一种用于鉴定墨兰蝶瓣相关性状的引物、试剂盒及方法与流程

1.本发明属于农业生物技术领域。更具体地，涉及一种用于鉴定墨兰蝶瓣相关性状的引物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.墨兰(cymbidium sinense)为兰属植物，是我国传统观赏兰之一，因其花期适逢传统节日春节，继而发展成了产业化程度最高的兰花品种之一。墨兰花被片的形态及伸展姿态变化十分丰富，出现了更具观赏性的瓣型变异，形成了独特的花艺，其中一种瓣型变异为外轮花被片或侧瓣呈现不同程度的唇瓣化，由此产生蝶瓣品种。传统杂交育种是获得墨兰蝶瓣品种的主要途径之一，但传统的瓣型选择通常需要等植株开花之后再根据花被片的形状变异来进行，墨兰从播种到开花需要数年时间。因此，迫切需要开发一种瓣型早期检测方法。
3.2017年5月31日，中国专利cn 106755526a公开了一种墨兰“唇瓣和花瓣萼片化”性状相关的功能性分子标记及其鉴定方法，但目前还未见墨兰蝶瓣性状相关的功能性分子标记，或用于鉴定墨兰蝶瓣性状的引物、试剂盒、方法等的报道。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于鉴定墨兰蝶瓣相关性状的引物、试剂盒及方法。
5.本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定墨兰蝶瓣相关性状的pcr引物。
6.本发明的第二个目的是提供所述pcr引物在鉴定墨兰蝶瓣品种中的应用。
7.本发明的第三个目的是提供所述pcr引物在制备鉴定墨兰蝶瓣品种的产品中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供一种用于鉴定墨兰蝶瓣品种的试剂盒。
9.本发明的第五个目的是提供一种墨兰蝶瓣品种的鉴定方法。
10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
11.mads
‑
box基因csagl6
‑
1主要在墨兰的萼片中高表达，但本发明通过对不同瓣型的墨兰品种的分析发现，csagl6
‑
1在墨兰蝶瓣品种“文山奇蝶”的各花器官中几乎都不表达。将墨兰普通品种“企黑”和蝶瓣品种“文山奇蝶”中的csagl6
‑
1基因序列进行比对分析发现，墨兰蝶瓣品种“文山奇蝶”的csagl6
‑
1基因有两个拷贝，其中一个拷贝的orf序列与普通品种“企黑”的csagl6
‑
1完全相同，而另一个拷贝的orf序列出现176bp的缺失，由此发现了可用于准确地鉴定墨兰蝶瓣性状的功能性分子标记，并在此基础上开发出了一种可用于快速、准确地鉴定墨兰蝶瓣相关性状的pcr引物。
12.本发明提供了一种用于鉴定墨兰蝶瓣相关性状的pcr引物，其序列如seq id no.1～2所示。
13.本发明同时申请保护seq id no.1～2所示引物在鉴定墨兰蝶瓣品种和/或在制备
鉴定墨兰蝶瓣品种的产品中的应用。
14.本发明还提供了一种用于鉴定墨兰蝶瓣品种的试剂盒，其包含seq id no.1～2所示引物。
15.优选地，所述试剂盒中还包含pcr扩增所需试剂。
16.本发明还提供了一种墨兰蝶瓣品种的鉴定方法，其包含以下步骤：
17.s1.提取待鉴定样本的基因组dna；
18.s2.以步骤s1所得dna为模板，用seq id no.1～2所示引物进行扩增；
19.s3.凝胶电泳检测步骤s2扩增产物，若出现大小为130～150bp的条带，则所鉴定样本为墨兰蝶瓣品种。
20.具体地，步骤s1中采用ctab法提取样本基因组dna。
21.更具体地，提取样本基因组dna的方法为：取0.1g叶片置于研钵中，加入液氮，用研磨棒将材料研磨至粉末状，将粉末转移至预冷的1.5ml离心管中；加入300μl预热的1.5％ctab抽提液，充分混匀后置于65℃保温60min，每隔10min将离心管颠倒混匀数次；加入300μl氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)的溶液，猛烈混匀，常温下12000rpm离心10min；小心吸取上清至新的1.5ml离心管中，加入等体积预冷的异戊醇缓慢混匀，出现白色絮状沉时，再猛烈震荡，然后置于
‑
20℃静置30min；常温下，12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl70％乙醇洗涤，12000rpm离心5min，重复两次；弃上清，加入500μl无水乙醇，12000rpm离心5min；弃上清，真空干燥后加入200μl 1
×
te buffer，使dna充分溶解。dna溶液置于
‑
20℃保存备用。
22.具体地，步骤s2中的pcr反应体系为：10
×
taq pcr buffer 3μl，2.5mm dntps 3μl，10pmol的引物mdf和mdr各1μl，5u/μl的taq dna聚合酶0.5μl，基因组dna 50ng，ddh2o补齐至30μl。
23.具体地，步骤s2中的pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸3min。
24.优选地，步骤s1中待鉴定样本为墨兰幼苗叶片，见实施例2。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明通过克隆比对不同墨兰品种中的csagl6
‑
