包含表达MAL的干细胞样记忆T细胞作为活性成分的免疫增强或抗癌活性增强的组合物的制作方法

包含表达mal的干细胞样记忆t细胞作为活性成分的免疫增强或抗癌活性增强的组合物
技术领域
1.本发明涉及用于免疫增强或抗癌活性增强的组合物，更具体而言，涉及使用表达髓鞘和淋巴细胞(mal)的干细胞样记忆t(tscm)细胞的用于免疫增强或抗癌活性增强的组合物、用于癌症免疫治疗的组合物、用于使用mal诱导tscm细胞分化的组合物、以及使用mal筛选癌症免疫治疗剂或tscm细胞分化诱导剂的方法。


背景技术：

2.根据国家统计局的数据，在韩国人的死因中，癌症居首位。一般而言，癌症是由构成人体组织的细胞的周期异常引起的细胞无正常分化而持续分裂的疾病，并且通过起始、促进和进展三个阶段产生。癌症的病因已知为通过由细胞持续刺激的异常增殖引起的癌变组织的形成，在所述细胞中，通过环境或食物中的致癌物质使正常基因或抑癌基因发生突变。
3.大多数的癌症治疗包括手术、放射疗法和免疫疗法以及化学疗法，研究用于治疗癌症的抗癌剂的方法包括寻找针对癌细胞的直接细胞毒性材料的方法、寻找调节机体的免疫能力的材料的方法、寻找抑制癌细胞转移的材料的方法、以及寻找抑制血管生成的材料的方法。然而，由于目前的临床实践中使用的大多数抗癌药物是化学合成材料，因此会引起对正常细胞产生毒性等问题，为了解决这些问题，近年来利用免疫应答的治疗受到关注。
4.直到1990年才知晓的免疫疗法是增高人体内的免疫力以对抗癌症的非特异性治疗方法，并包括使用干扰素和白细胞介素的活化淋巴细胞疗法和细胞因子疗法。最近，癌症免疫疗法包括非常广泛范围的癌症疫苗疗法、单克隆抗体疗法、过继细胞疗法和细胞疗法。在癌症免疫疗法中，过继细胞疗法是一种被动免疫疗法并使用各种免疫细胞，在所述疗法中，通过给予预期具有针对肿瘤的免疫功能的细胞来预期抗肿瘤效果。特别是，通过t细胞的组织渗透性和抗原特异性，预期可一次有效去除分散在多个地方的癌症，并且由于t细胞可通过外渗直接渗透到组织中来杀死特异性表达抗原的细胞，其渗透入各种转移的组织以去除癌细胞，并因此使用t细胞的细胞疗法的开发正在积极进行。
5.然而，缺乏在体内维持给予的免疫细胞的存活和活性并表现出作为治疗剂的足够功能的技术发展。因此，在本发明中，在cd3

t细胞中，旨在使用tscm细胞作为维持和增加体内给予的免疫细胞的存活和活性的方式。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明针对提供用于免疫增强或抗癌活性增强的组合物。
8.本发明还针对提供用于癌症免疫治疗的组合物，或用于干细胞样记忆t细胞分化的组合物。
9.本发明针对提供筛选癌症免疫治疗剂或干细胞样记忆t细胞分化诱导剂的方法。
10.技术方案
11.为了解决上述问题，本发明提供了用于免疫增强或抗癌活性增强的组合物，所述组合物包含表达mal(髓鞘和淋巴细胞)的干细胞样记忆t细胞(tscm)作为活性成分。
12.本发明还提供了用于癌症免疫治疗的药物组合物或用于癌症免疫治疗的保健功能食品组合物，所述组合物包含mal蛋白表达或活性的激活剂作为活性成分。
13.本发明还提供了用于分化干细胞样记忆t细胞的组合物，所述组合物包含mal蛋白表达或活性的激活剂作为活性成分。
14.本发明还提供了筛选癌症免疫治疗剂的方法，所述方法包括：(a)从分离自人的样品中分出cd3 t细胞；(b)通过用il
‑
17、il
‑
15和测试物质处理并随后培养，将cd3 t细胞分化为干细胞样记忆t细胞；(c)测量干细胞样记忆t细胞中的mal的表达水平；以及(d)与未用测试物质处理的对照相比，在测试物质中选择具有增高的mal的表达或活性水平的物质。
15.本发明还提供了筛选干细胞样记忆t细胞分化诱导剂的方法，所述方法包括：(a)从分离自人的样品中分出cd3 t细胞；(b)通过用il
‑
17、il
‑
15和测试物质处理并随后培养，将cd3 t细胞分化为干细胞样记忆t细胞；(c)测量干细胞样记忆t细胞中的mal的表达水平；(d)与未用测试物质处理的对照相比，在测试物质中选择具有增高的mal的表达或活性水平的物质。
16.有益效果
17.根据本发明，由于髓鞘和淋巴细胞(mal)改善了干细胞样记忆t(tscm)细胞的体内分化、存活和活化，在其中表达mal的tscm细胞可用作用于免疫增强或抗癌活性增强的组合物，并且mal可有效地用于癌症免疫治疗组合物、诱导tscm细胞分化的组合物、筛选癌症免疫治疗剂的方法和筛选tscm细胞分化诱导剂的方法。
附图说明
18.图1显示了从外周血单核细胞中分离cd3

