ENPP1抑制剂和调节免疫反应的方法与流程

enpp1抑制剂和调节免疫反应的方法
1.相关申请
2.本技术要求2019年2月1日提交的美国临时专利申请第62/800,283号和2019年3月6日提交的美国临时专利申请第62/814,745号的优先权和权益，其各自通过引用整体并入本文中。
3.政府权益
4.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的合同ca190896和ca228044及美国国防部(department of defense)授予的合同w81xwh
‑
18
‑1‑
0041在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。


背景技术：

5.环单磷酸鸟苷
‑
单磷酸腺苷(cgamp)激活干扰素基因刺激因子(sting)途径，这是一种重要的抗癌先天免疫途径。cgas
‑
cgamp
‑
sting途径在细胞质dna存在下被激活，可能是由于微生物感染或包括癌症和自身免疫性疾病在内的病理生理条件。环状gmp
‑
amp合酶(cgas)属于核苷酸基转移酶家族，并且是一种通用的dna传感器，其在与细胞质dsdna结合后被激活以产生信号传导分子(2
’‑5’
,3
’‑5’
)环状gmp
‑
amp(或2
′
,3
′‑
cgamp或环单磷酸鸟苷
‑
单磷酸腺苷，cgamp)。2
′
,3
′‑
cgamp在微生物感染期间充当第二信使，结合并激活sting，从而导致产生i型干扰素(ifn)和其他触发免疫响应的共刺激分子。除了在传染病中的作用外，sting途径已成为癌症免疫疗法和自身免疫性疾病的靶标。
6.外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(enpp1)是可降解cgamp的主要cgamp水解酶。enpp1是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(enpp)家族的成员，并且是包含两个相同的二硫键合的亚基的ii型跨膜糖蛋白。enpp1具有广泛的特异性以切割包括核苷酸和核苷酸糖的磷酸二酯键以及核苷酸和核苷酸糖的焦磷酸酯键在内的多种底物。enpp1可以起到将核苷5'三磷酸酯水解成其相应的单磷酸酯的作用，并且还可以水解多磷酸二腺苷。


技术实现要素：

7.提供了用于抑制enpp1的化合物、组合物和方法。主题方法的方面包括使样品与enpp1抑制剂化合物接触以抑制enpp1的cgamp水解活性。在一些情况下，enpp1抑制剂化合物是细胞不可渗透的。enpp1抑制剂化合物可以在胞外起到阻断cgamp的降解的作用。还提供了用于治疗癌症的药物组合物和方法。该方法的方面包括向受试者施用治疗有效量的enpp1抑制剂以治疗受试者的癌症。在某些情况下，癌症是实体瘤癌症。还提供了向受试者施用放射疗法联合向受试者给药enpp1抑制剂的方法。该放射疗法可以在主题方法中以有效降低对受试者造成的放射损伤，但是仍然能激发免疫响应的剂量和/或频率来施用。
8.在阅读下面更全面地描述的组合物和使用方法的细节之后，本公开的这些和其他优点和特征对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
9.当结合附图阅读时，本发明可从以下详述最好地理解。专利或申请文件含有至少一个彩色图。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征未按比例绘制。相反，为了清楚起见，任意扩大或缩小了各个特征的尺寸。附图中包括以下图。应当理解，下面描述的图仅用于说明目的。所述图无意以任何方式限制本教导的范围。
10.图1,小图a至j,显示了证明cgamp作为可溶性因子从293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞输出的实验结果。
11.图2,小图a至c,显示了证明enpp1可以调节细胞外cgamp的实验结果。
12.图3,小图a至f,图解说明了示例性enpp1抑制剂(化合物1)在各种细胞测定中的结构和活性。
13.图4,小图a至e,显示了表明癌细胞在培养物中表达cgas并持续输出cgamp的实验结果。
14.图5,小图a至i,显示了表明细胞外cgamp的隔离以肿瘤cgas和宿主sting依赖性方式减少了肿瘤相关的树突细胞的实验结果。
15.图6,小图a至d,显示了表明enpp1
‑
/
‑
肿瘤募集先天免疫浸润，攻击性较低，并且更容易受到ir和抗
‑
ctla
‑
4(细胞毒性t淋巴细胞相关的抗原4)疗法的影响的实验结果。
16.图7,小图a至c,显示了表明enpp1抑制与ir治疗和抗
‑
ctla
‑
4协同发挥抗肿瘤作用的实验结果。
17.图8,小图a至d,图解说明了使用lc
‑
ms/ms方法和293t cgas enpp1
低
和293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞系来评估enpp1水解活性和cgamp水平。
18.图9,小图a至b,显示了解释说明cd14

原代人外周血单核细胞(pbmc)对细胞外cgamp有反应的实验示意图和结果。
19.图10,小图a至b,显示了比较化合物1和化合物qs1的enpp1抑制活性的实验结果，并显示了qs1在细胞测定中的活性。
20.图11,小图a至f,显示了表明示例性的enpp1抑制剂化合物1(stf
‑
1084)是细胞不可渗透的，对enpp1具有特异性，并且无毒的实验结果。
21.图12,小图a至e,显示了表明癌细胞在培养物中不断输出cgamp的实验结果。
22.图13,小图a至d,显示了表明细胞外cgamp的隔离以肿瘤cgas和宿主sting依赖性方式减少了肿瘤相关的树突细胞的实验结果。
23.图14,小图a至f,显示了表明已确定的enpp1
‑
/
‑
肿瘤导致肿瘤相关的树突细胞增加，攻击性较低，并且更容易受到ir和抗
‑
ctla
‑
4疗法的影响的实验结果。
24.图15显示了证明enpp1抑制(例如，使用化合物1；stf
‑
1084)与ir治疗协同增加肿瘤相关的树突细胞的数据图。
25.图16显示了图解说明从合成细胞到靶细胞的cgamp传递的不同模式的示意图。
26.图17显示了图解说明cgamp是体内癌细胞分泌的癌症危险信号的示意图。
27.图18a至图18c显示了图解说明示例性enpp1抑制剂(化合物1)可以增加细胞系统中存在的细胞外cgamp量的数据。
28.图19a至图19b显示了图解说明示例性enpp1抑制剂(化合物1)可以增加cgamp刺激的干扰素转录的实验示意图和结果。
29.图20a至图20b显示了图解说明示例性enpp1抑制剂(化合物1)可以增加小鼠肿瘤模型中肿瘤相关的树突细胞数量的数据。
30.图21a至图21c显示了图解说明enpp1抑制与ir治疗和抗
‑
ctla
‑
4协同发挥抗肿瘤作用的实验结果。
31.图22显示了图解说明enpp1是调节免疫递质cgamp的先天免疫检查点的示意图。
32.定义
33.在进一步描述本公开的实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。
34.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。
35.必须注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/一个”、“和/以及”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及的"化合物"不仅包括单一化合物，还包括两种或更多种化合物的组合，提及的"取代基"包括单一取代基以及两个或多个取代基，以此类推。
36.在描述和要求保护本发明时，某些术语将根据下面阐述的定义使用。应当理解，本文提供的定义并非旨在相互排斥。因此，一些化学部分可落入多于一个术语的定义内。
37.短语“例如(for example)”、“比如(for instance)”、“诸如”或“包括”旨在引入进一步阐明更一般的主题的实例。提供这些实例仅是为了帮助理解本公开，并不意味着以任何方式进行限制。
38.本文所讨论的公布仅出于其在本技术的提交日期之前的公开而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明由于在先发明而无权早于此类公布。此外，提供的公布的日期可能与实际公布日期有所不同，实际公布日期可能需要独立确认。
39.术语"活性剂"、“拮抗剂"、"抑制剂"、"药物"和"药理活性剂"在本文中可互换地用来指代当被施用于生物体(人或动物)时通过局部和/或全身作用诱导所需的药理和/或生理作用的化学材料或化合物。
40.术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所需的药理和/或生理作用，诸如减轻肿瘤负荷。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的；并且/或者就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”意在涵盖哺乳动物，特别是人类中的任何疾病治疗，并且包括：(a)预防疾病或疾病的症状在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生(例如，包括可能与原发性疾病有关或由原发性疾病引起的疾病(如在可能导致慢性hcv感染的肝纤维化中的情况)；(b)抑制疾病，即遏制其发展；以及(c)缓解疾病，即使疾病消退(如，肿瘤负荷减轻)。
41.术语“药学上可接受的盐”意指对于诸如哺乳动物的患者施用是可接受的盐(对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的具有抗衡离子的盐)。此类盐可以源自药学上可接受的无机或有机碱并且可以源自药学上可接受的无机或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自多种本领域众所周知的有机和无机
抗衡离子，并且包括，仅举例来说，钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
42.术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指动物，包括但不限于人类和非人类灵长类动物，包括猿猴和人类；啮齿动物，包括大鼠和小鼠；牛科动物；马科动物；绵羊类动物；猫科动物；犬科动物；等。"哺乳动物"意指任何哺乳动物物种的一个或多个成员，并且例如包括犬科动物；猫科动物；马科动物；牛科动物；绵羊类动物；啮齿类等，以及灵长类动物，如非人灵长类动物和人类。非人动物模型，如哺乳动物，如非人灵长类动物、鼠科动物、兔类动物等可以用于实验研究。
43.术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，并且包括定量和定性确定。
44.在本文中可互换使用的术语"多肽"和"蛋白质"是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，含有具有或不具有n末端甲硫氨酸残基的异源和天然前导序列的融合物；免疫标记的蛋白；具有可检测的融合伴侣的融合蛋白，如包含荧光蛋白、β
‑
半乳糖苷酶、荧光素酶等作为融合伴侣的融合蛋白；等。
45.术语"核酸分子"和“多核苷酸"可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离的dna、控制区、任何序列的经分离的rna、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。
46."治疗有效量"或"有效量"意指当被施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病、疾患或病症时足以对所述疾病、疾患或病症实现此类治疗的化合物的量。"治疗有效量"将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
47.如本文所用的术语“单位剂型”是指适于作为人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有被计算为与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合足以产生预期效果的量的预定量的化合物(例如，如本文所述的氨基嘧啶化合物)。单位剂型的规格取决于所使用的特定化合物和待实现的效果，以及宿主中与每种化合物相关的药效动力学。
48.术语"药学上可接受的赋形剂"、"药学上可接受的稀释剂"、"药学上可接受的载体"和"药学上可接受的佐剂"是指可用于制备通常安全、无毒且无生物学或其他不良影响的药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体或佐剂，并且包括对于兽医用途以及人类制药用途是可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。如说明书和权利要求书中使用的"药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂"包括一种和多于一种此类赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。
49.术语"药物组合物"意在涵盖适合于施用给受试者诸如哺乳动物，尤其人的组合物。通常，“药物组合物”是无菌的，并且优选地不含能够在受试者内引起不期望的响应的污染物(如，药物组合物中的一种或多种化合物是药物级的)。可以设计药物组合物以经由许多不同的施用途径(包括经口、经颊、经直肠、肠胃外、腹膜内、真皮内、气管内、肌内、皮下
等)施用给有需要的受试者或患者。
50.短语"具有式"或"具有结构"不意在限制并且以与术语"包含"通常被使用的方式相同的方式使用。术语"独立地选自"在本文中用于指示所列举的要素，例如，r基团等可以相同或不同。
51.术语“可能”、“任选的”、“任选地”或“可以任选地”意指随后描述的情形可能发生或可能不发生，因此该描述包括所述情形发生的例子和所述情形不发生的例子。例如，短语“任选地被取代/任选地被
……
取代”意指在给定原子上可以存在或可以不存在非氢取代基，并且因此，该描述包括其中存在非氢取代基的结构和其中不存在非氢取代基的结构。
[0052]“酰基”是指基团h
‑
c(o)
‑
、烷基
‑
c(o)
‑
、取代的烷基
‑
c(o)
‑
、烯基
‑
c(o)
‑
、取代的烯基
‑
c(o)
‑
、炔基
‑
c(o)
‑
、取代的炔基
‑
c(o)
‑
、环烷基
‑
c(o)
‑
、取代的环烷基
‑
c(o)
‑
、环烯基
‑
c(o)
‑
、取代的环烯基
‑
c(o)
‑
、芳基
‑
c(o)
‑
、取代的芳基
‑
c(o)
‑
、杂芳基
‑
c(o)
‑
、取代的杂芳基
‑
c(o)
‑
、杂环基
‑
c(o)
‑
和取代的杂环基
‑
c(o)
‑
，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文所定义。例如，酰基包括“乙酰基”基团ch3c(o)
‑
。
[0053]
术语"烷基"通常是指支链或无支链的饱和烃基基团(即，单基烃基基团)，尽管不一定含有1至约24个碳原子，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基等，以及环烷基基团诸如环戊基、环己基等。通常，尽管不是必须的，但是本文中的烷基基团可含有1至约18个碳原子，并且此类基团可含有1至约12个碳原子。术语"低级烷基"意指1至6个碳原子的烷基基团。"取代的烷基"是指用一种或多种取代基基团取代的烷基，并且这包括其中来自烷基取代基中同一碳原子的两个氢原子被替代的例子，诸如在羰基基团中的情况(即，取代的烷基基团可包括
‑
c(＝o)
‑
部分)。术语"含杂原子的烷基"和"杂烷基"是指其中至少一个碳原子被杂原子替代的烷基取代基，如下文进一步详细描述。如果没有另外说明，则术语"烷基"和"低级烷基"分别包括直链、支链、环状、未取代、取代的和/或含杂原子的烷基或低级烷基。
[0054]
术语“取代的烷基”意在包括其中烷基链中的一个或多个碳原子被杂原子诸如
‑
o
‑
、
‑
n
‑
、
‑
s
‑
、
‑
s(o)n
‑
(其中n是0至2)、
‑
nr
‑
(其中r是氢或烷基)任选地替代的如本文所定义的烷基基团，其具有1至5个选自以下的取代基：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、
‑
so
‑
烷基、
‑
so
‑
芳基、
‑
so
‑
杂芳基、
‑
so2
‑
烷基、
‑
so2
‑
芳基、
‑
so2
‑
杂芳基和
‑
nrarb，其中r’和r”可以是相同的或不同的，并且选自氢、任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环。
[0055]
术语"烯基"是指含有至少一个双键的2至约24个碳原子的直链、支链或环状烃基团，诸如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四碳烯基、十六碳烯基、二十碳烯基、二十四碳烯基等。通常，尽管也不是必须的，但本文中的烯基基团可以含有2至约18个碳原子，并且例如可以含有2至12个碳原子。术语"低级烯基"意指2至6个碳原子的烯基基团。术语"取代的烯基"是指被一个或多个取代基基团取代的烯基，并且术
语"含杂原子的烯基"和"杂烯基"是指其中至少一个碳原子被杂原子替代的烯基。如果没有另外说明，术语"烯基"和"低级烯基"分别包括直链、支链、环状、未取代、取代的和/或含杂原子的烯基和低级烯基。
[0056]
术语"炔基"是指含有至少一个三键的2至24个碳原子的直链或支链烃基团，诸如乙炔基、正丙炔基等。通常，尽管也不是必须的，但本文的炔基基团可含有2至约18个碳原子，并且此类基团还可含有2至12个碳原子。术语"低级炔基"意指2至6个碳原子的炔基基团。术语"取代的炔基"是指被一个或多个取代基基团取代的炔基，并且术语"含杂原子的炔基"和"杂炔基"是指其中至少一个碳原子被杂原子替代的炔基。如果没有另外说明，术语"炔基"和"低级炔基"分别包括直链、支链、未取代、取代的和/或含杂原子的炔基和低级炔基。
[0057]
术语"烷氧基"是指通过单个末端醚连接键结合的烷基基团；即，"烷氧基"基团可以被表示为
‑
o
‑
烷基，其中烷基如上文所定义。"低级烷氧基"基团是指含有1至6个碳原子的烷氧基基团，并且包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等。在本文中表示为"c1
‑
c6烷氧基"或"低级烷氧基"的取代基可例如，可含有1至3个碳原子，并且作为进一步的实例，此类取代基可含有1或2个碳原子(即，甲氧基和乙氧基)。名称
“‑
ome”和“meo
‑”
指的是甲氧基。
[0058]
术语“取代的烷氧基”是指基团，取代的烷基
‑
o
‑
、取代的烯基
‑
o
‑
、取代的环烷基
‑
o
‑
、取代的环烯基
‑
o
‑
和取代的炔基
‑
o
‑
，其中取代的烷基、取代的烯基、取代的环烷基、取代的环烯基和取代的炔基如本文所定义。
[0059]
术语"芳基"，除非另有说明，否则是指芳族取代基，其通常，但不是必须地含有5至30个碳原子并且含有单个芳族环或稠合在一起、直接连接或间接连接(使得不同的芳族环结合至共同的基团，诸如亚甲基或亚乙基部分)的多个芳族环。芳基基团可以例如含有5至20个碳原子，并且作为进一步的实例，芳基基团可以含有5至12个碳原子。例如，芳基基团可含有一个芳族环或两个或更多个稠合或连接的芳族环(即联芳基、芳基
‑
取代的芳基等)。实例包括苯基、萘基、联苯基、二苯醚、二苯胺、二苯甲酮等。"取代的芳基"是指被一个或多个取代基基团取代的芳基部分，并且术语"含杂原子的芳基"和"杂芳基"是指这样的芳基取代基，其中至少一个碳原子被杂原子替代，如将在下文中进一步详细描述。芳基旨在包括稳定的环状、杂环的、多环和多杂环的不饱和c3‑
c
14
部分(例如但不限于苯基、联苯基、萘基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、嘧啶基和噁唑基)，其还可被1
‑
5个选自以下的成员取代：羟基、c1‑
c8烷氧基、c1‑
c8支链或直链烷基、酰氧基、氨基甲酰基、氨基、n
‑
酰基氨基、硝基、卤素、三氟甲基、氰基和羧基(参见如katritzky,handbook of heterocyclic chemistry)。如果没有另外说明，术语"芳基"包括未取代的、取代的和/或含杂原子的芳族取代基。
[0060]
术语"芳烷基"是指具有芳基取代基的烷基基团，并且术语"烷芳基"是指具有烷基取代基的芳基基团，其中"烷基"和"芳基"如上所定义。通常，本文的芳烷基和烷芳基基团含有6至30个碳原子。芳烷基和烷芳基基团可例如含有6至20个碳原子，并且作为进一步的实例，此类基团可含有6至12个碳原子。
[0061]
术语"亚烷基"是指二基烷基基团。除非另有说明，否则此类基团包括含有1至24个碳原子的饱和烃链，其可以被取代或未被取代、可以含有一个或多个脂环族基团并且可以含有杂原子。"低级亚烷基"是指含有1至6个碳原子的亚烷基连接键。实例包括亚甲基(
‑‑
ch2‑‑
)、亚乙基(
‑‑
ch2ch2‑‑
)、亚丙基(
‑‑
ch2ch2ch2‑‑
)、2
‑
甲基亚丙基(
‑‑
ch2‑‑
ch(ch3)
‑‑
ch2‑‑
)、亚己基(
‑‑
(ch2)6‑‑
)等。
[0062]
类似地，术语"亚烯基"、"亚炔基"、"亚芳基"、"亚芳烷基"和"亚烷芳基"分别是指二
‑
基烯基、炔基、芳基、芳烷基和烷芳基基团。
[0063]
术语"氨基"是指基团
‑
nrr’，其中r和r’独立地是氢或非氢取代基，其中非氢取代基包括例如烷基、芳基、烯基、芳烷基以及其取代的和/或含杂原子的变体。
[0064]
术语"卤代"和"卤素"以常规含义使用以指代氯、溴、氟或碘取代基。
[0065]“羧基”、“羧”或“羧酸基(carboxylate)”是指
–
co2h或其盐。
[0066]“环烷基”是指具有单个或多个环状环(包括稠环、桥环和螺环体系)的3至10个碳原子的环烷基基团。适合的环烷基基团的实例包括例如金刚烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等。此类环烷基基团包括，举例来说，单环结构，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等，或多环结构，诸如金刚烷基等。
[0067]
术语“取代的环烷基”是指具有1至5个取代基或1至3个取代基的环烷基基团，所述取代基选自烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、
‑
so
‑
烷基、
‑
so
‑
取代的烷基、
‑
so
‑
芳基、
‑
so
‑
杂芳基、
‑
so2‑
烷基、
‑
so2‑
取代的烷基、
‑
so2‑
芳基和
‑
so2‑
杂芳基。
[0068]
如在"含杂原子的烷基"(也称为"杂烷基"基团)或"含杂原子的芳基"(也称为"杂芳基"基团)中的术语"含杂原子的"是指其中一个或多个碳原子被除碳以外的原子如氮、氧、硫、磷或硅，通常为氮、氧或硫替代的分子、连接键或取代基。类似地，术语"杂烷基"是指含有杂原子的烷基取代基，术语"杂环烷基"是指含杂原子的环烷基取代基，术语"杂环的"或“杂环”是指含杂原子的环状取代基，术语"杂芳基"和"杂芳族的"分别是指含杂原子的"芳基"和"芳族"取代基等。杂烷基基团的实例包括烷氧基芳基、烷基硫基
‑
取代的烷基、n
‑
烷基化的氨基烷基等。杂芳基取代基的实例包括吡咯基、吡咯烷基、吡啶基、喹啉基、吲哚基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、1,2,4
‑
三唑基、四唑基等，并且含杂原子的脂环族基团的实例为吡咯烷子基、吗啉代、哌嗪子基、哌啶子基、四氢呋喃基等。
[0069]“杂芳基”是指环内具有1至15个碳原子，诸如1至10个碳原子和1至10个选自氧、氮和硫的杂原子的芳族基团。此类杂芳基基团可以在环体系中具有单环(诸如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或多个稠环(例如，如在诸如吲嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基的基团中的情况)，其中环体系中的至少一个环是芳族的，条件是连接点是通过芳族环的原子的。在某些实施方案中，杂芳基基团的一个或多个氮和/或硫环原子被任选地氧化以提供n
‑
氧化物(n
→
o)、亚磺酰基或磺酰基部分。该术语包括，举例来说，吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。除非另外受到针对杂芳基取代基的定义的限制，否则此类杂芳基基团可以任选地被1至5个取代基或1至3个取代基取代，所述取代基选自酰氧基、羟基、硫醇、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、取代的烷基、取代的烷氧基、取代的烯基、取代的炔基、取代的环烷基、取代的环烯基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、酰基氨基、烷芳基、芳基、芳氧基、叠氮基、羧基、羧基烷基、氰基、卤素、硝基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧
基、氨基酰氧基、氧基酰基氨基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、
‑
so
‑
烷基、
‑
so
‑
取代的烷基、
‑
so
‑
芳基、
‑
so
‑
杂芳基、
‑
so2‑
烷基、
‑
so2‑
取代的烷基、
‑
so2‑
芳基和
‑
so2‑
杂芳基，和三卤代甲基。
[0070]
术语“杂环”、“杂环的”和“杂环基”是指具有单个环或多个稠环(包括稠合的桥环体系和螺环体系)并且具有3至15个环原子(包括1
‑
4个杂原子)的饱和或不饱和基团。这些环杂原子选自氮、硫和氧，其中在稠环体系中，一个或多个环可以是环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点通过非芳族环。在某些实施方案中，杂环基团的一个或多个氮和/或硫原子任选地被氧化，以提供n
‑
氧化物、
‑
s(o)
‑
或
–
so2‑
部分。
[0071]
杂环和杂芳基的实例包括但不限于氮杂环丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4
‑
四氢异喹啉、4,5,6,7
‑
四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为噻吗啉基)、1,1
‑
二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。
[0072]
除非另外受到针对杂环取代基的定义的限制，否则此类杂环基团可任选地被1至5个或1至3个选自以下的取代基取代：烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、酰基、酰基氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨基酰基、氨基酰氧基、氧基氨基酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟基氨基、烷氧基氨基、硝基、
‑
so
‑
烷基、
‑
so
‑
取代的烷基、
‑
so
‑
芳基、
‑
so
‑
杂芳基、
‑
so2‑
烷基、
‑
so2‑
取代的烷基、
‑
so2‑
芳基、
‑
so2‑
杂芳基和稠合杂环。
[0073]
"烃基"是指含有1至约30个碳原子(包括1至约24个碳原子，进一步包括1至约18个碳原子并且进一步包括约1至12个碳原子)的单价烃基基团，包括直链、支链、环状、饱和和不饱和物质，诸如烷基基团、烯基基团、芳基基团等。烃基可以被一个或多个取代基基团取代。术语"含杂原子的烃基"是指其中至少一个碳原子被杂原子替代的烃基。除非另有说明，否则术语"烃基"应被解释为包括取代的和/或含杂原子的烃基部分。
[0074]
如在一些前述定义中所提及的，如在"取代的烃基"、"取代的烷基"、"取代的芳基"等中的"取代的"意指在烃基、烷基、芳基或其他部分中，至少一个与碳(或其他)原子结合的氢原子被一个或多个非氢取代基替代。此类取代基的实例包括但不限于官能团和烃基部分c1
‑
c24烷基(包括c1
‑
c18烷基，进一步包括c1
‑
c12烷基，并且进一步包括c1
‑
c6烷基)、c2
‑
c24烯基(包括c2
‑
c18烯基，进一步包括c2
‑
c12烯基，并且进一步包括c2
‑
c6烯基)、c2
‑
c24炔基(包括c2
‑
c18炔基，进一步包括c2
‑
c12炔基，并且进一步包括c2
‑
c6炔基)、c5
‑
c30芳基(包括c5
‑
c20芳基，并且进一步包括c5
‑
c12芳基)，和c6
‑
c30芳烷基(包括c6
‑
c20芳烷基，并且进一步包括c6
‑
c12芳烷基)。上述烃基部分可以进一步被一个或多个官能团或另外的烃基部分，诸如具体列举的那些取代。除非另有说明，否则本文所述的任何基团均应解释为除了包括未取代的基团之外，还包括取代的和/或含杂原子的部分。
[0075]“磺酰基”是指基团so2‑
烷基、so2‑
取代的烷基、so2‑
烯基、so2‑
取代的烯基、so2‑
环烷基、so2‑
取代的环烷基、so2‑
环烯基、so2‑
取代的环烯基、so2‑
芳基、so2‑
取代的芳基、so2‑
杂芳基、so2‑
取代的杂芳基、so2‑
杂环和so2‑
取代的杂环，其中烷基、取代的烷基、烯基、取代
的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、环烯基、取代的环烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环如本文所定义。磺酰基包括，举例来说，甲基
‑
so2‑
、苯基
‑
so2‑
和4
‑
甲基苯基
‑
so2‑
。
[0076]
术语“官能团”意指化学基团，诸如卤素、羟基、巯基、c1
‑
c24烷氧基、c2
‑
c24烯基氧基、c2
‑
c24炔基氧基、c5
‑
c20芳氧基、酰基(包括c2
‑
c24烷基羰基(
‑
co
‑
烷基)和c6
‑
c20芳基羰基(
‑
co
‑
芳基))、酰氧基(
‑
o
‑
酰基)、c2
‑
c24烷氧基羰基(
‑
(co)
‑
o
‑
烷基)、c6
‑
c20芳氧基羰基(
‑
(co)
‑
o
‑
芳基)、卤代羰基(
‑
co)
‑
x，其中x是卤素)、c2
‑
c24烷基碳酸根合基(carbonato)(
‑
o
‑
(co)
‑
o
‑
烷基)、c6
‑
c20芳基碳酸根合基(
‑
o
‑
(co)
‑
o
‑
芳基)、羧基(
‑
cooh)、羧酸根合基(carboxylate)(
‑
coo
‑
)、氨甲酰基(
‑
(co)
‑
nh2)、单取代的c1
‑
c24烷基氨甲酰基(
‑
(co)
‑
nh(c1
‑
c24烷基))、二取代的烷基氨甲酰基(
‑
(co)
‑
n(c1
‑
c24烷基)2)、单取代的芳基氨甲酰基(
‑
(co)
‑
nh
‑
芳基)、硫代氨甲酰基(
‑
(cs)
‑
nh2)、脲基(
‑
nh
‑
(co)
‑
nh2)、氰基(
‑
c≡n)、异氰基(
‑
n ≡c
‑
)、氰氧基(
‑
o
‑
c≡n)、异氰氧基(
‑
o
‑
n ≡c
‑
)、异硫代氰氧基(
‑
s
‑
c≡n)、叠氮基(
‑
n＝n ＝n
‑
)、甲酰基(
‑
(co)
‑
h)、硫代甲酰基(
‑
(cs)
‑
h)、氨基(
‑
nh2)、单
‑
和二
‑
(c1
‑
c24烷基)取代的氨基、单
‑
和二
‑
(c5
‑
c20芳基)取代的氨基、c2
‑
c24烷基酰氨基(
‑
nh
‑
(co)
‑
烷基)、c5
‑
c20芳基酰氨基(
‑
nh
‑
(co)
‑
芳基)、亚氨基(
‑
cr＝nh，其中r＝氢、c1
‑
c24烷基、c5
‑
c20芳基、c6
‑
c20烷芳基、c6
‑
c20芳烷基等)、烷基亚氨基(
‑
cr＝n(烷基)，其中r＝氢、烷基、芳基、烷芳基等)、芳基亚氨基(
‑
cr＝n(芳基)，其中r＝氢、烷基、芳基、烷芳基等)、硝基(
‑
no2)、亚硝基(
‑
no)、磺基(
‑
so2‑
oh)、磺酸根合基(
‑
so2‑
o
‑
)、c1
‑
c24烷基硫基(
‑
s
‑
烷基；也称为"烷硫基")、芳基硫基(
‑
s
‑
芳基；也称为"芳硫基")、c1
‑
c24烷基亚磺酰基(
‑
(so)
‑
烷基)、c5
‑
c20芳基亚磺酰基(
‑
(so)
‑
芳基)、c1
‑
c24烷基磺酰基(
‑
so2‑
烷基)、c5
‑
c20芳基磺酰基(
‑
so2‑
芳基)、膦酰基(
‑
p(o)(oh)2)、膦酸根合基(
‑
p(o)(o
‑
)2)、亚膦酸根合基(
‑
p(o)(o
‑
))、磷酸基(
‑
po2)和膦基(
‑
ph2)、单
‑
和二
‑
(c1
‑
c24烷基)取代的膦基、单
‑
和二
‑
(c5
‑
c20芳基)取代的膦。此外，如果特定基团允许，前述的官能团可以进一步地用一个或多个另外的官能团或者用一个或多个烃基部分诸如上面具体列举的那些取代。
[0077]
如在"连接基团"、"连接基部分"等中的"连接"或"连接基"意指经由共价键连接两个基团的连接部分。该连接基可以是直链、支链、环状或单个原子。此类连接基团的实例包括烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基、亚烷芳基、亚芳烷基，和含有包括但不限于以下的官能团的连接部分：酰氨基(
‑
nh
‑
co
‑
)、亚脲基(
‑
nh
‑
co
‑
nh
‑
)、酰亚胺(
‑
co
‑
nh
‑
co
‑
)、桥氧基(
‑
o
‑
)、桥硫基(
‑
s
‑
)、桥二氧基(
‑
o
‑
o
‑
)、羰基二氧基(
‑
o
‑
co
‑
o
‑
)、烷基二氧基(
‑
o
‑
(ch2)n
‑
o
‑
)、桥氧基亚氨基(
‑
o
‑
nh
‑
)、桥亚氨基(
‑
nh
‑
)、羰基(
‑
co
‑
)等。在某些情况下，连接基主链的一个、两个、三个、四个或五个或更多个碳原子可以任选地被硫、氮或氧杂原子取代。主链原子之间的键可以是饱和或不饱和的，通常在连接基主链中存在不超过一个、两个或三个不饱和键。连接基可以包含一个或多个取代基，例如具有烷基、芳基或烯基基团。连接基可以包括但不限于一个或多个聚(乙二醇)单元(如
‑
(ch2‑
ch2‑
o)
‑
)；醚；硫醚；胺；烷基(如(c1‑
c
12
)烷基)，其可以是直链或支链的，如甲基、乙基、正丙基、1
‑
甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1
‑
二甲基乙基(叔丁基)等。连接基主链可以包括环状基团，例如芳基、杂环或环烷基基团，其中环状基团的2个或更多个原子，如2、3或4个原子被包括在主链中。连接基可以是可断裂的或不可断裂的。可以使用连接基与被连接基团的任何方便的取向和/或连接。
[0078]
当术语“取代的”出现在可能的取代的基团的列表之前时，意指此术语适用于此基
团的每个成员。例如，短语"取代的烷基和芳基"应解释为"取代的烷基和取代的芳基"。
[0079]
除了本文的公开内容外，术语“取代的”在用于修饰指定的基团或基时，还可以意指该指定基团或基的一个或多个氢原子彼此独立地各自被相同或不同的如下所定义的取代基替代。
[0080]
除了针对本文各个术语公开的基团之外，用于取代指定基团或基中的饱和碳原子上的一个或多个氢(单个碳上的任何两个氢可以被＝o、＝nr
70
、＝n
‑
or
70
、＝n2或＝s替代)的取代基基团除非另有指定，否则是
‑
r
60
、卤素、＝o、
‑
or
70
、
‑
sr
70
、
‑
nr
80
r
80
、三卤代甲基、
‑
cn、
‑
ocn、
‑
scn、
‑
no、
‑
no2、＝n2、
‑
n3、
‑
so2r
70
、
‑
so2o
–
m