1基因序列的差异，发现了一种可用于快速、准确地鉴定墨兰蝶瓣品种的功能性分子标记，并在此基础上提供了一种用于鉴定具有蝶瓣性状的墨兰品种的pcr引物、试剂盒及方法。传统的瓣型鉴定方法通常需要等植株开花之后再通过花瓣的形状特征来判定，这极大地制约了鉴定的效率。与传统的鉴别墨兰蝶瓣品种的方法相比，本发明所述方法在墨兰幼苗时即可通过提取叶片dna，通过pcr反应进行鉴定，耗时更短，更高效，且本发明所述方法的准确率高，操作简便，不仅适用于墨兰种质资源的收集和鉴定，还可用于墨兰分子标记辅助育种，从而提高育种效率、降低育种成本。
附图说明
27.图1为不同瓣型的墨兰品种中csagl6
‑
1 orf序列的比对结果，其中wtcsagl6
‑
1和scsagl6
‑
1分别代表“企黑”和“文山奇蝶”相应的csagl6
‑
1 orf全长序列。
28.图2为引物对mdf和mdr对多种墨兰品种中的功能性标记的pcr扩增结果，其中m为marker dl2000，泳道1～5分别为“企黑”、“文山奇蝶”、“玉麒麟”、“华光蝶”和“大屯麒麟”。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
31.实施例1功能性分子标记的开发
32.本实施例中所使用的2种墨兰品种均来自深圳市兰科植物保护研究中心。它们分别是：墨兰普通品种“企黑”和墨兰蝶瓣品种“文山奇蝶”。
33.具体步骤如下：
34.1、采集墨兰的花苞，使用omega公司的植物rna提取试剂盒提取总rna；
35.2、使用takara公司的反转录试剂盒，将墨兰总rna分别反转录合成cdna；
36.3、以墨兰cdna为模板，采用特异引物csagl6
‑1‑
f(5
’‑
atgggaagaggaagagttg
‑3’
)和csagl6
‑1‑
r(5
’‑
gagcatccatccaagcata
‑3’
)进行pcr扩增，扩增后测序得到“企黑”和“文山奇蝶”的csagl6
‑
1序列，使用dnaman软件对获得的基因序列进行多序列比对。
37.比对结果如图1所示，与普通品种“企黑”相比，蝶瓣品种“文山奇蝶”的csagl6
‑
1 orf全长序列在466bp至641bp处发生了176bp的缺失，利用该基因的序列差异开发出了一种可用于快速、准确地鉴定墨兰蝶瓣品种的功能性分子标记。
38.实施例2墨兰蝶瓣性状的功能性分子标记的检测
39.首先基于墨兰普通品种“企黑”和蝶瓣品种“文山奇蝶”的csagl6
‑
1基因中的orf的序列差异，设计并筛选出两条特异性引物，其序列如下所示，引物所在位置如图1下划线所示：
40.mdf(seq id no.1)：5
’‑
atgcttgatcaaatggaagaacttc
‑3’
41.mdr(seq id no.2)：5
’‑
tgagcatccatccaagca
‑3’
42.本实施例中所使用的5种墨兰品种均来自深圳市兰科植物保护研究中心。它们分别是：“企黑”、“文山奇蝶”、“玉麒麟”、“华光蝶”和“大屯麒麟”，其中“企黑”为墨兰普通品种，其余为墨兰蝶瓣品种。
43.用ctab法提取上述5种墨兰叶片的总dna，优先选取墨兰幼苗叶片。
44.具体步骤如下：
45.1、取0.1g叶片置于研钵中，加入液氮，用研磨棒将材料研磨至粉末状，将粉末转移至预冷的1.5ml离心管中；
46.2、加入300μl预热的1.5％ctab抽提液，充分混匀后置于65℃保温60min，每隔10min将离心管颠倒混匀数次；
47.3、加入300μl氯仿∶异戊醇(24∶1)的溶液，猛烈混匀，常温下12000rpm离心10min；
48.4、吸取上清至新的1.5ml离心管中，加入等体积预冷的异戊醇，缓慢混匀，出现白色絮状沉时，再猛烈震荡，然后置于
‑
20℃静置30min；
49.5、常温下，12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 70％乙醇洗涤，12000rpm离心5min，重复两次；
50.6、弃上清，加入500μl无水乙醇，12000rpm离心5min；
51.7、弃上清，真空干燥后加入200μl 1
×
te buffer，使dna充分溶解。dna溶液置于
‑
20℃保存备用。
52.8、以所提取的墨兰dna为模板，使用引物mdf和mdr对墨兰中的功能性分子标记进行pcr检测。
53.pcr扩增体系为：10
×
taq pcr buffer 3μl，2.5mmdntps 3μl，10pmol的引物mdf和mdr各1μl，5u/μl的taq dna聚合酶0.5μl，基因组dna 50ng，ddh2o补齐至30μl。
54.pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸3min。
55.实施例2中的5个墨兰品种的功能性分子标记的pcr检测结果如附图2所示，其中m为marker dl2000，泳道1～5分别为“企黑”、“文山奇蝶”、“玉麒麟”、“华光蝶”和“大屯麒麟”。由图可知，4个蝶瓣品种(“文山奇蝶”、“玉麒麟”、“华光蝶”和“大屯麒麟”)均扩增出了大小约140bp的条带。其中，由于文山奇蝶的csagl6
‑
1有两个拷贝，pcr扩增之间存在竞争，最终导致差异条带弱，但4个蝶瓣品种均扩增出了大小约140bp的条带，与功能性分子标记的大小相符，表明本发明所述方法可用于鉴定墨兰蝶瓣品种，结果准确。
56.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。