血根碱在制备洋刀豆脲酶抑制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于天然化合物应用技术领域，具体涉及血根碱在制备洋刀豆脲酶抑制剂中的应用。


背景技术：

2.脲酶，又称尿素酶或尿素酰胺水解酶，分子量约为120000
‑
130000，脲酶中的洋刀豆脲酶是首次被发现含有镍离子的金属酶，在生物化学发展史上具有里程碑意义，脲酶广泛存在于各种细菌、真菌、放线菌和植物中，可将尿素分解为二氧化碳化合物和氨。脲酶有助于植物和微生物体利用内源性和外源性尿素作为氮源，并能将分解产生的氨合成机体蛋白质。但脲酶的存在也加速了尿素分解释放氨气的进程，大大降低了动物和植物对氮的利用率，引起土壤的ph值升高，增加了农业生产成本，污染农业产品。同时，动物体内的挥发性氨气容易引起动物血氨中毒，甚至死亡；而挥发性氨气通过淋溶进入环境水体后，可导致严重的土壤污染和水体富营养化；人体内的脲酶可将人体的代谢产物尿素重新分解后再次被吸收，改变体内的酸碱平衡，使体液和尿液的ph值升高，引发肾及尿结石、胃肠道溃疡、泌尿系统感染、甚至引起脑瘫、肝病等多种疾病。基于上述情况，关于脲酶抑制剂的开发越来越受到人们的重视。
3.目前，针对脲酶对人类生产和生活中带来的严重危害，国内外学者研究并使用脲酶抑制剂进行预防与治疗。迄今，脲酶抑制剂被广泛应用于医药、农业、畜牧业等领域，其种类主要包括尿素类似物，异羟肟酸类，重金属离子类，磷酰胺酯类，醍类，多酚类等。然而，现有的脲酶抑制剂因为大多具有稳定性差、作用时间短、毒副作用明显等问题，在实际应用中具有一定的限制。因此，从天然药物中筛选出安全、高效、无污染的脲酶抑制剂的研究备受关注。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种血根碱在制备洋刀豆脲酶抑制剂中的应用，本发明指出血根碱抑制洋刀豆脲酶的效果显著，且具有结构简单，安全性好等特点，具备良好的应用价值与开发前景，可作为脲酶抑制剂在植物肥料和动物饲料添加剂等领域进行应用。
5.本发明提供了血根碱在制备洋刀豆脲酶抑制剂中的应用，所述血根碱的结构式如式(ⅰ)所示：
[0006][0007]
血根碱是一种苯菲啶异喹啉类生物碱，为白屈菜、紫堇、博落回、血水草等中药的关键活性成分，其化学结构式如式(ⅰ)所示。血根碱是已知的一种安全、低毒的化合物，具有多种药理作用，如抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗血管生成、提高机体免疫力、改善肠道健康等。本发明率先发现，血根碱具有抑制洋刀豆脲酶活性的作用，因而可应用于制备洋刀豆脲酶抑制剂。
[0008]
本发明还提供了一种洋刀豆脲酶抑制剂，包括血根碱或其在药学上可接受的盐。
[0009]
优选的，所述洋刀豆脲酶抑制剂中还包括药学上可接受的辅料。
[0010]
本发明还提供了所述洋刀豆脲酶抑制剂在制备动物饲料添加剂中的应用。
[0011]
优选的，所述动物为反刍动物或单胃动物。
[0012]
将血根碱或其在药物上可接受的盐作为动物饲料添加剂添加至饲料中，可以减慢尿素在奶牛、肉牛、肉羊以及肉鸡等反刍动物或单胃动物体内的分解速度，提高尿素的利用率，并降低禽舍和畜舍内空气中氨气含量。
[0013]
本发明还提供了所述洋刀豆脲酶抑制剂在制备植物肥料中的应用。将所述洋刀豆脲酶抑制剂添加于氮肥中，提高尿素利用率，增加农作物产量，提高生产性能。
[0014]
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0015]
本发明开拓了血根碱作为洋刀豆脲酶抑制剂在植物肥料或动物饲料添加剂中的新用途，丰富了现有脲酶抑制剂的可选种类，有助于减少药物的耐药性。同时，由于血根碱本身为天然药物成分，并具有高效低毒的特点，因此在抑制洋刀豆脲酶活性方面具有良好的开发前景。
附图说明
[0016]
图1为血根碱对洋刀豆脲酶的抑制活性；
[0017]
图2为血根碱对洋刀豆脲酶的抑制类型研究；其中，a表示血根碱抑制洋刀豆脲酶的lineweaver
