一种多烯磷脂酰胆碱的制备方法与流程

1.本发明涉及一种多烯磷脂酰胆碱的制备方法，属于制药工程技术领域。


背景技术：

2.多烯磷脂酰胆碱(polyene phosphatidylcholine，ppc)是从大豆磷脂中提取出来的一种磷脂酰胆碱，是卵磷脂的甘油三酯骨架上含有亚油酸、亚麻酸和油酸的磷脂酰胆碱，其主要活性成分为1,2
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二亚油酰磷脂酰胆碱(1,2
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dilinoleoyl
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sn
‑
glycero
‑3‑
phosphatidylcholine，dlpc)，又称为1,2
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二亚油酰基卵磷脂。多烯磷脂酰胆碱在化学结构上与重要的内源性磷脂一致，并具有以下生理功能：使受损的肝功能和酶活力恢复正常、调节肝脏的能量平衡、促进肝组织再生、将中性脂肪和胆固醇转化成容易代谢的形式和稳定胆汁。dlpc具有非常重要的生物学功能，它不仅是人体细胞膜的基本构成组分，还是胆碱和亚油酸的一个重要来源，对于维持生物膜的生理活性和基体的正常代谢起至关重要的作用；其胆碱成分参与脂肪的代谢，可预防因脂肪从肝脏排泄缓慢所引起的脂肪肝病变，它还参与人体内必需氨基酸蛋氨酸和其它一些氨基酸的生物合成，并促进脂溶性维生素在体内更好地吸收等；其亚油酸成分属于n
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6脂肪酸，是营养学上必需的重要脂肪酸之一，具有降低血清胆固醇含量、预治高血压、心血管疾病及动脉粥样硬化症、抗癌、强化免疫、抑制脂肪沉积等功能。
3.由于天然磷脂酰胆碱成分复杂、结构相似，因此纯化富集出多烯磷脂酰胆碱的制备技术较为复杂，目前纯化磷脂酰胆碱的方法主要包括溶剂法、氧化铝吸附法、无机盐复合沉淀法、超临界二氧化碳萃取技术、柱色谱技术、膜分离法等。
4.cn1506368a公开了一种由大豆磷脂提取磷脂酰胆碱的方法，采用饱和烷烃
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乙腈
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低碳醇双液相混合溶剂系对大豆磷脂进行多级逆流萃取，并将最终萃取液真空脱溶的工艺方法，得磷脂酰胆碱产品。
5.cn102633832a提供了一种制备磷脂酰胆碱的方法，其包括：醇处理步骤：以粗磷脂为原料，低碳醇和水为混合溶剂，经萃取分离，分离出的醇可溶性产物；硅胶柱层析步骤：对前一步所得产物进行硅胶柱层析，用乙醇梯度洗脱，收集产物溶液干燥步骤：对所得产物溶液进行真空浓缩，冷冻干燥，得到磷脂酰胆碱。
6.cn103288870a公开了一种注射级高纯度磷脂酰胆碱的制备方法，包括：(1)将磷脂原料溶于非极性溶剂中，配成一次萃取原料液，离心过滤去除固体杂质，一次分馏萃取得一次萃取液；(2)将所述一次萃取液进行真空浓缩得到磷脂酰胆碱一次产品；(3)将所述磷脂酰胆碱一次萃取产品配成二次萃取原料液，进行二次分馏萃取，得到二次萃取液；(4)将所述二次萃取液经真空浓缩得到磷脂酰胆碱二次萃取产品；(5)将所述磷脂酰胆碱二次萃取产品溶于极性溶剂中，连续通过脱色吸附柱，收集流出液，经真空浓缩、冷冻干燥得到注射级磷脂酰胆碱产品。
7.cn103613612a提供了一种高纯度磷脂酰胆碱的制备方法，含以下步骤：以低级醇醇溶性粗磷脂为原料，配成醇溶性粗磷脂乙醇溶液，将醇溶性粗磷脂乙醇溶液上样到葡聚
糖凝胶sephadexlh
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20层析柱中，采用高浓度乙醇洗脱后，收集洗脱液，蒸发掉溶剂，得到高纯度磷脂酰胆碱。
8.cn108101938a公开了一种多烯磷脂酰胆碱的制备方法，包括以下步骤：(1)以纯度为35
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60％的大豆磷脂粉末为原料，采用中性氧化铝吸附，制备得到纯度90％以上的多烯磷脂酰胆碱；(2)以步骤(1)得到的纯度为90％以上的多烯磷脂酰胆碱为原料，采用硅胶吸附，制备得到纯度为95％以上的多烯磷脂酰胆碱。
9.cn104592292a公开了一种注射用多烯磷脂酰胆碱的制备方法，其步骤包括以大豆磷脂为原料，用合适的溶剂溶解，通过柱色谱以多卤代烷烃
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低碳醇
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水所组成的三元混合溶剂进行两次洗脱，干燥，得到多烯磷脂酰胆碱产品。