、
‑
so2or
70
、
‑
oso2r
70
、
‑
oso2o
–
m

、
‑
oso2or
70
、
‑
p(o)(o
–
)2(m

)2、
‑
p(o)(or
70
)o
–
m

、
‑
p(o)(or
70
)2、
‑
c(o)r
70
、
‑
c(s)r
70
、
‑
c(nr
70
)r
70
、
‑
c(o)o
–
m

、
‑
c(o)or
70
、
‑
c(s)or
70
、
‑
c(o)nr
80
r
80
、
‑
c(nr
70
)nr
80
r
80
、
‑
oc(o)r
70
、
‑
oc(s)r
70
、
‑
oc(o)o
‑
m

、
‑
oc(o)or
70
、
‑
oc(s)or
70
、
‑
nr
70
c(o)r
70
、
‑
n r
70
c(s)r
70
、
‑
nr
70
co2–
m

、
‑
nr
70
co2r
70
、
‑
nr
70
c(s)or
70
、
‑
nr
70
c(o)nr
80
r
80
、
‑
nr
70
c(nr
70
)r
70
和
‑
nr
70
c(nr
70
)nr
80
r
80
，其中r
60
选自：任选取代的烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂芳基和杂芳烷基，每个r
70
独立地是氢或r
60
；每个r
80
独立地是r
70
或可替地，两个r
80’连同与它们所键合的氮原子一起形成可任选地包含1至4个相同或不同另外的选自o、n和s的杂原子的5
‑
、6
‑
或7
‑
元杂环烷基，其中的n可具有
‑
h或c1‑
c3烷基取代；并且每个m

是具有净单个正电荷的抗衡离子。每个m

可独立地为例如碱金属离子，诸如k

、na

、li

；铵离子，诸如

n(r
60
)4；或碱土金属离子，诸如[ca
2
]
0.5
、[mg
2
]
0.5
或[ba
2
]
0.5
(“下标0.5意指二价碱土金属离子的一个抗衡离子可以是本发明的化合物的离子化形式，并且另一个是典型的抗衡离子诸如氯离子，或者两种本文公开的离子化的化合物可用作此类二价碱土金属离子的抗衡离子，或者本发明的二次离子化化合物可用作针对此类二价碱土离子的抗衡离子)。作为具体的实例，
‑
nr
80
r
80
意在包括
‑
nh2、
‑
nh
‑
烷基、n
‑
吡咯烷基、n
‑
哌嗪基、4n
‑
甲基
‑
哌嗪
‑1‑
基和n
‑
吗啉基。
[0081]
除了本文的公开内容外，否则“取代的”烯烃、炔烃、芳基和杂芳基基团中的不饱和碳原子上的氢的取代基除非另有指定，否则是
‑
r
60
、卤素、
‑
o
‑
m

、
‑
or
70
、
‑
sr
70
、
‑
s
–
m

、
‑
nr
80
r
80
、三卤代甲基、
‑
cf3、
‑
cn、
‑
ocn、
‑
scn、
‑
no、
‑
no2、
‑
n3、
‑
so2r
70
、
‑
so3–
m

、
‑
so3r
70
、
‑
oso2r
70
、
‑
oso3–
m

、
‑
oso3r
70
、
‑
po3‑2(m

)2、
‑
p(o)(or
70
)o
–
m

、
‑
p(o)(or
70
)2、
‑
c(o)r
70
、
‑
c(s)r
70
、
‑
c(nr
70
)r
70
、
‑
co2–
m

、
‑
co2r
70
、
‑
c(s)or
70
、
‑
c(o)nr
80
r
80
、
‑
c(nr
70
)nr
80
r
80
、
‑
oc(o)r
70
、
‑
oc(s)r
70
、
‑
oco2–
m

、
‑
oco2r
70
、
‑
oc(s)or
70
、
‑
nr
70
c(o)r
70
、
‑
nr
70
c(s)r
70
、
‑
nr
70
co2–
m

、
‑
nr
70
co2r
70
、
‑
nr
70
c(s)or
70
、
‑
nr
70
c(o)nr
80
r
80
、
‑
nr
70
c(nr
70
)r
70
和
‑
nr
70
c(nr
70
)nr
80
r
80
，其中r
60
、r
70
、r
80
和m

如前所定义，条件是在取代的烯烃或炔烃的情况下，取代基不是
‑
o
‑
m

、
‑
or
70
、
‑
sr
70
或
‑
s
–
m

。
[0082]
除了针对本文各个术语公开的基团之外，“取代的”杂烷基和环杂烷基基团中的氮原子上的氢的取代基基团除非另有指定，否则是
‑
r
60
、
‑
o
‑
m

、
‑
or
70
、
‑
sr
70
、
‑
s
‑
m

、
‑
nr
80
r
80
、三卤代甲基、
‑
cf3、
‑
cn、
‑
no、
‑
no2、
‑
s(o)2r
70
、
‑
s(o)2o
‑
m

、
‑
s(o)2or
70
、
‑
os(o)2r
70
、
‑
os(o)2o
‑
m

、
‑
os(o)2or
70
、
‑
p(o)(o
‑
)2(m

)2、
‑
p(o)(or
70
)o
‑
m

、
‑
p(o)(or
70
)(or
70
)、
‑
c(o)r
70
、
‑
c(s)r
70
、
‑
c(nr
70
)r
70
、
‑
c(o)or
70
、
‑
c(s)or
70
、
‑
c(o)nr
80
r
80
、
‑
c(nr
70
)nr
80
r
80
、
‑
oc(o)r
70
、
‑
oc(s)r
70
、
‑
oc(o)or
70
、
‑
oc(s)or
70
、
‑
nr
70
c(o)r
70
、
‑
nr
70
c(s)r
70
、
‑
nr
70
c(o)or
70
、
‑
nr
70
c(s)or70、
‑
nr
70
c(o)nr
80
r
80
、
‑
nr
70
c(nr
70
)r
70
和
‑
nr
70
c(nr
70
)nr
80
r
80
，其中r
60
、r
70
、r
80
和m

