疏水性液体包括矿物油、硅油或全氟化油，或者它们的组合，并且其中所述粘稠的水性溶液包含聚乙二醇(peg)、聚乙烯基吡咯烷酮、普兰尼克葡聚糖、蔗糖、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷
‑
聚环氧丙烷
‑
聚环氧乙烷、peo
‑
ppo
‑
peoyiaponite，或它们的组合。
[0043]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0044]
[0045]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0046]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0047][0048]
其中：
[0049]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0050]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0051]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或它们的组合。
[0052]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为丙烯酰胺，所述交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)，并且所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。
[0053]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。
[0054]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0055]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模为聚对苯二甲酸乙二醇酯、碳墨或化学蚀刻的金属膜。
[0056]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模层合至所述流通池的上部外表面。
[0057]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光源为紫外光源。
[0058]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为圆柱形的。
[0059]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为倒c形的。
[0060]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述生物细胞为哺乳动物的细胞。
[0061]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述生物细胞为细菌的细胞。
[0062]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述核酸为脱氧核糖核酸。
[0063]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述核酸为核糖核酸。
[0064]
另一种实施方式涉及用于制备流通池上的三维聚合物结构的方法，包括：将水凝胶前体溶液装载到流通池上，其中所述水凝胶前体溶液包含含有遗传物质的生物细胞或生物细胞集落、单体、交联剂和光引发剂，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面，并且其中引物结合到所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面两者；使用发射活化所述光引发剂的波长的光的光源，透过图案化光掩模照射所述水凝胶前体溶液，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述水凝胶前体溶液的至少一些聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维水凝胶结构，并且其中所述生物细胞或生物细胞集落在所述三维水凝胶结构中区室化；将裂解试剂扩散到所述三维水凝胶结构中，其中所述裂解试剂裂解所述生物细胞并从中释放遗传物质，并且其中所述遗传物质包括核酸；使所释放的核酸片段化，并且将衔接子连接到所述片段的末端；以及通过以下方式将所述核酸片段接种在所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面上：将扩散阻挡层引入所述至少一个通道中，其中所述扩散阻挡层防止水凝胶结构之间的交叉污染，将所述流通池加热到切割所述水凝胶结构并释放所述核酸片段的温度，使所述核酸片段与所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面上的引物杂交，以及将经切割的水凝胶结构从所述流通池中洗出；以及克隆扩增所述杂交的核酸片段，以产生用于测序的簇。
[0065]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0066][0067]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0068]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0069][0070]
其中：
[0071]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0072]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0073]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺
酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或它们的组合。
[0074]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为丙烯酰胺，所述交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)，并且所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。
[0075]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述水凝胶前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。
[0076]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述水凝胶前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0077]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述扩散阻挡层包括疏水性液体或粘稠的水性溶液，其中所述疏水性液体包括矿物油、硅油或全氟化油，或者它们的组合，并且其中所述粘稠的水性溶液包含聚乙二醇(peg)、聚乙烯基吡咯烷酮、普兰尼克葡聚糖、蔗糖、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷
‑
聚环氧丙烷
‑
聚环氧乙烷、peo
‑
ppo
‑
peoyiaponite，或它们的组合。
[0078]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模为聚对苯二甲酸乙二醇酯、碳墨或化学蚀刻的金属膜，并且其中所述光掩模层合至所述流通池的上部外表面。
[0079]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光源为紫外光源。
[0080]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述水凝胶结构为圆柱形的。
[0081]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述水凝胶结构为倒c形的。
[0082]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述生物细胞为哺乳动物的细胞。
[0083]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述生物细胞为细菌的细胞。
[0084]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述核酸为脱氧核糖核酸。
[0085]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述核酸为核糖核酸。
[0086]
另一种实施方式涉及流通池，该流通池包括：通道，其中所述通道包括具有涂覆在其上的引物的上部内表面和具有涂覆在其上的引物的下部内表面；以及在所述通道中的由
聚合物前体溶液形成的可逆、可渗透的三维聚合物结构，其中所述三维聚合物结构从所述通道的上部内表面延伸到所述通道的下部内表面。
[0087]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池还包括放置在所述通道的外部外表面上方的光掩模。
[0088]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为圆柱形的、倒c形的、管状的，或它们的组合。
[0089]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构包括水凝胶。
[0090]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池、聚合物前体溶液和光掩模在套件中提供。
[0091]
另一种实施方式涉及用于制备流通池上的三维测序基质的方法，包括：将寡核苷酸包埋在可渗透的三维基质内，其中所述寡核苷酸促进所述基质内的核酸片段克隆扩增；将所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质引入流通池中，其中所述流通池包括用于接收所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质的至少一个通道；以及所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质固定在所述至少一个通道中。
[0092]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包含聚合物。
[0093]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质为水凝胶。
[0094]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括预定尺寸的水凝胶网络。
[0095]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括相同尺寸颗粒或不同尺寸颗粒的基质。
[0096]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括柱状柱体。
[0097]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括中孔结晶材料。
[0098]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括通过光刻法将所述流通池中的所述可渗透的三维基质图案化。
[0099]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述寡核苷酸适于边合成边测序。
[0100]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池具有内部体积，并且其中所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质占据所述流通池的整个内部体积。
[0101]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括将所述可渗透的三维基质成像在离散的二维层中。
[0102]
另一种实施方式涉及使用流通池上的三维测序基质进行三维测序的方法，包括：将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体和寡核苷酸；使所述聚合物前体溶液聚合，以在所述流通池内产生可渗透的三维基质；将测序文库扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中，其中所述测序文库包括核酸片段；将酶和试剂扩散到所述
可渗透的三维聚合物基质中；使所述核酸片段与所述可渗透的三维聚合物基质中的所述寡核苷酸杂交；克隆扩增所述杂交的核酸片段，以在所述可渗透的三维聚合物基质内产生用于测序的簇；对所述可渗透的三维聚合物基质内的所述簇进行测序；以及将三维基质内的经测序的簇光学成像在多个离散的二维切片中以表征所述测序文库，其中所述多个离散的二维切片表示所述流通池的整个三维内部体积。
[0103]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0104][0105]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0106]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体包括聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。
[0107]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体包括聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0108]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液还包含含有叠氮部分的聚(n
‑
(5
‑
叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
‑
共
‑
丙烯酰胺)(pazam)。
[0109]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述寡核苷酸为适于结合到pazam中的叠氮部分的炔连接的寡核苷酸。
[0110]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述寡核苷酸适于边合成边测序。
[0111]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括水凝胶。
[0112]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括预定尺寸的水凝胶网络。
[0113]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括相同尺寸颗粒或不同尺寸颗粒的基质。
[0114]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括柱状柱体。
[0115]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述柱状柱体被制造为在z方向上包括交替的材料。
[0116]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中光学成像包括使用共焦显微镜、多光子或光片照明显微镜。
[0117]
另一种实施方式涉及使用流通池上的三维测序基质进行三维测序的方法，包括：将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和寡核苷酸；使用紫外光使所述聚合物前体溶液聚合，以在所述流通池内产生可渗透的三维基质；将测序文库扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中，其中所述测序文库包括已添加衔接子的核酸片段；将酶和试剂扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中；使所述核酸片段与所述可渗透的三维聚合物基质中的所述寡核苷酸杂交；克隆扩增所述杂交的核酸片段，以在所述可渗透的三维聚合物基质内产生用于测序的簇；对所述可渗透的三维聚合物基质内的所述簇进行测序；以及使用共焦显微镜、多光子或光片照明显微镜将所述三维基质内的经测序的簇成像在多个离散的二维切片中以表征所述测序文库，其中所述多个离散的二维切片表示所述流通池的整个三维内部体积。