t细胞。
19.图2显示了使用cd3

t细胞分化成各种类型的记忆t细胞。
20.图3显示了根据记忆t细胞的类型特异性表达的基因。
21.图4为根据记忆t细胞的类型确认mal的表达水平的结果。
22.图5为根据mal表达的抑制确认tscm细胞的数量减少的结果。
23.图6为根据mal表达的调节确认体内淋巴细胞存活的变化的结果。
具体实施方式
24.本发明人使用从正常人的血液中分离的cd3

t细胞证实，处于分化的各种类型的记忆t细胞中，mal在干细胞样记忆t(tscm)细胞中特异性地过表达，并且mal改善了tscm细胞的分化、存活和活化，从而完成了本发明。
25.因此，本发明提供了用于免疫增强或抗癌活性增强的组合物，所述组合物包含在其中表达mal(髓鞘和淋巴细胞)的干细胞样记忆t细胞(tscm)作为活性成分。
26.mal的氨基酸序列可由seq id no：1示出，mal的碱基序列可由seq id no：2示出。
27.干细胞样记忆t细胞可通过il
‑
17和il
‑
15进行分化，并且可为cd3

cd8

ccr7

cd45ro
‑
cd95

t细胞。
28.此外，本发明提供了用于癌症免疫治疗的组合物，所述组合物包含mal蛋白表达或活性的激活剂作为活性成分。
29.mal蛋白表达和活性的激活剂可为与mal蛋白特异性结合的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体或天然物质，但本发明不限于此。
30.当本发明的组合物为药物组合物时，为了给药，除了上述活性成分之外，还可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂和稀释剂可为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐/酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。
31.本发明的药物组合物可配制成口服制剂(例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂或气雾剂)、外用制剂、栓剂或无菌注射液。具体而言，对于制剂，可以制备通常使用的表面活性剂或赋形剂，例如填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、稀释剂。作为口服给予的固体制剂，使用片剂、丸剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，但本发明不限于此。除了活性成分之外，还可以通过混合赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)中的至少一种来制备这种固体制剂。此外，除了简单的赋形剂之外，还可使用润滑剂(如硬脂酸镁和滑石粉)。除了用于口服给予的液体或液体石蜡之外，可在制剂中添加各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、调味剂和防腐剂。肠胃外给予的制剂可为无菌水性溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂或栓剂。作为非水性溶剂或混悬剂，可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、或可注射的酯(如油酸乙酯)。作为栓剂基质，可使用witepsol、macrogol、吐温61、可可脂、月桂精或甘油明胶。
32.本发明的药物组合物的合适剂量取决于患者的病情和体重、疾病的严重程度、剂型、给予途径和持续时间，但可由本领域普通技术人员选择，并且该组合物的日剂量优选为0.001mg/kg至50mg/kg，并且如果需要，可一次或以分开的部分给予。
33.此外，本发明提供了用于癌症免疫疗法的保健功能食品组合物，所述组合物包含mal蛋白表达或活性的激活剂作为活性成分。
34.mal蛋白表达和活性的激活剂可为与mal蛋白特异性结合的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体或天然物质，但本发明不限于此。
35.当本发明的组合物为保健功能食品组合物时，可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(包括合成和天然调味剂)、着色剂、填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇或碳酸饮料中使用的碳化剂。此外，该组合物还可含有用于制造天然果汁、合成果汁和植物饮料的果肉。这些成分可单独使用或组合使用。此外，保健食品组合物可为肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、蜜饯、比萨、拉面、口香糖、冰淇淋、各种汤、饮料、茶、功能水、饮品、酒精饮料和维生素复合物中的任一种。
36.此外，保健食品组合物可进一步包含食品添加剂，并且除非另有说明，否则作为食品添加剂的适用性通过根据食品药品安全部批准的韩国食品添加剂法典的一般规定和一般试验方法中的相应项目的标准和准则进行确定。
37.韩国食品添加剂法典中列出的项目可为例如化学合成物(如酮、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸和肉桂酸)，天然添加剂(如柿子色素、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色素和瓜尔
胶)，以及混合制剂(如l
‑
谷氨酸钠、面条用碱剂、防腐剂、焦油色素制剂)。
38.在本文中，可根据需要适当地添加或去除在制备保健食品组合物的过程中添加到食品中的根据本发明的组合物的含量。
39.此外，本发明提供了用于干细胞样记忆t细胞分化的组合物，该组合物包括mal蛋白表达或活性的激活剂作为活性成分。
40.mal蛋白表达和活性的激活剂可为与mal蛋白特异性结合的化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体或天然物质，但本发明不限于此。
41.此外，本发明提供了筛选癌症免疫治疗剂的方法，所述方法包括：(a)从分离自人的样品中分出cd3 t细胞；(b)通过用il
‑
17、il
‑
15和测试物质处理并随后培养，将cd3 t细胞分化为干细胞样记忆t细胞；(c)测量干细胞样记忆t细胞中的mal的表达水平；以及(d)与未用测试物质处理的对照相比，在测试物质中选择具有增高的mal表达或活性水平的物质。
42.此外，本发明提供了筛选干细胞样记忆t细胞分化诱导剂的方法，所述方法包括：(a)从分离自人的样品中分出cd3

