一种增强免疫力的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及保健品技术领域，具体涉及一种增强免疫力的组合物的制备方法。


背景技术：

2.免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。人体内执行这一功能的是免疫系统。
3.目前，国内外免疫力低下的主要人群是儿童；老年人；器官移植术后长期服用免疫抑制剂的人群；接受化疗、放疗的恶性肿瘤患者；营养缺乏引起的免疫力下降人群；经常熬夜睡眠不足的人群；生活、工作压力大的人群；以及过分依赖抗生素及滥用抗生素人群；长期吸烟人群等。据专业人士调查，目前，我国免疫力低下的人群比例约为20％。
4.增强免疫力的的方法主要有以下几种：全面均衡适量营养、适度劳逸、经常锻炼、戒烟限酒、心理健康等，其中最方便、快捷的方法是科学的食疗方法，科学合理的蛋白质补充是必不可少的，一方面维生素a能促进糖蛋白的合成，细胞膜表面的蛋白主要是糖蛋白，免疫球蛋白也是糖蛋白。动物蛋白中乳清蛋白含丰富的蛋氨酸，氨基酸的种类齐全配比接近人体所需要的模式，浓缩乳清蛋白还含有大量免疫球蛋白，可增强人体的免疫功能，促进矿物质吸收，调节肠道菌群平衡。当大豆蛋白与浓缩乳清蛋白合用时，能够达到互补和协同作用，使蛋白质粉更易被人体消化和吸收，更能提高其增强免疫力的保健功能。
5.人体是由无数细胞构成的，蛋白质是主要成分。蛋白质不仅是人类机体的主要构成物质，而且蛋白质也是构成人类体内的各类重要生命活性物质，故体内的蛋白质的种类数以千计，其中包括人类赖以生存的无数的酶类，多种作用于人体代谢活动的激素类，抵御疾病侵袭的各种免疫物质类，以及各种微量元素的载体等都主要由蛋白质构成。
6.实验证明，蛋白质不足可能使抗体抗原结合反应和补体浓度降低，免疫器官萎缩，t淋巴细胞尤其是辅助性淋巴细胞数量减少，吞噬细胞发生机能障碍，自然杀伤(nk)细胞对靶细胞的杀伤力下降。
7.我国将步入老年化社会，免疫力低下的人群会逐步上升，对增强免疫力保健食品的需求逐渐上升，以蛋白质粉为代表的增强免疫力保健食品备受消费者青睐，市场上也出现较多这类产品。中国专利文献也公开了一些宣称增强免疫力保健食品的制备方法，如cn106174598a公开了一种增强免疫力的蛋白粉，由植物蛋白、动物蛋白、磷脂以及添加剂等组成，所述蛋白粉中动物蛋白和磷脂的质量需配制成一定比例。该发明提供的蛋白粉同时包含动物蛋白和植物蛋白，提高了蛋白质种类，更利于人体吸收增强人体免疫力；同时磷脂和动物蛋白按一定比例配置，避免了动物蛋白食用过量引起的高血脂、高胆固醇等危害，无副作用、更安全方便食用。再有公开号cn109588729a公开了一种增强免疫力蛋白粉及其制备方法，由浓缩乳清蛋白、针叶樱桃粉、柠檬粉、酵母粉、牛磺酸、复合维生素、氧化锌组成。经加乙醇湿润蛋白、保温下蛋白网状结构再建、包埋维生素等工艺制得蛋白粉。上述蛋白粉中，有的配方营养素过于单一，未考虑到多种营养素的协同增效；有的配方营养素过多过
℃下冻结1h,在室温条件下解冻；再置于
‑
5℃下冻结10h，在室温条件下解冻，干燥，粉碎过60目筛，备用；
26.所述浓缩乳清蛋白中乳铁蛋白含量＞0.05％、免疫球蛋白＞3％；
27.所述维生素是由维生素c和维生素x组成，其中，维生素c占维生素总量的重量百分比为92％；所述维生素x选自叶酸、维生素b1、维生素b2、维生素b6和维生素b
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的等重量比混合物；
28.所述矿物质是由硒剂和锌剂组成，其中，锌剂占矿物质总重百分比为67％；所述硒剂选自亚硒酸钠；所述锌剂选自葡萄糖酸锌。
29.所述益生元为低聚木糖；
30.2)将0.5kg的维生素、0.1kg矿物质、2kg益生元分别过60目筛，备用；
31.3)将步骤1)、2)的配料混匀，即得。
32.实施例2
33.1)将60kg大豆分离蛋白和30kg浓缩乳清蛋白混合，加入2250kg的水溶解，在
‑
5℃下冻结5h,在室温条件下解冻；再置于
‑
35℃下冻结20h，在室温条件下解冻，干燥，粉碎过60目筛，备用；
34.所述浓缩乳清蛋白中乳铁蛋白含量＞0.05％、免疫球蛋白＞3％；
35.所述维生素是由维生素c和维生素x组成，其中，维生素c占维生素总量的重量百分比为88％；所述维生素x选自叶酸；
36.所述矿物质是由硒剂和锌剂组成，其中，锌剂占矿物质总重百分比0.3％；所述硒剂选自硒蛋白；所述锌剂选自乳酸锌。
37.所述益生元为低聚异麦芽糖；
38.2)将10kg的维生素、2kg矿物质、30kg益生元分别过60目筛，备用；
39.3)将步骤1)、2)的配料混匀，即得。
40.实施例3
41.1)将30kg大豆分离蛋白和12kg浓缩乳清蛋白混合，加入840kg的水溶解，在
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2℃下冻结4h,在室温条件下解冻；再置于
‑
25℃下冻结15h，在室温条件下解冻，干燥，粉碎过60目筛，备用；
42.所述浓缩乳清蛋白中乳铁蛋白含量＞0.05％、免疫球蛋白＞3％；
