人间皮素嵌合抗原受体及其用途的制作方法

1.本披露涉及特异性结合间皮素的抗体、表达特异性结合间皮素的嵌合抗原受体(car)的t细胞，以及其用于治疗与间皮素的表达相关的疾病的用途。


背景技术：

2.这里的陈述仅提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
3.嵌合抗原受体(car)是包含以下三个基本单元的分子：(1)胞外抗原结合基序，(2)连接/跨膜基序，和(3)胞内t细胞信号传导基序，其对所选择的抗原具有特异性。使用car的靶向t细胞疗法在治疗一些血液恶性肿瘤中已获得临床成功，然而，将表达car的t细胞疗法用于实体瘤治疗依然比较困难。
4.人间皮素(mesothelin，简称msln)是一种40kda的细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(gpi)
‑
连接的糖蛋白。该蛋白质作为70kd的前体被合成，然后被蛋白水解处理。间皮素的30kd氨基末端被分泌出来，并被称为巨核细胞强化因子(mpf)(yamaguchi et al.，j.biol.chem.269：805808，1994)。40kd的羧基末端作为成熟的间皮素与膜保持结合(chang et al.，natl.acad.sci.usa93：136140，1996)。
5.msln在正常的组织中并非必须的，在包括间皮在内的正常成人组织中存在很少，但在例如间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌中不正常的大量表达(chang k,pastan i.molecular cloning of mesothelin,a differentiation antigenpresent on mesothelium,mesotheliomas,and ovarian cancers.proc natl acad sciusa 1996；93:136
–
40.)。过量的间皮素表达首先在间皮瘤和卵巢癌中被发现，之后又相继在肺癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、胆道癌、子宫内膜癌、胸腺癌、结肠癌、乳腺癌中被发现(morello a,sadelain m,adusumilli p s.mesothelin
‑
targeted cars:driving t cellsto solid tumors[j].cancer discovery,2015,6(2).)。90％的类上皮恶性胸膜间皮瘤，69％肺腺癌，60％乳癌，46％食道癌表达间皮素(morello a,sadelain m,adusumilli ps.mesothelin
‑
targeted cars:driving t cells to solid tumors[j].cancer discovery,2015,6(2))。间皮素也在更具有侵略性的肺癌、乳腺癌(三阴性乳腺癌)和食道癌(高度发育不良和腺癌)中表达。因此，间皮素作为一个肿瘤抗原，是car
‑
t一个良好的靶点。
[0006]
因此，继续研究开发针对msln的car
‑
t，对于提高肿瘤治疗效果具有重要意义。目前，有以下专利中公开了针对msln的cart，如wo2013063419、cn109097396、wo2017112741、wo2020043152等。


技术实现要素：

[0007]
本披露提供一种具有全新序列的针对msln的嵌合抗原受体(msln
‑
car)，经实验验证发现，这些msln
‑
car可特异性与人msln结合，并可在体内和体外有效的杀伤肿瘤靶细胞。
[0008]
在一些实施方案中，所述的嵌合抗原受体(car)分子，其包含：
[0009]
i)抗间皮素结合结构域，
[0010]
ii)跨膜结构域，和
[0011]
iii)细胞内信号传导结构域；
[0012]
其中所述的抗间皮素结合结构域包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含如下所示的lcdr：
[0013]
lcdr1如x1asqrissyls(seq id no：94)所示；
[0014]
lcdr2如x2asx3lx4s(seq id no：95)所示；
[0015]
lcdr3如qsyayfdsnnwha(seq id no：6)所示；和
[0016]
重链可变区包含如下所示的hcdr：
[0017]
hcdr1如fyx5yac(seq id no：91)所示；
[0018]
hcdr2如ciytagsgstyyax6x7x8kg(seq id no：92)所示；
[0019]
hcdr3如stx9ntrstyylnx
10
(seq id no：93)所示；
[0020]
其中，x1选自q或r，x2选自a或g，x3选自s或t，x4选自a或q，x5选自f、y或h，x6选自s或d，x7选自w或s，x8选自a或v，x9选自s或a，x
10
选自t或l。
[0021]
在一些实施方案中，如前所述的car分子，其间皮素结合结构域包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0022]
a)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0023]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0024]
b)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0025]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0026]
c)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0027]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0028]
d)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0029]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0030]
e)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0031]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0032]
f)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0033]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0034]
g)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0035]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0036]
h)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0037]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0038]
i)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0039]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0040]
j)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0041]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0042]
k)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0043]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0044]
l)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0045]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0046]
m)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0047]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0048]
n)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0049]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0050]
o)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0051]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0052]
p)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0053]
所述重链可变区包含分别如seq id no：8、seq id no：2和seq id no：3所示的
hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0054]
q)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0055]
所述重链可变区包含分别如seq id no：8、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0056]
r)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0057]
所述重链可变区包含分别如seq id no：8、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0058]
s)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0059]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：9和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0060]
t)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0061]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：9和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0062]
u)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0063]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：9和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0064]
v)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0065]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：10和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
[0066]
w)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0067]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：10和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0068]
在一些实施方案中，如前所述的car分子，其间皮素结合结构域包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0069]
所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0070]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
[0071]
所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0072]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0073]
在一些实施方案中，如前所述的car，其抗间皮素结合结构域包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0074]
所述轻链可变区序列如seq id no：25、26、27、28、29、30或32所示；和/或
[0075]
所述重链可变区序列如seq id no：16、17、18、19、20、21、22、23、24、31或33所示。
[0076]
在一些实施方案中，如前所述的car，其抗间皮素结合结构域包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0077]
a1)所述轻链可变区序列如seq id no：25所示或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0078]
所述重链可变区序列如seq id no：16、19、20、21或22所示，或与seq id no：16、19、20、21或22分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
[0079]
b1)所述轻链可变区序列如seq id no：26所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0080]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22、23或33所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22、23或33分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
[0081]