[0118]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0119][0120]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0121]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0122][0123]
其中：
[0124]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0125]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0126]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或它们的组合。
[0127]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体包括聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶
原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。
[0128]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体包括聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0129]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)、重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐或双酰基氧化膦(bapo)盐。
[0130]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液还包含叠氮部分已结合到其上的聚(n
‑
(5
‑
叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
‑
共
‑
丙烯酰胺)(pazam)。
[0131]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述寡核苷酸为适于结合到pazam中的叠氮部分的炔连接的寡核苷酸。
[0132]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述寡核苷酸适于边合成边测序。
[0133]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括水凝胶。
[0134]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括预定尺寸的水凝胶网络。
[0135]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括相同尺寸颗粒或不同尺寸颗粒的基质。
[0136]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述可渗透的三维基质包括柱状柱体，并且其中所述柱状柱体被制造为在z方向上包括交替的材料。
[0137]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中在添加衔接子之后将已添加所述衔接子的核酸片段环化，以产生纳米球。
[0138]
另一种实施方式涉及套件，该套件包括：流通池，其中所述流通池包括至少一个通道；以及含有寡核苷酸的可渗透的三维基质，其中所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质适于被引入所述至少一个通道中并且随后固定在其中。
[0139]
另一种实施方式涉及用于制备流通池上的具有官能化表面的三维聚合物结构的方法，包括：将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和官能化聚合物，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；以及用波长活化所述光引发剂的光透过光掩模照射所述聚合物前体溶液，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔，其中所述光掩模已放置在所述通道的外表面上方，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液中的至少一些聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构。
[0140]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使具有第一末端和第二末端的双官能接头与所述官能化聚合物反应，其中所述双官能接头的所述第一末端以化学或酶促方式附接到所述官能化聚合物，并且其中所述双官能接头的所述第二末端选择性地结合预定类型的分子。
[0141]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述官能化聚合物为含有叠氮部分的聚(n
‑
(5
‑
叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
‑
共
‑
丙烯酰胺(pazam)，并且其中所述双官能接头为生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物，并且所述方法还包括使用叠氮
‑
炔烃点击反应使所述生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物与所述pazam中的叠氮部分反应。
[0142]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使链霉亲和素与生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物中的生物素结合。
[0143]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使生物素化的捕获寡核苷酸与所述链霉亲和素结合，其中所述生物素化的捕获寡核苷酸对测序文库中的感兴趣的靶标具有特异性。
[0144]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括将未聚合的聚合物前体溶液从所述流通池中洗出。
[0145]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述方法还包括使用热、切割用化学品或者热和切割用化学品的组合从所述流通池切割所述三维聚合物结构中的至少一些。
[0146]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池具有预定长度的寡核苷酸以及与所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面两者结合的序列，并且其中所述寡核苷酸包括适于核酸扩增的引物。
[0147]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中聚合物为水凝胶。
[0148]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0149][0150]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0151]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0152][0153][0154]
其中：
[0155]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0156]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0157]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或它们的组合。
[0158]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为丙烯酰胺，所述交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)，并且所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。
[0159]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或者它们的组合或混合物。
[0160]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0161]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模为聚对苯二甲酸乙二醇酯。
[0162]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模层合至所述流通池的上部表面。
[0163]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中照射所述聚合物前体溶液包括使用紫外光源。
[0164]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为圆柱形的。
[0165]
另一种实施方式涉及用于制备流通池上的具有官能化表面的三维聚合物结构的方法，包括：将水凝胶前体溶液装载到流通池中，其中所述水凝胶前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和含有叠氮部分的pazam，并且其中所述流通池包括用于接收所述水凝胶前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；以及使用活化所述光引发剂的波长的光，透过所述光掩模照射所述水凝胶前体溶液，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述水凝胶前体溶液的至少一些聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维水凝胶结构；使用叠氮
‑
炔烃点击反应使生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物与所述三维聚合物结构中的pazam中的叠氮部分反应；使链霉亲和素与所述生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物中的生物素结合；以及使生物素化的捕获寡核苷酸与所述链霉亲和素结合，其中所述生物素化的捕获寡核苷酸对测序文库中的感兴趣的靶分子具有特异性。
[0166]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合
物：
[0167][0168]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0169]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0170][0171]
其中：
[0172]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0173]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0174]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或者它们的组合或混合物。
[0175]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为丙烯酰胺，所述交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)，并且所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。
[0176]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或者它们的组合或混合物。
[0177]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0178]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模包括聚酯膜。
[0179]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模层合至所述流通池的上部表面。
[0180]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光源为紫外光源。
[0181]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为圆柱形的。
[0182]
另一种实施方式涉及用于制备流通池上的具有官能化表面的三维聚合物结构的方法，包括：将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面，并且其中预定长度的寡核苷酸结合到所述至少一个通道的上部表面和下部表面两者；将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；使用活化所述光引发剂的波长的光，透过所述光掩模照射所述聚合物前体溶液，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液中的至少一些聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构；使生物素化的捕获寡核苷酸选择性地与所述三维聚合物结构中的链霉亲和素结合，其中所述生物素化的捕获寡核苷酸对文库中的感兴趣的靶分子具有特异性并且与之结合；以及洗脱所结合的靶分子，并且将洗脱的靶分子接种在所述流通池的其上结合有寡核苷酸的表面上。
[0183]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为式i的化合物：
[0184][0185]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0186]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述交联剂为式ii的化合物：
[0187][0188]
其中：
[0189]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0190]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0191]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光引发剂为重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐；双酰基氧化膦(bapo)盐；或者它们的组合或混合物。
[0192]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述单体为丙烯酰胺，所述交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)，并且所述光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)。
[0193]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)、peg、聚
环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯，或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或者它们的组合或混合物。
