一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，涉及一株生产虾青素的重组酿酒酵母及其应用。


背景技术：

2.虾青素(3,3
’-
dihydroxy-β,β
′-
carotene-4,4
’-
dione，c
40
h
52
o4，596.84)具有亲脂性和亲水性，也是迄今为止目前自然界中发现的抗氧化性最强的抗氧化剂之一，其抗氧化能力是辅酶q10的800倍、花青素的700倍、维生素e的550倍。虾青素有两个不对称碳，位于β-紫罗酮环的3、3’位置，根据两个手性碳的不同，分为(3r,3’r)、(3s,3’s)、(3r,3’s)3种不同的构型，其中(3s,3’s)构型抗氧化能力最强。虾青素具有多个共轭双键，能够清除细胞膜内外的自由基，减少蛋白质、脂质的氧化以及dna的损伤，保护细胞、延缓衰老，是唯一能通过血脑屏障的一种类胡萝卜素抗氧化剂，对心脑血管、糖尿病、癌症等有积极的治疗和预防作用，被欧美科学家、医学家誉为“健康软黄金”，在医药、保健品、食品和水产养殖等领域具有巨大市场价值。2017年全球虾青素产量约为511.8吨，总产值约为1亿美元，2018年激增至1.5亿美元。预计2024年全球虾青素产值接近3.4亿美元，而中国的虾青素产值将达到近2亿美元，广阔的市场前景也推动着虾青素生物合成技术不断向前发展。
3.目前，被批准用于生物合成虾青素的菌种主要是红发夫酵母和雨生红球藻。红发夫酵母生产(3r,3’r)构型的虾青素，这种虾青素的抗氧化能力低，生物活性差，主要用于饲料添加剂。雨生红球藻体内能积累较高浓度构型为(3s,3’s)的虾青素，可以用于人类的食品和化妆品中，但是培养条件苛刻，需要在常年具有合适光照的条件下培养，而且周期较长，所以生产经济成本长期高居不下。近年来随着合成生物学的发展，研究人员将目光转向其他遗传背景比较成熟的工程菌。酿酒酵母作为一种公认的安全模式微生物，遗传背景清晰、分子操作工具丰富，能实现高密度发酵和合成高品质的(3s,3’s)构型的虾青素，因此实现虾青素在酿酒酵母中的高产在工业生产上将会具有极大的竞争力。但是目前由于从β-胡萝卜素到虾青素合成的这两步网状代谢路径中会积累大量的中间体，限制了虾青素的产量，因此疏通下游网状代谢路径的代谢通量，减少中间体的积累，对提高酿酒酵母中虾青素的合成具有重大意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提高酿酒酵母中虾青素的合成。
5.为解决上述技术问题，本发明提供一株重组酿酒酵母，其组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因crtw，诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因crtz，将中间产物β-胡萝卜素合成为虾青素。
6.在一些实施方案中，上述重组酿酒酵母中，所述组成型表达β-胡萝卜素酮化酶基因crtw所用的组成型启动子为tdh3p，tdh3p的序列如seq id no:9所示。
7.在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述诱导型表达β-胡萝卜素羟化酶基因crtz所用的诱导型启动子为gal1，gal1的序列如seq id no:6所示。
8.在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述β-胡萝卜素酮化酶基因crtw为泡囊短波单胞菌(brevundimonas vesicularis dc263)来源的bdc263crtw，bdc263crtw的序列如seq id no:28中第9-734位所示。
9.在一些实施方案中，上述任一所述的重组酿酒酵母中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因crtz为橙黄农杆菌(agrobacterium aurantiacum)来源的aacrtz，aacrtz的序列如seq id no:25中第9-497位所示。
10.为解决上述技术问题，本发明还提供一种酿酒酵母的重组表达载体，包括组成型启动子及其控制下的β-胡萝卜素酮化酶基因crtw，以及诱导型启动子及其控制下的β-胡萝卜素羟化酶基因crtz。
11.在一些实施方案中，上述重组表达载体中，所述组成型启动子为tdh3p，tdh3p的序列如seq id no:9所示。