10.以上公开的磷脂酰胆碱的制备方法工艺复杂，有的要用到如sephadexlh
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20这种昂贵的层析填料，成本高；而且，目前由大豆粉末磷脂分离得到的大豆磷脂酰胆碱(pc
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90)，其有效成分dlpc含量在40％
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50％，市售的aventis公司多烯磷脂酰胆碱其dlpc含量约52％。因此，如果能找到一种制备方法能显著提高多烯磷脂酰胆碱产品中dlpc含量，无疑将有助于多烯磷脂酰胆碱产品质量的提升。


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供一种高dlpc含量的多烯磷脂酰胆碱的制备方法，通过硝酸银色谱硅胶柱层析分离，得到dlpc含量达60％以上的多烯磷脂酰胆碱产品。
12.本发明的技术方案如下：
13.提供一种多烯磷脂酰胆碱的制备方法，以大豆磷脂为原料，在避光的色谱柱中经过硝酸银色谱硅胶柱层析分离制得多烯磷脂酰胆碱；所述色谱柱下端装填有银离子螯合剂。
14.在一些实施方案中，所述银离子螯合剂选自羧酸类金属离子螯合剂或有机多元膦酸金属离子螯合剂，其中羧酸类金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸(edta)、氨基三乙酸(nta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)，有机多元膦酸类金属离子螯合剂选自羟基亚乙基
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1,1
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二膦酸(hedp)、氨基三亚甲基膦酸(atmp)、二乙烯三胺五亚甲基膦酸(htpmp)、三乙烯四胺六亚甲膦酸(tethmp)、双(1,6
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亚己基)三胺五亚甲基膦酸(bnhmtpmp)。
15.在一些实施方案中，所述硝酸银色谱硅胶按硝酸银和硅胶的质量比1:5～1:20制得，制备方法为：将硝酸银溶解于10倍质量的水，再与相应质量的硅胶浸透，混合均匀后，在沸水浴中加热20
‑
30min，间歇搅拌，冷却至室温后，抽滤，然后在110～120℃下真空干燥活化18～24h，即得。
16.在一些实施方案中，所述银离子螯合剂的用量为所述硝酸银重量的0.5～3倍。
17.进一步地，所述银离子螯合剂的用量为所述硝酸银重量的1～2倍。
18.在一些实施方案中，所述硅胶柱层析的条件为：首先用体积比为95:5～85:15的溶剂a:溶剂b组成的混合溶剂体系进行洗脱除杂；然后再用体积比为80:20～60:40的溶剂a:溶剂b组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集洗脱部位，浓缩干燥得所述多烯磷脂酰胆碱；所述溶剂a选自石油醚、二氯甲烷、氯仿或环己烷，所述溶剂b选自乙酸乙酯、丙酮或甲醇。
19.进一步地，所述硅胶柱层析的条件为：首先用体积比为95:5～90:10的溶剂a:溶剂b组成的混合溶剂体系进行洗脱除杂；然后再用体积比为80:20～60:40的溶剂a:溶剂b组成
的混合溶剂体系进行洗脱并收集洗脱部位，浓缩干燥得所述多烯磷脂酰胆碱。
20.在一些实施方案中，所述溶剂a:溶剂b组成的混合溶剂体系为氯仿:甲醇组成的混合溶剂体系。
21.在一实施方案中，所述硅胶柱层析的条件为：首先用体积比为95:5的氯仿:甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱除杂；然后再用体积比为80:20的氯仿:甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集洗脱部位，浓缩干燥即得所述多烯磷脂酰胆碱。
22.本发明整个层析柱采用避光措施，用锡箔纸或者黑色涂料等材料附着于层析柱表面，以尽量减少光线进入层析柱内部，即制得避光的色谱柱。
23.本发明产品中磷脂酰胆碱(pc)、1,2
‑
二亚油酰磷脂酰胆碱(dlpc)的含量测定方法如下：
24.采用hplc法(elsd)：色谱柱：waters spherisorb silica(250mm
×
4.6mm,5μm)；流动相：a相(正己烷:异丙醇)＝6.5/8(v/v)，b相(正己烷:异丙醇:水)＝6.5/8/1.5(v/v/v)；0min 50％a,50％b,10min 100％b，保持15min，25min 50％a,50％b，保持5min；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；elsd漂移管温度：70℃；雾化气：高纯氮；载气压力：3.0