[0194]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述聚合物前体溶液包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇/peg
‑
丙烯酸酯；丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)；peg/聚环氧丙烷(ppo)；或它们的组合。
[0195]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模为聚对苯二甲酸乙二醇酯。
[0196]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光掩模层合至所述流通池的上部表面。
[0197]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述光源为紫外光源。
[0198]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构为圆柱形的。
[0199]
另一种实施方式涉及流通池，该流通池包括：通道，其中所述通道包括具有涂覆在其上的引物的上部内表面和具有涂覆在其上的引物的下部内表面；以及在所述通道中的由聚合物前体溶液形成的可逆、可渗透的三维聚合物结构，其中所述三维聚合物结构从所述通道的上部内表面延伸到所述通道的下部内表面。
[0200]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池还包括放置在所述通道的外部外表面上方的光掩模。
[0201]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述三维聚合物结构包括水凝胶。
[0202]
存在关于上述实施方式中的任何一者或多者的变化，其中所述流通池、聚合物前体溶液和光掩模在套件中提供。
[0203]
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分并且可以被实施以实现如本文所述的有益效果。在阅读并理解以下对示例性实施方案的详细描述后，本发明所公开的系统、装置和方法的附加特征和方面对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。如技术人员将理解的，在不脱离本文所公开的范围和实质的情况下，另外的实施方式是可能的。因此，附图和相关描述应被视为例示性的而非限制性的。
附图说明
[0204]
一个或多个具体实施的细节在附图和下文的描述中进行阐述。根据说明书、附图和权利要求书，其他特征、方面和优点将变得显而易见，其中：
[0205]
图1a是根据本发明所公开的系统和方法的一种实施方式的流通池的透视图；
[0206]
图1b是图1a的流通池的顶视图和特写顶视图，其中水凝胶结构的阵列已在该流通池上形成；
[0207]
图1c描绘了被正确插入边合成边测序过程中所使用的盒中的图1a的流通池；
[0208]
图2a描绘了本发明所公开的系统和方法用于在流通池(诸如图1a中所示的流通池)上形成聚合物(例如，水凝胶)结构的一个示例，其中聚合物前体溶液已被引入流通池的流体通道中，并且预图案化的光掩模已被放置在所述通道的上方；
[0209]
图2b描绘了本发明所公开的系统和方法用于在流通池上形成聚合物(例如，水凝胶)结构的一个示例，其中紫外光透过光掩模中的开口被引导到流通池的通道中，用于使聚合物前体溶液的内容物聚合；
[0210]
图2c描绘了在流通池的通道内形成的水凝胶结构的阵列，其中水凝胶结构具有圆柱形的形状并且附接到通道的上部内表面和下部内表面；
[0211]
图2d描绘了通过将含有切割剂的油引入流通池的通道中来切割形成于流通池的通道中的水凝胶结构的示例性方法；
[0212]
图2e描绘了通过洗涤流通池的通道来从该通道移除经切割的水凝胶结构的示例性方法；
[0213]
图3a描绘了本发明所公开的系统和方法用于在测序流通池上形成聚合物(例如，水凝胶)结构的另一个示例中的第一步骤，其中将预图案化的光掩模放置在流通池上或附接到流通池，然后将流通池插入盒中；
[0214]
图3b描绘了本发明所公开的系统和方法用于在测序流通池上形成聚合物(例如，水凝胶)结构的另一个示例中的第二步骤，其中将含有生物细胞的聚合物前体溶液装载到图3a的流通池中，然后使用可延伸托盘将流通池装载到装置或仪器中；
[0215]
图3c描绘了本发明所公开的系统和方法用于在测序流通池上形成聚合物(例如，水凝胶)结构的另一个示例中的第三步骤，其中使流通池暴露于紫外光以在流通池上形成水凝胶结构的阵列(其在明视场显微照片中示出)，并且其中随后洗涤流通池以移除未聚合的材料并将流通池从仪器卸下；
[0216]
图4a描绘了本发明所公开的系统和方法用于细胞封装和原位制备测序文库的一个示例，其中将单细胞或细胞集落与聚合物前体溶液混合并装载到流通池中，然后用紫外光透过光掩模照射以在流通池上产生包埋细胞的水凝胶结构(例如，柱)的阵列，其在明视场显微照片中示出；
[0217]
图4b描绘了本发明所公开的系统和方法用于细胞封装和原位制备测序文库的一个示例，其中裂解试剂和标签化试剂扩散到图4a的水凝胶结构中，并且其中细胞随后在水凝胶结构内裂解并被标签化；
[0218]
图4c描绘了本发明所公开的系统和方法用于细胞封装和原位制备测序文库的一个示例，其中将图4b的文库接种到流通池的顶部表面和底部表面上，方式为将油引入流通池中并且升高温度以释放包含在水凝胶结构中的文库片段，然后将所述文库片段与附接至流通池表面的表面引物杂交；
[0219]
图4d描绘了本发明所公开的系统和方法用于细胞封装和原位制备测序文库的一个示例，其中然后使用用于产生簇的桥式扩增方法来克隆扩增图4c的杂交的文库片段；
[0220]
图5a是使用本发明所公开的系统和方法的另选型式形成于流通池上的用于在流
通池上捕获细胞以原位制备文库的一组水凝胶结构的侧视图，其中所述水凝胶结构具有倒c形几何形状；
[0221]
图5b为图5a的细胞捕集水凝胶特征部的若干顶视图，示出了其倒c形几何形状；
[0222]
图5c为图5a的水凝胶结构的侧视图，示出了在每个水凝胶结构中捕获的各个细胞；
[0223]
图5d为图5c的水凝胶结构之一的侧视图，示出了捕获在水凝胶结构中的各个细胞以及被引导进入和穿过流通池的含有细胞的流体的方向；
[0224]
图6为流程图，描绘了用于在流通池上制备可逆、可渗透的三维聚合物结构的方法的示例性实施方式；
[0225]
图7为流程图，描绘了使用形成于流通池上的可逆、可渗透的三维聚合物结构对文库制备进行测序的方法的示例性实施方式；
[0226]
图8为流程图，描绘了使用形成于流通池上的可逆、可渗透的三维水凝胶结构对文库制备进行测序的方法的示例性实施方式；
[0227]
图9a至图9b描绘了流通池，该流通池具有位于流通池内的使用光刻法形成的各个水凝胶柱的阵列，其中所述柱包含p5/p7引物并且支持簇在水凝胶基质内的生长；
[0228]
图10a描绘了在miseq
tm
流通池内制造的水凝胶柱，并且图10b至图10k描绘了时间序列图像，其示出荧光染料被引入流通池中、染料扩散到水凝胶柱中，以及染料从水凝胶柱中洗出；
[0229]
图11a至图11b描绘了掺杂有含有p5/p7引物的聚(n
‑
(5
‑
叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
‑
共
‑
丙烯酰胺)(pazam)的水凝胶珠粒，其中所述珠粒最初用测序文库浸泡，然后浸泡在examp中，以在每个珠粒的整个三维体积中产生簇；
[0230]
图12a至图12b描绘了无索引测序，其中每个水凝胶珠粒均含有来自该珠粒在其中温育的样品的簇，其中将含有此类簇的水凝胶珠粒装载于流通池上并测序，并且其中可以使用多种手段将来自每种样品类型的珠粒彼此区分开，所述手段诸如包埋在珠粒中的在测序前移除的荧光团；
[0231]
图13a描绘了测序流通池，其中测序发生在顶部表面和底部表面上的簇的二维网络中，并且其中所述顶部表面和所述底部表面沿z轴隔开已知距离(例如，100μm)；
[0232]
图13b描绘了测序流通池，其中测序发生在顶部表面和底部表面上以及位于顶部表面与底部表面之间的离散区域中的簇的三维网络中，并且其中所述顶部表面和所述底部表面沿z轴隔开100μm的距离；
[0233]
图14描绘了示例性spim设置，其中通过低na物镜将激发递送到样品中，并且其中通过高na发射物镜收集荧光发射；
[0234]
图15描绘了测序流通池内的大水凝胶网络；
[0235]
图16描绘了测序流通池内的大颗粒、小颗粒或者大颗粒和小颗粒的组合的基质；
[0236]
图17描绘了测序流通池内的周期性柱状柱体；
[0237]
图18描绘了测序流通池内的中孔结晶材料；
[0238]
图19a至图19d描绘了通过使pazam 二dbco
‑
peg聚合而在流通池内形成水凝胶的方法的示例性实施方式；
[0239]
图20描绘了丙烯酰胺和经丙烯酰胺基修饰的寡核苷酸共聚成大的聚丙烯酰胺珠
粒；
[0240]
图21a为明视场显微图像，描绘了载玻片上的水凝胶珠粒；
[0241]
图21b为明视场显微图像，描绘了堆积在hiseq
tm
流通池内的水凝胶珠粒；
[0242]
图22a是标准丙烯酰胺珠粒在与染料标记的互补链一起温育后的荧光显微图像；
[0243]
图22b是经寡核苷酸修饰的丙烯酰胺珠粒在与染料标记的互补链一起温育后的荧光显微图像；
[0244]
图23a描绘了水凝胶珠粒，其中长dna片段已被封装捕集在流通池内；
[0245]
图23b描绘了在图23a的经捕集的水凝胶珠粒内进行的用于文库制备的酶促过程；
[0246]
图23c描绘了扩增的文库，其产生在每个水凝胶珠粒内三维分布的链接读段簇；
[0247]
图24a描绘了在携带寡核苷酸的水凝胶珠粒上发生的模板捕获和延伸；
[0248]
图24b描绘了水凝胶珠粒上的文库插入物的克隆扩增，其用于产生簇；
[0249]
图25a描绘了在水凝胶前体溶液中被递送到流通池中的聚簇珠粒；
[0250]
图25b描绘了交联水凝胶基质内的聚簇珠粒的固定，用于在测序和随后的成像期间保持珠粒在三维中的空间位置；
[0251]
图26描绘了具有不同的正交线性化化学性质的二聚体颗粒；
[0252]
图27描绘了用于合成类似的二聚体颗粒的示例性系统；
[0253]
图28a和图28b描绘了使用在z方向上具有交替材料组成的柱状柱体的三维基质在三维中对簇的空间控制；
[0254]
图29a至图29d描绘了用于产生聚合物支架的简化示例性方法，其中用具有预定尺寸分布的盐颗粒将未聚合的单体溶液包埋；其中盐颗粒将单体置换，从而在溶液内产生三维网络；其中使单体溶液聚合，以形成围绕盐颗粒的三维聚合物支架；并且其中盐颗粒溶解，从而产生限定支架的无规三维孔阵列。
[0255]
图30为流程图，描绘了用于在测序流通池上制备可渗透的三维基质的示例性方法；
[0256]
图31为流程图，描绘了用于核酸文库三维测序的第一示例性方法；
[0257]
图32为流程图，描绘了用于核酸文库三维测序的第二示例性方法；
[0258]
图33描绘了在流通池内的通道上形成水凝胶微柱，其中各个水凝胶微柱在明视场显微照片中可见；
[0259]
图34a描绘了用于在流通池上制造水凝胶微柱的示例性方法，其中将包含单体和光引发剂的水凝胶前体溶液引入流通池中；
[0260]
图34b描绘了用于在流通池上制造水凝胶微柱的示例性方法，其中将预图案化的光掩模放置在图34a的流通池上并且用紫外光照射；
[0261]
图34c描绘了用于在流通池上制造水凝胶微柱的示例性方法，其中水凝胶微柱形成于图34a的流通池上，并且其中水凝胶微柱附接到流通池中的通道之一的上部表面和下部表面；
[0262]
图35a描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的示例性方法，其中将含有10％聚丙烯酰胺(pa)、交联剂和其中已掺入叠氮部分的0.25％pazam的水凝胶前体溶液装载到流通池上；
[0263]
图35b描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的示例性方法，其中将包
括形成于其中的多个开孔的光掩模放置在图35a的流通池之上，然后暴露于紫外光10秒以使丙烯酰胺和pazam共聚，并且在流通池的窄通道中形成叠氮官能化的水凝胶微柱的阵列；
[0264]
图35c描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的示例性方法，其中生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物被点击到图35b的水凝胶微柱的叠氮部分上；
[0265]
图35d描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的示例性方法，其中用荧光素标记的链霉亲和素与图35c的水凝胶微柱中的生物素结合；
[0266]
图35e描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的示例性方法，其中链霉亲和素与生物素化的捕获寡核苷酸结合，以使得能够固定靶测序文库分子；
[0267]
图36a描绘了pa/pazam对照(无生物素)的4x明视场显微照片；
[0268]
图36b描绘了pa/pazam加blackpool的4x明视场显微照片；
[0269]
图36c描绘了五分钟反应时间后pa/pazam对照(无生物素)的4x荧光显微照片；
[0270]
图36d描绘了五分钟反应时间后pa/pazam加blackpool的4x荧光显微照片；
[0271]
图36e描绘了在40℃处的十分钟反应时间后pa/pazam对照(无生物素)的4x荧光显微照片；
[0272]
图36f描绘了在40℃处的十分钟反应时间后pa/pazam加blackpool的4x荧光显微照片；
[0273]
图37a描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的另一种示例性方法，其中将含有10％聚丙烯酰胺(pa)和0.25％链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体的水凝胶前体溶液装载到流通池上；
[0274]
图37b描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的另一种示例性方法，其中将包括形成于其中的多个开孔的光掩模放置在图37a的流通池之上，然后暴露于紫外光10秒以使丙烯酰胺链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体共聚，并且在流通池的窄通道中形成链霉亲和素官能化的水凝胶微柱的阵列；
[0275]
图37c描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的另一种示例性方法，其中生物素化的捕获寡核苷酸与图37b的水凝胶微柱中的链霉亲和素部分结合，并且其中靶文库分子杂交到生物素化的捕获寡核苷酸并变得固定在图37b的水凝胶微柱上；
[0276]
图37d描绘了用于在流通池上制造官能化的水凝胶结构的另一种示例性方法，其中将固定的靶分子从图37c的捕获寡核苷酸洗脱并且接种在流通池的宽通道上；
[0277]
图38a描绘了与链霉亲和素官能化的水凝胶微柱结合的生物素化的p5引物和p7引物；
[0278]
图38b描绘了正与tet标记的互补p5’寡核苷酸和p7’寡核苷酸一起温育的图38a的生物素化的p5引物和p7引物；
[0279]
图38c描绘了与生物素化的p5引物和p7引物杂交的图38b的tet标记的互补p5’寡核苷酸和p7’寡核苷酸；
[0280]
图39a为明视场显微照片，示出了在不存在生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸的情况下与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱；
[0281]
图39b为荧光显微照片(488nm激发)，示出了在不存在生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸的情况下与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱，其中观察到p5引物和p7引物在流通池表面上均匀染色；
[0282]
图39c为明视场显微照片，示出了在与生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸一起温育后与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱；
[0283]