如前所定义。
[0083]
除了本文的公开内容外，在某个实施方案中，取代的基团具有1、2、3或4个取代基，
1、2或3个取代基，1或2个取代基，或1个取代基。
[0084]
除非另有指定，否则通过如下方式来获得本文未明确定义的取代基的命名：先命名官能团的末端部分，然后朝向连接点命名相邻的官能团。例如，取代基“芳烷基氧基羰基”是指基团(芳基)
‑
(烷基)
‑
o
‑
c(o)
‑
。
[0085]
对于本文公开的含有一个或多个取代基的任何基团，当然应理解，此类基团不含有在空间上不切实际和/或在合成上不可行的任何取代或取代形式。另外，主题化合物包括由这些化合物的取代产生的所有立体化学异构体。
[0086]
在某些实施方案中，取代基可有助于化合物的旋光异构和/或立体异构。化合物的盐、溶剂化物、水合物和前药形式也是令人感兴趣的。本公开涵盖所有此类形式。因此，本文所述的化合物包括其盐、溶剂化物、水合物、前药和异构体形式，包括其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、前药和异构体。在某些实施方案中，化合物可被代谢成有药学活性的衍生物。
[0087]
除非另有指定，否则提及的原子意在包括此原子的同位素。例如，提及的h意在包括1h、2h(即d)和3h(即t)，并且提及的c意在包括
12
c和碳的所有同位素(诸如
13
c)。
[0088]
本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见，在文中描述和图示的各个实施方案中的每一个都具有分立的组成和特征，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，它们可以容易地与其他几个实施方案中的任一个特征分离或组合。任何所述的方法都可以按照所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
[0089]
虽然为了语法流畅性和功能性解释已经或将要描述该装置和方法，但应明确理解，除非在35u.s.c.
§
112下明确表述，否则不应将权利要求解释为必须以任何方式受到“方法”或“步骤”的解释限制，但根据等同的司法原则，应给予权利要求提供的定义的全部含义和等同范围，并且在权利要求根据35u.s.c.
§
112条明确表述的情况下，则应根据35u.s.c.
§
112给予完全的法定等同物。
[0090]
其他术语和概念的定义出现在整个具体实施方式中。
[0091]
发明详述
[0092]
如上所概述，本公开的方面包括用于抑制enpp1的化合物、组合物和方法。该方法的方面包括使样品与enpp1抑制剂化合物接触以抑制enpp1的cgamp水解活性。发现这些化合物、组合物和方法可用于需要抑制enpp1的多种应用。
[0093]
还提供了使用主题enpp1抑制剂化合物治疗癌症的药物组合物和方法。该方法的方面包括向受试者施用治疗有效量的enpp1抑制剂化合物以抑制cgamp的水解并治疗受试者的癌症。
[0094]
enpp1
‑
抑制剂化合物
[0095]
该主题enpp1抑制剂化合物可以包括与亲水性头部基团连接的基于芳基或杂芳基环体系的核结构，如喹唑啉或喹啉基团。该芳基或杂芳基环体系与亲水性头部基团之间的连接基可以包括单环芳基、杂芳基、碳环或杂环和一个或多个非环状连接部分。该喹唑啉或喹啉核结构可在4
‑
位处被连接基取代。该芳基或杂芳基环体系任选地进一步被取代。本公开包括具有在4
‑
位被连接基取代并且在3
‑
位被氰基取代的喹啉核结构的化合物。在一些情况下，该连接基包括1,4
‑
二取代的6元芳基或杂芳基环状基团，例如苯基或取代的苯基。在某些情况下，该连接基包括1,4
‑
二取代的6元饱和杂环或碳环，例如n1,4
‑
二取代的哌啶环
或n1,n4
‑
二取代的哌嗪环。该主题enpp1抑制剂化合物的其他方面在下文和li等人在2018年9月7日提交的pct申请号pct/us2018/050018中进行了描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0096]
术语“亲水性头部基团”是指与核心芳基或杂芳基环体系相连的基团，其在水性环境中如在生理条件下是亲水的并且被很好地溶剂化，并且对细胞膜具有低渗透性。在一些情况下，对细胞膜的低渗透性意指渗透系数为10
‑4cm/s或更小，诸如10
‑5cm/s或更小、10
‑6cm/s或更小、10
‑7cm/s或更小、10
‑8cm/s或更小、10
‑9cm/s或更小，或甚至更小，如经由任何方便的经分离的亲水性头部基团通过膜(如，细胞单层，诸如结直肠caco
‑
2或肾mdck细胞系)被动扩散的方法测量。参见，如yang和hinner,methods mol biol.2015；1266：29
–
53。亲水性头部基团可以赋予与其连接的分子以改善的水溶性和降低的细胞渗透性。亲水性头部基团可以是在水性环境中被良好溶剂化并且对膜的渗透性低的任何方便的亲水性基团。在某些情况下，亲水性基团是离散的官能团(例如，如本文所述)或其取代的形式。一般而言，带电基团或较大的不带电极性基团的渗透性低。在一些情况下，亲水性头部基团带电，如带正电或负电。在一些实施方案中，亲水性头部基团本身不是细胞可渗透的并且赋予主题化合物以细胞不可渗透性。应当理解，可以选择亲水性头部基团或其前药形式以提供主题化合物所需的细胞渗透性。在某些情况下，亲水性头部基团是中性的亲水基团。在一些情况下，亲水性头部基团包含在前药形式中，因此包括可在体内去除的前体部分。在某些情况下，主题化合物是细胞可渗透的。
[0097]
亲水性头部基团可以是能够结合或螯合锌离子的任何方便的基团，或其前药形式。在某些情况下，亲水性头部基团是含磷基团。可用于主题enpp1抑制剂的目标含磷基团包括但不限于，膦酸或膦酸根(phosphonate)、膦酸酯、磷酸根(phosphate)、磷酸酯、硫代磷酸根(thiophosphate)、硫代磷酸酯、氨基磷酸根(phosphoramidate)和硫代氨基磷酸根(thiophosphoramidate)、或其盐，或其前药形式(例如，如本文所述)。
[0098]
示例性的包括喹唑啉和异喹啉环体系的目标enpp1抑制剂化合物在式(i)
‑
(xvb)和表1
‑
2的化合物结构中列出。
[0099]
在一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(i)化合物、或其前药、药学上可接受的盐或溶剂化物：
[0100][0101]
其中，
[0102]
x1为亲水性头部基团(例如，如本文所述)；
[0103]
a为选自下列的环体系：芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的
环烷基、杂环和取代的杂环；
[0104]
l1和l2独立地为共价键或连接基；
[0105]
z3不存在或选自nr
22
、o和s；
[0106]
z2为cr
12
或n；
[0107]
z1为cr
11
或n；
[0108]
r1选自h、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷基芳基、取代的烷基芳基、烷基杂芳基、取代的烷基杂芳基、烯基芳基(例如，乙烯基芳基)、取代的烯基芳基、烯基杂芳基(例如，乙烯基杂芳基)、取代的烯基杂芳基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环和取代的杂环；
[0109]
r
11
和r
12
独立地选自h、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基；
[0110]
r
22
选自h、烷基和取代的烷基；和
[0111]
r2至r5独立地选自h、oh、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、
‑
ocf3、卤素、氰基、胺、取代的胺、酰胺、杂环和取代的杂环；或者其中r2和r3、r3和r4、或r4和r5与它们所连接的碳原子一起提供稠环(例如，5
‑
或6
‑
元单环)，其选自杂环、取代的杂环、环烷基、取代的环烷基、芳基和取代的芳基。
[0112]
在式(i)的某些实施方案中，z3不存在。在式(i)的某些实施方案中，z3为nr
22
，其中r
22
选自h、c
(1
‑
6)
烷基和取代的c
(1
‑
6)
烷基。在某些情况下，z3为nh。在某些情况下，z3为nr
22
，且r
22
为c
(1
‑
6)
烷基，例如，甲基、乙基、丙基、戊基或己基。在某些情况下，z3为nr
22
，且r
22
为取代的c
(1
‑
6)
烷基。在式(i)的某些情况下，z3为o。在式(i)的某些情况下，z3为s。
[0113]
在式(i)的一些情况下，z1为cr
11
，且r
11
选自氢、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基氢。在一些情况下，该烷基或取代的烷基为c1‑5烷基。在式(i)的一些情况下，z1为cr
11
，且r
11
为氢。在一些情况下，r
11
为氰基。
[0114]
在一些情况下，r
11
为三氟甲基。在一些情况下，r
11
为卤素，例如br、i、cl或f。在一些情况下，r
11
为烷基，例如c1‑5烷基。在一些情况下，r
11
为取代的烷基，例如取代的c1‑5烷基。
[0115]
在式(i)的一些情况下，z2为cr
12
，且r
12
选自氢、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基氢。在一些情况下，该烷基或取代的烷基为c1‑5烷基。在式(i)的一些情况下，z2为cr
12
，且r
12
为氢。在一些情况下，r
12
为氰基。在一些情况下，r
12
为三氟甲基。在一些情况下，r
12
为卤素，例如br、i、cl或f。在一些情况下，r
12
为烷基，例如c1‑5烷基。在一些情况下，r
12
为取代的烷基，例如取代的c1‑5烷基。
[0116]
在式(i)的某些实施方案中，z1和z2中的至少一个为n。在式(i)的某些实施方案中，z1为cr
11
，且z2为n。在式(i)的某些情况下，z1为n，且z2为cr
12
。在式(i)的某些情况下，z1为cr
11
，且z2为cr
12
。在式(i)的某些情况下，z1为n，且z2为n。
[0117]
在式(i)的某些实施方案中，l1和l2各自为共价键。在某些情况下，l1和l2各自为连接基。在某些情况下，l1为共价键，且l2为连接基。在某些情况下，l1为连接基，且l2为共价键。任何方便的连接基可用于将a连接至x和/或将a连接至z3(例如，如本文所述)。在一些情况下，a通过共价键连接至x。在某些情况下，a通过长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的直链连接基连接至x。该连接基l2可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(carbamate)(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。在一些情况下，a通过共价键连接至z3。在某些情况下，a通过长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的直链连接基连接至z3。该连接基l1可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酮基(co)、酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。当z3为nr
22
时，该连接基l1可包括末端酮基(c＝o)，其与z3一起提供酰氨基基团(nr
22
co)连接。当z
31
为o或s时，该连接基l1可包括末端酮基(c＝o)，其与z
31
一起提供酯或硫酯基团连接。
[0118]
在式(i)的某些实施方案中，z3为能够结合锌离子的含磷基团，或其前药形式。
[0119]
在式(i)的某些情况下，z3选自nr
22
、o和s。因此，式(i)的主题enpp1抑制剂化合物可以由式(ii)描述：
[0120][0121]
其中z
31
选自nr
22
、o和s。
[0122]
在式(ii)的某些实施方案中，z
31
为nr
22
，其中r
22
选自h、c
(1
‑
6)
烷基和取代的c
(1
‑
6)
烷基。在某些情况下，z
31
为nh。在某些情况下，z
31
为nr
22
，且r
22
为c
(1
‑
6)
烷基，例如，甲基、乙基、丙基、戊基或己基。在某些情况下，z
31
为nr
22
，且r
22
为取代的c
(1
‑
6)
烷基。在式(i)的某些情况下，z
31
为o。在式(i)的某些情况下，z
31
为s。
[0123]
在式(ii)的一些情况下，z1为cr
11
，且r
11
选自氢、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基氢。在一些情况下，该烷基或取代的烷基为c1‑5烷基。在式(ii)的一些情况下，z1为cr
11
，且r
11
为氢。在一些情况下，r
11
为氰基。
[0124]
在一些情况下，r
11
为三氟甲基。在一些情况下，r
11
为卤素，例如br、i、cl或f。在一些情况下，r
11
为烷基，例如c1‑5烷基。在一些情况下，r
11
为取代的烷基，例如取代的c1‑5烷基。
[0125]
在式(ii)的一些情况下，z2为cr
12
，且r
12
选自氢、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基氢。在一些情况下，该烷基或取代的烷基为c1‑5烷基。在式(ii)的一些情况下，z2为cr
12
，且r
12
为氢。在一些情况下，r
12
为氰基。在一些情况下，r
12
为三氟甲基。在一些情况下，r
12
为卤素，例如br、i、cl或f。在一些情况下，r
12
为烷基，例如c1‑5烷基。在一些情况下，r
12
为取代的烷基，例如取代的c1‑5烷基。
[0126]
在式(ii)的某些实施方案中，z1和z2中的至少一个为n。在式(i)的某些实施方案中，z1为cr
11
，且z2为n。在式(i)的某些情况下，z1为n，且z2为cr
12
。在式(i)的某些情况下，z1为cr
11
，且z2为cr
12
。在式(i)的某些情况下，z1为n，且z2为n。
[0127]
在式(ii)的某些实施方案中，l1和l2各自为共价键。在某些情况下，l1和l2各自为
连接基。在某些情况下，l1为共价键，且l2为连接基。在某些情况下，l1为连接基，且l2为共价键。任何方便的连接基可用于将a连接至x和/或将a连接至z3(例如，如本文所述)。在一些情况下，a通过共价键连接至x。在某些情况下，a通过长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的直链连接基连接至x。该连接基l2可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酮基(co)、酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。在一些情况下，a通过共价键连接至z3。在某些情况下，a通过长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的直链连接基连接至z3。该连接基l1可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酮基(co)、酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。当z
31
为nr
22
时，该连接基l1可包括末端酮基(c＝o)，其与z
31
一起提供酰氨基基团(nr
22
co)连接。当z
31
为o或s时，该连接基l1可包括末端酮基(c＝o)，其与z
31
一起提供酯或硫酯基团连接。
[0128]
在式(ii)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(iii)化合物：
[0129][0130]
其中：
[0131]
r
31
至r
34
各自独立地选自h、卤素、烷基和取代的烷基，或者r
31
和r
32
或r
33
和r
34
是环状连接的，并且与它们所连接的碳原子一起提供环烷基、取代的环烷基、杂环基或取代的杂环基环；和
[0132]
n和m各自独立地为0至6的整数(例如0
‑
3)。
[0133]
在式(iii)的某些实施方案中，z
31
为nr
22
，其中r
22
选自h、c
(1
‑
6)
烷基和取代的c
(1
‑
6)
烷基。在某些情况下，z
31
为nh。在某些情况下，z
31
为nr
22
，且r
22
为c
(1
‑
6)
烷基，例如，甲基、乙基、丙基、戊基或己基。在某些情况下，z
31
为nr
22
，且r
22
为取代的c
(1
‑
6)
烷基。在式(iii)的某些情况下，z
31
为o。在式(iii)的某些情况下，z
31
为s。
[0134]
在式(ii)中，当z
31
为nr
22
时，该连接基l1可包括末端酮基(c＝o)，其与z
31
一起提供酰氨基基团(nr
22
co)连接。因此，在式(ii)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(iiia)化合物：
[0135][0136]
其中：
[0137]
z
41
为
‑
nr
22
c(＝o)
‑
；
[0138]
r
31
至r
34
各自独立地选自h、卤素、烷基和取代的烷基，或者r
31
和r
32
或r
33
和r
34
是环状连接的，并且与它们所连接的碳原子一起提供环烷基、取代的环烷基、杂环基或取代的杂环基环；和
[0139]
n和m各自独立地为0至6的整数(例如，0
‑
3)。
[0140]
在式(iii)
‑
(iiia)的一些情况下，z1为cr
11
，且r
11
选自氢、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基氢。在一些情况下，该烷基或取代的烷基为c1‑5烷基。在式(iii)
‑
(iiia)的一些情况下，z1为cr
11
，且r
11
为氢。在一些情况下，r
11
为氰基。在一些情况下，r
11
为三氟甲基。在一些情况下，r
11
为卤素，例如br、i、cl或f。在一些情况下，r
11
为烷基，例如c1‑5烷基。在一些情况下，r
11
为取代的烷基，例如取代的c1‑5烷基。
[0141]
在式(iii)
‑
(iiia)的一些情况下，z2为cr
12
，且r
12
选自氢、氰基、三氟甲基、卤素、烷基和取代的烷基氢。在一些情况下，该烷基或取代的烷基为c1‑5烷基。在式(iii)
‑
(iiia)的一些情况下，z2为cr
12
，且r
12
为氢。在一些情况下，r
12
为氰基。在一些情况下，r
12
为三氟甲基。在一些情况下，r
12
为卤素，例如br、i、cl或f。在一些情况下，r
12
为烷基，例如c1‑5烷基。在一些情况下，r
12
为取代的烷基，例如取代的c1‑5烷基。
[0142]
在式(iii)
‑
(iiia)的某些实施方案中，z1和z2中的至少一个为n。在式(iii)
‑
(iiia)的某些实施方案中，z1为cr
11
，且z2为n。在式(iii)
‑
(iiia)的某些情况下，z1为n，且z2为cr
12
。在式(iii)
‑
(iiia)的某些情况下，z1为cr
11
，且z2为cr
12
。在式(iii)
‑
(iiia)的某些情况下，z1为n，且z2为n。
[0143]
在式(iii)
‑
(iiia)的某些实施方案中，r
31
至r
34
各自为氢。在某些实施方案中，r
31
至r
34
中的至少一个为卤素。在某些实施方案中，r
31
至r
34
中的至少一个为烷基。在某些实施方案中，r
31
至r
34
中的至少一个为取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为卤素，并且其余选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为烷基，并且其余选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为取代的烷基，并且其余选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为卤素，并且其余为氢。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为烷基，并且其余为氢。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为取代的烷基，并且其余为氢。
[0144]
在式(iii)
‑
(iiia)的某些实施方案中，n为0至3的整数。在某些情况下，n为0。在某
些情况下，n为1。在某些情况下，n为2。在某些情况下，n为3。在式(iii)
‑
(iiia)的某些实施方案中，m为0至3的整数。在某些情况下，m为0。在某些情况下，m为1。在某些情况下，m为2。在某些情况下，m为3。在某些情况下，n为0，且m为1。在某些情况下，n为0，且m为2。在某些情况下，n为0，且m为3。在某些情况下，n为1，且m为0。在某些情况下，n为1，且m为1。在某些情况下，n为1，且m为2。在某些情况下，n为1，且m为3。在某些情况下，n为2，且m为0。在某些情况下，n为2，且m为1。在某些情况下，n为2，且m为2。在某些情况下，n为2，且m为3。在某些情况下，n为3，且m为0。在某些情况下，n为3，且m为1。在某些情况下，n为3，且m为2。在某些情况下，n为3，且m为3。在某些情况下，n m为0至3的整数。在某些情况下，n m为0。在某些情况下，n m为1。在某些情况下，n m为2。在某些情况下，n m为3。
[0145]
在式(i)至(iiia)中任一个的一些实施方案中，该环体系a选自苯基、取代的苯基、吡啶基、取代的吡啶基、嘧啶、取代的嘧啶、哌啶、取代的哌啶、哌嗪、取代的哌嗪、哒嗪、取代的哒嗪、环己基和取代的环己基。在某些情况下，该环体系a为苯基或取代的苯基。在一些情况下，该环体系a为吡啶基或取代的吡啶基。在一些情况下，该环体系a为嘧啶或取代的嘧啶。在一些情况下，该环体系a为哌啶或取代的哌啶。在一些情况下，该环体系a为哌嗪或取代的哌嗪。在一些情况下，该环体系a为环己基或取代的环己基。
[0146]
在一些实施方案中，该环体系a由式(a1)描述：
[0147][0148]
其中：
[0149]
r6各自选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；和
[0150]
p为0至4的整数。
[0151]
在某些情况下，a1为亚苯基。在某些情况下，a1为单取代的亚苯基。在某些情况下，a1为二取代的亚苯基。在某些情况下，a1为三取代的亚苯基。在某些情况下，a1为四取代的亚苯基。在某些情况下，亚苯基的取代基选自低级烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)和卤素(例如，f、cl、i或br)。
[0152]
在一些实施方案中，a1环由式(a1a)描述：
[0153][0154]
在一些实施方案中，该环体系a由式(a2)描述：
[0155]
[0156]
其中：
[0157]
z5选自n和cr6；
[0158]
r6各自选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；和
[0159]
q为0至2的整数。
[0160]
在某些情况下，a2为吡啶基。在某些情况下，a2为取代的吡啶基。在一些情况下，该吡啶基为单取代的吡啶基。在其他情况下，该吡啶基为二取代的吡啶基。在其他情况下，该吡啶基为三取代的吡啶基。在某些情况下，z5为n，使得a2为嘧啶基。在一些情况下，a2为取代的嘧啶基。在一些情况下，该嘧啶基为单取代的。在一些情况下，该嘧啶基为二取代的。在a2的某些实施方案中，取代基选自低级烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)、三氟甲基和卤素(例如，f、cl、i或br)。
[0161]
在一些实施方案中，该环体系a由式(a3)描述：
[0162][0163]
其中：
[0164]
z5选自n和cr6；
[0165]
r6各自选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；和
[0166]
q为0至2的整数。
[0167]
在某些情况下，a3为吡啶基。在某些情况下，a3为取代的吡啶基。在一些情况下，该吡啶基为单取代的吡啶基。在其他情况下，该吡啶基为二取代的吡啶基。在其他情况下，该吡啶基为三取代的吡啶基。在某些情况下，z5为n，使得a3为嘧啶基。在一些情况下，a3为取代的嘧啶基。在一些情况下，该嘧啶基为单取代的。在一些情况下，该嘧啶基为二取代的。在a3的某些实施方案中，取代基选自低级烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)、三氟甲基和卤素(例如，f、cl、i或br)。
[0168]
在一些实施方案中，该环体系a由式(a4)描述：
[0169][0170]
其中：
[0171]
z5为n；
[0172]
r6各自选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；和
[0173]
q为0至2的整数。
[0174]
在一些情况下，a4为取代的嘧啶基。在一些情况下，该嘧啶基为单取代的。在一些情况下，该嘧啶基为二取代的。在a4的某些实施方案中，取代基选自低级烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)、三氟甲基和卤素(例如，f、cl、i或br)。
[0175]
在式(iii)
‑
(iiia)的一些情况下，该enpp1抑制剂化合物为式(iv)
‑
(iva)化合物：
[0176][0177]
其中：
[0178]
z
31
选自nr
22
、o和s；
[0179]
z
41
为
‑
nr
22
c(＝o)
‑
；
[0180]
z
11
和z
21
独立地选自n和c(cn)；
[0181]
r
31
至r
34
各自独立地选自h、卤素、烷基和取代的烷基，或者r
31
和r
32
或r
33
和r
34
是环状连接的，并且与它们所连接的碳原子一起提供环烷基、取代的环烷基、杂环基或取代的杂环基环；
[0182]
r6各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基和卤素；
[0183]
p为0至4的整数；和
[0184]
n和m各自独立地为0至6的整数(例如，0
‑
3)。
[0185]
在式(iv)
‑
(iva)的某些实施方案中，z
31
为nr
22
，其中r
22
选自h、c
(1
‑
6)
烷基和取代的c
(1
‑
6)
烷基。在某些情况下，z
31
为nh。在某些情况下，z
31
为nr
22
，且r
22
为c
(1
‑
6)
烷基，例如，甲基、乙基、丙基、戊基或己基。在某些情况下，z
31
为nr
22
，且r
22
为取代的c
(1
‑
6)
烷基。在式(iv)
‑
(iva)的某些情况下，z
31
为o。在式(iv)
‑
(iva)的某些情况下，z
31
为s。
[0186]
在式(iv)
‑
(iva)的某些实施方案中，z
11
和z
21
中的至少一个为n。在式(iv)
‑
(iva)的某些实施方案中，z
11
为c(cn)，且z
21
为n。在式(iv)
‑
(iva)的某些情况下，z
11
为n，且z
21
为c(cn)。在式(iv)
‑
(iva)的某些情况下，z
11
为c(cn)，且z
21
为c(cn)。在式(iv)
‑
(iva)的某些情况下，z
11
为n，且z
21
为n。
[0187]
在式(iv)
‑
(iva)的某些实施方案中，r
31
至r
34
各自为氢。在某些实施方案中，r
31
至r
34
中的至少一个为卤素。在某些实施方案中，r
31
至r
34
中的至少一个为烷基。在某些实施方案中，r
31
至r
34
中的至少一个为取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为卤素，并且其余选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为烷基，并且其余选自氢、卤
素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为取代的烷基，并且其余选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为卤素，并且其余为氢。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为烷基，并且其余为氢。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为取代的烷基，并且其余为氢。
[0188]
在式(iv)
‑
(iva)的某些实施方案中，n为0至3的整数。在某些情况下，n为0。在某些情况下，n为1。在某些情况下，n为2。在某些情况下，n为3。在式(iv)
‑
(iva)的某些实施方案中，m为0至3的整数。在某些情况下，m为0。在某些情况下，m为1。在某些情况下，m为2。在某些情况下，m为3。在某些情况下，n为0，且m为1。在某些情况下，n为0，且m为2。在某些情况下，n为0，且m为3。在某些情况下，n为1，且m为0。在某些情况下，n为1，且m为1。在某些情况下，n为1，且m为2。在某些情况下，n为1，且m为3。在某些情况下，n为2，且m为0。在某些情况下，n为2，且m为1。在某些情况下，n为2，且m为2。在某些情况下，n为2，且m为3。在某些情况下，n为3，且m为0。在某些情况下，n为3，且m为1。在某些情况下，n为3，且m为2。在某些情况下，n为3，且m为3。在某些情况下，n m为0至3的整数。在某些情况下，n m为0。在某些情况下，n m为1。在某些情况下，n m为2。在某些情况下，n m为3。
[0189]
在式(iva)的一些情况下，n为0，且m为0
‑
2，例如m为1或2。
[0190]
在式(iv)
‑
(iva)的一些情况下，该enpp1抑制剂化合物为式(v)
‑
(va)化合物：
[0191][0192][0193]
其中：
[0194]
r
41
至r
44
独立地选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺。
[0195]
在式(v)
‑
(va)的某些实施方案中，z
11
和z
21
中的至少一个为n。在式(v)
‑
(va)的某些实施方案中，z
11
为c(cn)，且z
21
为n。在式(v)
‑
(va)的某些情况下，z
11
为n，且z
21
为c(cn)。在式(v)
‑
(va)的某些情况下，z
11
为c(cn)，且z
21
为c(cn)。在式(v)
‑
(va)的某些情况下，z
11
为n，且z
21
为n。
[0196]
在式(v)
‑
(va)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(via)
‑
(vid)之一的化合物：
[0197][0198]
在式(via)
‑
(vid)的某些实施方案中，r
41
至r
44
各自为氢。在某些实施方案中，r
41
至r
44
中的至少一个为烷基或取代的烷基。在某些实施方案中，r
41
至r
44
中的至少一个为羟基。在某些实施方案中，r
41
至r
44
中的至少一个为烷氧基或取代的烷氧基。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为三氟甲基。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为卤素。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为酰基或取代的酰基。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为羧基。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为甲酰胺或取代的甲酰胺。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为磺酰基或取代的磺酰基。在某些情况下，r
41
至r
44
中的至少一个为磺酰胺和取代的磺酰胺。在某些情况下，r
31
至r
34
之一为氢，并且其余选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺。在某些情况下，r
31
至r
34
中的两个为氢，并且其余选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺。在某些情况下，r
31
至r
34
中的三个为氢，并且其余选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺。
[0199]
在式(via)
‑
(vid)的某些实施方案中，n为0至3的整数。在某些情况下，n为0。在某些情况下，n为1。在某些情况下，n为2。在某些情况下，n为3。在式(via)
‑
(vid)的某些实施方案中，m为0至3的整数。在某些情况下，m为0。在某些情况下，m为1。在某些情况下，m为2。在某些情况下，m为3。在某些情况下，n为0，且m为1。在某些情况下，n为0，且m为2。在某些情况下，n为0，且m为3。在某些情况下，n为1，且m为0。在某些情况下，n为1，且m为1。在某些情况下，n
为1，且m为2。在某些情况下，n为1，且m为3。在某些情况下，n为2，且m为0。在某些情况下，n为2，且m为1。在某些情况下，n为2，且m为2。在某些情况下，n为2，且m为3。在某些情况下，n为3，且m为0。在某些情况下，n为3，且m为1。在某些情况下，n为3，且m为2。在某些情况下，n为3，且m为3。在某些情况下，n m为0至3的整数。在某些情况下，n m为0。在某些情况下，n m为1。在某些情况下，n m为2。在某些情况下，n m为3。
[0200]
在式(via)
‑
(vid)的某些实施方案中，r
22
为氢。在某些情况下，r
22
为烷基。在某些情况下，r
22
为取代的烷基。在某些情况下，该烷基或取代的烷基为c
(1
‑
6)
烷基。
[0201]
在式(i)
‑
(vid)中任一个的某些实施方案中，r1选自氢、烷基芳基、取代的烷基芳基、烷基杂芳基、取代的烷基杂芳基、烯基芳基(例如，乙烯基芳基)、取代的烯基芳基、烯基杂芳基(例如，乙烯基杂芳基)、取代的烯基杂芳基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
[0202]
在式(i)
‑
(vid)的某些情况下，r1为氢。在某些情况下，r1为芳基或取代的芳基。在某些情况下，r1为杂芳基或取代的杂芳基。在某些情况下，r1为烷基芳基或取代的烷基芳基。在某些情况下，r1为烷基杂芳基或取代的烷基杂芳基。在某些情况下，r1为烯基芳基或取代的烯基芳基。在某些情况下，r1为乙烯基芳基。在某些情况下，r1为取代的乙烯基芳基。在一些情况下，r1为乙烯基杂芳基。在某些情况下，r1为烯基杂芳基或取代的烯基杂芳基。在一些情况下，r1为取代的乙烯基杂芳基。
[0203]
在式(via)
‑
(vid)的一些情况下，该enpp1抑制剂化合物为式(viia)
‑
(viib)之一的化合物：
[0204][0205]
在式(i)
‑
(viib)中任一个的某些实施方案中，r2至r5独立地选自h、oh、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、
‑
ocf3、卤素、氰基、胺、取代的胺、酰胺、杂环和取代的杂环。
[0206]
在式(i)
‑
(viib)中任一个的某些实施方案中，r2至r5独立地选自氢、oh、c
(1
‑
6)
烷氧基、
‑
ocf3、c
(1
‑
6)
烷基氨基、二
‑
c
(1
‑
6)
烷基氨基、f、cl、br和cn。
[0207]
在某些情况下，r2至r5中的至少一个为氢。在某些情况下，r2至r5中的至少两个为氢。在某些情况下，r2至r5各自为氢。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为羟基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为烷基或取代的烷基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为烷氧基或取代的烷氧基。
[0208]
在某些情况下，该烷氧基或取代的烷氧基为c
(1
‑
6)
烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为甲氧基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为
‑
ocf3。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为卤素。在某些情况
下，该卤素为氟。在某些情况下，该卤素为氯。在某些情况下，该卤素为溴。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为氰基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为胺或取代的胺。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为c
(1
‑
6)
烷基氨基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为二
‑
c
(1
‑
6)
烷基氨基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为酰胺。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为杂环或取代的杂环。
[0209]
在式(i)
‑
(viib)的一些情况下，r3和r4独立地为烷氧基；且r2和r5都为氢。在某些情况下，该烷氧基为甲氧基。在一些情况下，r3为烷氧基；且r2、r4和r5为氢。在一些情况下，r4为烷氧基；且r2、r3和r5各自为氢。在某些情况下，r2、r3和r4为氢，且r5为烷氧基。在某些情况下，该烷氧基为c
(1
‑
6)
烷氧基。在某些情况下，该烷氧基为甲氧基。在某些情况下，该烷氧基为乙氧基。在某些情况下，该烷氧基为丙氧基。在某些情况下，该烷氧基为丁氧基。在某些情况下，该烷氧基为戊氧基。在某些情况下，该烷氧基为己氧基。
[0210]
在式(vic)
‑
(vid)的一些情况下，r
41
‑
r
44
各自独立地为h、卤素、c
(1
‑
6)
烷基或c
(1
‑
6)
烷氧基。在式(vic)
‑
(vid)的一些情况下，m为1或2。在式(vic)
‑
(vid)的一些情况下，r2为h，且r3至r5独立地选自氢、c
(1
‑
6)
烷氧基、f、cl和c
(1
‑
6)
烷基。
[0211]
在式(viia)
‑
(viib)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(viic)
‑
(viil)之一的化合物：
[0212]
[0213][0214]
在式(via)的一些情况下，该enpp1抑制剂化合物为式(viim)化合物：
[0215][0216]
在式(viim)的某些实施方案中，r2至r5独立地选自h、oh、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、
‑
ocf3、卤素、氰基、胺、取代的胺、酰胺、杂环和取代的杂环。在式(viim)的某些实施方案中，r2至r5独立地选自氢、oh、c