c1)所述轻链可变区序列如seq id no：27所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0082]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22或23所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22或23分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
[0083]
d1)所述轻链可变区序列如seq id no：28所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0084]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22或23所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22或23分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
[0085]
e1)所述轻链可变区序列如seq id no：29所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0086]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22、23或24所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22、23或24分别具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；
[0087]
f1)所述轻链可变区序列如seq id no：30所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0088]
所述重链可变区序列如seq id no：19、20、21、23或24所示，或与seq id no：19、20、21、23或24分别具有至少95％序列同一性；或
[0089]
g1)所述轻链可变区序列如seq id no：32所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性；和
[0090]
所述重链可变区序列如seq id no：31所示，或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
[0091]
在一些实施方案中，如前所述的car，其抗间皮素结合结构域包含如seq id no：29所示的轻链可变区和如seq id no：20所示的重链可变区；或
[0092]
包含如seq id no：30所示轻链可变区和如seq id no：21所示的重链可变区。
[0093]
在一些实施方案中，如前所述的car，其抗间皮素结合结构域是scfv。
[0094]
在一些实施方案中，如前所述的car，其抗间皮素结合结构域scfv包含：
[0095]
如seq id no：25、26、27、28、29、30或32所示的轻链可变区，和/或
[0096]
如seq id no：16、17、18、19、20、21、22、23、24、31或33所示的重链可变区。
[0097]
在一些实施方案中，如前所述的car，其抗间皮素结合结构域scfv包含：
[0098]
如seq id no：29所示的轻链可变区和如seq id no：20所示的重链可变区；或
[0099]
如seq id no：30所示轻链可变区和如seq id no：21所示的重链可变区。
[0100]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的抗间皮素结合结构域包含如seq id no：34
‑
74中任一序列。
[0101]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的抗间皮素结合结构域包含如seq id no：51、52、53、58、59或60所示的序列。
[0102]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的跨膜结构域包含选自如下任一蛋白质的跨膜结构域：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
[0103]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的跨膜结构域包含seq id no：77所示的序列。
[0104]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的抗间皮素结合结构域通过铰链区与所述的跨膜结构域相连。
[0105]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的铰链区包含seq id no：76所示的序列。
[0106]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的细胞内信号传导结构域为cd3ζ的功能性信号传导结构域；
[0107]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的cd3ζ的功能性信号传导结构域包含如seq id no：79所示的序列。
[0108]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域。
[0109]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的共刺激结构域包含选自如下任一蛋白质的的功能性信号传导结构域：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、cd278(也被称为“icos”)和4
‑
1bb(cd137)。
[0110]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的共刺激结构域为4
‑
1bb的功能性信号传导结构域。
[0111]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的4
‑
1bb的功能性信号传导结构域包含如seq id no：78所示的序列。
[0112]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的细胞内信号传导结构域包含如seq idno：78的所示序列和/或如seq id no：79所示的序列。
[0113]
在一些实施方案中，如前所述的car，其进一步包含前导序列。
[0114]
在一些实施方案中，如前所述的car，其中所述的前导序列包含如seq id no：75所示的序列。
[0115]
在一些实施方案中，如前所述的car，其包含如seq id no：80
‑
87中任一所示的序列。
[0116]
在一些实施方案中，如前所述的car，其包含如seq id no：82或85所示的序列。
[0117]
本披露还提供一种特异性结合间皮素的抗体，其包含前述任一项中所述的抗间皮素结合结构域。
[0118]
在一些实施方案中，其中所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0119]
轻链可变区包含如下所示的lcdr：
[0120]
lcdr1如x1asqrissyls(seq id no：94)所示；
[0121]
lcdr2如x2asx3lx4s(seq id no：95)所示；
[0122]
lcdr3如qsyayfdsnnwha(seq id no：6)所示；和
[0123]
重链可变区包含如下所示的hcdr：
[0124]
hcdr1如fyx5yac(seq id no：91)所示；
[0125]
hcdr2如ciytagsgstyyax6x7x8kg(seq id no：92)所示；
[0126]
hcdr3如stx9ntrstyylnx
10
(seq id no：93)所示；
[0127]
其中，x1选自q或r，x2选自a或g，x3选自s或t，x4选自a或q，x5选自f、y或h，x6选自s或d，x7选自w或s，x8选自a或v，x9选自s或a，x
10
选自t或l。
[0128]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含如下任一项所述的轻链可变区和重链可变区，其中：
[0129]
a)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0130]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0131]
b)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0132]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0133]
c)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0134]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0135]
d)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0136]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0137]
e)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0138]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0139]
f)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0140]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：11所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0141]
g)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0142]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0143]
h)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0144]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0145]
i)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0146]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0147]
j)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0148]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0149]
k)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0150]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0151]
l)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0152]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0153]
m)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0154]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0155]
n)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0156]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0157]
o)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：14和seq id no：6所示的
lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0158]
所述重链可变区包含分别如seq id no：8、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0159]
p)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0160]
所述重链可变区包含分别如seq id no：8、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0161]
q)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0162]
所述重链可变区包含分别如seq id no：8、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0163]
r)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0164]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：9和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0165]
s)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0166]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：9和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0167]
t)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0168]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：9和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
[0169]
u)所述轻链可变区包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0170]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：10和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