图39d为荧光显微照片(488nm激发)，示出了在与生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸一起温育后与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱，其中观察到tet染色定位到水凝胶微柱的边缘，表明tet标记的寡核苷酸已杂交到链霉亲和素结合的生物素化的p5引物和p7引物；
[0284]
图40a为荧光显微照片，描绘了在一分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平；
[0285]
图40b为描绘在一分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平的图；
[0286]
图40c为荧光显微照片，描绘了在五分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平；
[0287]
图40d为描绘在五分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平的图；
[0288]
图40e为荧光显微照片，描绘了在十分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平；
[0289]
图40f为描绘在十分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平的图；
[0290]
图41a描绘了测序文库分子的p7’区域和p5’区域与生物素化的p5寡核苷酸和p7寡核苷酸杂交；
[0291]
图41b描绘了用附接到流通池表面的链霉亲和素官能化的水凝胶柱捕获测序文库分子；
[0292]
图41c描绘了接种结合的测序文库分子，方式为：在85℃处温育以使杂交的生物素化引物变性，然后升温至20℃以允许测序文库分子与表面引物杂交；
[0293]
图42a为未处理的流通池(对照)的明视场显微照片；
[0294]
图42b为sytox染色的未处理的流通池(对照)的荧光显微照片(488nm)，其中未显示簇；
[0295]
图42c为具有链霉亲和素微柱的流通池的明视场显微照片；
[0296]
图42d为具有链霉亲和素微柱的sytox染色的流通池的荧光显微照片(488nm)；
[0297]
图42e为图42c的水凝胶微柱的明视场显微照片；
[0298]
图42f为图42d的sytox染色微柱的荧光显微照片(488nm)；
[0299]
图43a描绘了盒中的流通池，其中链霉亲和素微柱已在流通池的窄通道中形成，而未在流通池的宽通道中形成；
[0300]
图43b为在24个循环的桥式扩增后用sytox染料染色的图43a流通池的宽通道的显微照片；
[0301]
图43c为在24个循环的桥式扩增后用sytox染料染色的图43a流通池的窄通道的显微照片；
[0302]
图44为流程图，描绘了用于在流通池上制备官能化的三维聚合物结构的第一方法；
[0303]
图45为流程图，描绘了用于在流通池上制备官能化的三维聚合物结构的第二方法；并且
[0304]
图46为流程图，描绘了用于在流通池上制备官能化的三维聚合物结构的第三方法。
具体实施方式
[0305]
i.概述
[0306]
本发明所公开的系统和方法的实施方式可以用于在所使用的流通池上形成可逆的水凝胶聚合物结构，所述流通池可以用作边合成边测序方法和其他测序方法的工作流程的一部分。该工作流程可以包括文库制备和测序。由于来自单细胞的低起始核酸输入以及不能在流通池上将测序文库区室化，所以这些水凝胶结构对于解决与在流通池上的高通量单细胞或单集落测序相关联的挑战可能特别有用。本发明所公开的系统和方法通过在流通池上的可逆水凝胶结构中提供细胞和遗传物质的截留或封装，而使得能够实现高通量单细胞或单集落测序。这些水凝胶结构将各个细胞或各个集落截留或区室化，同时允许有效的试剂交换以用于细胞裂解并且最终原位制备测序文库。
[0307]
本发明所公开的系统、装置和方法的各种实施方式可以用于在测序流通池上的流体通道内产生可逆、可渗透的三维聚合物(例如，水凝胶)结构。这些临时聚合物结构使可用的测序表面从二维扩展至三维，从而大大增加测序流通池的通量。
[0308]
本发明所公开的系统、装置和方法的各种实施方式可以用于在流通池上的流体通道内产生可逆的三维聚合物(例如，水凝胶)结构。这些结构可以用于在流通池内引入除了预先存在的测序表面之外的临时功能性表面，用于多种应用，包括例如：(i)靶dna富集；(ii)成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)筛选；以及(iii)使用dna缀合抗原的高度多重筛选应用。
[0309]
如本文所用，术语“水凝胶”是指当有机聚合物(天然的或合成的)通过共价键、离子键或氢键交联以产生截留水分子以形成凝胶的三维开放网格结构时所形成的物质。在一些型式中，水凝胶可以是生物相容性水凝胶，是指形成凝胶的聚合物对活细胞无毒并且允许氧和营养物质充分扩散到截留的细胞以保持活力。在一些型式中，水凝胶聚合物包含约60％至90％的流体(诸如水)和约10％至30％的聚合物，其中在其他型式中，水凝胶的水含量为约70％至80％。
[0310]
如本文所用，术语“衔接子”是指可以例如通过连接或标签化与核酸分子融合的线性寡核苷酸。在一些示例中，衔接子与样品中存在的任何靶序列的3'端或5'端基本上不互补。在一些示例中，合适的衔接子长度在约10个至100个核苷酸、约12个至60个核苷酸或约15个至50个核苷酸的长度范围内。一般来讲，衔接子可以包括核苷酸和/或核酸的任何组合。衔接子可以包括一个或多个位置处的一个或多个可切割基团。衔接子可以还包括与引物(例如，包含通用核苷酸序列的引物)的至少一部分互补的序列。衔接子可以还包括条形码(也称为标签或索引)以有助于下游纠错、识别或测序。如本文所用，术语“索引”是指可以用作分子标识符或条形码以将核酸加标签或识别核酸来源的核苷酸序列。索引可以用于识别单个核酸或核酸亚群。
[0311]
本文的流通池可以指将在测序工作流程期间使用的流通池。例如，流通池可以用
于文库制备、测序或这两者。在一种实施方式中，同一个流通池可以用于文库制备和测序两者。示例性流通池包括通道，该通道包括一种或多种流体试剂可以流经并且测序文库的适应片段可以转运和结合到其上的表面。流通池包括具有其上结合测序文库的表面的固体载体。在一些示例中，固体表面覆盖有水凝胶层。在一些示例中，该表面含有可以结合至测序文库的适应片段的捕获核苷酸苔层(lawn)。在一些示例中，该表面为图案化表面。当提及表面时，术语“图案化”可以指在固体载体的暴露表面之中或之上的不同区域(诸如扩增位点)的排列(诸如阵列)。例如，这些区域中的一个或多个区域可以是存在一种或多种扩增引物和/或捕获引物的特征部。这些特征部可以由不存在引物的间隙区域隔开。在一些示例中，该流通池装置的通道高度为约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm或约150μm，或者由前述值中的任何两者限定的范围内的量。
[0312]
如图1a中所示，示例性测序流通池100包括具有形成于其中的流体孔112的玻璃顶层110；限定通道的间隔件120，该间隔件包括形成于其中的多个流体通道/测序通道122；以及在其上形成阵列150的玻璃底层130。阵列150包括通过本发明所公开的方法在其上形成的多个单独的结构152。单独的结构152可以为三维结构。所述结构可以包含聚合物。在一种实施方式中，所述聚合物为水凝胶。应当注意，虽然在本文的一些情况下使用水凝胶来指代结构152，但是“水凝胶”仅用作该实施方式中的代表性材料，并且该结构不必包含水凝胶，而是可以包含任何合适的聚合物材料。图1b描绘了组装的流通池100，其上已经在测序通道122之一中制造了各个三维水凝胶结构152的阵列150，并且图1c描绘了具有形成于其上的多个三维水凝胶结构152的流通池100，该流通池插入测序盒160中，该测序盒与边合成边测序设备一起使用。具有特定的预定几何形状的三维水凝胶结构可以通过以下方式在流通池上形成：(i)将水凝胶前体溶液引入流通池的测序通道中；(ii)在将水凝胶前体溶液引入流通池中之前或之后，将具有形成于其上的特定图案的光掩模放置在流通池上的测序通道上方；以及(iii)使水凝胶前体溶液暴露于透过光掩模的预定波长的光，其中对水凝胶前体溶液的照射使其内容物聚合并且在流通池上形成与光掩模上的图案相对应的三维结构。一旦水凝胶结构已用于它们的目的，就可以将其从流通池切割并且洗掉，而不影响流通池的总体功能。
[0313]
水凝胶前体溶液可以包括能够通过活化光引发剂而光聚合的单体溶液。一种这样的体系的示例包含至少一种类型的单体、可逆或可切割的交联剂，以及光引发剂。在一种型式中，单体为丙烯酰胺，可逆的交联剂为n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺(bac)，并且光引发剂为苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)，该光引发剂通过预定波长的紫外(uv)光活化。
[0314]
在其他型式中，前体溶液可以包含聚乙二醇(peg)
‑
硫醇、peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺、n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺、peg、聚环氧丙烷(ppo)、聚丙烯酸、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(phema)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)、聚(乳酸)(pla)、聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(plga)、聚己内酯(pcl)、聚(乙烯基磺酸)(pvsa)、聚(l
‑
天冬氨酸)、聚(l
‑
谷氨酸)、聚赖氨酸、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、肝素、藻酸盐硫酸盐、硫酸葡聚糖、透明质酸、果胶、角叉菜胶、明胶、脱乙酰壳多糖、纤维素、胶原、双丙烯酰胺、二丙烯酸酯、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二乙烯基砜、二乙二醇二烯丙基醚、乙二醇二丙烯酸酯、聚亚甲基二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基三丙烯酸酯、或乙氧基化季戊四醇四丙烯酸酯，或它们的组合。在其他型式中，单体可以包括peg
‑
硫
醇/peg
‑
丙烯酸酯、丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)或peg/ppo。
[0315]
在本发明所公开方法的一些实施方式中，单体可以为式i的化合物：
[0316][0317]
其中每个r2独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0318]
在本发明所公开方法的包括交联剂的一些实施方式中，所述交联剂可以为式ii的化合物：
[0319][0320][0321]
其中：
[0322]
每个n独立地为1至6的整数；并且
[0323]
每个r1独立地为氢或(c1‑6)烷基。
[0324]
交联剂能够使聚合物内的聚合物链交联。在一种实施方式中，所述聚合物为水凝胶。在一些型式中，交联剂能够因下列原因而被切割，从而使聚合物链解开：存在还原剂；升高的温度；电场；或将水凝胶结构暴露于将交联水凝胶的聚合物的可光切割的交联剂切割的光波长。在一些型式中，还原剂可以包括膦化合物、水溶性膦、含氮膦及其盐和衍生物、二硫赤藓糖醇(dte)、二硫苏糖醇(dtt)(分别为2,3
‑
二羟基
‑
1,4
‑
二硫醇丁烷的顺式异构体和反式异构体)、2
‑
巯基乙醇或β
‑
巯基乙醇(bme)、2
‑
巯基乙醇或氨基乙硫醇、谷胱甘肽、巯基乙醇酸盐或巯基乙酸、2,3
‑
二巯基丙醇、三(2
‑
羧乙基)膦(tcep)、三(羟甲基)膦(thp)或对
‑
[三(羟甲基)膦]丙酸(thpp)。在一些型式中，通过将温度升高至大于约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃、约95℃或约100℃来切割交联剂。在一些型式中，还原剂由紫外光活化。
[0325]
其他合适的光引发剂包括不损伤核酸的用于自由基聚合的生物相容性光引发剂，诸如重氮磺酸盐引发剂；单酰基氧化膦(mapo)盐，诸如na
‑
tpo和li
‑
tpo；以及双酰基氧化膦(bapo)盐，诸如bapo
‑
ona和bapo
‑
oli。
[0326]
在一些示例中，将水凝胶结构的聚合物链交联形成了具有孔的水凝胶基质(即多孔水凝胶基质)。在一些型式中，水凝胶结构中的孔的大小是可调节或可微调的，并且可以被配制以封装足够大的遗传物质(诸如细胞或核酸(例如，大于约300个碱基对)，但允许较小的材料(诸如试剂)或较小的核酸(例如，小于约50个碱基对)(诸如引物)通过这些孔，从而进出水凝胶结构。水凝胶可以具有任何孔径，其直径足以允许试剂扩散通过结构，同时保留封装的核酸分子。术语“孔径”还可以指基于多个孔的测量结果的孔的横截面的平均直径或平均有效直径。非圆形横截面的有效直径等于具有与非圆形横截面相同的横截面积的圆形横截面的直径。在一些示例中，当水凝胶水合时，水凝胶结构可以溶胀。然后，孔的尺寸可以根据水凝胶结构的水凝胶中的水含量而变化。在一些示例中，这些孔具有约10nm至约
100nm的直径。
[0327]
在一些示例中，通过改变聚合物浓度与交联剂浓度的比率来微调水凝胶结构的孔径。在一些示例中，聚合物与交联剂的比率为约30:1、约25:1、约20:1、约19:1、约18:1、约17:1、约16:1、约15:1、约14:1、约13:1、约12:1、约11:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:15、约1:20或约1:30，或约这些比率中的任一者，或者由前述比率中的任何两者限定的范围内的比率。
[0328]
图2a至图2e描绘了用于制造以及随后移除流通池210上的三维水凝胶结构的示例性方法200。流通池210包括上部内表面212和下部内表面214，这两个内表面一起限定流通池通道216。预图案化的光掩模218已层合至或以其他方式附接到流通池210的上部表面。图2a描绘了将水凝胶前体溶液230引入流通池210中，该溶液包含：(i)单体(例如丙烯酰胺)、(ii)交联剂(例如bac)和(iii)光引发剂(例如lap)。图2b描绘了使水凝胶前体溶液230暴露于透过预图案化的光掩模218的预定波长的紫外光，所述光掩模具有形成于其中的多个开孔200。将水凝胶前体溶液230暴露于紫外光使光引发剂(lap)活化，从而产生自由基，这些自由基导致单体(丙烯酰胺)受控地聚合成含有二硫键的水凝胶结构232。图2c描绘了水凝胶特征部232的形成，这些特征部锚定到流通池210的测序通道216的顶部表面212和底部表面214，该流通池适于插入盒260中。图2c包括明视场显微照片250，其示出了具有致密凝胶壁与较不致密的芯的圆柱形水凝胶结构232(直径100um至150um)。图2d描绘了使用热或者热和交联剂的化学切割的组合从流通池210切割水凝胶特征部232。例如，将水凝胶结构232与还原剂(诸如含有dtt的油)一起温育，通过将水凝胶交联剂中的二硫键还原为硫醇来切割结构，从而允许水凝胶从流通池210中洗出，如图2e中所示。在已将经切割的水凝胶结构从流通池中洗出之后，流通池210的表面保持功能性，即，从流通池210中移除水凝胶结构不影响在制造和随后移除水凝胶的凝胶特征部之前已结合到流通池的测序引物的功能性。
[0329]
水凝胶结构(诸如先前所述的那些)的制造可以在工厂环境和实验室环境两者中实现。然而，已知的水凝胶制造技术通常涉及使用昂贵且笨重的设备，诸如具有准直紫外光源和铬掩模的光掩模对准器。因此，为了有利于由测序产品的消费者直接在流通池上制造水凝胶结构，提供了用于在流通池上制造水凝胶的相对小规模、低成本的仪器。以举例的方式，该仪器的一般具体实施包括：(i)准直led紫外光源，诸如thor labs型号m385lp1
‑
c1；(ii)外壳，其适于在其中接纳流通池(和流通池盒)并且相对于流通池支撑和适当地定位光源；(iii)预图案化的光掩模，其适于层压粘附在特定流通池的上部表面上；以及(iv)屏蔽罩，其用于容纳光源和外壳。屏蔽罩中的开口允许流通池插入外壳中，以用于透过预图案化的光掩模对流通池进行紫外照射。外壳可以包括可移动的或可调节的台设备，如果外壳的照明区小于流通池上要被光致图案化的区域，则该台设备用于沿流通池的长度和宽度复制图案。除了作为宽场照明器操作之外，本发明所公开的仪器的不同型式还执行各种试剂交换并且提供热控制以利于自动化文库制备。如下文更详细地描述的，本发明所公开的仪器的某些具体实施作为输出准备聚簇或准备文库测序的独立文库制备装置来操作。光掩模可以包括(但不必限于)(聚对苯二甲酸乙二醇酯)；丝网印刷的吸光材料，诸如碳墨；或化学蚀刻的金属膜；这样的铝、铬、金或铂，以及其他吸光材料。
