一种高动态范围的多重数字PCR芯片及其制备方法与流程

一种高动态范围的多重数字pcr芯片及其制备方法
技术领域
1.本技术涉及分子生物学领域，涉及一种高动态范围的多重数字pcr芯片及其制备方法。


背景技术：

2.微流控技术(microfluidics)，以微加工结构为特点，典型地在微米尺度上操纵流体，具有高通量和灵敏度。微流体器件的关键元件是由集成的微通道、阀门和腔室组成，以实现高效的流体精确控制和自动分析复杂流体作为一种强大的生物医学设备，微型微流控平台已被应用于组织工程、微粒子制造、药物传递、护理点检测(poct)和肿瘤筛查等多个领域。随着微制造方法的巨大进步，微流控平台因其低成本、良好控制的微结构、减少样品消耗、快速流体处理和满意的检测灵敏度等显著优势，越来越多地被用于病原菌检测和疾病监测等领域。
3.数字pcr(digital pcr，dpcr)是一种无需标准曲线即可对目标核酸进行绝对定量的新方法，该方法在检测领域具有巨大潜力。近些年来，在文献中报道了许多新型数字pcr芯片，主要有两大类，一类是基于液滴的数字pcr芯片，另一类是基于微阵列的数字pcr芯片。但是这些芯片大多一次只能检测一种样本，无法实现多种样本的同时检测，极大限制了数字pcr芯片的实际应用能力。此外，目前以报道的数字pcr芯片无法实现高动态范围的检测。然而，在实际样本诊断及临床监测中，对样品进行高动态范围的多重检测十分重要。因此，提高数字pcr芯片的动态监测范围及多重检测能力是目前亟待解决的关键问题。目前关于这方面的研究报道较少。公开号为cn110575852a的中国专利申请中开发了一种集成样品前处理的多重数字rpa微流控芯片，最多只能进行四重检测，并且该发明的腔室只有一种尺寸，无法实现动态范围的检测。
4.在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下问题：
5.1.数字pcr芯片在多重检测方面能力不足，2.数字pcr芯片的检测动态范围有限。