×
105pa；光倍增管增益：5倍；进样量：10μl。
25.本发明以大豆磷脂为原料，采用硝酸银色谱硅胶柱层析分离制备多烯磷脂酰胆碱，方法简便，经过一次柱层析即可制得活性成分1,2
‑
二亚油酰磷脂酰胆碱(dlpc)含量达60％以上的多烯磷脂酰胆碱产品，大大提高了多烯磷脂酰胆碱产品的质量。
具体实施方式
26.下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
27.实施例1硝酸银色谱硅胶的制备
28.称50kg普通硅胶(100目
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200目，粗孔)，加入含有5kg硝酸银的水溶液100l(使其完全浸没硅胶)，在沸水浴中加热20
‑
30min(间歇搅拌)。冷却至室温后，抽滤，然后在120℃的真空干燥箱内活化20h，即制得硝酸银色谱硅胶。
29.实施例2多烯磷脂酰胆碱的制备
30.取大豆磷脂40g，用甲醇溶解，然后用40g硅胶(100目)拌样，另取800g硝酸银色谱硅胶干法装于避光的色谱柱(下端预先装填80g乙二胺四乙酸)，将样品装入色谱柱上，先用体积比为95:5的氯仿:甲醇混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用体积比为80:20的氯仿:甲醇混合溶剂体系洗脱，收集洗脱液，经过真空浓缩、干燥得到多烯磷脂酰胆碱27.4g，经hplc分析，其多烯磷脂酰胆碱纯度为98.3％，活性成分1,2
‑
二亚油酰磷脂酰胆碱(dlpc)含量为69.8％。
31.实施例3多烯磷脂酰胆碱的制备
32.取大豆磷脂40g，用甲醇溶解，然后用40g硅胶(100目)拌样，另取800g硝酸银色谱硅胶干法装于避光的色谱柱(下端预先装填100g双(1,6
‑
亚己基)三胺五亚甲基膦酸)，将样品装入色谱柱上，先用体积比为95:5的氯仿:甲醇混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用体积比
为70:30的氯仿:甲醇混合溶剂体系洗脱，收集洗脱液，经过真空浓缩、干燥得到多烯磷脂酰胆碱28.2g，经hplc分析，其多烯磷脂酰胆碱纯度为96.1％，活性成分dlpc含量为65.7％。
33.实施例4多烯磷脂酰胆碱的制备
34.取大豆磷脂40g，用甲醇溶解，然后用40g硅胶(100目)拌样，另取800g硝酸银色谱硅胶干法装于避光的色谱柱(下端预先装填50g二亚乙基三胺五乙酸)，将样品装入色谱柱上，先用体积比为90:10的氯仿:甲醇混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用体积比为60:40的氯仿:甲醇混合溶剂体系洗脱，收集洗脱液，经过真空浓缩、干燥得到多烯磷脂酰胆碱30.3g，经hplc分析，其多烯磷脂酰胆碱纯度为95.9％，dlpc含量为61.1％。
35.实施例5多烯磷脂酰胆碱的制备
36.取大豆磷脂40g，用乙酸乙酯溶解，然后用40g硅胶(100目)拌样，另取800g硝酸银色谱硅胶干法装于避光的色谱柱(下端预先装填200g羟基亚乙基
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1,1
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二膦酸)，将样品装入色谱柱上，先用体积比为95:5的石油醚:乙酸乙酯混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用体积比为70:30的石油醚:乙酸乙酯混合溶剂体系洗脱，收集洗脱液，经过真空浓缩、干燥得到多烯磷脂酰胆碱29.7g，经hplc分析，其多烯磷脂酰胆碱纯度为94.6％，dlpc含量为63.5％。
37.实施例6多烯磷脂酰胆碱的制备
38.取大豆磷脂40g，用乙酸乙酯溶解，然后用40g硅胶(100目)拌样，另取800g硝酸银色谱硅胶干法装于避光的色谱柱(下端预先装填160g三乙烯四胺六亚甲膦酸)，将样品装入色谱柱上，先用体积比为95:5的环己烷:乙酸乙酯混合溶剂体系进行洗脱除杂；再用体积比为60:40的环己烷:乙酸乙酯混合溶剂体系洗脱，收集洗脱液，经过真空浓缩、干燥得到多烯磷脂酰胆碱28.6g，经hplc分析，其多烯磷脂酰胆碱纯度为96.6％，dlpc含量为66.2％。
39.按中国专利cn108101938a实施例1所述方法实施，以纯度为50％的大豆磷脂粉末为起始原料，制得多烯磷脂酰胆碱产品，经hplc检测，其多烯磷脂酰胆碱纯度为97.9％，dlpc含量为43.8％。
40.按中国专利cn104592292a实施例1所述方法实施，以大豆磷脂(纯度50％)为起始原料，得到多烯磷脂酰胆碱产品，经hplc检测，其多烯磷脂酰胆碱纯度为99.1％，dlpc含量为41.3％。