12.在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素酮化酶基因crtw下游具有终止子，终止子优选为tdh2t，tdh2t的序列如seq id no:12所示。
13.在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述诱导型启动子为gal1，gal1的序列如seq id no:6所示。
14.在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因crtz下游具有终止子，终止子优选为adh1t，adh1t的序列如seq id no:3所示。
15.在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素酮化酶基因crtw为泡囊短波单胞菌(brevundimonas vesicularis dc263)来源的bdc263crtw，bdc263crtw的序列如seq id no:28中第9-734位所示。
16.在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因crtz为橙黄农杆菌(agrobacterium aurantiacum)来源的aacrtz，aacrtz的序列如seq id no:25中第9-497位所示。
17.在一些实施方案中，上述任一所述的重组表达载体中，所述重组表达载体为prs416-adh1t-aacrtz-gal1-tdh3p-bdc263crtw-tdh2t，序列如seq id no:35所示。
18.为解决上述技术问题，本发明还提供一种构建上述任一所述的重组酿酒酵母的方法，包括将上述任一所述的重组表达载体转入出发酿酒酵母中获得重组酿酒酵母的步骤；
19.所述出发酿酒酵母为能合成β-胡萝卜素的酿酒酵母，出发酿酒酵母优选为scy10026酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
20.为解决上述技术问题，本发明还提供一种生产虾青素的方法，包括将上述任一所述的重组酿酒酵母进行发酵培养，使得β-胡萝卜素酮化酶基因crtw组成型表达并且在发酵培养过程中添加d-( )-半乳糖诱导β-胡萝卜素羟化酶基因crtz表达以合成虾青素的步骤。
21.在一些实施方案中，上述生产虾青素的方法中，所述发酵培养包括将上述任一所述的重组酿酒酵母在初始发酵培养基中进行发酵培养，在例如初始od
600
＝0.5，30℃、发酵ph5.8-6.2、通气量3.0vvm，溶氧30％、300-500rpm条件下发酵48h，再加入终浓度例如为20g/l的d-( )-半乳糖诱导β-胡萝卜素羟化酶基因crtz表达；
22.添加d-( )-半乳糖之前，流加葡萄糖并控制在0-1g/l范围内，以尽可能地减少副产物的产生，加入d-( )-半乳糖的同时停止流加葡萄糖，进入虾青素合成阶段，此时发酵罐中碳源切换为乙醇，同样通过流加方式添加，流加乙醇并控制在0.5-10g/l范围内，温度控
制在20-30℃；
23.采用浓度梯度递减的间歇补料方式补加氮源，每隔一段时间向发酵罐中加入一定体积的酵母浸粉母液，例如以初始发酵培养基中酵母膏的浓度为1.0
×
，从发酵开始每隔12小时(第12h，24h，36h，48h，60h)加入1.5
×
酵母浸粉，补加5次，之后每隔12小时(发酵的第72h、84h)加入1.0
×
酵母浸粉，补加2次，之后每隔12小时(发酵的第96h、108h)加入0.5
×
酵母浸粉，补加2次。
24.在一些实施方案中，上述任一所述的生产虾青素的方法中，所述初始发酵培养基为含3％葡萄糖的ypd(10g/l酵母膏、20g/l蛋白胨、30g/l葡萄糖，余量为水)。
25.在一些实施方案中，上述任一所述的生产虾青素的方法中，在发酵培养之前，还具有将上述任一所述的重组酿酒酵母进行一级种子培养和二级种子培养的步骤；
26.所述一级种子培养包括将上述任一所述的重组酿酒酵母接入装有sc-ura液体培养基的摇瓶中，在例如30℃、250rpm的条件下培养至od
600
＝6-7的步骤；
27.所述二级种子培养包括将一级种子培养得到的一级种子转接至装有sc-ura液体培养基的摇瓶中，在例如30℃、250rpm的条件下培养至od
600
＝5-6的步骤；
28.所述一级种子的接种量可以为5％。
29.为解决上述技术问题，本发明还提供上述任一所述的重组酿酒酵母和/或上述任一所述的重组表达载体在生产虾青素中的应用。