(1
‑
6)
烷氧基、
‑
ocf3、c
(1
‑
6)
烷基氨基、二
‑
c
(1
‑
6)
烷基氨基、f、cl、br和cn。在式(viim)的某些实施方案中，n m＝1。在式(viim)的某些实施方案中，n m＝2。在式(viim)的某些实施方案中，n为1，且m为0。
[0217]
在式(viim)的某些情况下，r3至r5中的至少一个为氢。在某些情况下，r3至r5中的至少两个为氢。在某些情况下，r3至r5各自为氢。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为羟基。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为烷基或取代的烷基。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为烷氧基或取代的烷氧基。在式(viim)的某些情况下，该烷氧基或取代的烷氧基为c
(1
‑
6)
烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为甲氧基。在式(viim)的某些情况下，r3至r5中的至少一个为
‑
ocf3。在某些情
况下，r3至r5中的至少一个为卤素。在某些情况下，该卤素为氟。在某些情况下，该卤素为氯。在某些情况下，该卤素为溴。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为氰基。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为胺或取代的胺。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为c
(1
‑
6)
烷基氨基。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为二
‑
c
(1
‑
6)
烷基氨基。在式(viim)的某些情况下，r3至r5中的至少一个为酰胺。在某些情况下，r3至r5中的至少一个为杂环或取代的杂环。
[0218]
在式(viim)的一些情况下，r3和r4独立地为烷氧基；且r2和r5都为氢。在某些情况下，该烷氧基为甲氧基。在一些情况下，r3为烷氧基；且r2、r4和r5为氢。在一些情况下，r4为烷氧基；且r2、r3和r5各自为氢。在式(viim)的某些情况下，r2、r3和r4为氢，且r5为烷氧基。在某些情况下，该烷氧基为c
(1
‑
6)
烷氧基。在某些情况下，该烷氧基为甲氧基。在某些情况下，该烷氧基为乙氧基。在某些情况下，该烷氧基为丙氧基。在某些情况下，该烷氧基为丁氧基。在某些情况下，该烷氧基为戊氧基。在某些情况下，该烷氧基为己氧基。
[0219]
在式(viim)的某些实施方案中，n为0
‑
3，且m为0
‑
3。在式(viim)的一些情况下，m为0。在某些情况下，m为1。在某些情况下，m为2。在某些情况下，m为3。在某些情况下，n为0，且m为1。在某些情况下，n为0，且m为2。在某些情况下，n为0，且m为3。在某些情况下，n为1，且m为0。在某些情况下，n为1，且m为1。在某些情况下，n为1，且m为2。在某些情况下，n为1，且m为3。在某些情况下，n为2，且m为0。在某些情况下，n为2，且m为1。在某些情况下，n为2，且m为2。在某些情况下，n为2，且m为3。在某些情况下，n为3，且m为0。在某些情况下，n为3，且m为1。在某些情况下，n为3，且m为2。在某些情况下，n为3，且m为3。在某些情况下，n m为0至3的整数。在某些情况下，n m为0。在某些情况下，n m为1。在某些情况下，n m为2。在某些情况下，n m为3。
[0220]
在式(i)的enpp1抑制剂化合物的某些情况下，z3不存在。在式(i)的某些实施方案中，z3不存在，z2为cr
12
，r
12
为氰基，并且该化合物由式(x)描述：
[0221][0222]
其中l
11
和l
12
独立地为共价键或连接基。在式(x)的一些情况下，l
11
为共价键。
[0223]
在式(x)的一些实施方案中，该环体系a选自苯基、取代的苯基、吡啶基、取代的吡啶基、嘧啶、取代的嘧啶、哌啶、取代的哌啶、哌嗪、取代的哌嗪、哒嗪、取代的哒嗪、环己基和取代的环己基。在某些情况下，该环体系a为苯基或取代的苯基。在一些情况下，该环体系a为吡啶基或取代的吡啶基。在一些情况下，该环体系a为嘧啶或取代的嘧啶。在一些情况下，该环体系a为哌啶或取代的哌啶。在一些情况下，该环体系a为哌嗪或取代的哌嗪。在一些情况下，该环体系a为环己基或取代的环己基。
[0224]
在一些实施方案中，该环体系a由式(a1)
‑
(a4)(例如，如本文所述)之一所描述：
[0225][0226]
其中：
[0227]
z5选自n和cr6；
[0228]
r6各自选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；
[0229]
p为0至4的整数；和
[0230]
q为0至2的整数。
[0231]
在一些实施方案中，该a环由式(a5)描述：
[0232][0233]
其中：
[0234]
z5各自独立地选自n和cr
16
；
[0235]
r
16
各自独立地选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；和
[0236]
r为0至8的整数。
[0237]
在某些情况下，a5为哌啶或取代的哌啶。在某些情况下，a5为哌嗪或取代的哌嗪。在某些情况下，a5为环己基或取代的环己基。在a5的某些实施方案中，r大于0，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在一些情况下，a5包括一个r
16
基团。在一些情况下，a5包括两个r
16
基团。在一些情况下，a5包括三个r
16
基团。在一些情况下，a5包括四个r
16
基团。在某些实施方案中，取代基选自低级烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基)、三氟甲基和卤素(例如，f、cl、i或br)。
[0238]
在某些实施方案中，该a环具有式(a5a)
‑
(a5c)中的任一个：
[0239][0240]
在某些实施方案中，该a环为具有式(a5d)或(a5e)相对构型的环己基：
[0241][0242]
在式(x)的某些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(xi)的化合物：
[0243][0244]
其中：
[0245]
z5各自独立地选自n和cr
16
；
[0246]
r
16
各自独立地选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺；和
[0247]
r为0至8的整数。
[0248]
在式(xi)的某些实施方案中，至少一个z5为n。在式(xi)的某些实施方案中，一个z5为n，并且另一个z5为cr
16
。在式(xi)的某些情况下，两个z5基团都为cr
16
。在式(xi)的某些情况下，两个z5基团都为n。
[0249]
在式(x)
‑
(xi)中任一个的化合物的某些实施方案中，l
11
和l
12
各自为共价键。在某些情况下，l
11
和l
12
各自为连接基。在某些情况下，l
11
为共价键，且l
12
为连接基。在某些情况下，l
11
为连接基，且l
12
为共价键。任何方便的连接基可用作l
11
和l
12
。在一些情况下，l
11
为共价键。在某些情况下，l
11
是长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的直链连接基。该连接基l
11
可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。在一些情况下，l
12
为共价键。在某些情况下，l
12
是长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的连接基。该连接基l
12
可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。
[0250]
在式(xi)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(xii)化合物：
[0251][0252]
在式(xii)化合物的某些实施方案中，z5为cr
16
，其中r
16
选自氢、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、三氟甲基、卤素、酰基、取代的酰基、羧基、甲酰胺、取代的甲酰胺、磺酰基、取代的磺酰基、磺酰胺和取代的磺酰胺。在式(xii)化合物的某些情况下，z5为n。
[0253]
在式(xii)化合物的某些实施方案中，l
12
为共价键。在某些情况下，l
12
为连接基。任何方便的连接基可用作l
12
。在某些情况下，l
12
是长度为1
‑
12个原子，例如长度为1
‑
10、1
‑
8或1
‑
6个原子，例如长度为1、2、3、4、5或6个原子的直链连接基。该连接基l
12
可为(c1‑6)烷基连接基或取代的(c1‑6)烷基连接基，其任选被杂原子或连接官能团如酯(
‑
co2‑
)、酰氨基(conh)、氨基甲酸基(oconh)、醚(
‑
o
‑
)、硫醚(
‑
s
‑
)和/或氨基基团(
‑
nr
‑
，其中r为h或烷基)取代。
[0254]
在式(xii)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(xiii)化合物：
[0255][0256]
其中：
[0257]
r
35
和r
36
各自独立地选自h、卤素、烷基和取代的烷基，或者r
35
和r
36
是环状连接的，并且与它们所连接的碳原子一起提供环烷基、取代的环烷基、杂环基或取代的杂环基环；和
[0258]
s为0至6的整数(例如，0至3)。
[0259]
在式(xiii)的某些实施方案中，r
35
和r
36
各自为氢。在某些实施方案中，r
35
或r
36
中的至少一个为卤素。在某些实施方案中，r
35
或r
36
中的至少一个为烷基。在某些实施方案中，r
35
或r
36
中的至少一个为取代的烷基。在某些情况下，r
35
为卤素，且r
36
选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
35
为烷基，且r
36
选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
35
为取代的烷基，且r
36
选自氢、卤素、烷基和取代的烷基。在某些情况下，r
35
为卤素，且r
36
为氢。在某些情况下，r
35
为烷基，且r
36
为氢。在某些情况下，r
35
为取代的烷基，且r
36
为氢。
[0260]
在式(xiii)的某些实施方案中，s为0至3的整数。在某些情况下，s为0。在某些情况下，s为1。在某些情况下，s为2。在某些情况下，s为3。
[0261]
在式(xiii)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(xiv)化合物：
[0262][0263]
其中s为0至6的整数(例如，0至3)。
[0264]
在式(xiii)的某些实施方案中，s为0至3的整数。在某些情况下，s为0。在某些情况下，s为1。在某些情况下，s为2。在某些情况下，s为3。
[0265]
在式(x)
‑
(xiv)中任一个的某些实施方案中，r2至r5独立地选自h、oh、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、
‑
ocf3、卤素、氰基、胺、取代的胺、酰胺、杂环和取代的杂环。
[0266]
在式(x)
‑
(xiv)中任一个的某些实施方案中，r2至r5独立地选自氢、oh、c
(1
‑
6)
烷氧基、
‑
ocf3、c
(1
‑
6)
烷基氨基、二
‑
c
(1
‑
6)
烷基氨基、f、cl、br和cn。
[0267]
在式(x)
‑
(xiv)中任一个的某些情况下，r2至r5中的至少一个为氢。在某些情况下，r2至r5中的至少两个为氢。在某些情况下，r2至r5中的至少三个为氢。在某些情况下，r2至r5各自为氢。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为羟基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为烷基或取代的烷基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为烷氧基或取代的烷氧基。在某些情况下，该烷氧基或取代的烷氧基为c
(1
‑
6)
烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为甲氧基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为
‑
ocf3。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为卤素。在某些情况下，该卤素为氟。在某些情况下，该卤素为氯。在某些情况下，该卤素为溴。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为氰基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为胺或取代的胺。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为c
(1
‑
6)
烷基氨基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为二
‑
c
(1
‑
6)
烷基氨基。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为酰胺。在某些情况下，r2至r5中的至少一个为杂环或取代的杂环。
[0268]
在式(x)
‑
(xiv)中任一个的一些情况下，r3和r4独立地为烷氧基；且r2和r5都为氢。在一些情况下，r3为烷氧基；且r2、r4和r5为氢。在一些情况下，r4为烷氧基；且r2、r3和r5各自为氢。在某些情况下，r2、r3和r4为氢，且r5为烷氧基。在某些情况下，该烷氧基为c
(1
‑
6)
烷氧基。在某些情况下，该烷氧基为甲氧基。在某些情况下，该烷氧基为乙氧基。在某些情况下，该烷氧基为丙氧基。在某些情况下，该烷氧基为丁氧基。在某些情况下，该烷氧基为戊氧基。在某些情况下，该烷氧基为己氧基。
[0269]
在式(xiv)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(xiva)
‑
(xive)之一的化合物：
[0270][0271]
其中s为0至6的整数(例如，0至3)。
[0272]
在式(i)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为式(xva)或(xvb)化合物：
[0273][0274]
其中：
[0275]
s为0至3；
[0276]
r
21
为c
(1
‑
6)
烷基或取代的c
(1
‑
6)
烷基；和
[0277]
r3和r4选自cl和f。
[0278]
在式(xva)
‑
(xvb)的一些情况下，r
21
选自甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些情况下，r
21
为甲基。在式(xva)
‑
(xvb)的一些情况下，r3和r4为cl。
[0279]
在某些情况下，r3和r4为f。在式(xva)
‑
(xvb)的一些情况下，s为2。在某些情况下，s为1。在式(xva)
‑
(xvb)的一些实施方案中，s为2；r
21
为甲基或异丙基；且r3和r4选自cl和f。
[0280]
在式(xva)
‑
(xvb)的一些情况下，该主题enpp1抑制剂化合物为以下结构之一的化合物或其前药(例如，如本文所述)：
[0281][0282]
如上所述，x1为亲水性头部基团或其前药形式。本文所述的亲水性头部基团的任何实施方案可并入本文所述的式(i)
‑
(xvb)的任一实施方案中。在式(i)
‑
(xvb)的一些实施方案中，x1为包含能够结合锌离子的带电基团的亲水性头部基团、或其前药形式。在某些情况下，能够结合锌离子的亲水性头部基团是含磷官能团(例如，如本文所述)。
[0283]
在式(i)
‑
(xvb)的一些实施方案中，该亲水性头部基团(x1)选自膦酸或膦酸根、膦酸酯、磷酸根、磷酸酯、硫代磷酸根、硫代磷酸酯、氨基磷酸根、硫代氨基磷酸根、磺酸根、磺酸、硫酸根、异羟肟酸、酮酸、酰胺和羧酸。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为膦酸、膦酸根，或其盐。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为磷酸根，或其盐。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为膦酸酯或磷酸酯。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为硫代磷酸根。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为硫代磷酸酯。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为氨基磷酸根。在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些实施方案中，该亲水性头部基团为硫代氨基磷酸根。
[0284]
可并入本文所述式(i)
‑
(xvb)的任一实施方案中的目标亲水性头部基团的具体实
例包括但不限于包含选自下列的第一部分的头部基团：磷酸根(rpo4h
‑
)、膦酸根(rpo3h
‑
)、硼酸(rbo2h2)、羧酸根(rco2‑
)、硫酸根(rso4‑
)、磺酸根(rso3‑
)、胺(rnh
3
)、甘油、糖例如乳糖或来源于透明质酸、极性氨基酸、聚环氧乙烷和低聚乙二醇，所述第一部分任选地缀合至选自以下的第二部分的残基：胆碱、乙醇胺、甘油、核酸、糖、肌醇、氨基酸或氨基酸酯(例如丝氨酸)和脂质(例如，脂肪酸或烃链，例如c8
‑
c30饱和或不饱和烃)。该头部基团可含有各种其他修饰，例如在含有头部基团的低聚乙二醇和聚环氧乙烷(peg)的情况下，此类peg链可以用甲基基团终止或具有供进一步修饰用的远端官能团。亲水性头部基团的实例还包括但不限于硫代磷酸根、磷酸胆碱、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酰基胆碱(ethylphosphosphorylcholine)、聚乙二醇、聚甘油、三聚氰胺、葡萄糖胺、三甲基胺、精胺、亚精胺和缀合的羧酸根、硫酸根、硼酸、磺酸根、硫酸根和碳水化合物。
[0285]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xvi)：
[0286][0287]
其中：
[0288]
z6不存在或选自o和ch2；
[0289]
z7和z9各自独立地选自o和nr
10
，其中r
10
为h、烷基或取代的烷基；
[0290]
z8选自o和s；和
[0291]
r8和r9各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、取代的酰基、非芳族杂环、取代的非芳族杂环、环烷基、取代的环烷基和前体部分。
[0292]
在式(xvi)的一些实施方案中，z6不存在。在其他情况下，z6为ch2。在其他情况下，z6为氧。在式(xvi)的一些实施方案中，z7为氧，且z9为nr
10
。在一些情况下，z7为nr
10
，且z9为氧。在一些情况下，z7和z9都为氧。在其他情况下，z7和z9都为nr
10
。在一些情况下，z8为氧。在其他情况下，z8为硫。
[0293]
在式(xvi)的一些实施方案中，z7、z8和z9都为氧原子，且z6不存在或为ch2。在其他情况下，z8为硫原子，z7和z9都为氧原子，且z6不存在或为ch2。在其他情况下，z8为硫原子，z6、z7和z9都为氧原子。在一些情况下，z8为氧原子，z7为nr
10
，z9为氧原子，且z6不存在或为ch2。在其他情况下，z8为氧原子，z7为nr
10
，z6和z9都为氧原子。在其他情况下，z8为氧原子，z7和z9各自独立地为nr
10
，且z6为氧原子。在其他情况下，z8为氧原子，z7和z9各自独立地为nr
10
，且z6不存在或为ch2。在一些情况下，z7和z9各自是相同的。在其他情况下，z7和z9是不同的。应理解，式(xvi)的基团可包括所描述结构的一种或多种互变异构形式，并且意在包括所有此类形式及其盐。
[0294]
在式(xvi)的一些实施方案中，z7和z9中的至少一个为nr
10
。在一些情况下，r
10
为氢。在一些情况下，r
10
为烷基。在一些其他的情况下，r
10
为取代的烷基。在一些情况下，z7和z9都为nr
10
。在一些情况下，z7和z9都为nr
10
，且r
10
、r8和r9各自独立地为氢。在一些情况下，z7和z9都为nr
10
，r
10
各自为烷基，且r8和r9各自为氢。在一些情况下，z7和z9都为nr
10
，r
10
各自为
取代的烷基(例如，被酯或羧基取代的烷基)，且r8和r9各自为氢。
[0295]
在式(xvi)的一些实施方案中，r8和r9都为氢原子。在一些情况下，r8和r9中的至少一个为除氢以外的取代基。在其他情况下，r8和r9都为除氢以外的取代基。在一些情况下，r8和r9中的至少一个为烷基或取代的烷基。在一些情况下，r8和r9中的至少一个为烯基或取代的烯基。在一些其他的情况下，r8和r9中的至少一个为芳基或取代的芳基。在一些情况下，r8和r9中的至少一个为酰基或取代的酰基。在一些情况下，r8和r9中的至少一个为杂芳基或取代的杂芳基。在一些情况下，r8和r9中的至少一个为环烷基或取代的环烷基。在一些情况下，r8和r9都为烷基(例如，低级烷基)。在一些情况下，r8和r9都为取代的烷基(例如，c
(1
‑
6)
烷基，其被烷氧基、取代的烷氧基、酯或羧基所取代)。在一些情况下，r8和r9中的至少一个包括前体部分。在某些情况下，r8和r9都为苯基。在一些情况下，r8和r9是相同的。在其他情况下，r8和r9是不同的。
[0296]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1选自式(xvia)至(xvif)中的任一个：
[0297][0298]
其中：
[0299]
r
10
和r
11
各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、酰基、取代的酰基、羧基、取代的羧基和前体部分(promoiety)(例如，如本文所述)。
[0300]
在式(xvia)至(xvif)中的一些实施方案中，r
10
和r
11
都为氢原子。在一些情况下，r
10
和r
11
中的至少一个为除氢以外的取代基。在其他情况下，r
10
和r
11
都为除氢以外的取代基。在一些情况下，r
10
和r
11
是相同的。在其他情况下，r
10
和r
11
是不同的。在一些情况下，r
10
和r
11
中的至少一个为烷基或取代的烷基。在一些情况下，r
10
和r
11
中的至少一个为芳基或取代的芳基。在一些情况下，r
10
和r
11
都为烷基或取代的烷基。在一些情况下，r
10
和r
11
都为芳基或取代的芳基。在一些情况下，r
10
和r
11
都为酰基或取代的酰基。在一些情况下，r
10
和r
11
都为低级烷基。在一些情况下，r
10
和r
11
都为取代的烷基(例如，c
(1
‑
6)
烷基，其被烷氧基、取代的烷氧基、酯或羧基所取代)。在一些情况下，r
10
和r
11
中的至少一个包括前体部分。在某些情况下，r
10
和r
11
都为苯基。
[0301]
在式(xvia)至(xvid)的某些情况下，r
10
和r
11
中的至少一个包括可裂解的基团或自消除的(self
‑
immolative)前体部分。自消除基团可为二硫键连接的前体部分或含有前体部分的自消除的酯。在一些情况下，r
10
和/或r
11
包括式
‑
ch2ch2‑
ss
‑
r
12
的二硫键连接的前体部分，其中r
12
为烷基或取代的烷基。在某些情况下，r
12
为c8
‑
c30饱和或不饱和烃链。在一些情况下，r
10
和/或r
11
包括式
‑
ch2ocor
13
的前体部分，其中r
13
为h、烷基或取代的烷基。在一
些情况下，r
10
和/或r
11
包括式
‑
ch2c(r
14
)2co2r
14
的前体部分，其中r
14
各自独立地为h、烷基或取代的烷基。
[0302]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1、或其前药形式选自：
[0303][0304]
或其药学上可接受的盐。
[0305]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xvi)的基团：
[0306][0307]
其中：
[0308]
r
81
和r
91
各自独立地选自h、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、酰基、酯、酰胺、杂环、取代的杂环、环烷基和取代的环烷基，或r
81
和r
91
与它们所连接的原子一起形成选自杂环和取代的杂环的基团。
[0309]
在式(xvi)的一些实施方案中，r
81
和r
91
都为氢原子。在其他情况下，r
81
和r
91
都为除氢以外的取代基。
[0310]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xvii)的基团：
[0311][0312]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xviii)的基团：
[0313][0314]
其中：
[0315]
z
61
不存在或选自o和ch2。
[0316]
在式(xviii)的一些实施方案中，该亲水性头部基团选自下列基团之一：
[0317][0318]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xix)的基团：
[0319][0320]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xx)的基团：
[0321][0322]
其中：
[0323]
r
92
选自h、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、酰基、酯、酰胺、杂环、取代的杂环、环烷基和取代的环烷基。
[0324]
在式(xx)的一些实施方案中，r
92
为氢。在其他情况下，r
92
为除氢以外的取代基。在某些实施方案中，r
92
为烷基或取代的烷基。在式(xx)的某些实施方案中，该亲水性头部基团是下列结构的基团：
[0325][0326]
在式(i)
‑
(xvb)中任一个的一些情况下，该亲水性头部基团x1为式(xxi)的基团：
[0327][0328]
应当理解，式(i)
‑
(xvb)中任一个的基团x1中的任何羟基和胺基团可以任选地进一步被任何方便的基团(例如，烷基、取代的烷基、苯基、取代的苯基、酯基等)取代。应当理解，任何方便的可替代的亲水性基团可用作式(i)
‑
(xvb)中任一个的化合物中的基团x1。
[0329]
在某些实施方案中，该enpp1抑制剂化合物由表1的结构或其前药(例如，如本文所述)、或其药学上可接受的盐之一描述。
[0330]
表1：enpp1抑制剂化合物
[0331]
[0332]
[0333]
[0334]
[0335]
[0336][0337]
在某些实施方案中，该enpp1抑制剂化合物由表2的结构或其前药(例如，如本文所述)、或其药学上可接受的盐之一描述。
[0338]
表2：enpp1抑制剂化合物
[0339]
[0340]
[0341]
[0342]
[0343][0344]
在某些实施方案中，该enpp1抑制剂化合物由表3的结构或其前药(例如，如本文所述)、或其药学上可接受的盐之一描述。
[0345]
表3：enpp1抑制剂化合物
[0346]
[0347]
[0348][0349]
在某些实施方案中，该化合物由表1
‑
3(在此，提及表1
‑
3包括表3a)的化合物之一的结构描述。应理解，表1
‑
3中所示的任何化合物可以以盐的形式存在。在一些情况下，该化合物的盐形式是药学上可接受的盐。应理解，表1
‑
3中所示的任何化合物可以前药形式存在。
[0350]
在一些实施方案中，该化合物由表3a的化合物之一的结构描述。
[0351]
表3a
[0352]
[0353]
[0354]
[0355]
[0356]
[0357]
[0358]
[0359][0360]
本公开的方面包括enpp1抑制剂化合物(如，如本文所述)、其盐(如，药学上可接受的盐)和/或其溶剂化物、水合物和/或前药形式。另外，应理解，在本文描述的具有一个或多个手性中心的任何化合物中，如果未明确指出绝对立体化学，则每个中心可以独立地具有
r
‑
构型或s
‑
构型或其混合物。应理解，盐、溶剂化物、水合物、前药和立体异构体的所有变换形式意在被本公开所涵盖。
[0361]
在一些实施方案中，主题enpp1抑制剂化合物或其前药形式以药学上可接受的盐的形式提供。包含含胺或氮的杂芳基基团的化合物本质上可以是碱性的，并因此可以与许多无机酸和有机酸反应从而形成药学上可接受的酸加成盐。通常用于形成此类盐的酸包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸和磷酸，以及有机酸诸如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸，以及相关的无机酸和有机酸。因此，此类药学上可接受的盐包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔
‑
1,4
‑
二酸盐、己炔
‑
1,6
‑
二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β
‑
羟基丁酸盐、乙醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘
‑1‑
磺酸盐、萘
‑2‑
磺酸盐、扁桃酸盐、马尿酸盐、葡糖酸盐、乳糖酸盐及类似盐。在某些特定的实施方案中，药学上可接受的酸加成盐包括与无机酸诸如盐酸和氢溴酸形成的那些，以及与有机酸诸如富马酸和马来酸形成的那些。
[0362]
在一些实施方案中，主题化合物以前药形式提供。“前药”是指活性剂的衍生物，其需要在体内进行转化以释放活性剂。在某些实施方案中，该转化是酶促转化。前药经常(尽管不一定)无药理学活性，直到转化为活性剂为止。“前体部分(promoiety)”是一种形式的保护基，其在被用于掩盖活性剂内的官能团时将活性剂转化为前药。在一些情况下，前体部分经由在体内通过酶促或非酶促方式切割的一个或多个键附接至药物。例如根据rautio等人(“prodrugs:design and clinical applications”,nature reviews drug discovery 7,255
‑
270(2008年2月))描述的策略和方法，可以制备任何方便的主题化合物前药形式。在一些情况下，前体部分附接至主题化合物的亲水性头部基团。在一些情况下，前体部分附接至主题化合物的羟基或羧酸基团。在某些情况下，前体部分是酰基或取代的酰基基团。在某些情况下，前体部分是例如当被附接至主题化合物的亲水性头部基团时形成酯官能团(例如，膦酸酯、磷酸酯等)的烷基或取代的烷基基团。
[0363]
在一些实施方案中，主题化合物是膦酸酯或磷酸酯前药，其可以被转化为包括膦酸或膦酸根或磷酸根头部基团的化合物。
[0364]
在一些实施方案中，主题化合物、其前药、立体异构体或盐以溶剂化物(如水合物)的形式提供。如本文所用的术语"溶剂化物"是指由一个或多个溶质(例如前药或其药学上可接受的盐)的分子与一个或多个溶剂分子形成的复合物或聚集体。此类溶剂化物通常是具有基本上固定的溶质和溶剂摩尔比的结晶固体。代表性的溶剂包括，举例来说，水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸等。当溶剂为水时，形成的溶剂化物为水合物。
[0365]
在一些实施方案中，主题化合物通过经口给药提供并被吸收到血流中。在一些实施方案中，主题化合物的经口生物利用度为30％或更高。可以使用任何方便的方法对主题化合物或其制剂进行修饰，以增加穿过肠道内腔的吸收或它们的生物利用度。
[0366]
在一些实施方案中，主题化合物代谢稳定(例如，在化合物的半衰期期间在体内基
本上保持完整)。在某些实施方案中，化合物的半衰期(如体内半衰期)为5分钟或更长时间，诸如10分钟或更长时间、12分钟或更长时间、15分钟或更长时间、20分钟或更长时间、30分钟或更长时间、60分钟或更长时间、2小时或更长时间、6小时或更长时间、12小时或更长时间、24小时或更长时间，或甚至更长时间。
[0367]
抑制enpp1的方法
[0368]
如上所概述，本公开的方面包括enpp1抑制剂，以及使用所述enpp1抑制剂的抑制方法。enpp1是外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(enpp)家族的成员。这样，主题方法的方面包括抑制enpp1针对cgamp的水解酶活性。本发明人发现cgamp可以具有重要的胞外生物学功能，该胞外生物学功能可以通过阻止cgamp的胞外降解，例如其降解酶enpp1所致的水解来增强。在某些例子中，enpp1抑制靶标位于胞外，并且主题enpp1抑制化合物是细胞不可渗透的，并因此不能扩散到细胞中。因此，主题方法可以提供对enpp1水解酶活性的选择性胞外抑制，并增加cgamp的胞外水平。因此，在一些情况下，enpp1抑制化合物是在胞外抑制enpp1活性的化合物。本发明人进行的实验表明，抑制enpp1的活性会增加胞外cgamp，并可因此增强sting途径。
[0369]
抑制enpp1意指酶的活性(例如，在任何方便的体外抑制测定中相对于对照)降低了10％或更多，诸如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多。在一些情况下，抑制enpp1意指使酶的活性相对于其正常活性(例如，如通过任何方便的测定测量，相对于对照)降低为2分之一或更低，诸如3分之一或更低、5分之一或更低、10分之一或更低、100分之一或更低，或1000分之一或更低。
[0370]
在一些情况下，该方法是抑制样品中的enpp1的方法。如本文所用的术语“样品”涉及含有一种或多种目标组分、通常但不一定呈流体形式的材料或材料的混合物。
[0371]
在一些实施方案中，提供了抑制enpp1的方法，该方法包括使样品与细胞不可渗透的enpp1抑制剂接触以抑制enpp1的cgamp水解活性。在一些情况下，样品是细胞样品。在一些情况下，样品包含cgamp。在某些情况下，cgamp水平在细胞样品中升高(例如，相对于未与抑制剂接触的对照样品)。主题方法可以提供增加的cgamp水平。“增加的cgamp水平”意指与主题化合物接触的细胞样品中的cgamp的水平，其中该样品中的cgamp水平相对于未与所述剂接触的对照样品增加了10％或更多，诸如20％或或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、100％或更多，或甚至更多。
[0372]
在某些实施方案中，该enpp1抑制剂是如本文定义的抑制剂。在一些实施方案中，该enpp1抑制剂是根据式(i)
‑
(xvb)中任一个的抑制剂(例如，如本文所述)。在一些情况下，该enpp1抑制剂是表1
‑
3中任一个的化合物(例如，如本文所述)。在一些情况下，该enpp1抑制剂是细胞不可渗透的。
[0373]
在一些实施方案中，enpp1抑制剂被设置为细胞可渗透的。在一些实施方案中，提供了抑制enpp1的方法，该方法包括使样品与细胞可渗透的enpp1抑制剂接触以抑制enpp1。
[0374]
在一些实施方案中，主题化合物具有反映针对另外的酶的活性的enpp1抑制特性。在一些实施方案中，主题化合物特异性地抑制enpp1而不会不希望地抑制一种或多种其他酶。
[0375]
在一些实施方案中，本公开的化合物干扰cgamp和enpp1的相互作用。例如，主题化
合物可起到通过抑制enpp1针对cgamp的水解酶活性来增加胞外cgamp的作用。不受任何特定理论的束缚，据认为增加胞外cgamp能激活sting途径。
[0376]
在一些实施方案中，主题化合物抑制enpp1，如通过抑制测试测定，例如通过确定相对于对照在用主题化合物处理后无细胞系统中或细胞中酶的活性水平的测定，通过分别测量ic
50
或ec
50
值。在某些实施方案中，主题化合物具有10μm或更少，诸如3μm或更少、1μm或更少、500nm或更少、300nm或更少、200nm或更少、100nm或更少、50nm或更少、30nm或更少、10nm或更少、5nm或更少、3nm或更少、1nm或更少，或甚至更少的ic
50
值(或ec
50
值)。
[0377]
如上所概述，本公开的方面包括抑制enpp1的方法。主题化合物(例如，如本文所述)可以抑制enpp1的活性的范围为10％至100％，如抑制了10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或90％或更多。在某些测定中，主题化合物可以以1x 10
‑6m或更少(如1x 10
‑6m或更少、1x 10
‑7m或更少、1x 10
‑8m或更少、1x 10
‑9m或更少、1x 10
‑
10
m或更少，或1x 10
‑
11
m或更少)的ic
50
抑制其靶标。
[0378]
可用于确定enpp1活性的方案很多，并且包括但不限于无细胞测定，如结合测定；使用纯化的酶的测定，其中测量细胞表型的细胞测定，如基因表达测定；以及涉及特定动物的体内测定(该动物在某些实施方案中可以是与目标病原体有关的疾患的动物模型)。
[0379]
在一些实施方案中，主题方法是包括使样品与特异性地抑制enpp1的主题化合物接触的体外方法。在某些实施方案中，样品被怀疑含有enpp1，并且主题方法还包括评价该化合物是否抑制enpp1。
[0380]
在某些实施方案中，主题化合物是包括标记，例如荧光标记的经修饰化合物，并且主题方法还包括例如使用光学检测来检测样品中的标记(如果存在)。
[0381]
在某些实施方案中，用支持物或用结合至支持物(如生物素)的亲和基团修饰化合物，使得任何不与化合物结合的样品可以被去除(如，通过洗涤去除)。特异性地被结合的enpp1，如果存在，可以使用任何方便的方法，诸如使用标记的靶标特异性探针的结合或使用荧光蛋白反应试剂进行检测。
[0382]
在主题方法的另一个实施方案中，已知样品含有enpp1。
[0383]
在一些实施方案中，该方法是减少癌细胞增殖的方法，其中该方法包括使细胞与有效量的主题enpp1抑制剂化合物(如，如本文所述)接触以减少癌细胞增殖。在某些情况下，主题enpp1抑制剂化合物可在细胞内起作用。该方法可以与化学治疗剂(例如，如本文所述)结合进行。癌细胞可以在体外或体内。在某些例子中，该方法包括使细胞与enpp1抑制剂化合物(例如，如本文所述)接触，并使细胞与化学治疗剂接触。任何方便的癌细胞都可以成为靶标。
[0384]
治疗方法
[0385]