t细胞；(b)通过用il
‑
17、il
‑
15和测试物质处理并随后培养，将cd3

t细胞分化为干细胞样记忆t细胞；(c)测量干细胞样记忆t细胞中的mal的表达水平；以及(d)与未用测试物质处理的对照相比，在测试物质中选择具有增高的mal的表达或活性水平的物质。
43.mal的表达或活性水平可通过选自于由如下所组成的组中的任一种方法测量：逆转录
‑
聚合酶链反应(rt
‑
pcr)、实时pcr、微阵列、elisa、免疫沉淀、免疫组织化学、蛋白质免疫印迹和facs，但本发明不限于此。
44.实施例
45.下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。提供这些实施例仅用于说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不限于这些实施例，这对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
46.实施例1：从血液中分离cd3 t细胞并诱导记忆t细胞分化
[0047]1‑
1.从血液中分离pbmc
[0048]
将4名正常人的血液收集在采血管中，将采集的血液转移至50ml试管中，并加入等量的磷酸盐缓冲盐水(pbs，2％血清)以稀释血液。然后，将等量的lymphoprep溶液(货号07851，stemcell)从50ml试管的底部缓慢注入血液中，使其不与经稀释的血液混合。随后，在4℃和800g下离心20分钟后，将血沉棕黄层转移至新管中，加入pbs(2％血清)，400g下离心后去除上清。洗涤过程重复3次，回收外周血单核细胞(pbmc)以计算细胞数，然后在用于实验前冷冻保存。
[0049]1‑
2.从pbmc中分离cd3

t细胞
[0050]
使用实施例1
‑
1中分离的pbmc来分离表达cd3的t细胞。简而言之，通过使用pan t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec,130
‑
096
‑
535)来移除表达cd14、cd15、cd16、cd19、cd34、cd36、cd56、cd123和cd235a的细胞的方法，获得表达cd3的t细胞。
[0051]
如图1所示，分离后，通过facs分析确认了表达cd3的t细胞，并且作为测定分离效率的结果，检测到表达cd3的t细胞为91.3％和85.4％。
[0052]1‑
3.从cd3 t细胞诱导记忆t细胞分化
[0053]
将经分离的表达cd3的t细胞接种在抗cd3抗体包被的板中，并使用含有1μg/ml抗
cd28抗体的培养液孵育72小时。在用于诱导分化的培养基中含有10μg/ml il
‑
7和10μg/ml il
‑
15，且对照不含这些白细胞介素。培养72小时后，通过facs分析证实了tscm细胞的增加。
[0054]
如图2所示，通过facs分析，将表达cd8的t细胞分选为幼稚样t细胞(tn样t细胞)、中枢记忆t(tcm)细胞、效应t细胞(teff)和效应记忆t(tem)细胞，并将tn样t细胞分选为干细胞样记忆t细胞(tscm)和幼稚t细胞(tn)并进行分析。证实了大多数tn样t细胞为tscm细胞，表明从cd3