30.本发明公开的生产虾青素的重组酵母菌株通过组成型和诱导型启动子组合调控虾青素合成路径上β-胡萝卜素酮化酶基因crtw和β-胡萝卜素羟化酶基因crtz的表达，将不同组合的启动子和基因元件克隆在质粒表达载体上，转入酿酒酵母，经过发酵，检测虾青素产量，筛选得到高产目的菌株。
31.本发明的有益效果是：通过用组成型启动子调控crtw基因先表达，用诱导型启动子调控crt z基因后表达，显著提高了酿酒酵母虾青素合成路径的代谢通量，提高了酿酒酵母中虾青素的产量和纯度，虾青素产量达到464.90mg/l，具有良好的工业开发前景。
附图说明
32.图1为实施例2构建的两种重组表达载体的示意图。
33.图2为实施例4中摇瓶发酵生产虾青素的检测结果。
34.图3为实施例6中重组酿酒酵母s1的7l发酵罐发酵检测结果。
具体实施方式
35.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
36.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
38.酿酒酵母s228c(saccharomyces cerevisiae s228c)在文献“fisk et al.saccharomyces cerevisiae s288c genome annotation:a working hypothesis.yeast.2006；23(12):857
–
865”中公开过，公众可从万华化学集团股份有限公司获得。
39.prs416载体为上海联迈生物工程有限公司产品，货号为lm4777。
40.d-( )-半乳糖为阿拉丁产品，货号为g100367。
41.实施例中的aacrtz为橙黄农杆菌(agrobacterium aurantiacum)来源的crtz，bdc263crtw为泡囊短波单胞菌(brevundimonas vesicularis dc263)来源的crtw。
42.实施例1：重组质粒prs416-adh1t-gal1-tdh3p-tdh2t的构建
43.一、以酿酒酵母s228c(saccharomyces cerevisiae s228c)的基因组dna为模板，以adh1t_f和adh1t_r为引物进行pcr扩增得到adh1t，adh1t的序列如seq id no:3所示。
44.adh1t_f：5
’-
agctttggacttcttcgccagagg-3’(seq id no:1)；
45.adh1t_r：5
’-
catgccggtagaggtgtggtcaataag-3’(seq id no:2)。
46.二、以酿酒酵母s228c的基因组dna为模板，以gal1_f和gal1_r为引物进行pcr扩增得到gal1，gal1的序列如seq id no:6所示。
47.gal1_f：5
’-
tatagttttttctccttgacgttaaagtatag-3’(seq id no:4)；
48.gal1_r：5
’-
ttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatgg-3’(seq id no:5)。
49.三、以酿酒酵母s228c的基因组dna为模板，以tdh3p_f和tdh3p_r为引物进行pcr扩增得到tdh3p，tdh3p的序列如seq id no:9所示。
50.tdh3p_f：5
’-
cagttcgagtttatcattatcaatactgcca-3’(seq id no:7)；
51.tdh3p_r：5
’-
tttgtttgtttatgtgtgtttattcgaaac-3’(seq id no:8)。
52.四、以酿酒酵母s228c的基因组dna为模板，以tdh2t_f和tdh2t_r为引物进行pcr扩增得到tdh2t，tdh2t的序列如seq id no:12所示。
53.tdh2t_f：5
’-
atttaactccttaagttactttaatgatttag-3’(seq id no:10)；
54.tdh2t_r：5
’-
gcgaaaagccaattagtgtgatac-3’(seq id no:11)。
55.五、将步骤一至步骤四获得的adh1t、gal1、tdh3p和tdh2t通过oe-pcr方式拼接，得到两端带有bamhi和sali的酶切位点的adh1t-gal1-tdh3p-tdh2t(seq id no:21)，其中adh1t和gal1之间加入bsmbi酶切位点，tdh3p和tdh2t之间加入bsai酶切位点。
56.oe-pcr体系(50μl反应体系)如下：
57.adh1t、gal1、tdh3p和tdh2t模板各1μl、上游引物各1μl、下游引物各1μl、10
×
