一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒与流程

技术特征：
1.一种rna和dna二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、对rna核酸和dna核酸进行一链合成，得到一链cdna；s2、对所述一链cdna进行二链合成，得到二链cdna；s3、通过一步反应，实现对所述二链cdna片段化、末端修复、磷酸化及加a处理后得到加a产物；s4、将所述加a产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标rna片段和dna片段并回收；s5、以回收的所述目标rna片段和dna片段作为模板进行pcr扩增反应，以富集所述目标rna片段和dna片段，构建并得到所述rna和dna二代测序文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中，一链合成还包括如下步骤：s11、将rna与random primers于65℃进行结合处理5min，得到rna结合产物；s12、将所述rna结合产物与反应液a、酶b和酶c进行混合反应，得到所述一链cdna；其中，反应液a包括tris
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hcl、mgcl2、kcl、dtt、datp、dgtp、dctp及dttp；所述酶b为m
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mmlv酶；所述酶c为rnasin酶。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤s12中，所述混合反应中，混合反应条件为：反应温度为25℃、反应时间5
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15min，或者反应温度为42℃、反应时间为10
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20min；或者反应温度为70℃、反应时间为10
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30min。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中，所述二链合成包括：将所述一链cdna与反应物d、酶混合液e进行二链合成反应，得到所述二链cdna；其中，反应液d包括tris
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hcl、mgcl2、kcl、dtt、nad 、bsa、datp、dgtp、dctp及dttp；所述酶混合液e包括dna polymerase i、e.coli dna ligase及rnase h。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述混合反应中，反应温度为16℃、反应时间为30
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60min。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述一步反应包括如下步骤：将所述二链cdna与反应液f和酶混合液g进行混合反应，得到所述加a产物；其中，所述反应液f包括tris
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hcl、mgcl2、nacl、dtt、triton x
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100、atp、datp、dgtp、dctp及dttp；所述酶混合液g为vvn endonuclease mutan、t7 endonuclease mutant和taq dna polymerase的混合液。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述混合反应中，反应条件为：反应温度为37℃、反应时间为10
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30min；或者反应温度为65℃、反应时间为20
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30min。8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s4中，所述接头连接包括如下步骤：将所述加a产物与反应液h、反应液i和酶j进行混合反应，得到rna片段和dna片段；其中，所述反应液h包括tris
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hcl、mgcl2、dtt、atp及peg8000中；所述反应液i为接头x为illumina接头或mgiseq接头ad153；所述酶j为t4 dnaligase连接酶。9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述混合反应中，反应温度为20℃、反应时间为30min。10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤s4中，所述第一次纯化处理包括
如下步骤：s41、将所述rna片段和dna片段、80μl磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使rna片段和dna片段与磁珠充分混匀；s42、采用ep吸管反复吹打rna片段和dna片段，使其与磁珠充分混匀混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；s43、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；s44、往离心管中加入200μl新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠；s45、重复步骤s42至s44；s46、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；s47、将离心管中的样品取出来，加入22μl去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述目标rna片段和dna片段。11.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s5中，所述pcr扩增反应包括步骤：将所述目标rna片段和dna片段与反应液k和反应液l进行混合反应，得到rna和dna的二代测序文库；其中，所述反应液k包括5*q5 buffer、datp、dgtp、dctp、dttp及q5热启动超保真dna聚合酶；所述反应液l为illumina文库扩增引物或mgiseq文库制备引物。12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述pcr扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下:1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；6)保存阶段：反应温度为4℃；其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10
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14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。13.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述pcr扩增反应结束后，还包括对pcr扩增产物进行的第二次纯化处理：s51、将所述pcr扩增产物、85μl磁珠装入离心管中，并颠倒或旋涡振荡离心管，使pcr扩增产物与磁珠充分混匀；s52、采用ep吸管反复吹打pcr扩增产物，使其与磁珠充分混匀混匀，将离心管置于磁力架上室温静置；s53、待离心管中的溶液澄清后，去除上清液；s54、往离心管中加入200μl新鲜配制的80v/v％乙醇漂洗磁珠；s55、重复步骤s52至s54；s56、将离心管离心处理后，再把离心管置于磁力架上，彻底去除离心管中的上清液；s57、将离心管中的样品取出来，加入22μl去核酸酶超纯水，用移液器轻轻吸打混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，得到所述rna和dna二代测序文库。14.一种采用权利要求1至13任一所述构建方法制得的rna和dna二代测序盒。

技术总结
本发明属于生物技术领域，其公开了一种RNA和DNA二代测序文库的构建方法及二代测序盒，该二代测序文库的构建方法包括步骤：对RNA核酸和DNA核酸进行一链合成，得到一链cDNA；对述一链cDNA进行二链合成，得到二链cDNA；对二链cDNA片段化、末端修复、磷酸化及加A处理后得到加A产物；将加A产物进行接头连接和第一次纯化处理，得到目标RNA片段和DNA片段并回收；对目标RNA片段和DNA片段进行PCR扩增反应，以构建并得到所述RNA和DNA二代测序文库。该方法构建二代测序文库，采用整体建库流程，工艺步骤简化，极大缩减了操作流程和实验时间，可最大程度减少核酸样本的损耗，同时，无需构建两种文库，可大大节约人力、试剂、时间等成本。时间等成本。时间等成本。


技术研发人员：蒋析文 梁志坤 张丽珊 吴轶兰
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2021.08.25
技术公布日：2021/11/23