[0171]
v)所述轻链可变区包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0172]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：10和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0173]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其中所述的特异性结合间皮素的抗体包含：
[0174]
轻链可变区，其包含分别如seq id no：13、seq id no：5和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0175]
所述重链可变区包含分别如seq id no：1、seq id no：2和seq id no：12所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或
[0176]
轻链可变区，其包含分别如seq id no：4、seq id no：15和seq id no：6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和
[0177]
所述重链可变区包含分别如seq id no：7、seq id no：2和seq id no：3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0178]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0179]
所述轻链可变区序列如seq id no：25、26、27、28、29或30所示；和/或
[0180]
所述重链可变区序列如seq id no：16、17、18、19、20、21、22、23或24所示。
[0181]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0182]
a1)所述轻链可变区序列如seq id no：25所示，或与其具有至少95％序列同一性；和
[0183]
所述重链可变区序列如seq id no：16、19、20、21或22所示，或与seq id no：16、19、20、21或22分别具有至少95％序列同一性；
[0184]
b1)所述轻链可变区序列如seq id no：26所示或，与其具有至少95％序列同一性；和
[0185]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22或23所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22或23具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0186]
c1)所述轻链可变区序列如seq id no：27所示，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和
[0187]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22或23所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22或23具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0188]
d1)所述轻链可变区序列如seq id no：28所示，或与其具有至少95％序列同一性；和
[0189]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22或23所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22或23具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；
[0190]
e1)所述轻链可变区序列如seq id no：29所示，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和
[0191]
所述重链可变区序列如seq id no：16、18、19、20、21、22、23或24所示，或与seq id no：16、18、19、20、21、22、23或24具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；或
[0192]
f1)所述轻链可变区序列如seq id no：30所示，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；和
[0193]
所述重链可变区序列如seq id no：19、20、21、23或24所示，或与seq id no：19、20、21、23或24具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
[0194]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含轻链可变区和重链可变区，其中：
[0195]
所述轻链可变区序列如seq id no：29所示和所述重链可变区序列如seq id no：20所示；或
[0196]
所述轻链可变区序列如seq id no：30所示和所述重链可变区序列如seq id no：21所示。
[0197]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体是单链抗体。
[0198]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的单链抗体包含：
[0199]
如seq id no：16、17、18、19、20、21、22、23或24所示的重链可变区，和/或
[0200]
如seq id no：25、26、27、28、29或30所示的轻链可变区。
[0201]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含如seq id no：34
‑
72中任一序列。
[0202]
在一些实施方案中，如前所述的特异性结合间皮素的抗体，其包含如seq id no：51、52、53、58、59或60所示的序列。
[0203]
本披露还提供一种核酸分子，其编码前述任一项car或前述任一项特异性结合间皮素的抗体。
[0204]
在一些实施方案中，其中所述的核酸分子其包含如seq id no：88或89所示序列。
[0205]
本披露还提供一种重组载体，其包含如前任一项所述的核酸分子。
[0206]
在一些实施方案中，其中所述的重组载体选自dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
[0207]
在一些实施方案中，其中所述的重组载体进一步包含启动子。
[0208]
在一些实施方案中，其中所述的启动子是ef
‑
1启动子。
[0209]
在一些实施方案中，其中所述的ef
‑
1启动子包含seq id no：90所示的序列。
[0210]
本披露还提供一种细胞，其包含如前所述的重组载体。
[0211]
在一些实施方案中，其中所述的细胞是免疫效应细胞，并表达如前任一项所述的car。
[0212]
在一些实施方案中，其中所述的免疫效应细胞是nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞或t细胞。
[0213]
在一些实施方案中，其中所述的免疫效应细胞是cd8 t细胞或cd4 t细胞。
[0214]
本披露还提供一种生产细胞的方法，其包含将前述的重组载体转导至免疫效应细胞的步骤。
[0215]
本披露还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的前述任一项所述的特异性结合间皮素的抗体，或前述的核酸分子，或前述的细胞，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
[0216]
本披露还提供表达如前任一项所述的car的细胞，或如前所述的特异性结合间皮素的抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的药物组合物在制备治疗或预防癌症的药物中的用途；优选地，其中所述的癌症选自：间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胆管癌、乳腺癌癌、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和膀胱癌；更优选地，其中所述的癌症与间皮素表达相关。
[0217]
在一些实施方案中，本披露提供一种治疗与癌症方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的表达如前任一项所述的分离car的细胞，或如前所述的特异性结合间皮素的抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的药物组合物；优选地，其中所述的癌症选自：间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胆管癌、乳腺癌癌、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和膀胱癌；更优选地，其中所述的癌症与间皮素表达相关。
[0218]
在一些实施方案中，本披露提供一种用于治疗癌症的表达如前任一项所述的分离car的细胞，或如前所述的特异性结合间皮素的抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的药物组合物；优选地，其中所述的癌症选自：间皮瘤、前列腺癌、肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、胆管癌、乳腺癌癌、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺瘤、卵巢癌、结肠直肠癌和膀胱癌；更优选地，其中所述的癌症与间皮素表达相关。
附图说明：
[0219]
图1：不同msln
‑
scfv抗体细胞水平结合人msln实验结果。
[0220]
图2：msln
‑
car介导的t细胞激活实验结果。
[0221]
图3：图3a显示msln
‑
cart细胞存活率
‑
时间曲线；图3b显示msln
‑
cart细胞增殖倍数
‑
时间曲线；图3c显示msln
‑
cart细胞中car阳性率；图3d显示msln
‑
cart细胞的mfi。
[0222]
图4：图4a显示无抗原重复刺激时，msln
‑
cart细胞增殖曲线；图4b显示抗原重复刺激后，测得的msln
‑
cart细胞的增殖曲线。
[0223]
图5：显示不同msln
‑
cart细胞对靶细胞的杀伤率。
[0224]
图6：图6a显示msln
‑
cart细胞对靶细胞的杀伤过程中il
‑
2的分泌；图6b显示msln
‑
cart细胞对靶细胞的杀伤过程中ifnγ的分泌。
[0225]
图7：图7a显示小鼠体重的变化；图7b显示小鼠体内肿瘤体积的变化。
[0226]
图8：msln
‑
cart细胞在小鼠体的持续增殖情况。
[0227]
发明详述
[0228]
定义
[0229]
为了更容易理解本披露，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科技术语均具有与如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0230]
术语“嵌合抗原受体”或“car”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在某些实施方式中，car包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。在某些实施方式中，多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与t细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4
‑
1bb(即，cd137)、cd27和/或cd28。在一个方面，car包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，car包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面中，car包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性
分子的两个功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面中，car包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含至少两个来源于一个或更多个共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，car包含在car融合蛋白的氨基末端(n
‑
末端)的任选的前导序列。在一个方面，car进一步包含在细胞外抗原结合结构域的n
‑
末端的前导序列，其中所述前导序列任选地在所述car的细胞加工和定位于细胞膜期间被从抗原结合结构域(例如scfv)上切割下来。
[0231]
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使作为效应物，经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
[0232]
术语“间皮素”是指40kda的蛋白质间皮素，其通过由糖基磷脂酰肌醇(gpi)键和氨基末端的31kda脱落片段(称为巨核细胞增强因子，mpf)锚固于细胞膜。两个片段都含有n
‑
糖基化位点。该术语也指40kda羧基端片段的可溶性剪接变体，也称为“可溶性间皮素/mpf
‑
相关的”。优选地，该术语是指genbank登录号aah03512.1的人间皮素及其天然切割下来的部分，例如在细胞膜(例如癌细胞膜)上表达的。
[0233]
本披露所述的“抗体”指免疫球蛋白，完整全长抗体是由两条重链和两条轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1、igg2、igg3、igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中每类ig都可以有κ链或λ链。
[0234]
抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(fv区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(cdr)。每条轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)由3个cdr区4个fr区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。轻链的3个cdr区指lcdr1、lcdr2、和lcdr3；重链的3个cdr区指hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0235]
本披露的抗体包括人抗体。
[0236]
术语“鼠源抗体”在本披露中为根据本领域知识和技能制备的针对人msln的单克隆抗体。制备时用msln抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本披露一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗msln抗体，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源igg1、igg2、igg3或其变体的重链恒定区。
[0237]
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将某物种(如鼠)的抗体的可变区与另一物种(如人)的抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻异源性抗体诱发的免疫应答反应。示例性的，建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本披露一个优选的实施方案中，所述的msln嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ
链或其变体的轻链恒定区。所述的msln嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源igg1、igg2、igg3、igg4或其变体的重链恒定区，优选包含人源igg1、igg2或igg4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如l234a和/或l235a突变，和/或s228p突变)的igg1、igg2或igg4变体。
[0238]
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为cdr移植抗体(cdr
‑
grafted antibody)，是指将某物种(如鼠)抗体的cdr序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量异原蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共dna数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在“vbase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在kabat，e.a.等人，1991sequences of proteins of immunological interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本披露的人源化抗体也包括进一步由酵母菌展示对cdr进行亲和力成熟突变后的人源化抗体。
[0239]
术语“人抗体”与“人源抗体”可以互换使用，是指有一或多个可变区和恒定区来源于人免疫球蛋白序列。其中一个优选的方式是所有的可变区和恒定区均来自于人免疫球蛋白序列，即“完全人源抗体”或“全人抗体”。这些抗体可以通过多种方式制备获得，包括通过噬菌体展示技术，从人pbmc、脾脏、淋巴结组织分离b细胞，构建天然单链噬菌体人抗体库，或者通过免疫可表达人抗体轻重链的转基因小鼠，筛选获得的抗体。本披露的人抗体还包括在人抗体基础上经过一个或更多个氨基酸的突变获得的仍结合目标抗原的抗体。
[0240]
本披露“抗体”除包括全长抗体外，还包括能结合抗原的抗原结合片段。术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于fab，fab'、f(ab')2、fv片段、scfv抗体片段、二硫键
‑
连接的fvs(sdfv)、由vh和ch1结构域组成的fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdab(vl或vh)、camelid vhh结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的cdr或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v
‑
nar和双
‑
scfv(参见，例如hollinger和hudson，nature biotechnology 23:1126
‑
1136,2005)。抗原结合片段也可以接枝到基于多肽的支架，比如iii型纤连蛋白(fn3)(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。
[0241]
术语“scfv”或“单链抗体”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，scfv可以以任何顺序(例如相对于多肽的n
‑
末端和c末端)具有所述的vl和vh可变区，scfv可以包括vl
‑
接头
‑
vh或可以包括vh
‑
接头
‑
vl。
[0242]
包含抗体或其抗体片段的本披露的car部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域被表达为连续的多肽链的一部分，所述多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdab)、单链抗体(scfv)人源化抗体或双特异性抗体(harlow等人,1999,in:using antibodies:
alaboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny；harlow等人,1989,in:antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor,new york；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879
‑
5883；bird等人,1988,science 242:423
‑
426)。在一个方面，本披露的car组合物的抗原结合结构域包括抗体片段。在另一个方面，car包括包含scfv的抗体片段。
[0243]
术语“互补决定区”、“cdr”或“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3)，每个轻链可变区中存在三个cdr(lcdr1、lcdr2、lcdr3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定cdr的氨基酸序列边界，包括“kabat”编号规则(参见kabat等(1991)，“sequences of proteins of immunological interest”，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda，md)、“chothia”编号规则(参见al
‑
lazikani等人，(1997)jmb 273：927
‑
948)和immunogentics(imgt)编号规则(lefranc m.p.，immunologist，7，132
‑
136(1999)；lefranc，m.p.等，dev.comp.immunol.，27，55
‑
77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循kabat规则，所述重链可变域(vh)中的cdr氨基酸残基编号为31
‑
35(hcdr1)、50
‑
65(hcdr2)和95
‑
102(hcdr3)；轻链可变域(vl)中的cdr氨基酸残基编号为24
‑
34(lcdr1)、50
‑
56(lcdr2)和89
‑
97(lcdr3)。遵循chothia规则，vh中的cdr氨基酸编号为26
‑
32(hcdr1)、52
‑
56(hcdr2)和95
‑
102(hcdr3)；并且vl中的氨基酸残基编号为26
‑
32(lcdr1)、50
‑
52(lcdr2)和91
‑
96(lcdr3)。通过组合kabat和chothia两者的cdr定义，cdr由人vh中的氨基酸残基26
‑
35(hcdr1)、50
‑
65(hcdr2)和95
‑
102(hcdr3)和人vl中的氨基酸残基24
‑
34(lcdr1)、50
‑
56(lcdr2)和89
‑
97(lcdr3)构成。遵循imgt规则，vh中的cdr氨基酸残基编号大致为26
‑
35(cdr1)、51
‑
57(cdr2)和93
‑
102(cdr3)，vl中的cdr氨基酸残基编号大致为27
‑
32(cdr1)、50
‑
52(cdr2)和89
‑
97(cdr3)。遵循imgt规则，抗体的cdr区可以使用程序imgt/domaingap align确定。除非另有说明，本披露实施例涉及的抗体可变区和cdr序列均适用“kabat”编号规则。
[0244]
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。
[0245]
术语“kd”是指特定抗体
‑
抗原相互作用的解离平衡常数。
[0246]
氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列及必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如blast、blast
‑
2、align、align
‑
2或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
[0247]
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5
‑
8章和15章。例如，鼠可以用人epcam或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的cdr区加上一个或更多个人源fr区。人fr种系序列可以通过比对imgt人类抗体可变区种系基因数据库和moe软件，从immunogenetics(imgt)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，
2001isbn012441351上获得。
[0248]
本披露工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cdna序列，可以克隆并重组至gs表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染cho细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在fc区的高度保守n端位点。通过表达与人epcam特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的a或g sepharose ff柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用ph梯度法洗脱结合的抗体，用sds
‑
page检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如
‑
70℃，或者冻干。
[0249]
术语“癌症”是指特征为异常细胞的不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或穿过血流和淋巴系统至身体的其他部分。各种癌症的实例是本文描述的，包括但不限于间皮瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0250]
术语“与间皮素的表达有关的疾病”包括，但不限于与间皮素的表达有关的疾病或与表达间皮素的细胞有关的病症，包括例如增殖性疾病比如癌症或恶性肿瘤或癌变前病症，比如间皮增生；或与表达间皮素的细胞有关的非癌相关适应症。表达间皮素的各种癌症的实例包括，但不限于间皮瘤、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
[0251]
术语“保守的序列修饰”是指不会显著地影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术(比如定点诱变和pcr
‑
介导的诱变)引入到本发明的抗体或抗体片段中。保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β
‑
支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在本披露的car之内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能性测定来测试改变的car例如结合间皮素的能力。
[0252]
术语“刺激”是指由刺激性分子(例如，tcr/cd3复合体或car)与其同源配体(或在car的情况下为肿瘤抗原)的结合，由此介导信号转导事件(比如但不限于经由tcr/cd3复合体的信号转导或经由适合的nk受体或car的信号传导结构域的信号转导)而诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
[0253]
术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，t细胞、nk细胞、b细胞)表达的提供细胞质信号传导的序列分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如tcr/cd3复合体与负载有肽的mhc分子的结合启动的初级信号，并且其导致介导t细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可
以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号传导基序。特别地用于本披露的含有itam的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：cd3ζ、常见的fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcepsilon r1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12。在本披露的特异性car中，在本披露的任一个或更多个car中的细胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如cd3
‑
ζ的初级信号传导序列。在本披露的特异性car中，cd3
‑