本公开的方面包括用于抑制enpp1针对cgamp的水解酶活性，以提供增加的cgamp水平和/或sting途径的下游调节(例如激活)的方法。本发明人已发现cgamp可存在于胞外空间中，并且enpp1可以控制cgamp的胞外水平。本发明人还发现cgamp可以在体内具有重要的胞外生物学功能。本文所述和证实的结果表明，根据主题方法的enpp1抑制可在体内调节sting活性，并因此可用于治疗多种疾病，如作为癌症免疫疗法的靶标。因此，主题方法可以提供对enpp1活性(例如cgamp水解酶活性)的选择性胞外抑制，以增加cgamp的胞外水平并激活干扰素基因刺激因子(sting)途径。在一些例子中，主题方法是用于增强受试者中
sting介导的响应的方法。在一些例子中，主题方法是用于调节受试者中的免疫响应的方法。
[0386]“sting介导的响应”是指由sting介导的任何响应，包括但不限于例如对细菌病原体、病毒病原体和真核病原体的免疫响应。参见如，ishikawa等人immunity 29:538
‑
550(2008)；ishikawa等人nature 461:788
‑
792(2009)；和sharma等人immunity 35:194
‑
207(2011)。sting还可以在由于对自身dna的不恰当识别而引发的某些自身免疫疾病中发挥作用(参见，例如，gall等人immunity 36:120
‑
131(2012)，并且还可以起到响应于dna疫苗而诱导适应性免疫的作用(参见，如ishikawa等人nature 461:788
‑
792(2009)。增加受试者中sting介导的响应意指受试者中sting介导的响应与对照受试者(例如，未施用主题化合物的受试者)相比增加。在一些情况下，受试者是人类并且主题化合物和方法提供对人sting的激活。在一些情况下，sting介导的响应包括对免疫响应的调节。在一些例子中，主题方法是调节受试者中的免疫响应的方法。
[0387]
在一些情况下，sting介导的响应包括增加受试者中的干扰素(如，i型干扰素(ifn)、iii型干扰素(ifn))的产生。干扰素(ifn)是具有多种生物活性(如抗病毒、免疫调节和抗增殖)的蛋白质。ifn是由哺乳动物细胞响应于在多种诱导物(诸如病毒、多肽、促细胞分裂剂等)中的暴露而产生的相对较小的、物种特异性的单链多肽。干扰素保护动物组织和细胞免受病毒侵袭，并且是重要的宿主防御机制。干扰素可分为i型、ii型和iii型干扰素。感兴趣的哺乳动物i型干扰素包括ifn
‑
α(alpha)、ifn
‑
β(beta)、ifn
‑
κ(kappa)、ifn
‑
δ(delta)、ifn
‑
ε(epsilon)、ifn
‑
τ(tau)、ifn
‑
ω(omega)和ifn
‑
ζ(zeta，也称为极限素(limitin))。
[0388]
干扰素可用于治疗多种癌症，因为这些分子具有以多种水平起作用的抗癌活性。干扰素蛋白可以直接抑制人肿瘤细胞的增殖。在一些情况下，抗增殖活性还与各种批准的化学治疗剂诸如顺铂、5fu和紫杉醇协同作用。干扰素蛋白的免疫调节活性也可以导致抗肿瘤免疫响应的诱导。该响应包括nk细胞的激活、巨噬细胞活性的刺激和mhc i类表面表达的诱导，从而导致抗肿瘤细胞毒性t淋巴细胞活性的诱导。另外，干扰素在免疫系统中抗原的交叉呈递中也起作用。此外，一些研究进一步表明ifn
‑
β蛋白可以具有抗血管生成活性。血管生成(新血管形成)对于实体瘤的生长至关重要。ifn
‑
β可通过抑制促血管生成因子诸如bfgf和vegf的表达来抑制血管生成。干扰素蛋白还可以通过调节在组织重塑中重要的酶诸如胶原酶和弹性蛋白酶的表达来抑制肿瘤的侵袭。
[0389]
该方法的方面包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的enpp1抑制剂以治疗该受试者的癌症。在一些例子中，该受试者是被诊断患有或疑似患有癌症的受试者。任何方便的enpp1抑制剂均可用于治疗癌症的主题方法中。在某些情况下，enpp1抑制剂化合物是如本文所述的化合物。在某些情况下，enpp1抑制剂是细胞不可渗透的化合物。在某些情况下，enpp1抑制剂是细胞可渗透的化合物。在某些情况下，癌症是实体瘤癌症。在某些实施方案中，癌症选自肾上腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、食道癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(小细胞癌和非小细胞癌二者)、甲状腺癌、恶性上皮肿瘤、肉瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤和各种头颈肿瘤。在一些情况下，癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，癌症是淋巴瘤。
[0390]
该方法的方面包括向受试者施用治疗有效量的细胞不可渗透的enpp1抑制剂，以
抑制cgamp的水解并治疗该受试者的癌症。在某些情况下，癌症是实体瘤癌症。在某些实施方案中，癌症选自肾上腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、食道癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(小细胞癌和非小细胞癌二者)、甲状腺癌、恶性上皮肿瘤、肉瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤和各种头颈肿瘤。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些情况下，癌症是淋巴瘤。
[0391]
在本文公开的方法的一些实施方案中，该细胞不可渗透的enpp1抑制剂是式(i)
‑
(xvb)中任一个的抑制剂(例如，如本文所述)。在一些情况下，该enpp1抑制剂是表1
‑
3中的化合物或其前药形式(例如，如本文所述)。
[0392]
在本文公开的方法的一些实施方案中，该enpp1抑制剂是细胞可渗透的。
[0393]
因此，该方法的方面包括在该化合物抑制enpp1的条件下使样品与主题化合物(例如，如上所述)接触。可以采用任何使化合物与样品接触的方便方案。如根据样品是在体外还是在体内，所采用的特定方案可能会改变。对于体外方案，可以使用任何方便的方案实现样品与化合物的接触。在一些例子中，样品包括保持在适合培养基中的细胞，并将所述复合物引入到培养基中。对于体内方案，可以采用任何方便的施用方案。根据化合物的效力，目标细胞、施用方式、存在的细胞数目，可以采用各种方案。
[0394]
在一些实施方案中，主题方法是治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，主题方法包括向受试者施用有效量的主题化合物(例如，如本文所述)或其药学上可接受的盐。主题化合物可以作为药物组合物(例如，如本文所述)的一部分施用。在该方法的某些例子中，所施用的化合物是式(i)
‑
(xvb)之一的化合物(例如，如本文所述)。在该方法的某些例子中，所施用的化合物由表1
‑
3中的化合物之一描述。
[0395]
在一些实施方案中，“有效量”是这样的主题化合物量，其当以一次剂量或多次剂量、在单一疗法或联合疗法中施用给个体时，与不存在该化合物的治疗的个体中的enpp1活性相比较或者可替代地与用该化合物治疗之前或之后个体中的enpp1活性相比较，能有效抑制enpp1约20％(20％抑制)、至少约30％(30％抑制)、至少约40％(40％抑制)、至少约50％(50％抑制)、至少约60％(60％抑制)、至少约70％(70％抑制)、至少约80％(80％抑制)或至少约90％(90％抑制)。
[0396]
在一些实施方案中，“治疗有效量”是这样的主题化合物量，其当以一次剂量或多次剂量、在单一疗法或联合疗法中施用给个体时，能有效地使受试者中的肿瘤负荷与不存在该化合物的治疗的个体中的肿瘤负荷相比较或者可替代地与用该化合物治疗之前或之后受试者中的肿瘤负荷相比较，减少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％，或至少约90％。如本文所用，术语“肿瘤负荷”是指患有癌症的受试者携带的肿瘤组织的总质量。
[0397]
在一些实施方案中，“治疗有效量”是这样的主题化合物量，当以一次剂量或多次剂量、在单一疗法或联合疗法中施用给个体时，能有效地使观察到受试者中肿瘤缩小所需的放射疗法剂量与在不存在该化合物的治疗的情况下观察到个体中肿瘤缩小所需的放射疗法的剂量相比较，降低约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。
[0398]
在一些实施方案中，化合物的“治疗有效量”是当以一次剂量或多次剂量施用给患有癌症的个体时能有效地实现1.5
‑
log、2
‑
log、2.5
‑
log、3
‑
log、3.5
‑
log、4
‑
log、4.5
‑
log或
5
‑
log的肿瘤尺寸减少的量。
[0399]
在一些实施方案中，化合物的有效量是范围为约50ng/ml至约50μg/ml(如约50ng/ml至约40μg/ml、约30ng/ml至约20μg/ml、约50ng/ml至约10μg/ml、约50ng/ml至约1μg/ml、约50ng/ml至约800ng/ml、约50ng/ml至约700ng/ml、约50ng/ml至约600ng/ml、约50ng/ml至约500ng/ml、约50ng/ml至约400ng/ml、约60ng/ml至约400ng/ml、约70ng/ml至约300ng/ml、约60ng/ml至约100ng/ml、约65ng/ml至约85ng/ml、约70ng/ml至约90ng/ml、约200ng/ml至约900ng/ml、约200ng/ml至约800ng/ml、约200ng/ml至约700ng/ml、约200ng/ml至约600ng/ml、约200ng/ml至约500ng/ml、约200ng/ml至约400ng/ml或约200ng/ml至约300ng/ml)的量。
[0400]
在一些实施方案中，化合物的有效量是范围为约10pg至约100mg，例如约10pg至约50pg、约50pg至约150pg、约150pg至约250pg、约250pg至约500pg、约500pg至约750pg、约750pg至约1ng、约1ng至约10ng、约10ng至约50ng、约50ng至约150ng、约150ng至约250ng、约250ng至约500ng、约500ng至约750ng、约750ng至约1μg、约1μg至约10μg、约10μg至约50μg、约50μg至约150μg、约150μg至约250μg、约250μg至约500μg、约500μg至约750μg、约750μg至约1mg、约1mg至约50mg、约1mg至约100mg，或约50mg至约100mg的量。该量可以是单次剂量的量或者可以是每日总量。每日总量可在10pg至100mg的范围内，或可在100mg至约500mg的范围内，或可在500mg至约1000mg的范围内。
[0401]
在一些实施方案中，施用单次剂量的化合物。在其他实施方案中，施用多次剂量。在一段时间内施用多次剂量的情况下，该化合物可以在一段时间内每天两次(qid)、每天(qd)、每隔一天(qod)、每三天、每周三次(tiw)或每周两次(biw)施用。例如，在从一天至约2年或更长的时间内按qid、qd、qod、tiw或biw施用化合物。例如，根据各种因素，以上述频率中的任一种来施用化合物一周、两周、一个月、两个月、六个月、一年或两年或更长时间。
[0402]
对患有癌症的个体施用治疗有效量的主题化合物可导致以下中的一种或多种：1)肿瘤负荷减小；2)实现肿瘤缩小所需的放射疗法剂量减小；3)个体中癌症从一个细胞到另一个细胞的扩散的减少；4)临床结果的发病率或死亡率降低；5)当与其他抗癌剂联合使用时治疗的总时间缩短；以及6)疾病响应指标的改善(例如，癌症的一种或多种症状减少)。可以使用多种方法中的任一种来确定治疗方法是否有效。例如，可以对从已经用主题方法治疗的个体获取的生物样品进行测定。
[0403]
本文所述的任何化合物均可用于主题治疗方法中。在某些例子中，所述化合物是式(i)
‑
(xvb)中的一种(例如，如本文所述)。在某些情况下，化合物是表1
‑
3中的化合物之一或其前药形式。在一些情况下，在主题方法中使用的化合物不是细胞可渗透的。在一些情况下，用于主题方法中的所述化合物具有较差的细胞渗透性。
[0404]
在一些实施方案中，该化合物特异性地抑制enpp1。在一些实施方案中，该化合物调节cgamp的活性。在一些实施方案中，该化合物干扰enpp1和cgamp的相互作用。在一些实施方案中，该化合物导致sting途径的激活。
[0405]
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些例子中，受试者是人类。其他受试者可以包括家养宠物(如，狗和猫)、牲畜(如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(如，小鼠、豚鼠和大鼠，例如，如在动物疾病模型中)，以及非人灵长类动物(如，黑猩猩和猴子)。受试者可能需要治疗癌症。在一些例子中，主题方法包括诊断包括本文所述的任一种癌症在内的癌
症。在一些实施方案中，所述化合物作为药物制品施用。
[0406]
在某些实施方案中，enpp1抑制剂化合物是包含标记的经修饰化合物，并且该方法还包括检测受试者中的标记。标记的选择取决于检测手段。任何方便的标记和检测系统都可用于主题方法中，参见如，baker,“the whole picture,”nature,463,2010,第977
‑
980页。在某些实施方案中，该化合物包含适用于光学检测的荧光标记。在某些实施方案中，该化合物包含放射性标记，以便使用正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)进行检测。在一些情况下，该化合物包含适合于进行断层扫描检测的顺磁性标记。如上所述，主题化合物可被标记，但是在一些方法中，该化合物未被标记并且第二标记剂被用于成像。
[0407]
组合疗法
[0408]
主题化合物可以单独地或与另外的活性剂，即第二活性剂组合施用给受试者。组合治疗方法，其中主题enpp1抑制剂化合物可与第二活性剂或另外疗法(如，放射疗法)组合使用。术语"剂"、"化合物"和"药物"在本文中可互换使用。例如，enpp1抑制剂化合物可以单独施用或与一种或多种其他药物，诸如用于治疗目标疾病(包括但不限于免疫调节性疾病和疾患以及癌症)的药物联合施用。在一些实施方案中，主题方法还包括伴随地或依序地共施用第二剂，如小分子、化学治疗剂、抗体、抗体片段、抗体
‑
药物缀合物、适体、蛋白或检查点抑制剂。在一些实施方案中，该方法还包括对受试者执行放射疗法。
[0409]
术语"共施用"和"与......组合"包括同时、同一时期或无特定时限地依序施用两种或更多种治疗剂。在一个实施方案中，所述剂同时存在于细胞中或受试者身体内，或同时发挥其生物学或治疗作用。在一个实施方案中，治疗剂在同一组合物或单位剂型中。在其他实施方案中，治疗剂在单独的组合物或单位剂型中。在某些实施方案中，可以在施用第二治疗剂之前(例如在施用第二治疗剂之前分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、与第二治疗剂的施用伴随地，或继施用第二治疗剂之后(例如施用第二治疗剂之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一剂。
[0410]
已知治疗药物或另外疗法与本公开的药物组合物的"伴随施用"意指将所述化合物和第二剂或另外疗法在使得已知药物和本发明组合物都将具有治疗效果的时间施用。就主题化合物的施用而言，此类伴随施用可涉及同一时期(即在同一时间)、之前或之后施用所述药物。该两种剂的施用途径可变化，其中下面将更详细地描述代表性施用途径。对于本公开的特定药物或疗法和化合物，本领域普通技术人员将不难确定适当的施用时间安排、施用顺序和施用剂量。
[0411]
在一些实施方案中，所述化合物(如，主题化合物和至少一种另外的化合物或疗法)在彼此的二十四小时内，诸如在彼此的12小时内、在彼此的6小时、在彼此的3小时内或在彼此的1小时内施用给受试者。在某些实施方案中，所述化合物在彼此的1小时内施用。在某些实施方案中，所述化合物基本上同时施用。基本上同时施用意指在彼此的约10分钟或更短时间，诸如彼此的5分钟或更短时间，或1分钟或更短时间内将化合物施用给受试者。
[0412]
还提供了主题化合物和第二活性剂的药物制品。在药物剂型中，所述化合物可以以其药学上可接受的盐的形式施用，或者它们也可以单独地使用或者与其它药物活性化合
物适当结合地施用，也可以与其它药物活性化合物组合使用。
[0413]
结合任何主题方法，可将enpp1抑制剂化合物(如，如本文所述)(或包含此类化合物的药物组合物)与经设计用于减轻或预防炎症、治疗或预防慢性炎症或纤维化或者治疗癌症的另一种药物组合施用。在每种情况下，enpp1抑制剂化合物可在其他药物施用之前、同时或之后施用。在某些情况下，癌症选自肾上腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、食道癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(小细胞癌和非小细胞癌二者)、甲状腺癌、恶性上皮肿瘤(carcinomas)、肉瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤和各种头颈肿瘤。
[0414]
为了治疗癌症，enpp1抑制剂化合物可以与选自由以下组成的组的化学治疗剂组合施用：烷基化剂、亚硝基脲、抗代谢物、肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱、类固醇激素、紫杉烷、核苷类似物、类固醇、蒽环类、甲状腺激素替代药物、胸苷酸靶向药物、嵌合抗原受体/t细胞疗法、嵌合抗原受体/nk细胞疗法、细胞凋亡调节剂抑制剂(如，b细胞cll/淋巴瘤2(bcl
‑
2)bcl
‑2‑
类1(bcl
‑
xl)抑制剂)、carp
‑
1/ccar1(细胞分裂周期和细胞凋亡调节剂1)抑制剂、集落刺激因子
‑
1受体(csf1r)抑制剂、cd47抑制剂、癌症疫苗(如，th17
‑
诱导的树突细胞疫苗或经遗传修饰的酪氨酸酶诸如)和其他细胞疗法。
[0415]
具体的目标化学治疗剂包括但不限于吉西他滨、多西他赛、博来霉素、厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、克里唑替尼、赛瑞替尼、曲美替尼、贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼、曲妥珠单抗、阿多
‑
曲妥珠单抗美坦新(ado
‑
trastuzumab emtansine)、利妥昔单抗、伊匹单抗、雷帕霉素、西罗莫司、依维莫司、甲氨蝶呤、多柔比星、abraxane、氟西林(folfirinox)、顺铂、卡铂、5
‑
氟尿嘧啶、teysumo、紫杉醇、强的松、左旋甲状腺素、培美曲塞、纳曲妥(navitoclax)和abt
‑
199。也可以使用肽类化合物。目标癌症化学治疗剂包括但不限于多拉司他汀(dolastatin)及其活性类似物和衍生物；以及澳瑞他汀(auristatin)及其活性类似物和衍生物(如单甲基澳瑞他汀d(mmad)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)等)。参见，如wo 96/33212、wo 96/14856和u.s.6,323,315。适合的癌症化学治疗剂还包括美登木素生物碱及其活性类似物和衍生物(参见如ep 1391213；和liu等人(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:8618
‑
8623)；倍癌霉素及其活性类似物和衍生物(例如包括合成类似物，kw
‑
2189和cb 1
‑
tm1)；以及苯并二氮杂及其活性类似物和衍生物(如吡咯并苯并二氮杂(pbd)。
[0416]
在一些实施方案中，enpp1抑制剂化合物可与化学治疗剂组合施用以治疗癌症。在某些情况下，化学治疗剂是吉西他滨。在一些情况下，化学治疗剂是多西他赛。在一些情况下，化学治疗剂是abraxane。
[0417]
为了治疗癌症(如，实体瘤癌症)，enpp1抑制剂化合物可以与免疫治疗剂组合施用。免疫治疗剂是通过诱导、增强或遏制免疫响应而用于治疗疾病的任何方便的剂。在一些情况下，免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂。例如，图21a
‑
4c示出了示例性enpp1抑制剂可以与免疫检查点抑制剂在小鼠模型中协同起作用。可以使用任何方便的检查点抑制剂，包括但不限于细胞毒性t
‑
淋巴细胞
‑
相关抗原4(ctla
‑
4)抑制剂、程序性死亡1(pd
‑
1)抑制剂和pd
‑
l1抑制剂。在某些例子中，检查点抑制剂选自细胞毒性t
‑
淋巴细胞
–
相关抗原4(ctla
‑
4)抑制剂、程序性死亡1(pd
‑
1)抑制剂和pd
‑
l1抑制剂。示例性目标检查点抑制剂包括但不限
于伊匹单抗、派姆单抗和纳武单抗。在某些实施方案中，为了治疗癌症和/或炎性疾病，可以将一种或多种免疫调节多肽与集落刺激因子
‑
1受体(csf1r)抑制剂组合施用。目标csf1r抑制剂包括但不限于尹克妥珠单抗(emactuzumab)。
[0418]
任何方便的癌症疫苗疗法和剂可以与主题enpp1抑制剂化合物、组合物和方法组合使用。为了治疗癌症(如卵巢癌)，可以将enpp1抑制剂化合物与疫苗疗法(例如促进th1/th17免疫的树突细胞(dc)疫苗接种剂)组合施用。th17细胞浸润与卵巢癌患者的总存活期显著延长有关。在一些情况下，enpp1抑制剂化合物可与th17
‑
诱导的疫苗接种组合用作辅助治疗。
[0419]
还令人感兴趣的是作为carp
‑
1/ccari(细胞分裂周期和细胞凋亡调节剂1)抑制剂的剂，包括但不限于由rishi等人,journal of biomedical nanotechnology,第11卷,第9期,2015年9月,第1608
‑
1627(20)页所述的那些和cd47抑制剂(包括但不限于抗cd47抗体剂诸如hu5f9
‑
g4)。
[0420]
在某些例子中，所述组合相对于单独的任一种组分提供增强的作用；在一些情况下，所述组合相对于各组分的组合或加和作用而提供超加或协同作用。可以采用依序或同时使用的主题化合物和化学治疗剂的多种组合。对于多次投药，例如，两种剂可以直接交替，或者一种剂的两次剂量或更多次剂量可以与另一种剂的单次剂量交替。这两种剂的同时施用也可以与单种剂的投药交替或者以另外的方式与单种剂的投药穿插在一起。在一些情况下，介于两次投药之间的时间可以是开始治疗之后从约1
‑
6小时至约6
‑
12小时、至约12
‑
24小时、至约1
‑
2天、至约1
‑
2周或更长时间的时间段。
[0421]
与诱导cgamp的化学治疗的组合
[0422]
本公开的方面包括治疗癌症的方法，其中enpp1抑制剂化合物(或包含此类化合物的药物组合物)可以与能够在体内诱导产生cgamp的化学治疗剂组合施用。当受试者暴露于有效量的特定化学治疗剂时，可以诱导受试者中产生2
’3’‑
cgamp。当共施用主题enpp1抑制剂化合物以预防cgamp降解时，cgamp的诱导水平可以得到维持和/或增强，例如与单独使用任何一种剂所达到的水平相比得到增强。可因修复或降解机制不堪重负而导致dna损伤并诱导垂死细胞产生cgamp的任何方便的化学治疗剂均可用于主题组合治疗方法中，诸如烷基化剂、核酸类似物和嵌入剂。在一些情况下，诱导cgamp的化学治疗剂是抗
‑
有丝分裂剂。抗
‑
有丝分裂剂是通过损伤dna或结合至微管而起作用的剂。在一些情况下，诱导cgamp的化学治疗剂是抗肿瘤剂。
[0423]
可以使用主题组合疗法治疗的目标癌症包括但不限于肾上腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、食道癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(小细胞癌和非小细胞癌二者)、甲状腺癌、恶性上皮肿瘤、肉瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤和各种头颈肿瘤。在一些情况下，癌症是乳腺癌。在某些例子中，癌症是胶质瘤或胶质母细胞瘤。
[0424]
目标化学治疗剂包括但不限于尿嘧啶类似物、氟尿嘧啶前药、胸苷酸合酶抑制剂、脱氧胞苷类似物、dna合成抑制剂(如导致s期细胞凋亡)、叶酸类似物、脱氢叶酸还原酶抑制剂、蒽环霉素、嵌入剂(如导致双链断裂)、拓扑异构酶iia抑制剂、紫杉烷、微管拆卸抑制剂(如导致g2/m期阻滞/细胞凋亡)、微管组装抑制剂、微管功能稳定剂(如导致g2/m
‑
期细胞凋亡)、微管蛋白聚合促进剂、微管蛋白结合剂(如导致由m
‑
期阻滞导致的细胞凋亡)、埃博霉
素b类似物、长春花生物碱、氮芥、亚硝基脲、dna烷基化剂(如导致链间交联，经由p53的细胞凋亡)、vegf抑制剂、抗血管生成抗体、her2抑制剂、喹唑啉her2抑制剂、egfr抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、西罗莫司类似物、mtorc1抑制剂(如在乳腺癌中与依西美坦＝抑制雌激素产生的芳香化酶抑制剂组合)、三氮烯、达卡巴嗪前药、甲基肼。
[0425]
示例性目标乳腺癌化学治疗剂包括但不限于卡培他滨、卡莫氟、氟尿嘧啶、替加氟、吉西他滨、甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、多西他赛、伊沙匹隆、长春地辛、长春瑞滨、环磷酰胺、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、拉帕替尼和依维莫司。示例性胶质瘤/胶质母细胞瘤相关的抗肿瘤药包括但不限于卡莫斯汀、洛莫斯汀、替莫唑胺、丙卡巴肼、长春新碱和贝伐单抗。示例性目标dna损伤化学治疗剂包括但不限于美法仑、顺铂和依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨。
[0426]
组合放射疗法
[0427]
可替代地，对于治疗癌症的方法，可以将enpp1抑制剂化合物(或包含此类化合物的药物组合物)与放射疗法组合施用。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用放射疗法。同样，可以在放射疗法施用之前或之后施用enpp1抑制剂化合物。因此，主题方法还可以包括向受试者施用放射疗法。放射疗法和主题化合物施用的组合可以提供协同治疗作用。当受试者在放射疗法(rt)期间暴露于适合的剂量和/或频率的放射中时，2
’3’‑
cgamp的产生可以在受试者中被诱导。当共同施用主题enpp1抑制剂化合物以防止cgamp降解时，这些诱导的cgamp水平可以得到维持和/或增强，例如与仅使用rt达到的水平相比得到增强。例如，图21a示出了示例性enpp1抑制剂可以与放射疗法(rt)协同地起到减少小鼠模型中的肿瘤负荷的作用。因此，与单独的放射疗法的治疗有效的剂量和/或频率/疗程(regimen)相比，主题方法的方面包括施用减少的剂量和/或频率/疗程的放射疗法。在一些情况下，放射疗法与主题化合物组合以有效降低对受试者的放射损伤(例如，将预期在治疗有效的剂量和/或频率/疗程的单独放射疗法下发生的放射损伤)的剂量和/或频率施用。
[0428]
在一些情况下，所述方法包括在放射疗法之前向受试者施用enpp1抑制剂。在一些情况下，所述方法包括在使受试者暴露于放射疗法后向受试者施用enpp1抑制剂。在某些情况下，所述方法包括向有需要的受试者依序施用放射疗法，然后施用enpp1抑制剂，然后施用检查点抑制剂。
[0429]
实用性
[0430]
例如，如本文所述的本发明的化合物和方法可用于多种应用中。目标应用包括但不限于：研究应用和治疗应用。本发明的方法可用于包括需要抑制enpp1的任何方便的应用在内的各种不同的应用中。
[0431]
主题化合物和方法可用于多种研究应用中。主题化合物和方法可用于优化化合物的生物利用度和代谢稳定性。
[0432]
主题化合物和方法可用于多种治疗应用中。目标治疗应用包括在癌症治疗中的那些应用。因此，主题化合物可用于治疗需要抑制和/或治疗宿主中的癌症的多种不同的疾患。例如，主题化合物和方法可用于治疗实体瘤癌症(如，如本文所述)。
[0433]
药物组合物
[0434]
本文讨论的化合物可以使用任何方便的赋形剂、试剂和方法进行配制。提供了与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配置的组合物。各种各样的药学上可接受的赋形剂
在本领域中是已知的，并无需在本文中详细讨论。药学上可接受的赋形剂已经在许多出版物中得到了充分的描述，所述出版物包括，例如a.gennaro(2000)“remington:the science and practice of pharmacy,”第20版,lippincott,williams,&wilkins；pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems(1999)h.c.ansel等人编辑,第7版,lippincott,williams,&wilkins；以及handbook of pharmaceutical excipients(2000)a.h.kibbe等人编辑,第3版amer.pharmaceutical assoc。
[0435]
药学上可接受的赋形剂诸如媒介物、佐剂、载体或稀释剂是公众容易获得的。此外，药学上可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等是公众容易获得的。
[0436]
在一些实施方案中，主题化合物在水性缓冲液中配制。适合的水性缓冲液包括但不限于醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液，其强度范围为5mm至100mm。在一些实施方案中，水性缓冲液包括提供等渗溶液的试剂。此类试剂包括但不限于氯化钠；以及糖，如甘露糖醇、右旋糖、蔗糖等。在一些实施方案中，水性缓冲液还包含非离子表面活性剂诸如聚山梨酯酯20或80。任选地，制剂还可以包含防腐剂。适合的防腐剂包括但不限于苄基醇、苯酚、氯丁醇、苯扎氯铵等。在许多情况下，该制剂储存在约4℃下。该制剂也可以被冻干，在这种情况下它们通常包含冷冻保护剂，诸如蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖醇等。冻干制剂即使在环境温度下也可以储存很长一段时间。在一些实施方案中，主题化合物被配制为持续释放。
[0437]
在一些实施方案中，将主题化合物和第二活性剂(如，如本文所述)，如小分子、化学治疗剂、抗体、抗体片段、抗体
‑
药物缀合物、适体或蛋白质等以含一种或多种药学上可接受的赋形剂的制剂的形式(如，以同一制剂或分开的制剂的形式)施用给个体。在一些实施方案中，第二活性剂是检查点抑制剂，例如，细胞毒性t淋巴细胞
‑
相关抗原4(ctla
‑
4)抑制剂、程序性死亡1(pd
‑
1)抑制剂或pd
‑
l1抑制剂。
[0438]
在本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含以下或基本上由以下组成：本发明的化合物，或其药学上可接受的盐、异构体、互变异构体或前药，并且还包含一种或多种另外的目标活性剂。任何方便的活性剂均可与主题化合物组合用于主题方法中。在一些例子中，另外的剂是检查点抑制剂。主题化合物和检查点抑制剂，以及如本文所述的用于组合疗法的另外治疗剂可以经口、皮下、肌肉内、鼻内、肠胃外或其他途径施用。主题化合物和第二活性剂(如果存在)可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。治疗剂可以通过任何适合的方式施用，所述方式包括但不限于例如经口施用、经直肠施用、经鼻施用、局部(包括经皮、气雾剂、经颊和舌下)施用、经阴道施用、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用、膀胱内施用或注射至受累器官中。在某些情况下，可以鼻内施用治疗剂。在一些情况下，可以肿瘤内施用治疗剂。
[0439]
在一些实施方案中，将主题化合物和化学治疗剂与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起以制剂的形式(例如，以同一制剂或分开的制剂的形式)施用给个体。化学治疗剂包括但不限于烷基化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。也可以使用肽类化合物。适合的癌症化学治疗剂包括多拉司他汀及其活性类似物和衍生物；以及澳瑞他汀及其活性类似物和衍生物(如，单甲基澳瑞他汀d(mmad)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)、单甲基澳瑞他汀f(mmaf)等)。参见，例如，wo 96/33212、wo 96/14856和
u.s.6,323,315。适合的癌症化学治疗剂还包括美登木素生物碱及其活性类似物和衍生物(参见，例如，ep 1391213；和liu等人(1996)proc.natl.acad.sci.usa 93:8618
‑
8623)；倍癌霉素及其活性类似物和衍生物(如，包括合成类似物，kw
‑
2189和cb 1
‑
tm1)；以及苯并二氮杂及其活性类似物和衍生物(如，吡咯并苯并二氮杂(pbd)。
[0440]
主题化合物和第二化学治疗剂以及如本文所述的用于组合疗法的另外治疗剂可以经口、皮下、肌肉内、肠胃外或其他途径施用。主题化合物和第二化学治疗剂可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。治疗剂可以通过任何适合的方式施用，所述方式包括但不限于例如经口施用、经直肠施用、经鼻施用、局部(包括经皮、气雾剂、经颊和舌下)施用、经阴道施用、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用、膀胱内施用或注射至受累器官中。
[0441]
主题化合物可以以单位剂型施用并且可以通过本领域公知的任何方法制备。此类方法包括将主题化合物与构成一种或多种辅助成分的药学上可接受的载体或稀释剂组合在一起。根据所选的施用途径和标准制药实践选择药学上可接受的载体。在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上，每个载体必须是"药学上可接受的"。该载体可以是固体或液体，并且通常基于所使用的施用类型来选择类型。
[0442]
适合的固体载体的实例包括乳糖、蔗糖、明胶、琼脂和松散粉末。适合的液体载体的实例包括水、药学上可接受的脂肪和油、醇或包括酯在内的其他有机溶剂、乳液、糖浆剂或酏剂、悬浮液、溶液和/或悬浮液，以及由非泡腾颗粒复溶的溶液或悬浮液，及从泡腾颗粒复溶的泡腾制品。此类液体载体可以含有例如适合的溶剂、防腐剂、乳化剂、助悬剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和熔融剂。优选的载体是食用油，例如玉米油或芥花油。聚乙二醇，如peg也是很好的载体。
[0443]
可以使用提供本公开的给药方案的任何药物递送设备或系统。多种递送设备和系统是本领域技术人员已知的。
实施例
[0444]
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何制作和使用本公开的实施方案的完整公开和描述，并且无意于限制发明人视为他们的发明的范围，也不打算表示以下实验是进行的全部实验或仅有的实验。已经尽力确保所使用的数字(如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指定，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。
[0445]
尽管已经参考本发明的特定实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等效物。另外，可以作出许多修改以使特定情形、材料、物质组成、工艺、一个工艺步骤或多个工艺步骤适应于本公开的目的、精神和范围。所有此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
[0446]
实施例1：化合物的合成
[0447]
可以使用任何方便的方法合成化合物。可适用于制备本公开的化合物的方法包括实施例1a
‑
1c中描述的示例性合成方法，以及li等人在2018年9月7日提交的pct申请号pct/us2018/050018中描述的那些方法，其公开内容通过引用整体并入本文。许多提供公知化学合成方案和可用于合成所公开化合物的条件的一般参考文献也是可用的(参见例如，smith
和march,march's advanced organic chemistry：reactions,mechanisms,and structure,fifth edition,wiley
‑
interscience,2001；或vogel,a textbook of practical organic chemistry,including qualitative organic analysis,fourth edition,new york：longman,1978)。反应可以通过薄层色谱法(tlc)、lc/ms和由lc/ms和1h nmr表征的反应产物进行监测。中间体和最终产物可以通过硅胶色谱法或通过hplc纯化。
[0448]
实施例1a：化合物1的示例性合成方案
[0449]
化合物1(其可适用于制备本公开化合物)的合成如下所示：
[0450][0451]
(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯的制备
[0452][0453]
在室温下，将氢化钠(2.16g,54.11mmol)小心地加入到搅拌下的双(二甲氧基磷酰基)甲烷(11.42g,49.19mmol)的甲苯(100ml)溶液中。然后将反应混合物置于氮气氛下，并缓慢加入1
‑
苄基哌啶
‑4‑
甲醛(10g,49.19mmol)的甲苯(50ml)溶液，保持温度低于40℃。将所得混合物在室温下搅拌16小时，然后通过加入饱和的氯化铵水溶液淬灭。分离有机相，用盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发至干。色谱法(120g sio2；5至100％梯度的etoac的己烷溶液)处理，得到(e)
‑
(2
‑
(1
‑
苄基哌啶
‑4‑
基)乙烯基)膦酸二甲酯(6.2g,16％)，为无色油状物。
[0454]
向(e)
‑
(2
‑
(1
‑
苄基哌啶
‑4‑
基)乙烯基)膦酸二甲酯(3.7g,12.0mmol)在乙醇(40ml)中的混合物中加入pd/c(1.1g,10.3mmol)。将混合物置于氢气气氛下并在室温下搅拌12小时，过滤并减压蒸发至干，得到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯(2.7g,100％)，为无色油状物。
[0455]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯的制备
[0456][0457]
将二异丙基乙胺(0.6g,8.9mmol)加入到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯(1.1g,4.9mmol)和4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉(1.0g,4.5mmol)在异丙醇(20ml)中的混合物中。在90℃搅拌3小时后，将反应混合物冷却并蒸发至干。进行硅胶(5％meoh的二氯甲烷溶液)纯化，得到(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯(755mg,37％)，为油状物。
[0458]
lc
‑
ms：m/z＝410.25[m h]