t细胞向记忆t细胞的分化被很好地诱导。
[0055]
实施例2：按记忆t细胞的类型分选细胞并提取rna
[0056]2‑
1.按记忆t细胞的类型分选细胞
[0057]
最后，如实施例1
‑
3所述，使用facs分选仪分选cd8 t细胞、tscm(cd3

cd8

ccr7

cd45ro
‑
cd95

)细胞、tcm细胞和tem细胞，然后用于实验中。
[0058]2‑
2.rna提取
[0059]
为了提取每种类型的记忆t细胞的总rna，使用了trizol(invitrogen,carlsbad,usa)。将每种细胞置于1.5ml管中，加入1.0ml trizol并混合，加入0.2ml氯仿，然后室温反应2分钟。随后，在以13,000rpm离心15分钟后，将0.5ml上清液转移到新管中。然后加入0.5ml异丙醇并混合，并在室温下反应10分钟，随后在13,000rpm下离心10分钟。向通过离心得到的沉淀加入75％酒精，并在7500rpm下离心5分钟，将得到的沉淀在空气中干燥，并根据沉淀的量加入20
‑
50μl的不含rnase的水以溶解沉淀。之后，在260nm波长下对rna进行定量。
[0060]
实施例3：根据记忆t细胞的类型筛选特异性表达的基因
[0061]3‑
1.mrna测序(转录组)
[0062]
将提取的rna通过片段化进行破裂，并使用truseq stranded mrna lt sample prep kit通过逆转录合成cdna，然后将接头连接到其两端。进行pcr扩增以得到能够测序的量，从而通过大小选择过程获得200至400bp大小的插入物。使用hiseq 2500系统进行测序。
[0063]3‑
2.根据记忆t细胞的类型筛选特异性表达的基因
[0064]
对通过测序获得的原始读段进行质量控制分析。产生了基本统计数据，例如总读段的质量、总碱基、总读段、gc(％)。考虑到剪接，使用hisat2程序将经过预处理的读段映射到参考基因组，然后生成比对的读段。使用stringtie程序进行转录组装，并使用通过各样本的转录量化获得的表达水平计算每百万个映射读段的转录本的每千碱基片段(frkm)值，其为考虑读段计数、转录本长度和覆盖深度的归一化值。结果如图3所示，通过比较每个基因的fpkm值来提取表达谱。
[0065]
实施例4：验证tscm细胞中特异性表达的mal表达
[0066]
使用实施例1中收集的pbmc分析tscm细胞中特异性增高的mal基因的表达。从用于转录组分析的样品1、3和4中的pbmc中分离cd3

t细胞，并使用il
‑
7/il
‑
15诱导分化。之后，为了根据t细胞的类型分析mal基因的表达，进行了定量pcr。将mal基因的表达归一化为每种细胞类型中表达的gapdh的表达并进行分析。
[0067]
使用omniscript rt试剂盒(qiagen,205111)将2μg提取的rna合成为cdna。向每管加入2μg rna、0.5mm dntp、1μm寡聚dt、10单位rnase抑制剂、4单位rtase和rt缓冲液，以使终体积为20μl，并在37℃下反应60分钟，从而合成cdna。使用mal特异性引物对合成的cdna模板进行实时pcr，并且实验中使用的引物的具体信息在下表1中示出。
[0068]
[表1]
[0069][0070]
结果如图4所示，在样品1至样品3中均证实，与其它t细胞类型相比，t细胞类型之中的tscm细胞中的mal基因的表达显著升高。
[0071]
实施例5：验证mal诱导tscm细胞分化的功能
[0072]5‑
1.诱导mal表达抑制
[0073]
根据invitrogen提供的方法，在含有opti
‑
mem溶液的管中，将pbmc与50nm on
‑
targetplus human mal sirna(l
‑
011723
‑
00
‑
0010，dharmacon,inc.)或50nm on
‑
targetplus non
‑
targeting pool(阴性对照sirna，siscramble，作为对照，不会影响细胞中的任何基因，d
‑
001810
‑
10
‑
20，dharmacon,inc.)和1.0μl lipofectamine 3000混合，并在室温下反应15分钟以诱导囊泡形成。
[0074]
此处使用的mal sirna的具体信息如下。
[0075]
5'
‑
ucauaaagccgcaguagaa
‑
3'(seq id no:5)
[0076]
5'
‑
gcgguguucucuuuaauca
‑
3'(seq id no:6)
[0077]
5'
‑
cgacuugcucuucaucuuu
‑
3'(seq id no:7)
[0078]
5'
‑
cuacauagccacucugcuc
‑
3'(seq id no:8)
[0079]
反应结束后，将含有囊泡的opti
‑
mem与培养液混合并进行处理，并在18小时后用新鲜培养基替换该培养基。48小时后，从细胞中提取rna，并通过实施例4所述的方法确认mal表达。
[0080]
结果参见图5，与未处理的样品和用siscramble处理的样品相比，证实了在用mal的sirna处理的样品中，mal表达降低了多于一半。
[0081]5‑
2.根据mal表达的抑制的记忆t细胞类型分析
[0082]
通过实施例5
‑
1中描述的方法对sirna进行处理，并通过实施例1
‑
3中描述的方法诱导cd3