buffer 5μl、dntp 4μl，pfu dna polymerase 1μl，加入ddh2o补足体积至50μl。
58.所用引物如下：
59.primer 1_f：5
’-
ggatcccatgccggtagaggtgtggtc-3’(seq id no:13)；
60.primer 1_r：5
’-
tgaaaattcaatataaatgggagacgcgtctcctaaagctttggacttc-3’(seq id no:14)；
61.primer 2_f：5
’-
aagtccaaagctttaggagacgcgtctcccatttatattgaattttcaaaaattc-3’(seq id no:15)；
62.primer 2_r：5
’-
tgataaactcgaactgtatagttttttctccttgacgttaaagtatag-3’(seq id no:16)；
63.primer 3_f：5
’-
gtcaaggagaaaaaactatacagttcgagtttatcattatcaatactg-3’(seq id no:17)；
64.primer 3_r：5
’-
ggagttaaatatttaggagaccggtctcccattatttgtttgtttatgtg-3’(seq id no:18)；
65.primer 4_f：5
’-
ataaacaaacaaataatgggagaccggtctcctaaatatttaactccttaag-3’(seq id no:19)；
66.primer 4_r：5
’-
gtcgacgcgaaaagccaattagtgtgatactaag-3’(seq id no:20)。
67.六、用限制性内切酶sali和bamhi双酶切adh1t-gal1-tdh3p-tdh2t，得到基因片段；用限制性内切酶sali和bamhi双酶切prs416载体，得到载体片段；将该基因片段与该载体片段连接，获得重组表达载体prs416-adh1t-gal1-tdh3p-tdh2t，序列如seq id no:22所示。
68.实施例2：外源基因插入
69.一、以aacrtz基因为模板，以primer 5_f和primer 5_r为引物进行pcr扩增得到bsai-aacrtz-bsai，bsai-aacrtz-bsai的序列如seq id no:25所示，aacrtz基因如seq id no:25中第9-497位所示。
70.primer 5_f：5
’-
ggtctccaatgactaacttcttgatcgttgttg-3’(seq id no:23)；
71.primer 5_r：5
’-
ggtctccatttaagttctttcttgagcttcag-3’(seq id no:24)。
72.二、以bdc263crtw基因为模板，以primer 6_f和primer 6_r为引物进行pcr扩增得到bsai-bdc263crtw-bsai，bsai-bdc263crtw-bsai的序列如seq id no:28所示，bdc263crtw基因如seq id no:28中第9-734位所示。
73.primer 6_f：5
’-
ggtctccaatgtccgctgttactccaatg-3’(seq id no:26)；
74.primer 6_r：5
’-
ggtctccatttatgaaaataaagaccaccaaggc-3’(seq id no:27)。
75.三、以aacrtz基因为模板，以primer 7_f和primer 7_r为引物进行pcr扩增得到bsmbi-aacrtz-bsmbi，bsmbi-aacrtz-bsmbi的序列如seq id no:31所示。
76.primer 7_f：5
’-
cgtctccaatgactaacttcttgatcgttgttg-3’(seq id no:29)；
77.primer 7_r：5
’-
cgtctcctttaagttctttcttgagcttcagc-3’(seq id no:30)。
78.四、以bdc263crtw基因为模板，以primer 8_f和primer 8_r为引物进行pcr扩增得到bsmbi-bdc263crtw-bsmbi，bsmbi-bdc263crtw-bsmbi的序列如seq id no:34所示。
79.primer 8_f：5
’-
cgtctccaatgtccgctgttactcc-3’(seq id no:32)；
80.primer 8_r：5
’-
cgtctcctttatgaaaataaagaccaccaaggc-3’(seq id no:33)。