[0330]
图3a至图3c描绘了用于在流通池上制造水凝胶结构的本发明所公开的系统和方法的示例性实施方式，其中水凝胶结构含有待测序或以其他方式分析的样品。在该实施方式中，本发明所公开的仪器是自动化的，并且外壳包括处理器，该处理器执行驻留在其上的各种程序，以用于照射流通池并且用于以自动化方式执行试剂交换和其他功能。如图3a中所示，客户(或其他使用者)订购已在其上层合光掩模318(具有包括形成于其中的客户指定图案的区域)以形成组件320的流通池310。将光掩模318的图案化区域放置在流通池310上的通道312上方并且与之对准。然后将流通池310插入适当的流通池盒360中。如图3b中所示，客户然后将感兴趣的样品(例如，生物细胞或基因组dna)与包含例如单体、交联剂和光引发剂的水凝胶前体溶液混合，并且将该溶液装载到流通池310上。如图3c中所示，然后将组件320和盒360装载到外壳370中，在该外壳上已使用可移动的托盘372安装了紫外光源。基于光掩模318的布局或几何图案，客户选择适当的照射程序并且将流通池310暴露于紫外光，以使溶液聚合并且使流通池310上的期望的水凝胶结构图案化。图3c包括使用本发明所公开的系统和方法在流通池上制造的水凝胶柱332的明视场显微照片。然后清洗流通池310以移除未聚合的溶液和过量样品，并且可以将光掩模318从流通池310移除。在一种实施方式中，将未聚合溶液、过量样品和光掩模中每一者的超过一半移除。在一种实施方式中，将未聚合溶液、过量样品和光掩模中每一者的全部移除。然后可以将流通池310放置到测序仪或流体处理器中，用于自动化的下游处理，诸如裂解、标签化、桥式扩增、聚簇等。
[0331]
提供了关于光掩模和流通池的组装的若干其他实施方式。在一种实施方式中，使用者首先将流通池插入外壳中，然后插入与流通池分离的光掩模(例如，光掩模没有层压到流通池)。因为各种光掩模图案和设计是可能的，所以使用者可以基于所需的间距或者基于流通池的特定应用或特定用途来选择不同的光掩模。在该实施方式和其他实施方式中，仪器的外壳适于接纳多种不同的流通池，包括hiseq
tm
、nextseq
tm
、novaseq
tm
、miniseq
tm
、iseq
tm
和miseq
tm
流通池，或购自illumina,inc.的其他合适的流通池。在另一种实施方式中，提供了预组装有光掩模的流通池，该光掩模已施加到流通池的外表面。根据分辨率，可以使用丝网印刷将光掩模印刷在流通池上，或者使用不透明的粘合剂膜将光掩模层合至流通池的表面，所述光掩模被图案化以在流通池上产生结构。如果需要，光掩模在已使用之后可以从流通池剥离。在另一种实施方式中，光掩模可以在用于产生流通池的微制造工艺期间由铝或沉积在流体通道内的另一种金属制成。然后，在流通池上形成水凝胶结构完成之后，可以用高ph缓冲液将光掩模蚀刻掉。
[0332]
ii.细胞区室化和原位测序文库制备
[0333]
本发明所公开的系统和方法可以通过提供生物细胞(和其中包含的遗传物质)在流通池上的区室化而具有高通量单细胞或单集落测序的有益效果，这种区室化是通过将单细胞或单细胞集落封装在允许有效的试剂交换以用于细胞裂解和测序文库制备的可逆水凝胶结构中来实现的。使用以下示例性实施方式来实现原位文库制备和簇的空间索引，包括流通池上的生物细胞封装、文库制备、文库接种和桥式扩增。流通池设置有结合到流通池的上部表面和下部表面的两种类型的寡核苷酸(例如，p5和p7)，称为表面引物或测序引物。这些表面引物的序列与文库衔接子互补，并且dna文库的片段被这些寡核苷酸捕获。如本文所用，p5和p7是指用于捕获目的和/或扩增目的的通用p5或p7序列或者p5或p7引物。p5序列包括由seq id no:1(aatgatacggcgaccaccga)限定的序列，并且p7序列包括由seq id no:2
(caagcagaagacggcatacga)限定的序列。
[0334]
如本文所用，“遗传物质”是指细胞、微生物群系或核酸。在一些型式中，细胞为单细胞，包括原核细胞或真核细胞。在一些型式中，细胞为哺乳动物细胞。在一些型式中，细胞为人细胞。在一些型式中，细胞为细菌细胞。在一些型式中，遗传物质为病毒颗粒。在一些型式中，核酸为长dna分子、基因组dna、病毒核酸、细菌核酸或哺乳动物核酸。可以将任何感兴趣的遗传物质封装在本发明所公开的水凝胶结构内。
[0335]
用本发明所公开的水凝胶结构封装的遗传物质具有足够大的尺寸，使得其被截留在水凝胶结构内，从而不能穿过水凝胶结构的孔。在一些示例中，封装在水凝胶结构内的靶核酸分子的长度为至少约100个核苷酸、至少约150个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约20,000个核苷酸、至少约50,000个核苷酸、至少约100,000个核苷酸，或更多个核苷酸。在若干示例中，封装在水凝胶结构内的核酸分子为具有以下长度的基因组dna片段：约1,000个至约10,000个核苷酸、约10,000个至约20,000个核苷酸、约10,000个至约50,000个核苷酸、约50,000个至约100,000个核苷酸，或者约300个、约500个、约1000个、约10,000个、约20,000个、约50,000个或约100,000个核苷酸，或者前述尺寸中的任何两者之间的范围，或者长于前述尺寸的长度。在一些示例中，封装的核酸分子的长度为至多约3m个碱基。
[0336]
本发明所公开的系统和方法的一些型式涉及处理水凝胶结构内的遗传物质以产生测序文库，该测序文库可以被定义为一个或多个靶核酸分子的片段或者这些片段的扩增子的集合。在一些型式中，使封装在水凝胶结构内的遗传物质与一种或多种用于核酸处理的试剂接触。在一些型式中，遗传物质保留在水凝胶结构内，并且试剂穿过水凝胶结构的孔。试剂可以包括裂解试剂、核酸纯化试剂、dna扩增试剂、标签化试剂、pcr作用剂或用于处理遗传物质的其他试剂(例如，溶菌酶、蛋白酶k、随机六聚体、聚合酶(例如φ29dna聚合酶、taq聚合酶、bsu聚合酶)、转座酶(例如tn5)、引物(例如p5和p7衔接子序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液或二价阳离子。因此，水凝胶结构通过允许存在试剂进出所述水凝胶结构的屏障，同时将遗传物质本身保持在所述结构内，来为所述水凝胶结构内的遗传物质的受控反应提供微环境。这具有使得能够进行单细胞处理以快速且有效地处理靶核酸的有益效果。在一些型式中，在水凝胶结构内对封装的核酸进行全部或部分测序。可根据任何合适的测序方法对包封的核酸进行测序，诸如直接测序，包括边合成边测序、边连接边测序、杂交测序、纳米孔测序等。
[0337]
对于细胞封装，如图4a中所示，将单细胞或单集落与包含单体、可切割的交联剂和光引发剂的聚合物前体溶液混合。然后将含有细胞的溶液装载到流通池中，并且以前述方式用紫外光透过光掩模照射，以在流通池上产生包埋细胞的水凝胶结构(例如，柱)的阵列。洗去过量的前体溶液，以在水凝胶结构之间获得清晰的间隙空间。合并的明视场和荧光显微照片示出了其中封装有大肠杆菌(e.coli)细胞的水凝胶结构，并且在流通池上形成的水凝胶柱的明视场图像出现在图4a的底部。另选地，如图5a至图5d中所示，可以首先在流通池510上产生其中形成有细胞捕集特征部的水凝胶结构532的阵列，然后可以使单细胞或单集落流过细胞捕集水凝胶特征部532，使得单细胞或单集落被截留在水凝胶特征部中。图5a描绘了附接到通道516的上部表面512和下部表面514的示例性细胞捕集水凝胶特征部532的
侧视图。图5b为图5a的细胞捕集水凝胶特征部的顶视图。图5c为描绘细胞550已被截留在其中的示例性细胞捕集水凝胶阵列的侧视图，并且图5d为图5c的细胞捕集水凝胶特征部之一的顶视图，示出了被捕集在其中的细胞550。如图5d中所示，水凝胶特征部532可以包括斜边缘以及形成于其中的各种通道和通路，以有利于流体流过这些特征部和围绕这些特征部流动。
[0338]
在一种实施方式中，对于文库制备，如图4b中所示，将裂解试剂和标签化试剂扩散到水凝胶结构中。微调或以其他方式改变水凝胶的孔径可以允许优化缓冲液交换以及试剂向水凝胶结构中和向水凝胶结构外的有效扩散。用酶裂解缓冲液或化学裂解缓冲液裂解水凝胶结构中捕获的细胞。然后对通过裂解细胞而释放的dna进行标签化。标签化涉及通过转座体复合物修饰核酸分子，以在单个步骤中片段化所述核酸分子并且将衔接子连接到这些片段的5'端和3'端。标签化反应可以将随机dna片段化和衔接子连接组合成单个步骤，以提高测序文库制备过程的效率。一旦衔接子已连接到所述片段，就可以添加附加的基序，诸如索引、条形码以及在扩增、测序和分析期间充当参考点的其他种类的分子修饰。索引和条形码是连接到测序文库内的片段，以用于下游计算机分选和识别的独特dna序列。示出水凝胶结构阵列的明视场显微照片出现在图4b的底部。
[0339]
如前所述，衔接子可以包括测序引物位点、扩增引物位点和索引。例如，衔接子可以包括p5序列、p7序列或任一者的互补序列。如前所述，“索引”可以包括可以用作分子标识符和/或条形码以将核酸加标签和/或识别核酸来源的核苷酸序列。在一些型式中，索引可以用于识别单个核酸或核酸亚群。
[0340]
对于文库接种，如图4c中所示，为了将文库制备所得的文库接种到流通池的顶部表面和底部表面上，同时保持空间区室化，将液体扩散阻挡层引入流通池中。液体扩散阻挡层可以包含使水凝胶结构降解的切割剂，诸如dtt。升高流通池的温度，并且切割水凝胶结构以释放其中包含的文库片段，然后将这些文库片段与在区域250处附接到流通池表面的表面引物杂交。在该实施方式中，使用采用水性缓冲液的洗涤步骤从流通池中移除经切割的水凝胶。示出矿物油中的融化水凝胶结构的明视场显微照片出现在图4c的底部。
[0341]
水凝胶结构被降解，同时被液体扩散阻挡层包围，以从这些结构中释放测序文库并且将测序文库接种在流通池上。将液体扩散阻挡层装载到流通池上，以填充水凝胶结构之间的空隙体积并且包围水凝胶结构。用液体扩散阻挡层包围捕获的水凝胶结构抑制了测序文库在所述结构降解时扩散到所述结构体积之外，从而减少了(并且在一些情况下甚至防止)水凝胶结构之间的交叉污染。在结构降解之后，封装的测序文库转运到流通池的表面，在那里被捕获。因此，在存在液体扩散阻挡层的情况下，在流通池上接种紧邻每个水凝胶结构的覆盖区发生。应当指出的是，在其中需要对水凝胶结构内产生的文库片段进行离散区室化的某些实施方式中使用了扩散阻挡层。然而，在其中不需要区室化的实施方式中，可以不使用扩散阻挡层。因此，扩散阻挡层可以被称为“任选的”。
[0342]
在一些示例中，液体扩散阻挡层可以为疏水性液体，诸如油，其示例包括矿物油、硅油或全氟化油，或者它们中的两种或更多种的组合。在一些示例中，液体扩散阻挡层为粘稠的水性溶液，例如，包含聚乙二醇(peg)、聚乙烯基吡咯烷酮、普兰尼克葡聚糖、蔗糖、聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷
‑
聚环氧丙烷
‑
聚环氧乙烷(peo
‑
ppo
‑
peoyiaponite，或者它们中的两种或更多种的组合。在一些示例中，温度响应材料可以用作液体扩散阻挡层。
温度响应材料在非接种温度处为非粘稠的液体，并且可以容易地装载到流通池上以占据水凝胶结构之间的间隙空间。在加热至接种温度时，材料固化形成物理屏障并且防止文库扩散。在一些示例中，温度响应材料可以为聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)或聚环氧乙烷
‑
聚环氧丙烷
‑
聚环氧乙烷(peo
‑
ppo
‑
peo)/合成锂皂石纳米颗粒复合材料。在一些示例中，用于本发明所公开的实施方式中的液体扩散阻挡层由上文讨论的液体扩散阻挡层中的任何两种或更多种的组合构成。
[0343]
可以使用任何不会大幅降低液体扩散阻挡层抑制测序文库扩散超过水凝胶结构直径的有效性的适当方法来降解水凝胶结构。水凝胶结构无需完全降解就能从所述水凝胶结构释放测序文库并且将测序文库接种在流通池上。充分降解包括水凝胶结构的孔隙度增加，以允许封装的测序文库扩散并且将测序文库转运到流通池的表面。
[0344]
对于桥式扩增，如图4d中所示，然后使用用于产生簇的桥式扩增方法来克隆扩增杂交的文库片段。在桥式扩增期间，聚合酶沿着与流通池结合的单链dna片段(多核苷酸)移动，从而产生其互补多核苷酸。洗去初始的多核苷酸，仅留下反向多核苷酸。在反向多核苷酸的顶部存在衔接子序列(例如，p5或p7)。dna片段弯曲并且附接到流通池表面上的与顶部衔接子序列互补的寡核苷酸。聚合酶附接到反向多核苷酸，并且制备其互补多核苷酸(其与初始的多核苷酸相同)。使现在的双链dna变性，使得每个多核苷酸都可以单独地附接到锚定于流通池的寡核苷酸序列。一条将是反向链；另一条将是正向链。然后反复重复该过程，并且可以同时在数百万个簇中进行，从而导致dna文库中的所有片段的克隆扩增。在桥式扩增后，将所得的簇260定位至流通池的顶部表面和底部表面，在那里水凝胶结构先前已被锚定。图4d底部的荧光显微照片示出了在用可从thermofisher scientific商购获得的sytox
tm
嵌入染料染色之后测序簇260的存在。
[0345]
图6为流程图，描绘了用于在流通池上制备三维聚合物结构的方法的示例性实施方式。方法600包括在框602处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂和光引发剂，其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；在框604处将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；以及在框606处，使用波长足以活化所述光引发剂的光，透过所述光掩模照射所述聚合物前体溶液。所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液中的至少一些聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构。在其他实施方式中，所述光掩模与所述流通池成一体，而不是放置在其上或附接到其上。
[0346]
图7为流程图，描绘了用于在流通池上制备三维聚合物结构的方法的另一种示例性实施方式。方法700包括在框702处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含含有遗传物质的生物细胞或生物细胞集落、单体、交联剂和光引发剂，其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面，并且其中引物结合到所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面两者；在框704处，将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；以及在框706处，使用活化所述光引发剂的波长的光，透过所述光掩模照射所述聚合物前体溶液，其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所
述聚合物前体溶液中的至少一些聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构；并且其中所述生物细胞或生物细胞集落在所述三维聚合物结构中区室化。在其他实施方式中，所述光掩模与所述流通池成一体，而不是放置在其上或附接到其上。
[0347]
图8为流程图，描绘了用于在流通池上制备三维水凝胶结构的方法的又一种示例性实施方式。方法800包括在框802处将水凝胶前体溶液装载到流通池上，其中所述水凝胶前体溶液包含含有遗传物质的生物细胞或生物细胞集落、单体、交联剂和光引发剂，其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面，并且其中引物结合到所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面两者；在框804处，将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；在框806处，用活化所述光引发剂的波长的光，透过所述光掩模照射所述水凝胶前体溶液，其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述水凝胶前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维水凝胶结构，并且其中所述生物细胞或生物细胞集落在所述三维水凝胶结构中区室化；在框808处，将裂解试剂扩散到所述三维水凝胶结构中，其中所述裂解试剂裂解所述生物细胞并从中释放遗传物质，并且其中所述遗传物质包括核酸；在框810处，使所释放的核酸片段化，并且将衔接子连接到所述核酸片段的末端；在框812处，通过以下方式将所述核酸片段接种在所述通道的上部表面和下部表面上：在814处将扩散阻挡层引入所述至少一个通道中，以防止水凝胶结构之间的交叉污染，在816处将所述流通池加热到切割所述水凝胶结构并释放所述核酸片段的温度，在818处使所述核酸片段与所述至少一个通道的上部内表面和下部内表面上的引物杂交，以及在820处将经切割的水凝胶结构从所述流通池中洗出；以及在框822处克隆扩增所述杂交的核酸，以产生用于测序的簇。在其他实施方式中，所述光掩模与所述流通池成一体，而不是放置在其上或附接到其上。