[0459]1h nmr(500mhz,cdcl3)δ8.65(s,1h),7.23(s,1h),7.09(s,1h),4.19(dq,j＝14.0,2.9,2.4hz,2h),4.02(s,3h),3.99(s,3h),3.77(s,3h),3.75(s,3h),3.05(td,j＝12.8,2.3hz,2h),1.93
–
1.77(m,4h),1.67(ddd,j＝14.1,9.5,5.9hz,3h),1.46(qd,j＝12.2,3.7hz,2h).
[0460]
二甲基(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸(化合物1)的制备
[0461][0462]
将溴代三甲基硅烷(3.67g,24mmol)加入到冷却下的(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯(3.25g,7.94mmol)的氯仿(60ml)(其通过冰浴冷却)溶液中。使反应混合物温热至室温，90分钟后加入甲醇(20ml)淬灭。在减压下将混合物蒸发至干，然后在甲醇(100ml)中溶剂化。将反应混合物浓缩至一半体积，过滤除去沉淀物，然后蒸发至干。将残余物用二氯甲烷结晶，过滤并真空干燥，得到二甲基(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸(2.1g,69％)。
[0463]
lc
‑
ms：m/z＝381.8[m h]

[0464]1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.77(s,1h),7.34(s,1h),7.23(s,1h),4.71(d,j＝13.1hz,2h),3.99(s,3h),3.97(s,3h),3.48(t,j＝12.7hz,2h),3.18(s,1h),1.97
–
1.90(m,2h),1.62
–
1.43(m,4h),1.40
–
1.27(m,2h).
[0465]
实施例1b：化合物5(表1)的合成
[0466]
下面列出的合成方案用于制备化合物5：
[0467][0468][0469]
实施例1c：化合物6(表1)的合成
[0470]
下面列出的合成方案用于制备化合物6：
[0471][0472]
化学合成：除非另有说明，反应均在环境气氛下进行。对250mm厚、玻璃背衬的f254二氧化硅(silicycle,quebec city,canada)进行定性tlc分析。可视化是使用紫外线并暴露于对茴香醛或kmno4染色溶液然后加热来完成的。使用的所有溶剂均为acs级
sure
‑
seal，除非另有说明，否则所有其他试剂均按原样使用。补充信息中描述了非市售的4
‑
氯喹唑啉和4
‑
氯
‑3‑
喹啉腈以及胺结构单元的合成。使用硅胶快速柱(siliasep
tm
40
‑
63mm,)在teledyne isco纯化系统上进行快速色谱法处理。使用agilent prepht zorbax eclipse xdb
‑
c18反相色谱柱(21.2
×
250mm)在agilent 1260infinity制备型规模的纯化系统上进行hplc。使用在bruker av
‑
500光谱仪上记录的1h光谱和在shimadzu 20
‑
20esi lcms仪器上收集的低分辨率质谱(esi
‑
ms)进行结构测定。使用在bruker av
‑
500或av
‑
400光谱仪上记录的1h光谱和在shimadzu 20
‑
20esi lcms仪器上收集的低分辨率质谱(esi
‑
ms)进行结构测定。根据hplc
‑
ms测定最终化合物纯度>95％。所有最终的化合物1h光谱都与预期的结构一致。
[0473]
脲4和5的合成。
[0474][0475]
a)dipea，i
‑
proh.
[0476]1‑
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)脲4(在表3a中)的制备
[0477]
在氮气气氛下，向1
‑
(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)脲64(173mg,1.01mmol)的异丙醇(5ml)溶液中加入4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉63(181mg,0.81mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(391mg,3.03mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后减压蒸发至干。纯化(制备型hplc)，得到标题化合物4(172mg,47％)，为淡黄色晶体。
[0478]
lcms：[m h]