81.五、用bsai酶切bsai-bdc263crtw-bsai，得到基因片段；用bsai酶切实施例1获得的prs416-adh1t-gal1-tdh3p-tdh2t，得到载体片段；将该基因片段与该载体片段连接，获得prs416-adh1t-gal1-tdh3p-bdc263crtw-tdh2t；
82.用bsmbi酶切bsmbi-aacrtz-bsmbi，得到基因片段；用bsmbi酶切prs416-adh1t-gal1-tdh3p-bdc263crtw-tdh2t，得到载体片段；将该基因片段与该载体片段连接，获得重组表达载体prs416-adh1t-aacrtz-gal1-tdh3p-bdc263crtw-tdh2t，序列如seq id no:35所示。
83.六、用bsai酶切bsai-aacrtz-bsai，得到基因片段；用bsai酶切实施例1获得的prs416-adh1t-gal1-tdh3p-tdh2t载体，得到载体片段；将该基因片段与该载体片段连接，获得prs416-adh1t-gal1-tdh3p-aacrtz-tdh2t；
84.用bsmbi酶切bsmbi-bdc263crtw-bsmbi，得到基因片段；用bsmbi酶切prs416-adh1t-gal1-tdh3p-aacrtz-tdh2t，得到载体片段；将该基因片段与该载体片段连接，获得重组表达载体prs416-adh1t-bdc263crtw-gal1-tdh3p-aacrtz-tdh2t，序列如seq id no：
36所示。
85.重组表达载体prs416-adh1t-aacrtz-gal1-tdh3p-bdc263crtw-tdh2t和prs416-adh1t-bdc263crtw-gal1-tdh3p-aacrtz-tdh2t的示意图如图1所示。
86.实施例3：生产虾青素的重组酵母菌株的构建
87.将实施例2构建获得的重组表达载体prs416-adh1t-aacrtz-gal1-tdh3p-bdc263crtw-tdh2t和prs416-adh1t-bdc263crtw-gal1-tdh3p-aacrtz-tdh2t通过醋酸锂法转化到生产β-胡萝卜素的菌株scy10026酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中，并经sc-ura固体培养基(合成酵母氮源ynb 6.7g/l，葡萄糖20g/l，除去尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/l，2％的琼脂粉)进行转化子筛选，分别获得生产虾青素的重组酿酒酵母菌株s1和s2。
88.上述scy10026酿酒酵母的构建方法如下：将cyc1t-btcrti-hxt7p-tdh3p-pacrtb-adh1t片段(seq id no:37)转入酿酒酵母s288c，同源重组并替换掉gal1、gal7、gal10基因，整合到染色体上；再将cyc1t-pacrty-hxt7p-fba1p-tmcrte-tdh2t片段(seq id no:38)转入其中，同源重组并替换掉ypl062w基因，整合到染色体上，获得生产β-胡萝卜素的酵母scy10026。
89.cyc1t-btcrti-hxt7p-tdh3p-pacrtb-adh1t(seq id no:37)中：
90.第1-40位为gal 7基因下游同源序列，第41-241位为终止子cyc1t序列，第242-1990位为基因btcrti序列，第1991-2691位为启动子hxt7p序列，第2692-3371位为启动子tdh3p序列，第3372-4301位为基因pacrtb序列，第4302-4629位为终止子adh1t序列，第4630-4669位为gal1基因下游同源序列。
91.cyc1t-pacrty-hxt7p-fba1p-tmcrte-tdh2t(seq id no:38)中：
92.第1-40位为ypl062w基因上游同源序列，第41-241位为终止子cyc1t序列，第242-1390位为pacrty基因序列，第1391-2091位为启动子hxt7p序列，第2092-2911位为启动子fba1p序列，第2912-4093位为基因tmcrte序列，第4094-4493位为终止子tdh2t序列，第4494-4533位为ypl062w基因下游同源序列。
93.实施例4：摇瓶发酵生产虾青素