[0348]
本文所述的方法和系统提供了某些有益效果。本文所述的“空间索引”方法和技术的型式缩短了数据分析并且简化了从单细胞和长dna分子制备文库的过程。用于单细胞测序的现有方案涉及细胞的有效物理分离，并且对每个分离的细胞进行唯一条形码标记并将细胞汇集在一起用于测序。用于合成长读段的当前方案还涉及繁琐的条形码标记、将每个经条形码标记的片段汇合在一起用于测序，以及执行数据分析以区分来源于每个经条形码标记的细胞的遗传信息。在这些长的过程期间，还存在遗传物质的损失，这导致核苷酸序列中的缺失。本文所述的型式不仅缩短了整个测序过程，而且还提高了单细胞的数据分辨率。
[0349]
提供以下非限制性工作实施例以展示某些实施例的特定特征，但权利要求的范围不应限于所例示的那些特征。
[0350]
实施例1：在流通池上整合由基因组dna进行文库制备
[0351]
该实施例展示了被捕集在水凝胶结构中的基因组dna的测序，其中通过测序制备文库被整合在流通池上并且直接在流通池上进行。
[0352]
由40％(w/v)丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)(19:1)单体储备溶液(3.8g丙烯酰胺、0.2g bacy和6ml双蒸(dd)h2o)与1mg/ml的lap光引发剂和大肠杆菌基因组dna(0.008ng/μl)制备10％t的水凝胶前体溶液。将溶液引入miseq
tm
流通池中，并且将流通池通过图案化为具有200μm圆形特征部的铬掩模(hta photomasks)暴露于准直的紫外光
(oai掩模对准器，功率在约30mw/cm2至40mw/cm2的范围内)，以形成水凝胶结构。
[0353]
用pr
‑
2洗出含有过量基因组dna的前体溶液。将流通池与标签化酶溶液在55℃处一起温育15分钟，之后用pr
‑
2洗涤并且用标签化终止缓冲液温育(37℃处维持10分钟)。然后用pr
‑
2洗涤流通池，并且将ams
‑
1酶在50℃处温育5分钟。用0.1m naoh洗涤，然后用ht
‑
2洗涤，使文库变性。将流通池与ht
‑
1一起温育5分钟，然后装载矿物油与表面活性剂和dtt(312.5μl矿物油 4.5％span 80、0.4％tween 20和0.05％triton x
‑
100，以及0.5μl 12mg dtt/400μl etoh)。通过以60℃、40℃和20℃的温度斜坡温育流通池来实现接种。
[0354]
然后用ht
‑
1洗涤流通池，并且用ams
‑
1扩展接种的文库(50℃维持5分钟)。然后用clm使剩余的水凝胶融化(40℃维持5分钟)并且用pr
‑
2洗涤流通池。然后将流通池插入测序仪中用于桥式扩增(24个循环)和测序。该方法展示了基因组dna可以被捕集在流通池上的水凝胶结构内，并且文库制备和文库测序可以直接在流通池上进行。
[0355]
实施例2：在流通池上整合文库制备以进行微型宏基因组测序
[0356]
以下实施例展示了微生物细胞测序的直接整合，从对封装在流通池上的水凝胶结构中的微生物进行裂解和文库制备，到接种、聚簇和对文库分子进行测序。
[0357]
由40％(w/v)丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)(19:1)单体储备溶液(3.8g丙烯酰胺、0.2g bacy和6ml双蒸(dd)h2o)与1mg/ml的lap光引发剂和0.01m tris/hcl以及10种微生物的混合物(zymomics microbial community standard d6300)制备10％t的水凝胶溶液，并且将该溶液引入miseq
tm
流通池中。将流通池通过图案化为具有200μm圆形特征部的铬掩模(hta photomasks)暴露于准直的紫外光(oai掩模对准器，功率在约30mw/cm2至40mw/cm2的范围内)，以形成水凝胶结构。
[0358]
用pr
‑
2洗出过量的前体溶液，并且使用chargeswitch gdna小量细菌试剂盒(thermo fisher cs11301)将微生物裂解；用溶菌酶和溶葡球菌酶进行第一次温育，之后用蛋白酶k进行第二次温育。用pr
‑
2洗涤流通池，并且引入标签化酶溶液并在55℃处温育15分钟，之后用pr
‑
2洗涤并且用标签化终止缓冲液温育(37℃处维持10分钟)。然后用pr
‑
2洗涤流通池，并且将ams
‑
1酶在50℃处温育5分钟。用0.1m naoh洗涤，然后用ht
‑
2洗涤，使文库变性。将流通池与ht
‑
1一起温育5分钟，然后装载矿物油与表面活性剂和dtt(312.5μl矿物油 4.5％span 80、0.4％tween 20和0.05％triton x
‑
100，以及0.5μl 12mg dtt/400μl etoh)。通过以60℃、40℃和20℃的温度斜坡温育流通池来实现接种。
[0359]
然后用ht
‑
1洗涤流通池，并且用ams
‑
1扩展接种的文库(50℃维持5分钟)。然后用clm使剩余的水凝胶融化(40℃维持5分钟)并且用pr
‑
2洗涤流通池。然后将流通池插入测序仪中用于桥式扩增(24个循环)和测序。该方法展示了微生物可以被捕集在流通池上的水凝胶结构内，并且基因组文库制备和文库测序可以直接在流通池上进行。
[0360]
实施例3：在流通池上整合由哺乳动物细胞进行文库制备
[0361]
以下实施例展示了在流通池上对来自哺乳动物细胞的遗传物质进行封装、裂解、文库制备和测序。
[0362]
由40％(w/v)丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)(19:1)单体储备溶液(3.8g丙烯酰胺、0.2g bacy和6ml pbs)与1mg/ml的lap光引发剂和哺乳动物细胞(gm12878细胞)制备10％t的水凝胶溶液。将溶液引入miseq
tm
流通池中，并且将流通池通过图案化为具有200μm至500μm圆形特征部的铬掩模(hta photomasks)暴露于准直的紫外光(oai掩模
对准器，功率在约30mw/cm2至40mw/cm2的范围内)，以形成封装所述细胞的水凝胶结构。然后用pbs洗涤流通池。
[0363]
用chargeswitch裂解缓冲液和蛋白酶k将细胞裂解(10分钟，50℃)。用pr
‑
2洗涤流通池，并且将标签化酶溶液添加到流通池中(55℃维持15分钟)，之后用pr
‑
2洗涤并且用标签化终止缓冲液温育(37℃处维持10分钟)。用pr
‑
2洗涤流通池，并且将ams
‑
1酶在50℃处温育5分钟。然后用0.1m naoh洗涤，之后用ht
‑
2洗涤并且与ht
‑
1一起温育5分钟，使文库变性。将流通池装载矿物油与表面活性剂和dtt(312.5μl矿物油 4.5％span 80、0.4％tween 20和0.05％triton x
‑
100以及0.5μl 12mg dtt/400μl etoh)，并且以60℃、40℃和20℃的温度斜坡温育。
[0364]
用ht
‑
1洗涤流通池，之后与ams
‑
1一起温育(50℃维持5分钟)。用clm切割任何剩余的水凝胶(40℃维持5分钟)并且用pr
‑
2洗涤流通池。将流通池插入miseq
tm
测序仪中用于桥式扩增(24个循环)和后续的测序。该方法展示了哺乳动物细胞可以被捕集在流通池上的水凝胶结构内，并且基因组文库制备和文库测序可以直接在流通池上进行。
[0365]
实施例4：在流通池上整合由基因组dna进行扩增子测序
[0366]
该实施例展示了在流通池上整合扩增子测序，其中基因组dna被封装在水凝胶结构中，用于后续扩增靶区域、添加测序引物、接种和测序。
[0367]
通过以下方式将基因组dna封装在水凝胶结构中：首先将基因组dna与由40％(w/v)丙烯酰胺/n,n'
‑
双(丙烯酰基)胱胺(bacy)(19:1)单体储备溶液(3.8g丙烯酰胺、0.2g bacy和6ml pbs)和1mg/ml的lap光引发剂制备的10％t水凝胶溶液混合。将该水凝胶前体溶液引入miseq
tm
流通池中。将流通池通过图案化为具有200μm圆形特征部的铬掩模(hta photomasks)暴露于准直的紫外光(oai掩模对准器，功率在约30mw/cm2至40mw/cm2的范围内)，从而导致形成包含基因组dna的水凝胶柱。用pr
‑
2洗出过量的溶液和dna。
[0368]
将10μl的1μm寡核苷酸对(含有靶序列和illumina衔接子序列突出端的正向引物和反向引物对)与25μl的kapa hifi 2x混合物(roche)和5μl重悬缓冲液混合，并且引入流通池中。使用以下程序在热循环仪上进行pcr：92℃维持5分钟，25个以下循环：(i)92℃30秒，(ii)55℃30秒和(iii)72℃维持2分钟，72℃维持5分钟。然后用pr
‑
2洗涤流通池。
[0369]
接下来，使用前述段落中所述的热循环仪程序运行8个循环的pcr，这次用5μl的nextera xt引物1、5μl的nextera xt引物2、25μl kapa hifi 2x混合物、15μl pcr级水。然后用pr
‑
2洗涤流通池。
[0370]
用0.1m naoh洗涤，之后用ht
‑
2洗涤并且与ht
‑
1一起温育5分钟，使文库分子变性。将流通池装载矿物油与表面活性剂和dtt(312.5μl矿物油 4.5％span 80、0.4％tween 20和0.05％triton x
‑
100以及0.5μl 12mg dtt/400μl etoh)，并且以60℃、40℃和20℃的温度斜坡温育。用ht
‑
1洗涤流通池，之后与ams
‑
1一起温育(50℃维持5分钟)。用clm切割任何剩余的水凝胶(40℃维持5分钟)并且用pr
‑
2洗涤流通池。然后将流通池插入miseq
tm
测序仪中用于桥式扩增(24个循环)和后续的测序。该方法展示了基因组dna可以被封装在流通池上的水凝胶结构内，并且后续的靶区域扩增、测序引物添加、接种和测序可以在流通池上进行。
[0371]
在本文所公开的实施例中，每种单独的水凝胶结构都含有由包含在水凝胶结构内的遗传物质或核酸产生的测序文库。因此，从单个水凝胶结构接种的测序文库对应于封装
在该水凝胶结构内的核酸。因为接种紧邻每个水凝胶结构的流通池上覆盖区发生，所以来自每个结构的接种测序文库基于该结构的位置在流通池上在空间上分离(或“索引”)。
[0372]
iii.三维核酸测序
[0373]
如前文所讨论的，当前最出色的下一代测序(ngs)平台的操作通量由以下项确定：(i)二维核酸簇密度；以及(ii)流通池的有效表面积的总体尺寸，这两者均已达到制造的实际限制。示例性实施方式提供了克服这些限制的系统和方法，这些系统和方法通过将可以在其上进行测序的表面从二维扩展到三维，从而提供了测序流通池通量和数据生成的大幅增加。
[0374]
通过用占据流通池的整个体积并且遍及整个流通池体积以期望密度支持簇形成的材料或三维结构填充流通池(或其他物品，诸如毛细管或小型化的比色皿)，有利于增加流通池测序通量和数据生成。然后完成边合成边测序或通过另一种合适方法的测序，其中通过光学询问整个流通池中的一系列堆叠的二维切片来进行簇识别和碱基判定。用于对整个流通池中的各个二维切片相继成像的示例性方法包括：(i)使用共焦显微镜，其能够聚焦在流通池的离散二维切片上并且重复测量同一个二维平面；以及(ii)使用光片照明显微镜，其可以对三维体积进行快速成像。在其他实施方式中，使用多光子荧光(诸如双光子激发荧光(2pef))或另一种多光子成像技术(诸如三光子激发荧光(3pef)或多谐波发生(mhg))来对三维基质进行成像。多光子成像是具有类似分割能力的类似共焦的激发模态，其涉及使用脉冲激光，但通常在近红外(nir)波长下，从而大大降低对基质及其内容物的潜在光损伤。
[0375]
在示例性实施方式中，通过使用点击化学将炔烃连接的捕获引物(例如，p5和p7)附接到包括含有叠氮部分的聚(n
‑
(5
‑
叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
‑
共
‑
丙烯酰胺)(pazam)的丙烯酰胺水凝胶基质，在整个可渗透的水凝胶基质(诸如上文所述的那些)中产生三维簇。叠氮
‑
炔烃点击反应涉及叠氮与炔烃的铜催化反应以形成5元杂原子环：cu(i)催化的叠氮
‑
炔环加成(cuaac)。叠氮
‑
炔烃点击反应可以使用cu(ii)和光引发剂体系(诸如ii型光引发剂体系，例如樟脑醌)光致引发，该体系可以使用470nm的蓝光作为激发源。然后将含有核酸片段(其中衔接子连接到该片段)的测序文库扩散到水凝胶基质中，并且通过使用簇扩增、桥式扩增或另一种合适的方法进行聚簇。在一些实施方式中，在添加衔接子之后将核酸片段环化，以产生核酸“纳米球”。水凝胶的渗透性允许酶和其他试剂扩散到水凝胶中并且进行核酸扩增。如下文更详细地讨论的，水凝胶基质可以聚合成各种形状和几何结构，诸如柱、柱体或线性沟槽的阵列，以利于水凝胶基质周围的试剂交换以及快速扩散进出水凝胶基质。
[0376]
测序流通池设置有两种类型的寡核苷酸(例如，p5和p7)，在替代方案中称为接枝引物、捕获引物、表面引物或测序引物，其使用水凝胶层或其他附接方法结合到流通池的上部表面和下部表面。这些引物的序列与文库衔接子互补，并且dna文库的片段被这些寡核苷酸捕获。如本文所用，p5和p7是指用于捕获目的和/或扩增目的的通用p5或p7序列或者p5或p7引物。p5序列包括由seq id no:1(aatgatacggcgaccaccga)限定的序列，并且p7序列包括由seq id no:2(caagcagaagacggcatacga)限定的序列。
[0377]
图9a和图9b描绘了流通池1400，其包括使用光刻法(诸如上文所述的光刻法)在流通池内形成的各个水凝胶柱1404的阵列1402。这些柱含有p5/p7引物并且支持簇1406在水
凝胶基质内的生长。图10a描绘了在miseq
tm
流通池内制造的水凝胶柱1410，并且图10b至图10f描绘了时间序列图像，其示出荧光染料被引入流通池中、染料扩散到水凝胶柱中，以及染料从水凝胶柱中洗出。图11至图11b描绘了掺杂有含有p5/p7引物的pazam的水凝胶珠粒1412。这些珠粒最初用测序文库浸泡，然后浸泡在examp中，以在每个珠粒的整个三维体积中产生簇。图12a至图12b描绘了无索引测序，其中每个水凝胶珠粒均含有来自该珠粒在其中温育的样品的簇(1420、1422、1424、1426)。将含有此类簇的水凝胶珠粒装载于流通池上并且测序。可以使用多种手段将来自每种样品类型的珠粒彼此区分开，所述手段诸如包埋在珠粒中的在测序前移除的荧光团。
[0378]
图13a描绘了测序流通池1430，其中测序发生在顶部内表面1440和底部内表面1450上的簇的二维网络中，并且其中顶部内表面1440和底部内表面1450沿z轴隔开已知距离(例如，100μm)。图13b描绘了测序流通池1430，其中测序发生在顶部内表面1440和底部内表面1450上以及区域1442、1444和1446中的簇的三维网络中，这些区域位于顶部内表面1440与底部内表面1450之间，并且其中顶部内表面1440和底部内表面1450沿z轴隔开已知距离(例如，100μm)。该示例性实施方式优于现有ngs系统和方法的优点和有益效果包括：(i)将各个流通池的通量提高了超过50倍；(ii)制造不涉及光学系统的x、y平移的高通量流通池；(iii)基于对整个流通池体积的利用，更有效地消耗测序试剂，从而减少浪费并且改善测序过程的经济方面；以及(iv)与大多数或所有的现有测序平台的兼容性。在一些实施方式中，在第一次扫描期间识别簇位置并且为后续的扫描分配x、y、z坐标。通过使用在第一次扫描期间生成的“参考簇映射”，可以解决x维度和y维度上的偏移。在本文中，术语x、y和z，或x轴、y轴和z轴是指三维笛卡尔坐标系。
[0379]
可以使用每个二维平面的簇的数量和可以在流通池内成像的二维切片的数量来针对给定的平台和流通池尺寸计算通量。后一种数量对于特定平台的光学检测系统是特定的，并且取决于沿z维度的光学截面厚度(dz)，其可以使用下式计算：
[0380][0381]
其中λ
em
为激发波长，n为样品的折射率，并且na为数值孔径。针对高数值孔径(na)平台和低数值孔径平台所获得的计算dz值汇集在下表1中。较高放大倍数的物镜可以具有较高的na(即，用于收集信息的角度较宽)，这也意味着z方向上的分辨率较好(即，dz值较小)。在实施过程中，z方向上的最大分辨率相比xy平面中的差，为后者的约1/3至1/2。此外，较短的波长产生较高的分辨率。
