一种粉红粘帚霉菌的引物、探针以及鉴定方法与流程

1.本发明属于菌种鉴定技术领域，尤其涉及一种粉红粘帚霉菌的引物、探针以及鉴定方法。


背景技术：

2.冬虫夏草作为一种传统的名贵中药材在中国已有上千年的历史，主产于青藏高原及其横断山区，具有补肺益肾、止血化痰、止咳定喘之功效，与人参、鹿茸共称为“中华三宝”。
3.由于天然冬虫夏草资源日益匮乏，且人工养殖冬虫夏草难以在市场中普及，寻找可培育的替代品显得尤为迫切。从上世纪70年代始，我国科学家就纷纷致力于从野生冬虫夏草中分离出多种菌种，并通过发酵技术进行人工培养成各种发酵虫草菌丝体，成功研制出与天然冬虫夏草具有相似药用功效的药品，直到上世纪80～90年代，各种发酵虫草类产品相继问世。
4.目前对发酵虫草制剂的相关研究大多集中于其化学成分、药理作用等方面，对发酵虫草类产品的菌种及其菌株专一性的研究较少。该类产品的原料是发酵菌粉，发酵菌粉是由从冬虫夏草中提取分离的菌种经深层发酵培养而来，不同菌种发酵成不同的发酵虫草菌粉，从而生产出不同的发酵虫草制剂。因此提取分离的菌种是源头，其纯度如何，直接影响发酵虫草制剂的质量。而在菌种传代发酵培育过程中，如何保证该菌种的菌株在生产周期内的稳定而不发生菌株变异，是保证产品质量的根本，这些目前尚未见国内外相关文献报道。
5.粉红胶霉(gliocladium roseum)亦称粉红粘帚霉，无性阶段拉丁名称为clonostachys rosea，是得到广泛研究和应用的粘帚霉之一，丝状真菌，在生长周期可产生3种繁殖体，包括菌丝体、分生孢子和厚垣孢子，它是一种真菌寄生菌，该菌株为半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘帚霉属，为冬虫夏草的伴生菌。粉红胶霉是心肝宝胶囊的原料
‑
人工虫草菌粉的菌种来源。人工虫草菌粉为心肝宝胶囊的原料药，是粉红胶霉(gliocladium roseum(link)thom)经人工培养所得的菌丝体的干燥粉末。
6.宁心宝胶囊的原料药虫草头孢菌粉标识为新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌虫草头孢菌(cephalosporium sinensis chen.sp.nov)经液体深层发酵所得菌丝体的干燥粉末。经dna测序比对，开展了该菌种的分子鉴定，基因数据库比对结果表明该菌种应为粉红胶霉(gliocladium roseum)即粉红粘帚霉菌。
7.目前粉红粘帚霉菌的鉴定多采用显微形态鉴别，主要从分生孢子的形态、菌落颜色及有无隔膜和菌环等进行描述，分子生物学技术用于虫草菌菌种的鉴定虽然有文献报道，但实际应用于菌种鉴定较少。究其原因是尚未建立一种专属性强、操作简便的分子鉴定方法，缺少菌种鉴定的质量控制标准。为此，我们提出了一种粉红粘帚霉菌的引物、探针以及鉴定方法。