‑
burk双倒数图，b表示血根碱抑制洋刀豆脲酶lineweaver
‑
burk双倒数图中曲线的斜率与抑制剂浓度关系图，c表示血根碱抑制洋刀豆脲酶lineweaver
‑
burk双倒数图中曲线的截距与抑制剂浓度关系图；
[0018]
图3为含疏基化合物对洋刀豆脲酶活性影响的条形图；其中，a图为含疏基化合物与洋刀豆脲酶孵育时间对脲酶活性影响的条形图，b图为含疏基化合物、血根碱与洋刀豆脲酶三种的加入顺序对脲酶活性影响的条形图；
[0019]
图4为无机化合物对血根碱抑制洋刀豆脲酶活性影响的条形图。
具体实施方式
[0020]
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
[0021]
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
[0022]
实验材料
[0023]
受试药物
[0024]
血根碱，购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于98％；尿素，二硫苏糖醇、半胱氨酸均购自索莱宝；谷胱甘肽购自美仑生物；氟化钠、硼酸均购自麦克林。hepes、水杨酸钠、硝普钠、氢氧化钠、次氯酸钠、丙三醇，均购自广州化学试剂厂，均为分析纯。
[0025]
药物的配制
[0026]
分别称取适量血根碱，用20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)配制成相应浓度，置于4℃避光保存，备用。
[0027]
洋刀豆脲酶的配制
[0028]
称取适量洋刀豆脲酶，溶于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成10u/ml的洋刀豆脲酶溶液，置于4℃冰箱中冷冻保存，备用。
[0029]
尿素的配制
[0030]
称取尿素适量，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成150mm的尿素溶液，放于4℃冰箱中冷冻保存，备用。
[0031]
berthelot显色液的配制
[0032]
a液：分别称取适量的硝普钠和水杨酸钠粉末，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，配制成含9.73mm亚硝基铁氰化钠、700mm水杨酸钠的显色a液，置于4℃避光保存，备用。
[0033]
b液：称取氢氧化钠9g，溶解于20mm的hepes缓冲液(ph为7.5)中，放冷，加入12ml次氯酸钠，混匀，定容至50ml，置4℃避光保存，备用。
[0034]
实施例1：血根碱对洋刀豆脲酶的抑制作用研究
[0035]
将洋刀豆脲酶溶液和一系列浓度的受试药物溶液混匀，置37℃孵育20分钟；加入尿素溶液，室温条件下避光反应20分钟；加入berthelot显色液避光显色10分钟，吸取200μl孵育液至96孔板上，在酶标仪上测定595nm下的od
绝对
值。每个浓度平行做3次。空白样以各稀释液的溶剂代替，其余操作同上，测得od
空白
。根据公式1求得相应的od
相对
值。根据公式2求得残余酶活性(residual activity，ra)，并通过graphpad求得相应半数抑制浓度ic
50
。
[0036]
od
相对
＝od
绝对
–
od
空白
ꢀꢀ
(公式1)
[0037]
剩余酶活性(％)＝od
相对值供试品
/od
相对空白
×
100％
ꢀꢀ
(公式2)
[0038]
如图1所示，血根碱抑制洋刀豆脲酶活性的半数抑制浓度(ic
50
)为0.11
±
0.02mm，表明血根碱抑制洋刀豆脲酶活性显著。
[0039]
实施例2：血根碱对脲酶的抑制类型研究
[0040]
取一定浓度的洋刀豆脲酶和一系列浓度的血根碱溶液(0、0.063、0.125、0.25mm)
混匀，置37℃孵育20分钟。然后在室温下加入一系列浓度的尿素溶液(0.468
‑