技术实现要素：

6.鉴于此，本技术实施例提供一种高动态范围的多重数字pcr芯片及其制备方法，以解决上述问题。
7.根据本技术实施例的第一方面，提供一种高动态范围的多重数字pcr芯片，其中，该芯片包括从下至上依次粘合的基底层、腔室层、支撑层和封口层；
8.其中所述腔室层包括：
9.一级进样口；
10.多个检测区域，所述检测区域包括：
11.蛇形通道，所述蛇形通道的一端与所述一级进样口相连通；
12.二级进样口，所述二级进样口的一端与所述蛇形通道的另一端相连通；
13.主通道，所述主通道的一端与所述二级进样口的另一端相连通；
14.反应单元，所述反应单元至少具有四种不同体积的腔室，所述腔室均接入所述主通道；以及
15.出样口，所述出样口与所述主通道的另一端相连通。
16.可选的，所述反应单元具有四种不同体积的腔室，四种腔室直径分别为100μm、400μm、800μm和1200μm，高为100μm。
17.可选的，直径为100μm的腔室有1656个，直径为400μm的腔室有360个，直径为800μm的腔室有288个，直径为1200μm的腔室有360个。
18.可选的，单个所述检测区域的进样体积是10μl。
19.可选的，每个所述检测区域具有六组反应单元。
20.可选的，所述主通道由四段宽度不同的子通道连接而成，一段所述子通道和一种所述腔室一一对应。
21.可选的，所述四段宽度不同的子通道沿样品流动方向依次增大。
22.可选的，所述四段宽度不同的子通道分别为50μm、100μm、200μm、300μm。
23.可选的，所述腔室层和支撑层均由聚二甲基硅氧烷制作而成。
24.可选的，所述腔室层和基底层通过不可逆等离子体键合。
25.根据本技术实施例的第二方面，提供第一方面所述的高动态范围的多重数字pcr芯片的制备方法，该方法包括以下步骤：
26.(1)准备干净的4英寸硅片；
27.(2)采用标准软光刻法制作腔室层模具；
28.(3)将模具用脱模剂进行旋涂处理，通风干燥；
29.(4)配制a：b＝5：1的pdms并浇注在腔室层模具上，加热固化后形成腔室层；
30.(5)配制a：b＝10：1的pdms并浇注在腔室层上，固化后形成支撑层；
31.(6)将不同比例的pdms加热后粘在一起，将固化后的pdms脱模并用打孔器进行打孔，形成进出样口；
32.(7)通过等离子体处理将腔室层与基底进行封接；
33.(8)在支撑层上贴一层封口层，密封进出样口。
34.本技术的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
35.(1)本发明提供的一种高动态范围的多重数字pcr芯片，制备相对简单。由于具有预包埋探针和引物的二级进样口，可以根据检测需求，灵活改变检测对象。在应用时，由于此芯片的材料为具有透气性和一定储气性的疏水材料，因此进样方式是基于负压的自吸分液进样，而无需施加外力。
36.(2)由于具有不同体积大小的腔室，因此可以达到高动态范围的检测。
37.(3)多个检测区域的设置，使得只需一次进样即可同时检测多个样本的优点。
38.(4)本发明提供的一种高动态范围的多重数字pcr芯片，体积较小，操作简单，无需借助大型仪器，非常适用于现场检测。
39.应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本技术。
附图说明
40.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本技术的实施例，并与说明书一起用于解释本技术的原理。
41.图1是根据一示例性实施例示出的一种高动态范围的多重数字pcr芯片的截面结构示意图。
42.图2是根据一示例性实施例示出的腔室层的结构示意图。
43.图中的附图标记有：
44.100、基底层；200、腔室层；300、支撑层；400、封口层；210、一级进样口；220、检测区；221、蛇形通道；222、二级进样口；223、主通道；224、第一腔室；225、第二腔室；226、第三腔室；227、第四腔室；228、出样口。
具体实施方式
45.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的装置和方法的例子。
46.在本技术使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本技术。在本技术和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
47.应当理解，尽管在本技术可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本技术范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在
……
时”或“当
……
时”或“响应于确定”。
48.参考图1和图2，本发明实施例提供一种高动态范围的多重数字pcr芯片，其中，该芯片包括从下至上依次粘合的基底层100、腔室层200、支撑层300和封口层400；其中所述腔室层200包括：一级进样口210和多个检测区220域，所述检测区220域包括：蛇形通道221、二级进样口222、主通道223、反应单元以及出样口228，所述蛇形通道221的一端与所述一级进样口210相连通；所述二级进样口222的一端与所述蛇形通道221的另一端相连通；所述主通道223的一端与所述二级进样口222的另一端相连通；所述反应单元至少具有四种不同体积的腔室，所述腔室均接入所述主通道223；所述出样口228与所述主通道223的另一端相连通。
49.由上述实施例可知，本技术由于具有预包埋探针和引物的进样口，可以根据检测需求，灵活改变检测对象。在应用时，由于此芯片的材料为具有透气性和一定储气性的疏水材料，因此进样方式是基于负压的自吸分液进样，而无需施加外力。由于具有不同体积大小的腔室，因此可以达到高动态范围的检测。多个检测区域的设置，使得只需一次进样即可同时检测多个样本的优点。该pcr芯片，体积较小，操作简单，无需借助大型仪器，非常适用于现场检测。
50.本实施例中，采用四种不同体积的反应单元的腔室能够显著提高检测的动态范围，通过引物和探针的预包埋可实现六种不同组分的检测。具体地，四种不同体积的反应单元分别记为第一腔室224、第二腔室225、第三腔室226以及第四腔室227，四个反应单元都是圆柱形的腔室，腔室直径分别为100μm、400μm、800μm和1200μm，高为100μm，4种不同体积的腔室可以用于提高芯片的动态范围。