43.所述维生素是由维生素c和维生素x组成，其中，维生素c占维生素总量的重量百分比26％；所述维生素x选自叶酸、维生素b1、维生素b2和维生素b6，其重量比为1:2:1:2；
44.所述矿物质是由硒剂和锌剂组成，其中，锌剂占矿物质总重百分比90％；所述硒剂选自富硒食用菌粉；所述锌剂选自柠檬酸锌。
45.所述益生元为低聚果糖；
46.2)将5kg的维生素、0.5kg矿物质、15kg益生元分别过60目筛，备用；
47.3)将步骤1)、2)的配料混匀，即得。
48.实施例4
49.1)将60kg大豆分离蛋白和10kg浓缩乳清蛋白混合，加入700kg的水溶解，在
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5℃下冻结1h,在室温条件下解冻；再置于
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35℃下冻结10h，在室温条件下解冻，干燥，粉碎过60目筛，备用；
50.所述浓缩乳清蛋白中乳铁蛋白含量＞0.05％、免疫球蛋白＞3％；
51.所述维生素是由维生素c和维生素x组成，其中，维生素c占维生素总量的重量百分比0.9％；所述维生素x选自维生素b1、维生素b2、维生素b6和维生素b
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，其重量比为1:1:1:3；
52.所述矿物质是由硒剂和锌剂组成，其中，锌剂占矿物质总重百分比0.15％；所述硒剂选自亚硒酸钠、硒蛋白和富硒食用菌粉的混合物，其重量比为1:1:1；所述锌剂选自氯化锌。
53.所述益生元选自木糖醇；
54.2)将10kg的维生素、0.1kg矿物质、2kg益生元分别过60目筛，备用；
55.3)将步骤1)、2)的配料混匀，即得。
56.对照例1
57.1)将20kg大豆分离蛋白和10kg浓缩乳清蛋白混合，干燥，粉碎过60目筛，备用；
58.所述浓缩乳清蛋白中乳铁蛋白含量＞0.05％、免疫球蛋白＞3％；
59.所述维生素是由维生素c和维生素x组成，其中，维生素c占维生素总量的重量百分比为92％；所述维生素x选自叶酸、维生素b1、维生素b2、维生素b6和维生素b
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的等重量比混合物；
60.所述矿物质是由硒剂和锌剂组成，其中，锌剂占矿物质总重百分比为67％；所述硒剂选自亚硒酸钠；所述锌剂选自葡萄糖酸锌。
61.所述益生元为低聚木糖；
62.实验例1
63.本发明所述增强免疫力的组合物经动物试验证明，具有增强免疫力保健作用，且无毒副作用，其详细说明如下：
64.1、材料与方法
65.1.1样品：实施例1制得的产品，临用前用蒸馏水配至所需浓度。
66.1.2实验动物：雄性健康sd小鼠，体重18
‑
22g，。实验期间全部动物给予清洁级全价鼠颗粒饲料和灭菌水自由食用。
67.1.3实验方法：该样品成人推荐用量为12g/d，即0.2g/kg bw/d(成人体重以60kg计)。动物按体重分成四大组。分别为免疫一组：空斑、溶血素测定、脏器指数、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验：免疫二组：nk活性、淋转试验：免疫三组：dth试验；免疫四组：小鼠碳廊清试验。每大组动物按体重随机分成4小组，每小组10只动物，按人日推荐量的5倍、10倍、30倍分别设1.0、2.0、6.0g/kg bw低、中、高三个剂量组和蒸馏水对照组。每组动物每天按20ml/kg bw连续灌胃30天后，分别进行以下试验。
68.1.3.1碳廓清实验测定：对小鼠称重，按10ml/kg bw从小鼠尾部静脉注入稀释的印度墨汁，注入墨汁后2、10min，分别从内静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml 0.1％na2co3溶液中。用722分光光度计在600nm测光密度值(od)，以na2co3溶液作空白对照，将小鼠处死后，解剖动物，取出肝脏、脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，计算吞噬指数a。结果见表1。
69.表1碳廓清试验
[0070][0071]
*与对照组相比p＜0.05
[0072]
实验结果：样品各剂量组小鼠碳廓清吞噬指数a与对照组相比，差异均无统计学意义(p＞0.05)。
[0073]
1.3.2迟发型变态反应(dth)检测：小鼠腹部皮肤用电动剃毛刀进行脱毛处理，范围约为3cm
×
3cm，后用dnfb溶液50μl均匀涂抹致敏；5天后，再用dnfb溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击。24小时后劲椎脱臼处死小鼠，剪下左右两耳，用打孔器取下直径8mm的耳片称重，计算左右耳重量差值。结果见表2。
[0074]
表2 dth测定结果
[0075][0076]
*与对照组相比p＜0.05
[0077]
样品高剂量组小鼠左右耳肿胀度差明显高于对照组，经统计，差异有统计学意义(p＜0.05)。
[0078]