ζ的初级信号传导序列是如seq id no：79中提供的序列或来自非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。
[0254]“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括t细胞，例如α/βt细胞和γ/δt细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。
[0255]
术语“抗原呈递细胞”或“apc”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(mhc的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，比如辅助细胞(例如，b
‑
细胞、树突细胞等)。t
‑
细胞可以使用其t
‑
细胞受体(tcr)识别这些复合体。apc加工抗原且将其呈递给t
‑
细胞。
[0256]
术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含有car的细胞例如cart细胞的免疫效应子功能的信号。在例如cart细胞中免疫效应子功能的实例包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
[0257]
在一种实施方式中，细胞内信号传导结构域可以包括一级细胞内信号传导结构域。示例性的一级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子。在一种实施方式中，细胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些。例如，在cart中，一级细胞内信号传导结构域可以包含t细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。一级细胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam的信号传导基序。含有itam的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：cd3ζ、常见fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcepsilon r1b)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12。
[0258]
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“cd3
‑
ζ”或“tcrζ”定义为如genban acc.no.bag36664.1提供的蛋白质或来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基，且“ζ刺激结构域”或“cd3
‑
ζ刺激结构域”或“tcr
‑
ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递t细胞活化所需的起始信号。在一个方面，ζ的细胞质结构域包括genbank acc.no.bag36664.1的残基52至164或作为其功能性同源物的来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基。
[0259]
术语“共刺激性分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导t细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子为除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于mhc i类分子，btla和toll配体受体，以及ox40、cd27、cd28、cds、icam
‑
1、lfa
‑
1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4
‑
1bb(cd137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括cds、icam
‑
1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla
‑
6、cd49f、
itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa
‑
1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa
‑
1、itgb7、nkg2d、nkg2c、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb
‑
a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo
‑
3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp
‑
76、pag/cbp、以及特异性地结合cd83的配体。
[0260]
共刺激性细胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族为代表：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(slam蛋白质)、和nk细胞受体。这样的分子的实例包括cd27、cd28、4
‑
1bb(cd137)、ox40、gitr、cd30、cd40、icos、baffr、hvem、icam
‑
1、与淋巴细胞功能相关的抗原
‑
1(lfa
‑
1)、cd2、cds、cd7、cd287、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7
‑
h3、以及特异性地结合cd83的配体等。
[0261]
细胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然细胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。
[0262]
术语“4
‑
1bb”是指具有如genbank acc.no.aaa62478.2提供的氨基酸序列的tnfr超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4
‑
1bb共刺激结构域”被定义为genbank acc.no..aaa62478.2的氨基酸残基214
‑
255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
[0263]
术语“编码”是指多核苷酸比如基因、cdna、或mrna中的核苷酸的特异性序列在生物学过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，该聚合物以及大分子具有确定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则基因、cdna或rna编码蛋白质。其核苷酸序列与mrna序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cdna的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cdna的蛋白或其他产物。
[0264]
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可包括内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子的程度。
[0265]
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换地使用，并且是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。
[0266]
术语“内源的”是指来自或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
[0267]
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
[0268]
术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0269]
术语“转移载体”是指包括分离的核酸且可用于将所分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。大量载体是本领域已知的，包括，但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当被解释为进一步包括非质粒和促进核酸转移到细胞中的非病毒化合物，比如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括，但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体等。
[0270]
术语"表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括被掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
[0271]
术语“慢病毒”是指逆转录病毒家族的种类。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的dna中，从而它们是基因递送载体的最有效方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。术语“慢病毒载体”是指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别地包括自我灭活性慢病毒载体，如milone等人,mol.ther.17(8):1453
–
1464(2009)中提供的。可用于临床中的慢病毒载体的其它实例包括，但不限于例如来自oxford biomedica的lentivector基因递送技术，来自lentigen lentimax的载体系统等。慢病毒载体的非临床种类也是可获得的，并且将是本领域技术人员已知的。
[0272]
术语“分离的”是指从天然状态改变或除去。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽为“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境比如例如宿主细胞中。
[0273]
术语“有效连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接编码序列。有效连接的dna序列可以彼此邻接，并且在结合两个蛋白编码区时必需在同一读码框中。
[0274]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以包括蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没限制。多肽包括含有彼此通过肽键结合的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。正如本文中使用的那样，该术语是指短链(其在本领域通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及较长链(其在本领域通常也称为蛋白质，其存在多种类型)。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、重组肽或其组合。
[0275]
术语“启动子”是指被细胞的合成机构识别的、或被引入了合成机构、启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的dna序列。
[0276]
术语“柔性的多肽接头”是指由比如单独或联合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成的肽接头，其将可变的重链和可变的轻链区域连接在一起。在一种实施方式中，柔性的多肽接头为gly/ser接头且包含氨基酸序列(gly4ser)
n
，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在本披露的范围内也包括被描述在wo2012/138475中的接头，将其并入本文作为参考。
[0277]
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。
[0278]“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
[0279]“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述特异性结合msln的抗体、cart细胞与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0280]
术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
[0281]“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
[0282]
术语“预防”是指预防性或保护性治疗疾病或疾病状态。
[0283]
术语“治疗(treat、treatment、treating)”是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本发明的car)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。在特定实施方式中，术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。在其它实施方案中，术语“治疗”是指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。在其它实施方案中，术语“治疗”是指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
具体实施方式
[0284]
以下结合实施例用于进一步描述本披露，但这些实施例并非限制着本披露的范围。本披露实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0285]
实施例
[0286]
实施例1.抗msln单链抗体分子的制备
[0287]
1.经大量实验，我们构建了一系列特异性结合msln的scfv(简称msln
‑
scfv)，其轻/重链可变区、cdr区、全长序列如下所示：
[0288]
表1.msln
‑
scfv重链可变区cdr
[0289][0290][0291]
表2.msln
‑
scfv轻链可变区cdr
[0292][0293]