m/z 360.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.49(s,1h),7.17(s,1h),7.07(s,1h),5.92
–
5.90(m,1h),5.36(br s,2h),4.13
–
4.09(m,2h),3.90(s,3h),3.88(s,3h),3.04
–
2.94(m,4h),1.81
–
1.78(m,2h),1.62
–
1.56(m,1h)和1.38
–
1.33(m,4h).
[0479]1‑
((1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)脲5(在表3a中)的制备
[0480]
在氮气气氛下，向1
‑
(哌啶
‑4‑
基甲基)脲65(155mg,0.97mmol)的异丙醇(10ml)溶液中加入4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉63(174mg,0.78mmol)和n,n
‑
二异丙基乙胺(394mg,2.9mmol)。将混合物在10℃搅拌3小时，然后减压蒸发至干。色谱法(sio2：0至6％meoh的二氯甲烷溶液)处理，得到所需的产物5(150mg,44％)，为白色固体。
[0481]
lcms：[m h]

m/z 346.0 1
h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.44(s,1h),7.14(s,1h),7.12(s,1h),4.28
–
4.24(m,2h),3.96(s,3h),3.94(s,3h),3.13
–
3.07(m,4h),1.94
–
1.87(m,3h)和1.50
–
1.41(m,2h).
[0482]3‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)丙酸6(在表3a中)的制备
[0483][0484]
将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
喹唑啉63(3.14g,13.98mmol)和3
‑
(4
‑
哌啶基)丙酸(2.0g,12.72mmol)悬浮于异丙醇(100ml)中，并于90℃搅拌3小时。一旦冷却，将混合物在减压下蒸发至干。然后将残余物与ch2cl2(20ml)一起研磨，得到标题化合物6(1.87g,42％)，为白色固体。
[0485]1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ
[0486]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)硼酸7(在表3a中)的制备
[0487]
a)cp2zrcl2，phme60℃；b)pd/c，h2，meoh；c)hci(aq)，meoh/己烷；；d)63，diea，thf80℃.
[0488]
将4
‑
乙炔基哌啶
‑1‑
甲酸叔丁酯66(2.92g,13.95mmol)、双(环戊二烯基)氯化锆氢化物(150mg,0.518mmol)和4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷67(1.49g,11.63mmol)在溶剂中的溶液于60℃搅拌16小时，然后用乙醚稀释并减压蒸发至干。色谱法(sio2；2
–
5％乙酸乙酯的石油醚溶液)处理，得到68(4.2g,89％)。将(e)
‑4‑
(2
‑
(4,4,5,5
‑
四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷
‑2‑
基)乙烯基)哌啶
‑1‑
甲酸叔丁酯68(4.2g,12.46mmol)和钯/碳(840mg,20％w/w)在meoh(500ml)中的混合物置于氢气气氛中，并在室温下搅拌16小时。然后将混合物通过垫过滤，然后在减压下蒸发至干，得到69(4.2g,92％)。将1m hcl水溶液(4ml)添加到冷却(0℃)的73(460mg,1.36mmol)在meoh/己烷(5ml/5ml)中的混合物中。将混合物温热至室温并搅拌3小时，然后减压蒸发至干，得到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)硼酸70(180mg,68％)，为盐酸盐。向70(140mg,1.04mmol)的thf(5ml)溶液中加入4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉63(180mg,0.935mmol)，随后加入n,n
‑
二异丙基乙胺(360mg,1.87mmol)。将混合物在80℃搅拌16小时，然后减压蒸发至干。纯化(制备型hplc)处理，得到标题化合物，为淡黄色固体(105mg；37％)。
[0489]
lcms：[m h]