1.3.3抗体生成细胞的测定：每鼠腹腔注射2％(v/v)srbc悬液0.2ml进行免疫。5天后，摘除眼球采血做血清溶血素检测：将动物颈椎脱臼处死，取脾脏，用玻璃匀浆器磨碎，并通过四层纱布过滤，离心(1000转/10min)，用hank’s液洗两遍。将脾细胞悬浮于8mlhank’s液中。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水100ml)加热溶解后，放入45℃水浴保温，与等量的ph7.2
‑
7.4、2倍浓度的hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入50μl 10％srbc、25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂薄层的6cm平皿上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用sa缓冲液稀释的补体(1:10)加入，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。结果见表3。
[0079]
表3抗体生成细胞检测试验
[0080][0081]
*与对照组相比p＜0.05
[0082]
样品高剂量组小鼠抗体积数明显高于对照组，经统计，差异有统计学意义(p＜0.05)。
[0083]
1.3.4血清溶血素的测定：将小鼠摘除眼球采血，于2000r/min分离血清，用生理盐
水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μl，再加入100μl0.5％(v/v)的srbc悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。结果见表4。
[0084]
表4血清溶血素试验
[0085][0086]
*与对照组相比p＜0.05
[0087]
结果表明，样品高剂量组小鼠抗体积数明显高于对照组，经统计，差异有统计学意义(p＜0.05)。
[0088]
1.3.5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)和脏器/体重比值：每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，间隔30min颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min，孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞，晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)giemsa
‑
磷酸缓冲液冲洗染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，在油镜下阅片读数，计算吞噬率和吞噬指数，并解剖动物取出脾脏及胸腺，用滤纸吸干血迹后称重，并计算胸腺指数和脾指数。结果见表5。
[0089]
表5胸腺指数、脾指数的测定
[0090][0091]
样品各剂量组小鼠胸腺指数、脾指数与对照组相比，差异均无统计学意义(p＞0.05)。
[0092]
1.3.6cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和小鼠nk细胞活性测定(乳酸脱氢酶ldh测定法)：颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，经200目筛网过滤，制成单细胞悬液，将细胞悬液分为两部分，分别用于cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和小鼠nk细胞活性测定。
[0093]
1.3.6.1cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验：用hanks液洗涤细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中，台酚兰染色计数活细胞数(95％以上)，调整细胞浓度为3
×
106个/ml，将每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl cona液，另一孔为对照，置培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt50μl/孔，继续培养4h，培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装倒入96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。结果见表6。
[0094]
1.3.6.2小鼠nk细胞活性测定(乳酸脱氢酶ldh测定法)：试验前24小时将靶细胞传
代培养，用前以hanks液洗3次，用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为4
×