技术实现要素：

8.本发明提供一种从分子水平对制剂及原料药的真菌来源即粉红粘帚霉菌的引物、探针及准确、专属的鉴定方法，保证了菌种、原料药到制剂的菌种专一性和稳定性，即保证菌种在生产传代过程中不发生变异，进而保证菌种和原料药及制剂的质量稳定与可控。
9.一种粉红粘帚霉菌的引物，所述特异性引物为5’ctagggcgtggtgttgg3’和5’ggaatatcactacttcgcagagg 3’；
10.一种粉红粘帚霉菌的探针，所述探针为5’ctaaatctagtggcggacccgtc 3’。
11.本发明提供一种所述的引物和探针在制备检测粉红粘帚霉菌的试剂盒中的用途。
12.本发明提供一种所述的引物和探针的试剂盒。
13.本发明提供一种试剂盒检测粉红粘帚霉菌的用途。
14.一种粉红粘帚霉菌的鉴定方法，所述粉红粘帚霉菌的鉴定方法的pcr反应总体系为25μl，反应体系包括10
×
buffer缓冲液2.5μl，dntp(10mmol/l)1.0μl，引物(50μmol/l)各0.2μl，探针0.2μl，taq dna聚合酶(5u/μl)0.15μl，模板2μl，无菌超纯水18.75μl。
15.进一步地，所述pcr反应在95℃预变性5分钟，循环反应40次，其中95℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，得到扩增曲线。
16.本发明的有益效果为：
17.本发明设计特异性引物和探针，优选后建立粉红粘帚霉菌、人工虫草菌粉及心肝宝胶囊/片和虫草头孢菌粉、宁心宝胶囊等各样品实时荧光pcr鉴别方法，从分子水平解决了发酵虫草类菌粉及制剂的真菌菌种鉴别难题。
附图说明
18.图1心肝宝胶囊的原料药人工虫草菌粉及宁心宝胶囊的原料药虫草头孢菌粉特异性引物扩增样品的凝胶电泳图；
19.图2本发明的粉红粘帚霉菌、心肝宝胶囊的原料药人工虫草菌粉及宁心宝胶囊的原料药虫草头孢菌粉的实时荧光pcr扩增曲线；
具体实施方式
20.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
21.在本实施例子中包括以下步骤：
22.取代表性样品人工虫草菌粉(glio.ros)及虫草头孢菌粉(经序列比对鉴定该菌种为粉红胶霉(gliocladium roseum(link)thom)的its序列应用idtdna网站进行在线引物和探针的设计，并将设计的所有引物和探针与样本序列进行比对，去掉公共引物和探针，其余的引物和探针合成，进行筛选与优化。
23.筛选、优化引物
24.采用pcr凝胶电泳方法对设计的引物进行一一筛选与优化，结果优选出一对特异性较好的引物和探针序列。
25.[鉴别]
[0026]
实时荧光pcr方法
[0027]
模板dna提取取样品粉末约20mg，置于2ml无菌离心管中，加入灭菌玻璃珠适量，于高速球磨仪上研磨，频率为30hz/次，1min/次，共6次，加入缓冲液ap1 500μl，rna酶溶液4μl，涡旋振荡，按照植物基因组提取试剂盒方法提取dna，得到洗脱液150μl，作为供试品溶液，测定浓度和纯度，置4℃冰箱中待用。另取人工虫草菌粉或虫草头孢菌粉对照药材同法制成对照药材模板dna溶液，随行提取空白溶液。
[0028]
rt pcr反应特异性引物：5’ctagggcgtggtgttgg3’和5’ggaatatcactacttcgcagagg 3’。
[0029]
一种粉红粘帚霉菌的探针：5’ctaaatctagtggcggacccgtc 3’。
[0030]
pcr反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体系为25μl。
[0031]
反应体系包括10
×
buffer缓冲液2.5μl，dntp(10mmol/l)1.0μl，引物(50μmol/l)各0.2μl，探针0.2μl，taq dna聚合酶(5u/μl)0.15μl，模板2μl，无菌超纯水18.75μl。将离心管置实时荧光定量pcr仪，pcr反应参数：95℃预变性5分钟，循环反应40次(95℃30秒，60℃30秒，72℃60秒)，得到扩增曲线。
[0032]
如图1心肝宝胶囊的原料药人工虫草菌粉及宁心宝胶囊的原料药虫草头孢菌粉特异性引物扩增样品的凝胶电泳图；如图2本发明的粉红粘帚霉菌、心肝宝胶囊的原料药人工虫草菌粉及宁心宝胶囊的原料药虫草头孢菌粉的实时荧光pcr扩增曲线。
[0033]
结果判断
[0034]
阳性样品在ct 30之前出峰，呈现阳性扩增曲线，对照药材也在ct 30之前出峰，空白溶液则不出峰。
[0035]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。