2.本披露中的针对msln的scfv的重、轻链可变区如下所示：
[0294]
表3.msln
‑
scfv重、轻链可变区
[0295]
[0296]
[0297][0298]
将上述的vh与vl通过连接子连接，示例性的连接子为(g4s)n，其中n≥1，获得单链抗体。示例性的将上述抗体的重、轻链可变区通过连接子(g4s)3连接，构建msln
‑
scfv。
[0299]
表4.msln
‑
scfv的重、轻链可变区组成
[0300][0301]
注：h1l1表示该msln
‑
scfv的重链可变区为h1，轻链可变区为l1。
[0302]
示例性的本披露中的msln
‑
scfv的序列如下所示：
[0303]
h1l1
[0304]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0305]
seq id no：34
[0306]
h1l2
[0307]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedva
tyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0308]
seq id no：35
[0309]
h1l3：
[0310]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0311]
seq id no：36
[0312]
h1l4：
[0313]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0314]
seq id no：37
[0315]
h1l5：
[0316]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0317]
seq id no：38
[0318]
h3l2：
[0319]
evqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvaciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmsslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0320]
seq id no：39
[0321]
h3l3：
[0322]
evqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvaciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmsslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0323]
seq id no：40
[0324]
h3l4：
[0325]
evqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvaciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmsslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0326]
seq id no：41
[0327]
h3l5：
[0328]
evqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvaciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmsslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0329]
seq id no：42
[0330]
h4l1：
[0331]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstsntrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0332]
seq id no：43
[0333]
h4l2：
[0334]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstsntrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0335]
seq id no：44
[0336]
h4l3：
[0337]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstsntrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0338]
seq id no：45
[0339]
h4l4：
[0340]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstsntrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0341]
seq id no：46
[0342]
h4l5：
[0343]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstsntrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0344]
seq id no：47
[0345]
h4l6：
[0346]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstsntrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedva
tyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0347]
seq id no：48
[0348]
h5l1：
[0349]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0350]
seq id no：49
[0351]
h5l2：
[0352]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0353]
seq id no：50
[0354]
h5l3：
[0355]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0356]
seq id no：51
[0357]
h5l4：
[0358]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0359]
seq id no：52
[0360]
h5l5：
[0361]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0362]
seq id no：53
[0363]
h5l6：
[0364]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0365]
seq id no：54
[0366]
h6l1：
[0367]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0368]
seq id no：55
[0369]
h6l2：
[0370]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0371]
seq id no：56
[0372]
h6l3：
[0373]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0374]
seq id no：57
[0375]
h6l4：
[0376]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0377]
seq id no：58
[0378]
h6l5：
[0379]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0380]
seq id no：59
[0381]
h6l6：
[0382]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0383]
seq id no：60
[0384]
h7l1：
[0385]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyhyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedva
tyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0386]
seq id no：61
[0387]
h7l2：
[0388]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyhyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0389]
seq id no：62
[0390]
h7l3：
[0391]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyhyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0392]
seq id no：63
[0393]
h7l4：
[0394]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyhyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0395]
seq id no：64
[0396]
h7l5：
[0397]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyhyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0398]
seq id no：65
[0399]
h8l2：
[0400]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0401]
seq id no：66
[0402]
h8l3：
[0403]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0404]
seq id no：67
[0405]
h8l4：
[0406]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0407]
seq id no：68
[0408]
h8l5：
[0409]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0410]
seq id no：69
[0411]
h8l6：
[0412]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0413]
seq id no：70
[0414]
h9l5
[0415]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0416]
seq id no：71
[0417]
h9l6
[0418]
evqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0419]
seq id no：72
[0420]
h10l8：
[0421]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveik
[0422]
seq id no：73
[0423]
h9l7：
[0424]
qqqleesggglvkpegsltltckasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewiaciytagsgstyyaswakgrftiskassttvtlqmtslaaadtatyfcarstantrstyylnlwgpgtlvtvssggggsggggsggggsdvvmtqtpasvsepvggtvtikcqasqrissylswyqqkpgqrpkllifgastlasgvpsrfkgsgsgteytltisdlecadaat
yycqsyayfdsnnwhafgggtevvv
[0425]
seq id no：74
[0426]
示例性的，msln
‑
scfv的cdr区序列如下：
[0427]
表5.msln
‑
scfv的cdr
[0428]
[0429]
[0430]
[0431][0432]
本披露中的msln
‑
scfv的cdr区具有共性，可归纳为如下通式：
[0433]
轻链可变区包含如下所示的lcdr：
[0434]
lcdr1如x1asqrissyls(seq id no：94)所示；
[0435]
lcdr2如x2asx3lx4s(seq id no：95)所示；
[0436]
lcdr3如qsyayfdsnnwha(seq id no：6)所示；和
[0437]
重链可变区包含如下所示的hcdr：
[0438]
hcdr1如fyx5yac(seq id no：91)所示；
[0439]
hcdr2如ciytagsgstyyax6x7x8kg(seq id no：92)所示；和
[0440]
hcdr3如stx9ntrstyylnx
10
(seq id no：93)所示；
[0441]
其中，x1选自q或r，x2选自a或g，x3选自s或t，x4选自a或q，x5选自f、y或h，x6选自s或d，x7选自w或s，x8选自a或v，x9选自s或a，x
10
选自t或l。
[0442]
3.msln
‑
scfv抗体的表达和纯化
[0443]
将msln
‑
scfv序列末端增加his标签，经基因公司合成，然后克隆至phr
‑
igg表达载体中，在gbico expi
‑
cho
‑
s表达系统表达。收取上清样品，高速离心去除杂质，使用capto l(ge heathcare 17
‑
5478
‑
02)进行亲和层析，利用纯水冲洗后用pbs平衡柱子，将上清结合至柱子，用0.1m醋酸缓冲液在ph3.5条件下洗脱目的蛋白，用1m tris
‑
hcl中和。a280检测吸光度计算得率，得到msln
‑
scfv抗体。
[0444]
实施例2.msln
‑
car的构建
[0445]
将上述msln
‑
scfv片段与跨膜区、信号转导结构域、共刺激结构域等进行重组，构建完整的msln
‑
car。相关序列如下所示：
[0446]
1.cd8前导氨基酸序列：
[0447]
malpvtalllplalllhaarp
[0448]
sqe id no：75
[0449]
2.cd8铰链区氨基酸序列：