7.5mm)避光反应20分钟，再根据2.1的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。实验通过反应速度的倒数(1/v，即1/od
相对
)对底物浓度的倒数(1/[urea])作lineweaver
‑
burk图，最后通过l
‑
b曲线结合公式3求得动力学参数k
m
、v
max
，并通过l
‑
b曲线进行二次作图求得抑制常数k
i
、k
is
。
[0041][0042]
结果如图2所示，由lineweaver
‑
burk双倒数图可知随着血根碱浓度的变化，血根碱抑制洋刀豆脲酶的动力学参数k
m
变化不大，而v
max
值随着血根碱浓度的增加而逐渐减小，由此可初步推断血根碱抑制洋刀豆脲酶的作用类型为非竞争性抑制类型。此外，结合血根碱抑制洋刀豆脲酶类型，对lineweaver
‑
burk双倒数图进行二次作图可求得血根碱抑制洋刀豆脲酶的抑制常数k
i
为0.15
±
0.03mm，k
is
为0.22
±
0.09mm。
[0043]
实施例3：含巯基化合物对洋刀豆脲酶活性的影响
[0044]
1.孵育时间试验
[0045]
把洋刀豆脲酶溶液，含巯基化合物溶液(dtt溶液，l
‑
cys溶液或gsh溶液，浓度均为1.25mm)以及0.25mm血根碱溶液混匀，置37℃分别预孵育5，10，20或40min后，于室温下加入尿素反应20min，再根据实施例1中的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性ra。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0046]
2.血根碱
‑
巯基
‑
脲酶的相互作用试验
[0047]
把洋刀豆脲酶溶液，含巯基化合物溶液(dtt溶液，l
‑
cys溶液或gsh溶液，浓度均为1.25mm)以及0.25mm血根碱溶液中的其中两种溶液混匀，置37℃预孵育20min后，接着加入第三中溶液混匀，并在37℃再孵育20min，然后在室温下向共孵育液加入尿素反应20min，再根据实施例1的方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性ra。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0048]
结果如图3所示，当系统中含有巯基化合物(二硫苏糖醇，半胱氨酸或谷胱甘肽溶液)时，即使是在血根碱存在的情况下，洋刀豆脲酶仍能保持较高的酶活性。结果表明血根碱抑制洋刀豆脲酶活性的其中一个作用位点为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。
[0049]
实施例4：无机化合物对洋刀豆脲酶活性的影响
[0050]
取洋刀豆脲酶溶液与无机化合物溶液(1.25mm硼酸或氟化钠溶液)混匀，置37℃培养箱预孵育20min。再加入血根碱溶液(0.25mm)混匀，置37℃培养箱再孵育20min后取出，在室温下加入尿素反应20min，再根据实施例1中方法显色并测得od
绝对
值并求得相应的od
相对
值，并求出相应的残余酶活性ra。以加入物质的溶剂作空白对照，平行测定3次。
[0051]
结果如图4所示，当系统中洋刀豆脲酶同时与血根碱及硼酸或氟化钠存在时，残余酶活性均降低，硼酸或氟化钠对洋刀豆脲酶的活性无保护作用。结果进一步表明血根碱抑制洋刀豆脲酶活性的作用位点可能为脲酶氨基酸系列中的巯基基团。
[0052]
以上实验表明，血根碱能显著抑制洋刀豆脲酶的活性。此外，抑制类型研究表明血根碱是一种非竞争性脲酶抑制剂。进一步机理研究表明，血根碱主要与洋刀豆脲酶结构中巯基活性部位相互作用，从而抑制洋刀豆脲酶的活性。综上可知，血根碱具抗洋刀豆脲酶的作用，且作用效果明显。再结合血根碱结构简单，安全等优点，血根碱在抑制洋刀豆脲酶活
性方面具有良好的应用价值与开发前景，是潜在的脲酶抑制剂。
[0053]
上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。