[0382]
表1：低na平台和高na平台的计算的光学厚度(dz)值。
[0383]
[0384]
使用dz值和流通池厚度，可以外推每个流通池能够访问的光学截面(或单独的二维切片)的数量和潜在的数据输出(参见下表2)。例如，具有约2μm的光学截面厚度的hiseq
tm
系统可以允许对50个单独的2d切片成像，而具有约10μm的较大dz的nextseq
tm
系统可以允许10个光学截面。使用该三维测序策略并且假定三维的簇密度恒定，nextseq
tm
流通池的产量可以从120gb增加至600gb，并且hiseq
tm
流通池的产量可以从1460gb增加至22500gb。通过使用较厚的流通池，甚至可以更大地增加数据密度，以便最大化三维中的簇生长空间。
[0385]
表2：低na平台和高na平台的计算的数据输出。
[0386][0387]
类似于共焦显微镜法，选择性平面照明显微镜法(spim)，也称为光片显微镜法，是用于使三维结构成像的示例性光学显微镜法。存在光片显微镜法的多种实施方式，所有这些实施方式均采用双物镜配置。第一物镜(通常为低成本和低na)用于激发；并且第二较高na物镜用于从感兴趣的样品收集荧光发射(参见图14)。在该几何形状中，系统的横向(xy)分辨率由收集光学器件确定，而轴向(z)分辨率由激发物镜和激发波长确定。这种模式通常用于以每秒数百张图像的速度以微米级分辨率对从细胞到尺寸高达几毫米的完整生物体的活生物样品进行成像。图14描绘了示例性spim设置1460，其中使用低na物镜1462将激发递送到样品1464中，并且其中通过高na发射物镜1466收集荧光发射。光束可以用柱面透镜成形，以同时激发整片荧光团，或者可以在发射物镜的整个焦平面上光栅扫描单线光束，以创建完整的图像。随后通过机械台平移样品允许以高分辨率进行快速体积成像。
[0388]
如前所述，本发明所公开的系统和方法提供了占据流通池的整个体积以及支持簇形成并且使得能够进行三维测序的材料和结构。合适的材料：(i)占据流通池通道的整个高度；(ii)允许通过各种聚合策略或通过存在可用的官能团(例如，叠氮)掺入寡核苷酸；(iii)具有可控密度的官能团以用于控制簇密度；(iv)以最小扩散梯度支持试剂的流动；以及(v)支持在流通池的整个深度上以最小的散射实施共焦显微镜法。合适材料的示例包括预定尺寸的水凝胶网络；大颗粒、小颗粒或者大颗粒和小颗粒的组合(例如，相同尺寸的颗粒或不同尺寸的颗粒)的基质；周期性柱状柱体；以及中孔结晶材料。图15描绘了测序流通池内的大水凝胶网络1000；图16描绘了测序流通池内的大颗粒1100、小颗粒1102或者大颗粒1100和小颗粒1102的组合的基质；图17描绘了测序流通池内的周期性柱状柱体1200；并且图18描绘了测序流通池内的中孔或微孔结晶材料1300。在一些实施方式中，三维基质可以由丝纤蛋白或聚合物纤维(诸如纤维素/纤维素制品)以及它们的构造体(例如纸)产生，在其上可以形成簇。
[0389]
大水凝胶网络(诸如图15中所示的)可以通过使功能性水凝胶在流通池内聚合来构造，从而形成具有支持簇形成的均匀分布的官能团的连续聚合物网络。在一种实施方式中，pazam与dbco官能化peg反应。可以通过调节pazam的浓度和pazam:dbco
‑
peg的相对浓度来控制该网络的密度，以优化官能团的密度和水凝胶的扩散特性。该方法使用软聚合物网络作为三维支架，该支架具有限定簇在水凝胶基质内所处的位置的核酸锚定点。图19a至图
14d描绘了通过使pazam 二dbco
‑
peg聚合而在流通池内形成水凝胶的方法的示例性实施方式。
[0390]
固体或多孔颗粒的三维基质(诸如图16中所示的)提供稳固的网络，其中测序反应发生在颗粒的表面上或颗粒的内部，并且试剂的扩散发生在颗粒之间的间隙区域中。簇位于颗粒的表面上或整个颗粒中。在该实施方式中，颗粒被设计成提供最佳的表面积、模量和光学透明度。示例包括多孔水凝胶珠粒(例如丙烯酰胺凝胶)、固体聚合物颗粒(例如聚苯乙烯)、聚合物核壳和无机材料(例如二氧化硅颗粒)；所有这些在其表面上和/或在其整个三维结构中均具有接枝引物。
[0391]
参考图20，在一种示例性实施方式中，使用简单的液滴产生与丙烯酰胺和经丙烯酰胺基修饰的寡核苷酸(可从integrated dna technologies,inc.商购获得)的共聚相组合制造了具有寡核苷酸的水凝胶珠粒。图20描绘了丙烯酰胺和经丙烯酰胺基修饰的寡核苷酸共聚成大的聚丙烯酰胺珠粒。由于水凝胶珠粒的尺寸(～120μm)略大于典型流通池的顶部表面与底部表面之间的高度(例如，100μmm)，所以水凝胶珠粒可以紧密堆积并且被捕集在流通池槽道内，而不与其具有任何形式的化学附接。图21a为明视场显微图像，描绘了载玻片上的水凝胶珠粒；并且图21b为明视场显微图像，描绘了堆积在hiseq
tm
流通池内的水凝胶珠粒。为了证明试剂可以容易地扩散进出通过本发明所公开的方法制造的多孔水凝胶珠粒，将染料标记的互补链与寡核苷酸标记的丙烯酰胺珠粒杂交，以检测遍及整个水凝胶基质的荧光。未用寡核苷酸接枝的对照标准丙烯酰胺珠粒在与互补的染料标记链一起温育时未显示荧光信号，从而证实对于经寡核苷酸修饰的丙烯酰胺珠粒检测到的信号是由杂交驱动的，并且在不存在水凝胶结合的互补链的情况下寡核苷酸可以保留在珠粒内。图22a是标准丙烯酰胺珠粒在与染料标记的互补链一起温育后的荧光显微图像；并且图17b是经寡核苷酸修饰的丙烯酰胺珠粒在与染料标记的互补链一起温育后的荧光显微图像。
[0392]
该实施方式可容易地转换成用于执行长读段的简单方法，其中具有接枝引物的水凝胶珠粒封装长dna文库片段(～100kb)并且充当酶促过程(诸如标签化、连接和聚簇)的反应容器以产生独特的在空间上隔离的链接读段簇。内部标签化和连接的dna片段与分布在水凝胶珠粒内的p5引物和p7引物结合，以允许遍及整个三维水凝胶结构形成桥式扩增辅助的簇，并且形成独特的空间条形码。图23a描绘了水凝胶珠粒，其中长dna片段已被封装捕集在流通池内；图23b描绘了在图23a的经捕集的水凝胶珠粒内进行的用于文库制备的酶促过程；并且图23c描绘了扩增的文库，其产生在每个水凝胶珠粒内三维分布的链接读段簇。
[0393]
利用固体或多孔颗粒的三维基质的某些实施方式包括在流通池外部的具有复杂物理和化学结构的颗粒，这些颗粒被引导到流通池中并且通过交联固定在流通池中。核酸文库的克隆扩增最初可以发生在流通池外部的珠粒上，然后将这些珠粒在含有水凝胶前体(诸如之前所述的那些)的水性溶液中引导到流通池中。然后使用之前所述的方法使水凝胶前体交联，以在流通池内形成支架。图24a描绘了在携带寡核苷酸的水凝胶珠粒上发生的模板捕获和延伸；并且图24b描绘了水凝胶珠粒上的文库插入物的克隆扩增，其用于产生簇。图25a描绘了在水凝胶前体溶液中被递送到流通池中的聚簇珠粒；并且图25b描绘了交联水凝胶基质内的聚簇珠粒的固定，用于在测序和随后的成像期间保持珠粒在三维中的空间位置。
[0394]
通过使用外部水凝胶珠粒制备，可以通过利用特定的珠粒设计在溶液中制备正交
线性化化学性质的空间共定位区域。然后可以将此类珠粒递送到流通池中并且用于同时进行三维正向链/反向链测序。这是使用具有在空间上分离的寡核苷酸引物的水凝胶颗粒来实现的，所述寡核苷酸引物具有独特的线性化化学性质。具有不同的表面化学性质的颗粒二聚体已使用连续流动反应来证明，其中前体颗粒在二聚反应之前合成并且官能化。二聚体颗粒可以用于在空间上连接的三维正向读段和反向读段。图26描绘了具有不同的正交线性化化学性质的二聚体颗粒；并且图27描绘了用于合成类似的二聚体颗粒的现有技术体系。
[0395]
本发明所公开的系统和方法的一些实施方式通过利用从流通池底部在竖直方向上延伸到流通池顶部的柱状柱体(诸如图17中所描绘的那些)来提供功能性的三维支架。这些柱状柱体可以使用自顶向下的微制造技术来制造，诸如光刻法；薄膜沉积；以及选择性蚀刻。柱体的表面可以使用包括pazam在内的之前所述的方法来官能化，以用于提供化学活性柱的刚性网络，同时允许液体流动和化学扩散遍及柱体之间的间隙区域发生。某些实施方式利用了被制造成在z方向上具有交替的材料组成的柱。此类柱体可以在两种材料之一的表面上被选择性地官能化，从而允许控制z方向上的簇空间分布，以限制多克隆性并且有助于光学成像。在该实施方式中，用于光学询问的z切片的流形以系统方式在空间中组织。图28a和图28b描绘了使用在z方向上具有交替材料组成的柱状柱体的三维基质在三维中对簇的空间控制。
[0396]
一些实施方式利用微孔结晶材料来产生流通池上的支架(诸如图18中所描绘的)。微孔结晶材料具有明确限定的结构，所述结构包括在一个方向上有序排列并且对齐的孔。因此，这些材料基本上提供了多路流体通道，其中每个孔代表单个流体通道。许多多孔材料的表面可以被官能化；因此，具有对齐的孔的微孔材料可以用作三维测序的基质，其中化学反应发生在孔的壁上。参考图18，流体流动和光学成像这两者的方向均在z方向上发生，如沿孔的长轴向下所观察到的。微孔硅是可以被制造成具有受控尺寸的预先定向的孔的材料的一个示例。微孔硅膜的横向尺寸和厚度易于通过选择前体晶片来控制，并且流通池可以通过将微孔硅膜安装到单独的流体单元上来制备。
[0397]
一些实施方式利用聚合物支架进行流通池上的三维测序。图29a至图29d描绘了用于产生聚合物支架的简化示例性方法，其中用具有预定尺寸分布的盐颗粒将未聚合的单体溶液包埋。盐颗粒将单体置换，从而在溶液内产生三维网络。使单体溶液聚合形成围绕盐颗粒的三维聚合物支架，并且使盐颗粒溶解，从而产生无规的三维孔阵列，该阵列限定所述支架。此类支架可以被活化并且用水凝胶(诸如pazam)涂覆。虽然此类支架不必是相等间隔的多层结构(诸如之前所述的那些)，但是合适的成像策略将对整个支架成像，并且图像处理然后将用于识别不同的簇。该示例性实施方式中所使用的盐颗粒可以掺杂钝化的金属颗粒。在将盐颗粒溶解之后，这些颗粒将在支架中的固定位置保留下来。在成像期间，这些颗粒可以用于提供簇可以与之对齐的点，从而基本上充当基准点。
[0398]
图30为流程图，描绘了用于在流通池上制备可渗透的三维基质的示例性方法。方法2500包括在框2502处将寡核苷酸包埋在可渗透的三维基质内；以及在框2504处将所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质引入流通池中，其中所述流通池包括用于接收所述含有寡核苷酸的可渗透的三维基质的至少一个通道。
[0399]
图31为流程图，描绘了用于核酸文库三维测序的第一示例性方法。方法2600包括
在框2602处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体和寡核苷酸；在框2604处，使所述聚合物前体溶液聚合，以在所述流通池内产生可渗透的三维基质；在框2606处，将测序文库扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中，其中所述测序文库包括核酸片段；在框2608处，将酶和试剂扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中；在框2610处，使所述核酸片段与所述可渗透的三维聚合物基质中的所述寡核苷酸杂交；在框2612处，克隆扩增所述杂交的核酸片段，以在所述可渗透的三维聚合物基质内产生用于测序的簇；在框2614处，对所述可渗透的三维聚合物基质内的所述簇进行测序；以及在框2614处，将三维基质内的经测序的簇光学成像在多个离散的二维切片中以表征所述测序文库，其中所述多个离散的二维切片表示所述流通池的整个三维内部体积。
[0400]
图32为流程图，描绘了用于核酸文库三维测序的第二示例性方法。方法2700包括在框2702处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和寡核苷酸；在框2604处，使用紫外光使所述聚合物前体溶液聚合，以在所述流通池内产生可渗透的三维基质；在框2606处，将测序文库扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中，其中所述测序文库包括核酸片段；在框2608处，将酶和试剂扩散到所述可渗透的三维聚合物基质中；在框2610处，使所述核酸片段与所述可渗透的三维聚合物基质中的所述寡核苷酸杂交；在框2612处，克隆扩增所述杂交的核酸片段，以在所述可渗透的三维聚合物基质内产生用于测序的簇；在框2614处，对所述可渗透的三维聚合物基质内的所述簇进行测序；以及在框2616处，使用共焦显微镜或光片照明显微镜将所述三维基质内的经测序的簇成像在多个离散的二维切片中以表征所述测序文库，其中所述多个离散的二维切片表示所述流通池的整个三维内部体积。
[0401]
iv.流通池上的水凝胶结构的官能化
[0402]
本发明所公开的系统、装置和方法的各种实施方式可以用于在流通池上的流体通道内产生可逆的水凝胶结构，所述水凝胶结构可以用于在流通池内引入除了预先存在的测序表面之外的临时功能性表面。这些临时功能性表面可以用于多种应用，包括例如：(i)靶dna富集；(ii)成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)筛选；以及(iii)使用dna缀合抗原的高度多重筛选应用。使用本文所公开的方法(包括上文所讨论的那些)，在流通池上制造装饰有链霉亲和素部分的水凝胶微柱。如下文更详细地讨论的，生物素化的捕获寡核苷酸结合至链霉亲和素并且将靶文库分子固定到水凝胶结构以便在流通池上进行文库富集。类似地，可以使用生物素
‑
链霉亲和素键将蛋白质和寡核苷酸附接到水凝胶柱，以使得能够进行多种其他的筛选过程，诸如crispr筛选。本发明所公开的实施方式由于水凝胶的多孔性质而为结合反应提供了大得多的表面积，并且允许针对结合事件而不是仅针对表面来筛选流通池的整个体积，从而导致更高的结合容量和反应速率。
[0403]
示例性实施方式在图33中示出，该图描绘了使用之前所述的用于在流通池上制造水凝胶微结构的方法在流通池内的通道上形成水凝胶微柱。在图33中，流通池400被示为插入盒460中。各个水凝胶微柱452的阵列450已形成于通道422内并且在图33的底部处的明视场显微照片中可见。在示例性实施方式中，水凝胶微柱452通过丙烯酰胺单体与n,n
′‑
双(丙烯酰基)胱胺交联剂的共聚而形成。使用光引发剂苯基
‑
2,4,6
‑
三甲基苯甲酰基次膦酸锂(lap)，通过引导紫外光穿过已定位在流通池400上的通道422上方的光掩模来引发聚合反应，从而实现对空间图案化的控制。图34a至图34c描绘了在流通池上制造水凝胶微柱452，
其中将包含丙烯酰胺和交联剂单体以及光引发剂的水凝胶前体溶液引入流通池400中(图34a)，然后使其暴露于透过光掩模418的紫外光(图34b)，以形成水凝胶柱(图34c)，该光掩模已预图案化为具有期望的特征部(例如，具有特定几何形状的开孔)。在图34a至图34c中，流通池400包括窄通道422和宽通道424，窄通道中形成了水凝胶微柱452。水凝胶微柱452附接到窄通道422的上部表面412和下部表面414两者。
[0404]
流通池400设置有结合到流通池的上部表面和下部表面的两种类型的寡核苷酸(例如，p5和p7)，称为表面引物或测序引物。这些表面引物的序列与文库衔接子互补，并且dna文库的片段被这些寡核苷酸捕获。如本文所用，p5和p7是指用于捕获目的和/或扩增目的的通用p5或p7序列或者p5或p7引物。p5序列包括由seq id no:1(aatgatacggcgaccaccga)限定的序列，并且p7序列包括由seq id no:2(caagcagaagacggcatacga)限定的序列。
[0405]
实施例5：pazam缀合的生物素
[0406]
在图35a至图36e中所示的示例性实施方式中，通过利用其中已掺入叠氮部分的聚(n
‑
(5
‑
叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺
‑
共
‑
丙烯酰胺)(pazam)以及叠氮
‑
炔烃点击反应，在流通池上的通道内形成官能化的可逆水凝胶结构。叠氮
‑
炔烃点击反应涉及叠氮与炔烃的铜催化反应以形成5元杂原子环：cu(i)催化的叠氮
‑
炔环加成(cuaac)。叠氮
‑
炔烃点击反应可以使用cu(ii)和光引发剂体系(诸如ii型光引发剂体系，例如樟脑醌)光致引发，该体系可以使用470nm的蓝光作为激发源。
[0407]
在该示例性实施方式中，首先使用紫外介导的丙烯酰胺、交联剂与其中已掺入叠氮部分的pazam的共聚反应，在miseq
tm
流通池(或任何其他合适的流通池)内制造水凝胶微柱。然后将生物素
‑
聚乙二醇(peg)
‑
炔烃复合物点击到pazam的叠氮部分上并且用于结合链霉亲和素。然后，链霉亲和素的多个结合位点允许固定的链霉亲和素将寡核苷酸捕获探针固定，所述寡核苷酸捕获探针进而与被引入流通池中的感兴趣的测序文库分子杂交。将任何未杂交的文库片段从流通池中洗出。然后将结合的测序文库片段从位于流通池的窄通道(非测序区域)中的水凝胶微柱洗脱，并且接种在流通池的宽通道(测序区域)中，以准备用于扩增、聚簇和边合成边测序或通过另一种方法测序。