51.本实施例中，直径为100μm的第一腔室224有1656个，直径为400μm的第二腔室225有360个，直径为800μm的第三腔室226有288个，直径为1200μm的第四腔室227有360个，在理论上可以实现8个数量级的动态范围。
52.本实施例中，单个所述检测区220域的最佳进样体积是10μl，整个芯片的最佳进样体积是60μl(包含损耗)，在减少试剂浪费的实现数字pcr精准检测。
53.本实施例中，每个检测区220域有六条主通道223，每个所述检测区220域具有六组四种不同体积的反应单元，通过一次进样便可实现6种不同目标的检测。
54.进一步地，所述主通道223由四段宽度不同的子通道连接而成，一段所述子通道和一种所述反应单元一一对应，具体地，四段宽度不同的子通道包括依次相连的第一子通道、第二子通道、第三子通道和第四子通道，第一腔室224对应第一子通道，第二腔室225对应第二子通道，第三腔室226对应第三子通道，第四腔室227对应第四子通道；所述四段宽度不同的子通道沿样品流动方向依次增大，具体地，所述四段宽度不同的子通道分别为50μm、100μm、200μm、300μm，梯度式的通道设计可以保证快速进样的同时实现样品的有效分割。
55.本实施例中，所述基底层100为玻璃材质或其他可与聚二甲基硅氧烷(pdms)密封接合的材料。
56.本实施例中，所述腔室层200和基底层100通过不可逆等离子体键合，实现整体封装防止漏液及漏气。
57.本实施例中，所述腔室层200由聚二甲基硅氧烷(pdms)制作而成，该材料透明易观察，并且具有很强的透气性储气性，同时还具有疏水性。
58.本实施例中，所述支撑层300由聚二甲基硅氧烷(pdms)制作而成，高度在2mm
‑
5mm之间，用来支撑腔室层200及提供一定的负压。
59.本发明实施例还提供一种高动态范围的多重数字pcr芯片的制备方法，通过以下步骤：
60.(1)准备干净的4英寸硅片；
61.(2)采用标准软光刻法制作腔室层200模具；
62.(3)将模具用脱模剂进行旋涂处理，通风干燥；
63.(4)配制a：b＝5：1的pdms并浇注在腔室层200模具上，加热固化后形成腔室层200；
64.(5)配制a：b＝10：1的pdms并浇注在腔室层200上，固化后形成支撑层300；
65.(6)pdms层芯片脱模并用打孔器进行打孔，形成进出样口228；
66.(7)通过等离子体处理后将芯片与基底进行封接；
67.(8)在支撑层300上贴一层聚丙烯薄膜作为封口层400，密封进出样口228。
68.下面通过具体的实施例来对制备方法进行细化说明。
69.实施例
70.本发明提供的高动态范围的多重数字pcr芯片通过以下步骤制备：
71.(1)硅片准备：将干净的硅片置于热板上200℃烘烤4～5min。
72.(2)模具制作：倾倒一个硬币大小的su
‑
8 3025负性光胶在硅片中央，设定匀胶机的涂覆程序为：500rpm，10s；1200rpm，30s，旋涂的光胶厚度为50μm。前烘：95℃烘烤15min，缓慢降至室温。曝光：将通道掩膜对准涂覆光胶的硅片，使用单面光刻机进行曝光，曝光时间为6s。后烘：65℃烘烤1min，95℃烘烤5min，缓慢降至室温。第二次涂覆光刻胶：倾倒一个硬币大小的su
‑
83025负性光胶在硅片中央，设定匀胶机的涂覆程序为：500rpm，10s；1200rpm，30s，旋涂的光胶厚度为50μm。第二次前烘：95℃烘烤15min，缓慢降至室温。第二次曝光：将腔室掩膜对准已经曝光通道的硅片，使用单面光刻机进行曝光，曝光时间为11s。后烘：65℃烘烤1min，95℃烘烤5min，缓慢降至室温。显影：该过程在通风橱进行。将硅片放入平皿中，倒入显影液使其没过硅片，盖上平皿盖并置于摇床上，显影15min后取出硅片，首先用异丙醇冲洗，若硅片上出现乳白色絮状物，则将其放入显影液中继续显影，直至用异丙醇清洗不会出现乳白色沉淀，然后用无水乙醇冲洗，显微镜观察模具结构，最后若无问题则用去离子水清洗硅片，并用空气吹干。显影后的硅片放置在热板上进行硬烘，设定程序为95℃烘烤5min，200℃烘烤30min。待硅片降至室温，用旋涂机涂覆一层脱模剂，以使pdms更易脱模。
73.(3)腔室层200制作：配制5:1的pdms预聚物6g，真空匀胶机混匀并排气泡。将配好的预聚物倒在制作好的模具上，使用旋转涂覆机进行旋涂，程序为：500rpm，10s；1500rpm，30s，厚度大约为300μm，85℃烘烤5min。
74.(4)支撑层300制作：在腔室层200上方倾倒一层10:1的pdms，厚度约为2
‑
5mm，85℃烘烤1h。
75.(5)将固化的pdms从模具上接下来并进行切割打孔。
76.(6)芯片封接：等离子体处理腔室层200与基底层100表面，将二者经过处理的面贴合，然后90℃烘烤600min。
77.(7)最后在芯片上层贴上透明胶带，用以密封进出样口228。
78.本发明时提供过的芯片，其独特设计，实现单次进样检测6种不同目标的数字pcr检测；利用单色荧光便可实现6种目标的检测，提高了数字pcr芯片的多重检测能力；每个检测区域的动态范围至少可以达到7个数量级，相当于百万级别阵列的腔室，提高了数字pcr的多重检测能力同时提高了芯片的动态检测范围；利用pdms的自吸进样方式，无需任何外源泵阀，负压处理后便可以自动进样；芯片的预包埋结构设计，可以在实现特定区域的预包埋的同时防止不同区域之间液体互串。
79.本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本技术的其它实施方案。本技术旨在涵盖本技术的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本技术的一般性原理并包括本技术未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本技术的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
80.应当理解的是，本技术并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本技术的范围仅由所附的权利要求来限制。