[0450]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
[0451]
sqe id no：76
[0452]
3.cd8跨膜区氨基酸序列：
[0453]
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc
[0454]
sqe id no：77
[0455]
4.4
‑
1bb细胞内结构域氨基酸序列：
[0456]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0457]
sqe id no：78
[0458]
5.cd3结构域氨基酸序列：
[0459]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0460]
sqe id no：79
[0461]
6.构建完整的msln
‑
car的氨基酸序列如下所示：
[0462]
(1)h5l3
‑
car：
[0463]
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeays
eigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0464]
sqe id no：80
[0465]
(2)h5l4
‑
car：
[0466]
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0467]
sqe id no：81
[0468]
(3)h5l5
‑
car：
[0469]
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylntwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0470]
sqe id no：82
[0471]
(4)h6l4
‑
car：
[0472]
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspssvsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkapklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0473]
sqe id no：83
[0474]
(5)h6l5
‑
car：
[0475]
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0476]
sqe id no：84
[0477]
(6)h6l6
‑
car：
[0478]
malpvtalllplalllhaarpevqllesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyyyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0479]
sqe id no：85
[0480]
(8)h11l8
‑
car：
[0481]
malpvtalllplalllhaarpevqlvesggglvqpggslrlscaasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewvsciytagsgstyyaswakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarstantrstyylnlwgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqrissylswyqqkpgkvpklliygastlasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqsyayfdsnnwhafgggtkveiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0482]
sqe id no：86
[0483]
(9)h10l7
‑
car：
[0484]
malpvtalllplalllhaarpqqqleesggglvkpegsltltckasgfdlgfyfyacwvrqapgkglewiaciytagsgstyyaswakgrftiskassttvtlqmtslaaadtatyfcarstantrstyylnlwgpgtlvtvssggggsggggsggggsdvvmtqtpasvsepvggtvtikcqasqrissylswyqqkpgqrpkllifgastlasgvpsrfkgsgsgteytltisdlecadaatyycqsyayfdsnnwhafgggtevvvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0485]
sqe id no：87
[0486]
(10)h5l5
‑
car核酸序列：
[0487]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctgctcgaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggaagcctcagactgagctgtgctgccagcggcttcgatctgggcttctacttctacgcttgttgggtgaggcaagcccccggcaaaggactggagtgggtgagctgcatctatactgccggctccggctccacatactatgccagctgggccaagggaaggttcactatctctagggacaacagcaagaacactctgtatctgcagatgaactctctgagggctgaggatactgccgtctattactgcgccagaagcactgccaacacaaggagcacttactatctgaatacttggggccaaggcactctggtcactgtgagcagcggcggaggcggatcaggtggtggcggatctggaggtggcggaagcgatatccagatgactcagtccccttcctctctgagcgctagcgtgggagacagagtgactatcacatgcagggccagccagaggatctccagctatctgagctggtaccagcagaagcccggcaaggtgcctaagctgctgatctatggcgcctccactctggctagcggagtgccttccagatttagcggcagcggaagcggcactgacttcactctgactatcagctctctgcagccagaggacgtggctacttactactgccagagctacgcctacttcgacagcaacaactggcacgcctttggcggcggcactaaggtcgagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcag
tgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctga
[0488]
sqe id no：88
[0489]
(11)h6l6
‑
car核酸序列：
[0490]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctgctcgaaagcggcggaggactggtgcaacccggcggaagcctcagactgagctgtgctgccagcggcttcgatctgggcttctactactacgcttgttgggtgaggcaagcccccggcaaaggactggagtgggtgagctgcatctatactgccggctccggctccacatactatgccagctgggccaagggaaggttcactatctctagggacaacagcaagaacactctgtatctgcagatgaactctctgagggctgaggatactgccgtctattactgcgccagaagcactgccaacacaaggagcacttactatctgaatctgtggggccaaggcactctggtcactgtgagcagcggcggaggcggatcaggtggtggcggatctggaggtggcggaagcgatatccagatgactcagtccccttcctctctgagcgctagcgtgggagacagagtgactatcacatgccaagccagccagaggatctccagctatctgagctggtaccagcagaagcccggcaaggtgcctaagctgctgatctatgctgcctccactctgcagagcggagtgccttccagatttagcggcagcggaagcggcactgacttcactctgactatcagctctctgcagccagaggacgtggctacttactactgccagagctacgcctacttcgacagcaacaactggcacgcctttggcggcggcactaaggtcgagatcaaaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctga
[0491]
sqe id no：89然后将所述的msln
‑
car克隆到慢病毒载体中，在单一的编码框中产生一个全长的car分子，并使用ef1α启动子进行表达。
[0492]
ef1α启动子
[0493]
ctagtggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagc
cggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctac
[0494]
sqe id no：90本披露中使用的对照及其他蛋白序列如下：
[0495]
1.n2(针对cd19的car)氨基酸序列：
[0496]
malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitraggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0497]
sqe id no：96
[0498]
2.msln
‑
r3
‑
hfc4：
[0499]
mngseyfvkiqsflggaptedlkalsqqnvsmdlatfmklrtdavlpltvaevqkllgphveglkaeerhrpvrdwilrqrqddldtlglglqggipngylvldlsmqealseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0500]
seq id no：97
[0501]
3.rs7(nc)抗体，作为阴性对照
[0502]
rs7抗体重链：
[0503]
qvqlqqsgselkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvkqapgqglkwmgwintytgeptytddfkgrfafsldtsvstaylqisslkaddtavyfcarggfgssywyfdvwgqgslvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0504]
seq id no：98
[0505]
rs7抗体轻链：
[0506]
diqltqspsslsasvgdrvsitckasqdvsiavawyqqkpgkapklliysasyrytgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfavyycqqhyitpltfgagtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0507]
seq id no：99
[0508]
实施例3.第三代慢病毒包装系统及慢病毒载体包装
[0509]
使用的第三代慢病毒包装系统，包括表达质粒、包膜质粒和包装质粒的四质粒系统进行包病毒。
[0510]
将msln
‑
car核酸序列插入pcdh
‑
ef1
‑
mcs
‑
ires
‑
copgfp载体(sbi，货号：cd530a
‑
2)的多克隆位点，并删除ires
‑
copgfp序列，得到表达质粒pcdh
‑
ef1α
‑
anti
‑
msln
‑
car；包膜质粒和包装质粒分别是为pmd2.g(优宝生物，货号：vt1443)，pmdlgprre(优宝生物，货号：
vt1449)，和prsv
‑
rev(优宝生物，货号：vt1445)。hek293细胞用dmem培养基加10％fbs培养到80％左右密度，把表达质粒pcdh
‑
msln
‑
car和三个辅助质粒pmdlg
‑
prre、prsv
‑
rev、pmd2.g分别以质量比为4:3:2:1混合，采用pei试剂转染hek293细胞，48小时后收获上清，并把收获后的慢病毒上清经25000g的高速离心机离心2小时，获得病毒。
[0511]
实施例4.msln
‑
cart的制备
[0512]
招募健康志愿者，由专业医务人员于静脉取血100ml到抗凝血管(bd，367886)。血液与等量的pbs缓冲液(含2％的胎牛血清)混合。取pbmc分离管sepmate
‑
50(stemcell technology 86450)，加入15ml的ficoll缓冲液(ge healthcare，17
‑
5442
‑
02)，再加入32ml血液
‑
pbs的混合液。室温1200g离心10min后，将上层含pbmc的悬液迅速倒入干净的50ml离心管，室温500g离心8min，弃去上清，用pbs重悬即得到pbmc。
[0513]
使用的分离试剂盒easysep
tm
人t细胞分离试剂盒(stem cell公司，17951)从pbmc中进一步分离t细胞。得到的t细胞以1：1的比例加入cd3/cd28的磁珠(dynabeads
tm human t
‑
activator cd3/cd28，gibco，11132d)，在x
‑
vivo 15(lonza，04
‑
418q)，包含终浓度为100iu/ml rhil
‑
2(r&d，202
‑
il
‑
050)的培养基中培养，细胞密度为1
×
106个/ml，37℃，5％co2的培养条件下活化。
[0514]
活化24小时后，收集细胞与磁珠的混合物，离心去上清，用上述培养基(x
‑
vivo 15 100iu/ml rhil
‑
2)重悬，取出1
×
106个细胞至48孔板中，以moi为5加入浓缩的病毒，最后将细胞密度调整到2
×
106个/ml，32℃2000g离心1小时；离心结束后按体积比1：1补加培养基(x
‑
vivo15 100iu/ml rhil2)，放入37℃，5％co2培养箱中培养3天。3天后去除磁珠，将细胞悬液置于磁极中easysep
tm d magnetite particles(stemcell，19550)，静置两分钟后，弃去管壁上的磁珠，得到msln
‑
cart细胞。随后在培养过程中通过细胞计数监测生长状况，并且每两天用新鲜的培养基稀释msln
‑
cart细胞，使培养期间的细胞密度为3