t细胞向记忆t细胞的分化。诱导分化72小时后，通过facs分析来对干细胞样记忆t(tscm)细胞和幼稚t细胞(tn)的分布进行分析。
[0083]
结果如图5所示，证实了从tn细胞分化的tscm细胞的数量随着mal表达的降低而减少。
[0084]
该结果也可通过相对未能分化为tscm细胞并维持tn细胞状态的细胞的增加来证实。
[0085]
实验实施例6：验证mal调节体内淋巴细胞存活的功能
[0086]6‑
1.用于诱导mal过表达的克隆和表达的确认
[0087]
为了产生表达mal基因的逆转录病毒，将pbabe逆转录病毒载体用作骨架载体。如图6的a所示，将通过pcr扩增的mal基因插入到pbabe载体的ecori限制位点中。使用克隆的质粒(pbabe
‑
mal、pmal)在plat
‑
a细胞中产生逆转录病毒，并通过facs分析证实由此获得的mal表达诱导效率(如图6的b所示)。此处，将使用pbabe载体制备的逆转录病毒(pbabe)用作对照。此外，将未用任何病毒处理的组用作阴性对照(n/c)。
[0088]6‑
2.使用shrna诱导mal表达的抑制
[0089]
使用人mal tripz慢病毒shrna(rhs4696
‑
200762536,dharmacon,inc.)并且使用
非沉默tripz慢病毒shrna对照(rhs4743,dharmacon,inc.)载体作为对照，在hek293细胞中产生慢病毒。ptripz载体通过四环素处理诱导shrna表达，并用产生的病毒转染cd3 细胞，然后将培养基更换为含四环素的培养基。mal表达抑制效率通过facs分析加以证实(如图6的b所示)。
[0090]6‑
3.体内淋巴细胞存活的验证
[0091]
使用了6周龄的无淋巴细胞nod
‑
scid小鼠。使用实施例6
‑
1和实施例6
‑
2的mal表达调节系统，对通过如实施例1
‑
1和实施例1
‑
2中描述的方法获得的表达cd3的t细胞进行诱导，以具有mal过表达或抑制。每只小鼠注射l
×
106个细胞后三天，从股静脉中回收血液。从回收的血液中去除红细胞，并使用apc/cy7抗人cd3抗体(货号300318，biolegend，inc.)进行染色，并使之接受facs分析(如图6的c所示)。将未治疗的人的表达cd3的t细胞用作阴性对照(n/c)。
[0092]
结果如图6的c所示，证实体内注射的细胞的存活随着mal表达的增高而增加，而表达的减弱降低了细胞的体内存活。
[0093]
从以上结果证实了，mal在淋巴细胞的体内存活中起作用。
[0094]
如上所述，由于已经详细描述了说明书的具体部分，虽然本领域技术人员清楚该具体技术仅仅是优选的实施方式，但说明书的范围不限于此。因此，本技术文件的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。
[0095]
本发明的范围由所附权利要求书代表，并且凡因权利要求书的含义和范围及其等同概念而衍生的变化或修改均应被诠释为包含在本发明的范围内。