94.分别挑取重组酿酒酵母菌株s1和s2单菌落接种到5ml sc-ura液体培养基(合成酵母氮源ynb 6.7g/l，葡萄糖20g/l，除去尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/l，余量为水)中，于30℃、250rpm过夜培养，得到一级种子。随后按5％(体积比)的接种量将一级种子接种到新鲜的5ml sc-ura液体培养基中进行二级种子培养，30℃、250rpm培养至od
600
＝5-6，得到二级种子。将二级种子接种至装有50ml ypd培养基的250ml摇瓶中发酵培养，初始od
600
＝0.5，发酵48小时加入终浓度2％(2g/100ml)的d-( )-半乳糖诱导虾青素生成，共发酵84小时结束，得到发酵液。
95.取1ml发酵液，12000rpm离心5min，倒掉上清，加入1ml无菌水重悬细胞，离心，倒掉上清。加入1ml 3m hcl重悬细胞，沸水浴5min，冰浴5min，离心，倒掉上清，重复沸水浴5min，冰浴5min，重复2次。离心水洗两遍，弃上清，加入1ml丙酮重悬细胞后，加入少量石英砂涡旋振荡10min，将丙酮提取液12000rpm离心10min后，将上清使用0.2μm有机滤膜过滤后，取200μl加到样品瓶中进行虾青素hplc高效液相色谱检测。
96.虾青素hplc高效液相色谱检测条件如下：
97.采用双波长检测，测定波长设为450/470nm，积分波长470nm；
98.柱温：25℃；
99.流动相：流速为1ml/min，流动相b：乙腈:水＝9:1(体积比)，流动相c：甲醇:异丙醇＝3:2(体积比)，洗脱条件为：0-15min，0-90％c；15-30min，90％c；30-35min，90-0％c；35-45min，0％c。外标法计算虾青素浓度。
100.按照下式计算虾青素纯度：
101.w＝ca/c*100％
102.w为纯度，ca为虾青素浓度(mg/l)，c为类胡萝卜素浓度(mg/l)；
103.其中类胡萝卜素浓度同样采用hplc外标法检测得到，hplc检测条件与上述虾青素hplc高效液相色谱检测条件一致。
104.经检测，重组酿酒酵母菌株s2的虾青素产量为43.72mg/l(纯度为57.51％)，重组酿酒酵母菌株s1的虾青素产量为70.67mg/l(纯度为90.65％)，重组酿酒酵母菌株s1和s2的虾青素产量比较如图2所示。
105.实施例5：发酵罐发酵生产虾青素
106.一、一级种子培养：取s1接种至装有50ml sc-ura液体培养基的250ml摇瓶中，30℃、250rpm培养至od
600
＝6-7，得到一级种子。
107.二、二级种子培养：将一级种子按5％(体积比)的接种量转接至装有50ml sc-ura液体培养基的250ml摇瓶中，30℃、250rpm培养至od
600
＝5-6，得到二级种子。
108.三、发酵罐接种：以10％(体积比)的接种量将二级种子转接至7l发酵罐中开始发酵，发酵罐初始装液量为3.5l，初始发酵培养基为含3％葡萄糖的ypd(10g/l酵母膏、20g/l蛋白胨、30g/l葡萄糖，余量为水)，初始od
600
＝0.5。发酵罐参数设置：发酵温度为30℃，ph控制在5.8，通气量设为3.0vvm，溶氧(do)为30％，转速范围300-500rpm，并将搅拌关联do。
109.整个发酵过程以d-( )-半乳糖诱导剂添加时刻为两阶段的分界点。添加d-( )-半乳糖诱导剂之前葡萄糖以流加方式加入，并控制在0-1g/l范围内，以尽可能地减少副产物的产生。发酵48h后，加入终浓度为20g/l的d-( )-半乳糖诱导剂，同时停止流加葡萄糖，进入虾青素合成阶段，此时发酵罐中碳源切换为乙醇，同样通过流加方式添加，并控制发酵罐内的乙醇浓度在0.5-10g/l。此外，影响发酵的重要因素还有发酵培养基中的氮源。本发明以酵母浸粉为氮源，为了避免氮源补料过量，采用浓度梯度递减的间歇补料方式向发酵罐中补加氮源，每隔一段时间向发酵罐中加入一定体积的酵母浸粉母液，具体补料过程如下：在发酵的第12、24、36、48、60小时，每升加入15g酵母浸粉；在发酵的第72、84小时每升加入10g酵母浸粉；在发酵的第96、108小时每升加入5g酵母浸粉。
110.经过与实施例4相同的hplc检测，测得最终7l发酵罐虾青素产量达到366.90mg/l，相比摇瓶发酵产量(70.67mg/l)提高了4.19倍。
111.实施例6
112.除了将发酵ph控制在6.2，将加入d-( )-半乳糖诱导剂之后的发酵温度设置为20℃之外，重复实施例6的实验，发酵检测结果如图3所示，其中经过与实施例4相同的hplc检测，测得最终7l发酵罐虾青素产量达到464.90mg/l，相比摇瓶发酵产量(70.67mg/l)提高了5.58倍。