×
105cells/ml至2
×
106cells/ml。
[0515]
测试例
[0516]
测试例1.抗msln单链抗体与靶细胞结合实验
[0517]
将hmsln构建到plvx
‑
ef1
‑
lucg质粒，转染k562细胞(购自atcc)后，挑取单克隆，获得k562
‑
hmsln
‑
lucg细胞。
[0518]
调整k562
‑
hmsln
‑
lucg细胞密度为3
×
106个/ml，96孔圆底板每孔加100μl。用pbs 2％fbs buffer洗一遍，离心500g，3分钟，弃上清。每孔加200μlmsln
‑
scfv上清，室温孵育30分钟，离心500g，3分钟，弃掉上清。用pbs 2％fbs缓冲液洗2遍，离心500g，3分钟，弃掉上清。用pbs 2％fbs缓冲液稀释二抗his标签抗体[ifluor 647](genscript，a01802
‑
100)，浓度为2μg/ml，每个样品加100μl，室温孵育30分钟，离心500g，3分钟，弃掉上清。用pbs 2％fbs缓冲液洗2遍，离心500gx3分钟，弃掉上清。用100μl pbs 2％fbs缓冲液重悬细胞吹吸混匀，用流式细胞仪(invitrogen，attune nxt)分析样品。用flowjo
‑
vx
‑
10.4对流式数据进行分析，对ifluor 647荧光强度的geometric mean作图，结果见图1。
[0519]
从结果可以看出阴性对照rs7(nc)不与k562
‑
hmsln
‑
lucg细胞结合，但msln
‑
scfv均与k562
‑
hmsln
‑
lucg细胞结合，说明本披露中的抗msln单链抗体可特异性识别人msln。
[0520]
测试例2.抗msln单链抗体与抗原亲和力检测
[0521]
用biacore测定msln
‑
scfv单链抗体与抗原msln
‑
r3
‑
hfc4的亲和力。
[0522]
用偶联有抗人抗体的cm5生物传感芯片(cat.#br100530,ge)亲和捕获一定量抗原msln
‑
r3
‑
hfc4，然后于芯片表面流经一定浓度的抗msln
‑
scfv单链抗体。利用biacore t200仪器实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用3m mgcl2(人抗体捕捉试剂盒，br
‑
1008
‑
39，ge)将生物芯片洗净再生。试验运行缓冲液为1
×
hbs
‑
ep缓冲溶液(ge，br
‑
1001
‑
88)。
[0523]
得到的数据用ge biacore t200 evaluation version 3.0软件以(1:1)langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值。
[0524]
表6.msln
‑
scfv单链抗体与msln
‑
r3
‑
hfc4亲和力
[0525][0526][0527]
结果显示，本披露中的msln
‑
scfv与msln
‑
r3
‑
hfc4抗原具有较高的亲和力。
[0528]
测试例3.msln
‑
car介导的t细胞激活能力检测
[0529]
首先构建jnl
‑
msln
‑
car细胞，调整nfat
‑
luc reporter t lymphocytes，(invivogen，货号jktl
‑
nfat，简称jnl细胞)密度为2
×
106个/ml，加100μl到96孔圆底板里。按照moi＝5计算msln
‑
car慢病毒量，加入慢病毒后2000g，32℃离心60分钟。离心后加入预热的1640培养基，调成细胞密度为1
×
106个/ml，放置培养箱继续培养4天，获得jnl
‑
msln
‑
car细胞。
[0530]
第五天，调整jjnl
‑
msln
‑
car细胞及jnl
‑
car
‑
n2细胞密度为1
×
106个/ml，取20μl到96孔平底板，k562
‑
hmsln细胞密度为2.5
×
105个/ml，取80μl至加有jnl
‑
msln
‑
car的96孔平底板中，放置培养箱培养18
‑
24小时。
[0531]
quanti
‑
luc
tm
分析试剂的配置：取一支干净的50ml离心管，加25ml无菌水。将quanti
‑
luc
tm
(invivogen，rep
‑
qlc2)粉末全部倒进去溶解，4℃避光保存一周。
[0532]
将细胞从培养箱取出，1000rpm离心5分钟，吸取20μl培养上清到96孔白板，加50μl quanti
‑
luc
tm
分析试剂，振荡5秒混匀。混匀后立即使用酶标仪检测生物发光值，结果见图2。
[0533]
从结果可以看出n2
‑
cart细胞不能被k562
‑
hmsln激活，而包含h1l3
‑
car，h5l5
‑
car，h6l5
‑
car，h6l6
‑
car和h11l8
‑
car的jnl
‑
msln
‑
car细胞均可被k562
‑
hmsln特异性激活。并且jnl
‑
msln
‑
car细胞激活的程度与car的scfv序列有关，其中包含h6l6
‑
car的jnl
‑
msln
‑
car细胞的效果最好。
[0534]
测试例4.msln
‑
cart细胞培养活率，增殖能力和car表达阳性率检测
[0535]
(1)cart细胞培养活率及增殖能力检测：
[0536]
msln
‑
cart每组细胞用移液器轻轻吹打混匀，取20μl至1.5ml的离心管中，与20μl稀释过的trypan blue solution(0.1％，gibco，15250061)混匀，吸取20μl至细胞计数板，用细胞计数器读取细胞密度数和细胞活率，根据培养体积计算出细胞总数和增殖倍数。其中：
[0537]
细胞存活率＝死细胞/(活细胞 死细胞)
×
100％。
[0538]
细胞增殖倍数＝第n天的活细胞总数/第1天的活细胞总数。
[0539]
(2)car表达阳性率检测：
[0540]
msln
‑
cart各组细胞5
×
105个细胞，500g，3分钟离心，弃上清；加1ml缓冲液(pbs 0.5％bsa)重悬，500g，3分钟离心，弃上清，用100μl缓冲液重悬。n2
‑
cart细胞中加2μl的cd19(fmc63抗体)一抗，msln
‑
cart各组细胞加2μl的msln fc蛋白，混匀，4℃孵育30分钟；使用缓冲液洗一遍后加入二抗，其中n2
‑
cart细胞中加2μl的pe羊
‑
抗鼠，igg(biolegend，554061)，msln
‑
cart各组细胞加2μl的pe抗
‑
人fc，igg(biolegend，405307)二抗，4度孵育30分钟。孵育完后用缓冲液洗2遍，加500μl缓冲液重悬细胞，混匀，避光，使用流式细胞仪检测。
[0541]
阳性率＝car阳性细胞/(car阳性细胞 car阴性细胞)
[0542]
结果见表7
‑
9，图3a
‑
3d。
[0543]
表7.msln
‑
cart细胞活率
[0544][0545]
注：d表示天。
[0546]
表8.msln
‑
cart增殖倍数
[0547][0548][0549]
注：d表示天。
[0550]
表9.car阳性率与mfi数据表
[0551][0552]
测试例5.抗原重复刺激cart细胞增殖能力检测
[0553]
1.第一轮刺激(第1
‑
4天)：
[0554]
复苏靶细胞skov3(购自atcc，dmem培养基 10％胎牛血清，购自thermo fisher，10566016)，起始细胞密度2
×
105个/ml，培养至对数生长期。部分靶细胞(剩余正常培养)用x
‑
vivo培养基(无il
‑
2，lonza，04418q)重悬后铺于48孔板中(1
×
105个/孔)，置于37度培养箱，对照孔未铺靶细胞。取实验所需效应细胞(msln
‑
cart)，pbs洗一次，x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)重悬后计数，用未转染car的t细胞进行调节使各组效应细胞的总细胞量达到一致。待靶细胞贴壁后吸去上清，按照效应细胞与靶细胞比例e:t ratio＝1:1向48孔板中加入效应细胞，每组3个复孔，补充x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)至600μl/孔。效应细胞与靶细胞共孵育2天后每孔补充300μl x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)。共孵育4天后，收集共孵育体系上清中的细胞，离心后用1毫升x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)重悬并计数，计算扩增倍数，其中：
[0555]
第一轮扩增倍数＝共孵育后的细胞量/初始加入细胞量。
[0556]
2.第二轮刺激(第4
‑
8天)：
[0557]
将正常培养的靶细胞用x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)重悬并铺于48孔板中(1
×
105个/孔)，置于37度培养箱(对照孔未铺靶细胞)，待细胞贴壁后，根据计数结果按照效应细胞与靶细胞比例e:t ratio＝1:1向48孔板中加入效应细胞，每组3个复孔，补充x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)至600μl/孔。效应细胞与靶细胞共孵育2天后每孔补充300μl x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)。共孵育4天后，收集共孵育体系上清中的细胞，离心后用1毫升x
‑
vivo培养基(无il
‑
2)重悬并计数，计算扩增倍数，其中：
[0558]
第二轮扩增倍数＝第一轮扩增倍数
×
共孵育后的细胞量/初始加入细胞量
[0559]
3.第三轮刺激(第8
‑
12天)：
[0560]
按照第二轮的刺激方法进行第三轮刺激，其中：
[0561]
第三轮扩增倍数＝第一轮扩增倍数
×
第二轮扩增倍数
×
共孵育后的细胞量/初始
加入细胞量。
[0562]
所测car
‑
t细胞增殖结果见图4a
‑
4b。
[0563]
从结果可以看出，与无抗原刺激的msln
‑
cart细胞相比，skov3细胞刺激后的细胞的数量均显著增加，表明抗msln
‑
cart中msln单链抗体均能有效识别msln抗原，并激活t细胞扩增。尤其是h6l6
‑
car、h6l4
‑
car和h5l3
‑
car可显著刺激t细胞扩增。
[0564]
测试例6.msln
‑
cart细胞体外对靶细胞杀伤能力检测
[0565]
将含有带lucifrase和gfp的plvx
‑
ef1
‑
lucg质粒转染sk
‑
ov
‑
3细胞(购自atcc)后，挑取单克隆，获得sk
‑
ov
‑3‑
lucg细胞系。
[0566]
调整靶细胞(sk
‑
ov
‑3‑
lucg)密度为5
×
104个/ml，取100μl于96孔平底板，600rpm离心2分钟，细胞培养箱孵育过夜。第二天弃掉靶细胞培养基，每孔加100μl不带酚红的x
‑
vivo15(lonza，04
‑
418q)。然后按照效应细胞(msln
‑
cart)与靶细胞比例e：t比值＝(20：1
‑
0.625：1)加入效应细胞，吹吸混匀。1000rpm离心2分钟，培养箱孵育16小时。300g，5分钟离心，弃掉上清。用pbs洗涤一遍，弃掉上清。加100μl pbs，再加100μl检测液(promega公司的luciferase assay system，e2520)，室温孵育10
‑
20分钟，使用酶标仪检测生物发光值，并计算杀伤率。
[0567]
杀伤率＝(单纯靶细胞读值
‑
加效应细胞后读值)/(单纯靶细胞读值
‑
培养基读值)
×
100％。
[0568]
所测杀伤结果如表10和图5所示。
[0569]
表10.msln
‑
cart细胞对靶细胞的杀伤率
[0570][0571]
从结果可以看出msln
‑
cart细胞对sk
‑
ov
‑3‑
lucg细胞具有显著杀伤能力，而n2对sk
‑
ov
‑3‑
lucg细胞没有杀伤，说明msln
‑
cart细胞可特异性的杀伤msln阳性细胞。
[0572]
测试例7.msln
‑
cart体外杀伤靶细胞细胞因子分泌
[0573]
测试6中msln
‑
cart与靶细胞共孵育后(e：t＝1:1，e:t＝5:1)的细胞上清，使用人il
‑
2elisa kit ii(bd，550611)和人ifn
‑
γelisa kit ii(bd，550612)检测其上清中il
‑
2及ifn
‑
γ的浓度，所得结果见图6a
‑
6b。
[0574]
结果显示，当与靶细胞共同培养时，候选细胞均产生了大量的ifn
‑
γ和il
‑
2的细胞因子，说明msln
‑
cart细胞均可以表现出杀伤性t细胞的特征。
[0575]
测试例8.msln
‑
cart细胞小鼠移植瘤模型体内药效评价
[0576]
ndg小鼠(百奥赛图公司购买)，雌性，6
‑
8周，饲养环境：spf级。适应性饲养一周后，将小鼠随机分成6组，每组6～8只。每只小鼠使用5
×
106个skov3肿瘤细胞右侧肩胛部皮下接种造模，18天后根据平均种瘤大小，随机分组，每只小鼠回输2.5
×
107个msln
‑
cart细胞，
每周2～3次记录小鼠体重和种瘤大小，比较不同cart在体内对sk
‑
o
‑
v3肿瘤细胞的杀伤情况。ndg小鼠的分组及回输cart细胞的情况如下表：
[0577]
表11.小鼠分组情况
[0578]
分组回输细胞种类回输细胞数量小鼠数量1h5l5
‑
car2.5
×
10782h6l5
‑
car2.5
×
10783h6l6
‑
car2.5
×
10784h11l8
‑
car2.5
×
10785n22.5
×
10776pbs无6
[0579]
小鼠造模及回输msln
‑
cart细胞后，体重及种瘤大小结果见图7a
‑
7b。
[0580]
结果显示，回输cart细胞后，小鼠的体重无明显变化，说明小鼠对cart细胞的耐受良好。h5l5
‑
car、h6l5
‑
car、h6l6
‑
car与h11l8
‑
car体内抗肿瘤效果相似，均能有效杀灭体内sk
‑
o
‑
v3肿瘤细胞。
[0581]
测试例9.msln
‑
cart细胞在移植瘤小鼠体内药物代谢动力学检测
[0582]
1.小鼠体内cart细胞的增殖分析
[0583]
ndg小鼠(百奥赛图公司购买)，雌性，6
‑
8周，饲养环境：spf级。适应性饲养一周后，将小鼠随机分成6组，每组7～8只。每只小鼠使用5
×
106个sk
‑
o
‑
v3肿瘤细胞右侧肩胛部皮下接种造模，18天后根据平均种瘤大小，随机分组，每只小鼠回输2.5
×
107个msln
‑
cart细胞。回输cart细胞后，第0(回输后3个小时)、3、7、14、21和28天，眼眶取小鼠血，检测小鼠外周血中cart细胞量，具体分组见表12。回输后4周内msln
‑
cart细胞在小鼠外周血中的数量，结果见图8。
[0584]
表12.小鼠分组情况
[0585][0586]
从图8中结果可以看出，sk
‑
o
‑
v3肿瘤细胞造模的小鼠后，注射msln
‑
cart细胞后，msln
‑
cart在小鼠体内显著扩增，而n2
‑
cart细胞的数量并没有显著增殖，说明msln
‑
cart细胞在小鼠体内受到了sk
‑
o
‑
v3肿瘤细胞的特异性的刺激，从而获得扩增信号，大量增殖。