[0408]
图35a至图35e描绘了用于在流通池上制造官能化水凝胶结构的方法的示例性实施方式。在图35a中，将含有10％聚丙烯酰胺(pa)、交联剂和其中已掺入叠氮部分的0.25％pazam的水凝胶前体溶液装载到流通池400上。在图35a中，流通池400是具有窄通道422和宽通道424两者的miseq
tm
流通池。在图35b中，将包括在其中形成的多个200μm开孔的光掩模418放置在流通池400之上，然后将流通池暴露于紫外光10秒以使丙烯酰胺和pazam共聚，并且在窄通道422中形成叠氮官能化的水凝胶微柱452的阵列450。在图35c中，在blackpool温育期间，将5μm生物素
‑
peg
‑
炔烃点击到叠氮部分上。在图35d中，用荧光素标记的链霉亲和素(1:500)与水凝胶微柱452中的生物素结合。在图35e中，链霉亲和素与生物素化的捕获寡核苷酸结合，以使得能够固定已在文库制备期间用与捕获寡核苷酸的序列互补的序列加标签的靶测序文库分子。
[0409]
图36a至图36f为一系列明视场显微照片和荧光显微照片(488nm激发)，描绘了生物素化的水凝胶微柱的荧光素
‑
链霉亲和素染色。图36a为pa/pazam对照(无生物素)的4x明视场显微照片。图36b为pa/pazam加blackpool的4x明视场显微照片。图36c为五分钟反应时
间后pa/pazam对照(无生物素)的4x荧光显微照片。图36d为五分钟反应时间后pa/pazam加blackpool的4x荧光显微照片。图36e为在40℃处的十分钟反应时间后pa/pazam对照(无生物素)的4x荧光显微照片。图36f为在40℃处的十分钟反应时间后pa/pazam加blackpool的4x荧光显微照片。图36d和图7f展示荧光素标记的链霉亲和素与生物素缀合的水凝胶微柱结合。在对照实验中(图36c和图36e)，不具有生物素的聚丙烯酰胺/pazam微柱不与荧光素标记的链霉亲和素结合。这些图清楚地展示，在该特定示例中，生物素缀合的(官能化的)水凝胶微柱有效地结合感兴趣的靶标，即荧光素标记的链霉亲和素。
[0410]
实施例6：链霉亲和素
‑
丙烯酰胺共聚物
[0411]
在图37a至图37d中所示的示例性实施方式中，官能化的可逆水凝胶结构通过丙烯酰胺单体、交联剂和链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体的光聚合反应而在流通池上的通道内形成。水凝胶的链霉亲和素官能团与生物素化的捕获寡核苷酸结合，这些寡核苷酸进而与被引入流通池中的感兴趣的序列文库分子杂交。将未杂交的文库片段从流通池中洗出。然后将结合的测序文库片段从位于流通池的窄通道(非测序区域)中的水凝胶微柱洗脱，并且接种在流通池的宽通道(测序区域)中，以准备用于扩增、聚簇和边合成边测序或通过另一种方法测序。
[0412]
在图37a中，将含有10％聚丙烯酰胺(pa)和0.25％链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体的水凝胶前体溶液装载到流通池400上。在图37a中，流通池400是具有窄通道422和宽通道424两者的miseq
tm
流通池。在图37b中，将包括在其中形成的多个200μm开孔的光掩模418放置在流通池400之上，然后将流通池暴露于紫外光10秒以使丙烯酰胺链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体共聚，并且在窄通道422中形成链霉亲和素官能化的水凝胶微柱452的阵列450。在图37c中，将生物素化的捕获寡核苷酸与水凝胶结构中的链霉亲和素部分结合，并且将靶文库分子与生物素化的捕获寡核苷酸杂交并固定在水凝胶微柱上。在图37d中，将固定的靶分子从捕获寡核苷酸洗脱并且接种在流通池400的宽通道424上，以用于扩增、聚簇和边合成边测序或通过另一种方法测序。
[0413]
参考图38a至图38c，水凝胶柱452的表面上的链霉亲和素可以通过与生物素化的引物p5和p7一起温育来检测。图38a描绘了与链霉亲和素官能化的水凝胶微柱452结合的生物素化的p5引物和p7引物(分别为908和906)。图38b描绘了与tet标记的互补p5’寡核苷酸和p7’寡核苷酸(分别为909和907)一起温育的生物素化的p5引物和p7引物(分别为908和906)。图38c描绘了与生物素化的p5引物和p7引物(分别为908和906)杂交的tet标记的互补p5’寡核苷酸和p7’寡核苷酸(分别为909和907)。未用链霉亲和素制造的对照水凝胶微柱未显示用tet标记的引物染色，而含有链霉亲和素的柱展示了用tet标记的引物染色。
[0414]
图39a为明视场显微照片，示出了在不存在生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸的情况下与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱452。图39b为荧光显微照片(488nm激发)，示出了在不存在生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸的情况下与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱452，其中观察到p5引物和p7引物在流通池表面上均匀染色。图39c为明视场显微照片，示出了在与生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸一起温育后与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱452。图39d为荧光显微照片(488nm激发)，示出了在与生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸一起温育后与tet
‑
p5’和tet
‑
p7’一起温育的水凝胶微柱452，其中观察到tet染色定位到水凝胶微柱的边缘，表明tet标
记的寡核苷酸已杂交到链霉亲和素结合的生物素化的p5引物和p7引物。
[0415]
当将tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸与先前与生物素
‑
p5寡核苷酸和生物素
‑
p7寡核苷酸一起温育的含有链霉亲和素的微柱一起温育时，随着荧光在微柱的表面处增加并且穿透水凝胶，在流通池上的微柱之间的间隙空间中观察到tet标记的引物耗尽。图40a为荧光显微照片，描绘了在一分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平，并且图40b为描绘在一分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平的图，其中距离在x轴上示出，并且水平在y轴上示出。图40c为荧光显微照片，描绘了在五分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平，并且图40d为描绘在五分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平的图，其中距离在x轴上示出，并且水平在y轴上示出。图40e为荧光显微照片，描绘了在十分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平，并且图40f为描绘在十分钟的温育时间处在水凝胶微柱之间的间隙空间中的tet
‑
p5’寡核苷酸/tet
‑
p7’寡核苷酸的水平的图，其中距离在x轴上示出，并且水平在y轴上示出。由这些显微照片表示的荧光强度分布证明，tet标记的寡核苷酸与水凝胶表面的结合耗尽了微柱之间的间隙区域中的寡核苷酸。
[0416]
参考图41a至图41c，为了证明使用上述示例性实施方式捕获和释放靶文库分子的能力，将phix文库与生物素化的p5引物和p7引物(1:10)一起温育。图41a描绘了测序文库分子的p7’区域和p5’区域(分别为902和904)与生物素化的p5寡核苷酸和p7寡核苷酸(分别为906和908)杂交。图41b描绘了用附接到流通池400的表面的链霉亲和素官能化的水凝胶柱452捕获测序文库分子902和904。图41c描绘了接种结合的测序文库分子902和904，方式为：在85℃处温育以使杂交的生物素化引物906和908变性，然后升温至20℃以允许文库分子902和904分别与表面引物510和912杂交。然后将杂交的phix文库(1pm)在未处理的流通池(对照)或链霉亲和素柱图案化的流通池中温育。在与杂交至生物素
‑
引物的文库分子一起温育后，用ht
‑
1洗涤流通池，之后进行接种(80℃5分钟，60℃5分钟，40℃2分钟和20℃2分钟)，第一次延伸(ams
‑
1，50℃5分钟)和24个桥式扩增循环。尽管对照流通池未显示簇(参见图42a至图42b)，但是链霉亲和素
‑
柱流通池却显示高簇密度(参见图42c至图42f)，证明成功捕获了与生物素
‑
p5/生物素
‑
p7杂交的文库。
[0417]
图42a为未处理的流通池(对照)的明视场显微照片，并且图42b为sytox(thermofisher scientific)染色的未处理的流通池(对照)的荧光显微照片(488nm)，其中未显示簇。图42c为具有链霉亲和素微柱的流通池的明视场显微照片，并且图42d为具有链霉亲和素微柱的sytox染色流通池的荧光显微照片(488nm)。图42e为图42c的水凝胶微柱的明视场显微照片。图42f为图42d的sytox染色微柱的荧光显微照片(488nm)。sytox染色的流通池的荧光显微照片表明，虽然未处理的流通池未显示簇，但是具有链霉亲和素
‑
水凝胶柱的流通池展示高簇密度和其中水凝胶微柱已被图案化的柱“覆盖区”。此外，当用链霉亲和素柱将流通池的仅一个通道(窄通道)图案化时，簇在同一个流通池内显示密度梯度，其中靠近柱的簇密度较高。图43a描绘了盒460中的流通池400，其中链霉亲和素微柱已在窄通道422中形成，但未在宽通道422中形成。当链霉亲和素柱仅在miseq
tm
流通池的窄通道中被图案化时，簇密度从靠近微柱(窄通道)到远离微柱(宽通道)形成从高到低的梯度。图43b为在
24个循环的桥式扩增后用sytox染料染色的宽通道424的显微照片，并且图43c为在24个循环的桥式扩增后用sytox染料染色的窄通道422的显微照片。以下的描述提供了与本文所提供的方法相关的一些附加示例。它们不一定是上文所提供的非限制性工作实施例的一部分。
[0418]
图44为流程图，描绘了用于在流通池上制备官能化的三维聚合物结构的第一方法。方法1500包括在框1902处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和官能化聚合物，诸如含有叠氮部分的pazam，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；在框1904处，将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；以及在框1906处用光源透过光掩模照射所述聚合物前体溶液，其中所述光源发射活化所述光引发剂的波长的光，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构。
[0419]
图45为流程图，描绘了用于在流通池上制备官能化的三维聚合物结构的第二方法。方法1600包括在框1602处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和含有叠氮部分的pazam，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；在框1604处将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；在框1606处用光源透过光掩模照射所述聚合物前体溶液，其中所述光源发射活化所述光引发剂的波长的光，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构；在框1608处使用叠氮
‑
炔烃点击反应使生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物与所述三维聚合物结构中的pazam中的叠氮部分反应；在框1610处使链霉亲和素与所述生物素
‑
peg
‑
炔烃复合物中的生物素结合；以及在框1612处使生物素化的捕获寡核苷酸与链霉亲和素结合，其中所述生物素化的捕获寡核苷酸对测序文库中的感兴趣的靶分子具有特异性。
[0420]
图46为流程图，描绘了用于在流通池上制备官能化的三维聚合物结构的第三方法。方法1700包括在框1702处将聚合物前体溶液装载到流通池中，其中所述聚合物前体溶液包含单体、交联剂、光引发剂和链霉亲和素标记的丙烯酰胺单体，并且其中所述流通池包括用于接收所述聚合物前体溶液的至少一个通道，并且其中所述至少一个通道具有上部内表面和下部内表面；在框1704处将光掩模放置在所述至少一个通道的上方，其中所述光掩模包括形成于其中的一系列开孔；在框1706处用光源透过光掩模照射所述聚合物前体溶液，其中所述光源发射活化所述光引发剂的波长的光，并且其中所述光引发剂的活化使所述光掩模中的开孔下面的所述聚合物前体溶液聚合，并且形成从所述至少一个通道的上部内表面延伸到下部内表面的三维聚合物结构；在框1708处使生物素化的捕获寡核苷酸与所述三维聚合物结构中的链霉亲和素结合，其中所述生物素化的捕获寡核苷酸对测序文库中的感兴趣的靶分子具有特异性并且与之结合；以及在框1710处洗脱所结合的靶分子，并且将洗脱的靶分子接种在所述流通池的其上结合有寡核苷酸的表面上。
[0421]
提供上述说明以使得本领域的技术人员能够实践本文所述的各种构型。虽然已参
考各种附图和构型具体描述了本主题技术，但应当理解，这些附图和构型仅用于说明目的，而不应被视为限制本主题技术的范围。
[0422]
本技术中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和网页，无论这些文献和类似材料的格式如何，都明确地全文以引用方式并入。如果所并入的参考文献和类似材料中的一者或多者与本技术不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本技术为准。
[0423]
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”是指单数和复数两者，除非上下文另有明确指示。如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。尽管可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的许多方法和材料，但是本文描述了特别合适的方法和材料。除非上下文另有指示，否则由端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值。此外，对“一个具体实施”的引用并非旨在被解释为排除也包含所叙述特征的附加具体实施的存在。此外，除非有相反的明确说明，否则“包括”或“具有”具有特定属性的一个或多个元件的具体实施可包括附加元件，无论它们是否具有该属性。
[0424]
在本说明书通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明小的波动，诸如由于处理中的变化所引起的小的波动。例如，它们可以指小于或等于
±
5％，诸如小于或等于
±
2％，诸如小于或等于
±
1％，诸如小于或等于
±
0.5％，诸如小于或等于
±
0.2％，诸如小于或等于
±
0.1％，诸如小于或等于
±
0.05％和/或0％。
[0425]
可存在许多其他方式来实现本主题技术。在不脱离本主题技术的范围的情况下，本文所述的各种功能和元件可与所示的那些功能和元件不同地划分。对这些具体实施的各种修改对于本领域的技术人员而言可以是显而易见的，并且本文所定义的一般原理可应用于其他具体实施。因此，在不脱离本主题技术的范围的情况下，本领域的普通技术人员可对本主题技术进行许多改变和修改。例如，可采用不同数量的给定模块或单元，可采用一个或多个不同类型的给定模块或单元，可添加给定模块或单元或者可省略给定模块或单元。
[0426]
带下划线和/或斜体的标题和子标题仅为了方便起见而使用，不限制本主题技术，并且不与本主题技术的描述的解释结合引用。本领域的普通技术人员已知的或稍后将知道的贯穿本公开描述的各种具体实施的元件的所有结构和功能等同物明确地以引用方式并入本文并且旨在被本主题技术所涵盖。此外，本文所公开的任何内容都不旨在专用于公众，而不管以上描述中是否明确地叙述了此类公开内容。
[0427]
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。