105个/ml，用hanks液洗涤脾细胞悬液2次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清液将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5ml2倍hanks液及8ml hanks液，离心10min(1000r/min)，用1ml完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数，台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2
×
107个/ml，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比为50:1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％np40各100μl，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％co2培养箱中培养4小时，然后将培养板离心(1500r/min)5min，每孔吸取上清液100μl置于96孔培养板中，同时加入ldh基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/l的hcl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(od)，计算nk细胞活性。结果见表7。
[0095]
表6 cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
[0096][0097]
*与对照组相比p＜0.05
[0098]
样品高剂量组小鼠淋转od差值明显高于对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。
[0099]
表7 nk细胞活性测定
[0100][0101]
样品各剂量组小鼠nk细胞活性与对照品比较，差异均无统计学意义(p＞0.05)。
[0102]
1.4实验数据统计方法：实验数据以spss软件进行单因素方差分析。经方差齐性检验，方差齐的实验数据采用lsd法进行统计分析，方差不齐的实验数据采用tambane法进行统计分析。
[0103]
1.5结论
[0104]
由以上结果可见，样品高剂量组明显增强cona诱导小鼠脾淋巴细胞增殖能力，促进dnfb诱导的迟发型变态反应；明显升高血清溶血素水平，促进小鼠抗体生成细胞生成。根据《保健食品检验与评价技术规范》之辅助增强免疫力功能试验的结果判定，在本试验条件下，本实施例1的产品具有辅助增强免疫力功能。
[0105]
实验例2
[0106]
本实施例1制得的增强免疫力的组合物经动物急性毒性试验表明无毒副作用，其详细说明如下：
[0107]
2、材料与方法
[0108]
2.1样品：采用实施例1制得的产品，成人日服推荐用量为12g，相当于0.2g/kg bw/d(成人体重按60kg计算)。
[0109]
2.2实验动物及环境：清洁级健康icr小鼠。
[0110]
2.3小鼠急性经口毒性试验：采用最大耐受剂量(mtd)试验法，选体重18
‑
22g的健康icr小鼠20只，雌雄各半。试验前小鼠隔夜禁食16小时，不禁水。称取样品10.0g，加蒸馏水至10ml，搅拌均匀，采取灌胃方式给药，按照每只小鼠每日灌胃剂量为20g/kg bw，即灌胃容量为0.02ml/g bw，灌胃后，连续观察14天，观察并记录动物中毒的表现和死亡情况。
[0111]
2.4结果：给药后至第14天，各鼠的外观、行为、呼吸、四肢活动、进食、排泄等均未见明显异常；无中毒死亡现象；实验结果见表8。
[0112]
表8样品急性经口毒性试验结果
[0113][0114]
从表8可见，该样品急性毒性试验结果为mtd＞20g/kg、bw(相当于成人日推荐量的100倍)，根据急性毒性分级属无毒级。
[0115]
实验例3
[0116]
将实施例1
‑
4以及对照例1中步骤1)制得的粉末进行氮溶指数(nsi)测定：
[0117]
称取1g样品，溶解于50ml的去离子水中，室温下磁力搅拌溶解1h，离心，用lowrry法测定上清液(可溶部分)的蛋白含量，采用dumas法测定样品蛋白质含量。上清液的蛋白总含量与样品蛋白总含量的比值即为氮溶指数。氮溶指数常常用来表示大豆分离蛋白溶解度及其所含功能性大豆蛋白含量，因此本试验用氮溶指数来平价各组大豆分离蛋白溶解性。
[0118][0119]
实验例4
[0120]
将实施例1～4及对照例1中步骤1)制得的粉末进行分散性及粘度测定：
[0121]
60s分散度：提前准备去离子水30ml于100ml烧杯中，打开搅拌器，保持转速恒定在500r/min，称取0.5g spi快速倒入烧杯，同时按下秒表，搅拌60s后，关闭搅拌器，迅速将悬浮液倒入60目滤网过滤，测定滤液中蛋白含量。分散度表示为滤液中蛋白质含量与总蛋白质含量的比值。滤液中蛋白质含量与总蛋白质含量均采用微量凯氏定氮法测定。
[0122]
粘度测定：称取试样30.00g于500ml塑料烧杯中，倒入170ml蒸馏水，加10滴消泡剂(消泡剂∶水＝2∶1)，用玻璃棒搅拌30秒，将挂于烧杯壁上的试样全部溶于水中，用手持高速搅拌器低速档搅拌30秒后，在2分钟内，用数显粘度计测定其粘度，直接读取并记录。
[0123]
各组试验结果如下表所示。
[0124]