m/z 346.3.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.67(s,1h),7.26(s,1h),7.25(s,1h),4.62
–
4.59(m,2h),3.92(s,3h),3.90(s,3h),3.42
–
3.36(m,4h),2.46(s,1h),1.88
–
1.86(m,2h),1.29
–
1.14(m,3h)和0.60
–
0.56(m,2h).
[0490]
异羟肟酸8和9的制备
[0491][0492]
a)63,i
‑
proh,100℃；b)naoh,thf,h20；c)nh2oh.hci,dipea,bop,thf.
[0493]2‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)
‑
n
‑
羟基乙酰胺8(在表3a中)的制备
[0494]
将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉63(600mg,2.68mmol)和2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙酸乙酯71(504mg,2.95mmol)在i
‑
proh(6ml)中的混合物在密封管中于100℃搅拌16小时。然后减压浓缩反应混合物，将残余物通过硅胶色谱法纯化，得到2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙酸乙酯(750mg,77％)。将2m naoh的h2o(1ml)溶液加入到2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙酸乙酯(250mg,0.696mmol)在thf(10ml)中的混合物中。将该混合物在室温下搅拌16小时，并然后通过加入1m hcl溶液淬灭。将有机相用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干，得到酸72(200mg,86％)，为白色固体。
[0495]
向酸72(300mg，0.906mmol)在thf(10ml)中的混合物中加入nh2oh
·
hcl(76mg，1.09mmol)、diea(468mg，3.63mmol)和(苯并三唑
‑1‑
基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(bop)(481mg，1.09mmol)。将该混合物在室温下搅拌16小时，并然后用水稀释，用乙酸乙酯萃取，用盐水溶液洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2，溶剂)处理，得到标题产物8(180mg，77％)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 347.10.1h nmr(400mhz，d2o)δ8.42(s，1h)，7.13(s，1h)，7.00(s，1h)，4.68
‑
4.62(m，2h)，3.95(s，3h)，3.91(s，3h)，3.51
‑
3.45(m，2h)，2.21
‑
2.15(m，3h)，1.93
‑
1.0(m，2h)和1.45
‑
1.36(m，2h).
[0496]1‑
(6，7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)
‑
n
‑
羟基哌啶
‑4‑
甲酰胺9(在表3a中)的制备.
[0497]
根据8的操作但使用哌啶
‑4‑
甲酸乙酯73来合成。
[0498]
lcms：[m h]

m/z 333.25.1h nmr(400mhz，d2o)δ8.39(s，1h)，7.04(s，1h)，6.94(s，1h)，4.62
‑
4.58(m，2h)，3.91(s，3h)，3.86(s，3h)，3.47
‑
3.41(m，2h)，2.65
‑
2.60(m，1h)，1.97
‑
1.94(m，2h)和1.82
‑
1.77(m，2h).
[0499]
用于化合物10、11、12、13和16(在表3a中)的通用操作。
[0500][0501]
a)i
‑
proh，100℃；b)
吡啶
，pscl3然后h2o；或c)
吡啶
，pocl3，
然后
h2o；d)pph
3，
i2，
咪唑
，ch2cl2；e)po(obn)
2，
[0502]
dbu，mecn；f)pd/c，h2，meoh.
[0503]2‑
(1
‑
(6，7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙
‑1‑
醇77的制备
[0504]
将4
‑
氯
‑
6，7
‑
二甲氧基喹唑啉63(1.0g，4.46mmol)和哌啶
‑4‑
基乙醇79(633mg，4.91mmol)在异丙醇(10ml)中的混合物在密封管中在100℃下搅拌16小时。冷却后，将反应混合物减压浓缩，并将残余物通过硅胶色谱法(sio2；etoac的石油醚溶液)纯化，得到2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙
‑1‑
醇75(1.3g,91％)。
[0505]
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲醇78的制备
[0506]
将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉63(900mg,4.02mmol)和哌啶
‑4‑
基甲醇76(508mg,4.42mmol)在i
‑
proh(10ml)中的混合物在密封管中在100℃下搅拌16小时。冷却后，将反应混合物减压蒸发至干。通过色谱法(sio2；10至80％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化，得到(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲醇78(1g,82％)。
[0507]
磷酸二氢2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基酯10(在表3a中)的制备
[0508]
将2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙
‑1‑
醇77(340mg,1.07mmol)溶于10ml无水吡啶中，然后将其冷却至
–
15℃，并搅拌10分钟。在n2气氛下滴加pocl3(821mg,5.4mmol)，将反应温度缓慢地升至0℃，然后再搅拌30分钟。在0℃下，将该混合物倒入到碳酸氢钠溶液(800mg在250ml水中)中。将所需的化合物用二氯甲烷萃取。将有机相浓缩，并用制备型hplc纯化，得到磷酸二氢2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基酯10(52mg,12％)，为白色固体。
[0509]
lcms：[m h]

m/z 398.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.54(s,1h),7.17(s,1h),7.15(s,1h),4.28
–
4.16(m,2h),3.93(s,8h),3.13
–
3.04(m,2h),1.90
–
1.80(m,2h),1.75(s,1h),1.59(d,j＝6.4hz,2h)和1.44
–
1.32(m,2h).
[0510]
磷酸二氢(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基酯11(在表3a中)的制备
[0511]
将(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲醇78(100mg,0.33mmol)溶于无水
吡啶(3ml)中，然后将其冷却至
–
15℃，并搅拌10分钟。在氮气气氛下滴加pocl3(253mg,1.65mmol)。将反应温度缓慢升至0℃，然后再搅拌30分钟。在0℃下，将该混合物倒入到nahco3水溶液(160mg在50ml水中)中。将所需的化合物用二氯甲烷萃取，并然后减压蒸发至干。冻干后通过制备型hplc纯化，得到磷酸二氢(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基酯11(70mg,55％)，为白色粉末。lcms：[m h]

m/z 384.20.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.74(d,j＝1.7hz,1h),7.31(s,1h),7.20(s,1h),4.66(d,j＝13.0hz,1h),3.97(m,j＝12.6,1.6hz,8h),3.76(t,j＝6.6hz,3h),2.19
–
2.00(m,1h),1.92(d,j＝13.5hz,2h),1.45(dd,j＝14.2,10.7hz,1h).
[0512]
o
‑
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)o,o
‑
二氢硫代磷酸酯12(在表3a中)的制备
[0513]
在
–
15℃下，向2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙
‑1‑
醇77(150mg,0.473mmol)在无水吡啶(5ml)中的溶液中加入p(s)cl3(477mg,2.84mmol)。在0℃下搅拌0.5小时后，将混合物倒入nahco3(238mg,2.84mmol)的h2o(50ml)溶液中。将该混合物在0℃下搅拌2小时。将反应混合物的过程通过lcms监测。然后将混合物减压浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化，得到化合物12(16mg,8％)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z414.05.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.62(s,1h),7.19(d,j＝7.7hz,2h),4.45(d,j＝12.3hz,2h),3.91(d,j＝11.3hz,10h),1.86(d,j＝12.2hz,3h),1.56(d,j＝6.4hz,2h),1.34(d,j＝10.7hz,2h).
[0514]
o
‑
((1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)o,o
‑
二氢硫代磷酸酯13(在表3a中)的制备
[0515]
在
–
15℃下，向(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲醇78(100mg,0.330mmol)在无水吡啶(5ml)中的溶液中加入p(s)cl3(280mg,1.98mmol)。在0℃下搅拌0.5小时后，将混合物倒入nahco3(116mg,1.98mmol)的h2o(50ml)溶液中。将该混合物在0℃下搅拌2小时。将该混合物减压蒸发至干，并将残余物通过制备型hplc纯化，得到化合物13(10mg,7.6％)，为黄色固体。lcms：[m h]

m/z 400.15.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.54(s,1h),7.18(s,1h),7.11(s,1h),4.25(d,j＝13.4hz,2h),3.89(d,j＝9.1hz,6h),3.76(s,2h),3.10(d,j＝11.8hz,3h),1.94(s,1h),1.81(d,j＝12.7hz,2h),1.39(d,j＝11.4hz,1h).
[0516]
((1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)膦酸16的制备
[0517]
将pph3(3.39g,15mmol)和咪唑(1.02g,15mmol)在无水ch2cl2(40ml)中的溶液在0℃下搅拌10分钟，并然后加入i2(3.8g,15mmol)。将粗的反应混合物置于氮气气氛中，并再搅拌10分钟，并然后加入(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲醇78(3.03g,10mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。该反应通过加入na2s2o3水溶液终止。将粗的混合物用ch2cl2萃取，用水、盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。用甲醇重结晶，得到4
‑
(4
‑
(碘甲基)哌啶
‑1‑
基)
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉(2.28g,56％)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 414.3.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.63(d,j＝1.3hz,1h),7.28(s,1h),7.07(s,1h),4.23(s,2h),4.00(s,6h),3.19(d,j＝6.5hz,2h),3.08(s,2h),2.11
–
2.00(m,2h),1.82(s,1h),1.49(s,2h),1.29
–
1.20(m,1h).
[0518]
将1,8
‑
二氮杂二环(5.4.0)十一
‑7‑
烯(dbu)(9.2g,60.5mmol)加入到冷却的(0℃)双(苄氧基)(氧代)
‑
λ4
‑
膦(9.5g,36.3mmol)的无水mecn(40ml)溶液中。10分钟后，加入4
‑
(4
‑
(碘甲基)哌啶
‑1‑
基)
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉(5.0g,12.1mmol)。将生成的混合物搅拌过夜，并然后减压蒸发至干。将残余物溶于乙酸乙酯中，用水、盐水洗涤，干燥(mgso4)，并减压蒸发至干。用fcc[ch2cl2：meoh(50：1)]纯化，得到((1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)膦酸二苄酯(1.1g,18％)，为无色粘稠油状物。lcms：[m h]

m/z 548.20.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.57(s,1h),7.89(s,1h),7.39
–
7.33(m,10h),6.99(s,1h),5.08(m,3h),4.96(m,2h),4.64(d,j＝13.5hz,2h),4.09(s,3h),3.93(s,3h),3.27(d,j＝12.9hz,2h),2.05(d,j＝13.9hz,5h),1.76(m,4h),1.42(d,j＝12.5hz,2h).
[0519]
将在meoh(20ml)中含有((1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)膦酸二苄酯(660mg,1.2mmol)和pd/c(132mg,20％w/w)的混合物置于h2气氛下，并在室温下搅拌。4小时后，将粗的混合物通过垫过滤，并将滤液减压蒸发至干。通过制备型hplc纯化，得到((1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)膦酸16(125mg,28％)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 368.10.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.72(s,1h),7.29(s,2h),4.60(d,j＝12.8hz,2h),3.95(d,j＝11.2hz,6h),3.46(s,2h),2.09(s,3h),1.61(s,2h),1.42(s,2h).
[0520]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)丙基)膦酸14(在表3a中)的制备
[0521][0522]
a)pph3，i2，咪唑，ch2cl2；b)p(o)h(oet)2，cs2co3，dmf；c)tfa，ch2cl2；d)63，dipea，
[0523]
ch2cl2；e)tmsbr,mecn,60℃
[0524]
将碘(1.35g,5.34mmol)加入到pph3(1.4g,5.34mmol)和咪唑(0.36g,5.34mmol)的ch2cl2(20ml)溶液中。将该混合物于室温搅拌0.5小时，并然后滴加79(1.0g,4.11mmol)的ch2cl2(5ml)溶液。将反应混合物于室温搅拌4小时，并然后用饱和的na2so3溶液终止，并用ch2cl2萃取。将有机相用水、盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2；5％etoac的石油醚溶液)处理，得到4
‑
(3
‑
碘丙基)哌啶
‑1‑
甲酸叔丁酯(1.0g,68％产率)，为淡黄色油状物。
[0525]
向4
‑
(3
‑
碘丙基)哌啶
‑1‑
甲酸叔丁酯(1.0g,2.83mmol)在dmf(50ml)中的混合物中加入膦酸二乙酯(0.58g,4.24mmol)和cs2co3(1.84g,5.66mmol)。将反应混合物在氮气气氛下在室温下搅拌过夜，并然后通过加入水终止。将有机相用水、盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2；20％etoac的石油醚溶液)处理，得到80(0.78g,76％)，为淡黄色油状物。lcms：[m h]

m/z 364.30.
[0526]
向80(0.78g,2.14mmol)的ch2cl2(8ml)溶液中加入tfa(1.5ml,21.4mmol)。将该混合物于室温搅拌4小时，并然后减压蒸发至干，得到油状的粗品81，将其无需进一步纯化即
可用于下一步。lcms：[m h]

m/z 264.25。
[0527]
将dipea(1.37g,10.63mmol)加入到膦酸二乙酯(597mg,2.65mmol)和粗品81在ch2cl2(10ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌过夜，并然后用饱和的nh4cl水溶液终止，并用ch2cl2萃取。将有机相用水、盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2,5％meoh的ch2cl2溶液)处理，得到膦酸二乙酯(0.5g,39％)中间体，为黄色油状物。将其在mecn(10ml)中进行溶剂化，加入tmsbr(1.46ml,11.07mmol)。将生成的混合物在60℃下搅拌6小时，并然后冷却至室温，并减压蒸发至干。色谱法(制备型hplc)处理，得到白色固体的14(220mg,50％)。lcms：[m h]

m/z396.20.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.51(s,1h),7.33(s,1h),7.14(s,1h),4.02(s,3h),3.97(s,3h),3.49(t,j＝12hz,2h),2.00
–
1.97(m,3h),1.75
–
1.66(m,5h)和1.45
–
1.37(m,5h).
[0528]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)硫代膦o,o
‑
酸17的制备
[0529][0530]
向搅拌下的(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)硫代膦酸o,o
‑
二乙基酯(400mg,1.51mmol)和dipea(927mg,7.19mmol)的dmso(10ml)溶液中加入4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
喹唑啉66(403mg,1.80mmol)。将反应混合物置于氮气气氛中，并然后在80℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。将有机相干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。纯化(sio2,0
–
100％etoac的己烷溶液)，得到(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)硫代膦酸o,o
‑
二乙基酯(380mg,46％)。将搅拌下的(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)硫代膦酸o,o
‑
二乙基酯(45mg,0.099mmol)的tmsi(7ml)溶液在60℃下搅拌16小时，并然后冷却至室温。将该混合物用水稀释，并用乙酸乙酯萃取。将有机相干燥(na2so4)，并然后减压蒸发至干。通过制备型hplc纯化，得到(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)硫代膦o,o
‑
酸17(13mg,32％)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 396.25.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.51(s,1h),7.33(s,1h),7.16(s,1h),4.02(s,3h),3.97(s,3h),3.58(d,j＝10.4hz,3h),3.48(t,j＝12.0hz,2h),2.00(d,j＝11.7hz,2h),1.81(s,1h),1.64(d,j＝17.9hz,2h),1.61
–
1.51(m,2h),1.45
–
1.32(m,2h).
[0531]
(2
‑
(4
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑1‑
基)乙基)膦酸18(在表3a中)
[0532][0533]
lcms：[m h]

m/z 382.251h nmr(400mhz,d2o)δ8.65(s,1h),6.93(s,1h),6.76(s,1h),3.86(s,3h),3.84(s,3h),3.30
–
3.22(m,1h),3.18
–
3.15(m,2h),2.73
–
2.66(m,2h),2.37
–
2.32(m,2h)和1.79
–
1.63(m,6h).
[0534]
(2
‑
(4
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌嗪
‑1‑
基)乙基)膦酸氢溴酸盐19(在表3a中).
[0535][0536]
a)iproh,δ；b)h2o,50℃；c)tmsbr,chci
s，
dmf
[0537]
将在丙
‑2‑
醇中的含有吡嗪82和化合物63的混合物加热回流30分钟，并然后冷却至室温。将反应混合物用水终止，并萃取到氯仿中。将有机相分离，用水、盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。用乙醚重结晶，得到白色固体的83(1.65g,84％)。将哌嗪83(0.31g,1.1mmol)溶于水(20ml)中，并加入膦酸乙烯基酯84(0.19g,1.2mmol)。将生成的混合物于50℃加热1小时，并然后冷却至室温。用氯仿萃取，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio212g；15％meoh的ch2cl2溶液)处理，随后用乙醚重结晶，得到乙酯85(0.23g；49％)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 410.101h nmr(500mhz,氯仿
‑
d)δ8.67(s,1h),7.25(s,1h),7.09(s,1h),4.01(d,j＝18.8hz,6h),3.77(d,j＝10.9hz,6h),3.68(t,j＝4.9hz,4h),3.49(s,2h),2.81
–
2.66(m,6h),2.11
–
2.00(m,2h)。将三甲基甲硅烷基溴(198mg,1.3mmol)加入到4
‑
[4
‑
(2
‑
二乙氧基磷酰基乙基)哌嗪
‑1‑
基]
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
喹唑啉85(600mg,3.8mmol)在氯仿(20ml)和dmf(5ml)中的溶液中。将生成的溶液在室温下搅拌3小时，并然后通过加入甲醇终止。将该混合物减压蒸发至干，并用甲醇
‑
乙醚重结晶，得到所需的产物19(0.23g,89％)，为hbr盐。lcms：[m h]

m/z 382.8.1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.97(s,1h),7.96(s,1h),7.42(s,1h),7.35(s,1h),4.02(s,3h),4.00(s,3h),3.34(t,j＝8.6hz,2h),3.17(s,2h),2.90(s,2h),2.74(s,2h),2.20
–
2.08(m,2h).
[0538]
(4
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)苯乙基)膦酸20(在表3a中)的制备
[0539][0540]
a)nbuli，硼酸三异丙酯，thf；b)pd(pph3)4，k2co3，h2o，thf，65℃；c)pph3，咪唑，i2，ch2cl2；d)(bno)2p(o)h，cs2co3，dmf；θ)pd/c，h2，meoh.
[0541]
在
–
78℃下，在氮气气氛下，将2.5m正丁基锂(24ml)加入到2
‑
(4
‑
溴苯基)乙
‑1‑
醇86(5.0g,24.8mmol)的无水thf(100ml)溶液中。搅拌1小时后，将硼酸三异丙酯(8.6ml)加入到混合物中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并然后通过加入2m hcl溶液(100ml)终止，并搅拌1小时。将该混合物用二氯甲烷(3
×
100ml)萃取，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2；二氯甲烷：甲醇，1：0至20：0)处理，得到硼酸87(1.34g,33％)，为淡黄色固体。然后将该物质溶于thf(30ml)和水(10ml)的溶液中。将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉63(2.24g,10.0mmol)和碳酸钾(2.76g,20.0mmol)加入到该溶液中，随后加入四(三苯基膦)钯(0.5g,0.43mmol)。将生成的混合物在65℃下搅拌16小时，并然后用乙酸乙酯稀释，用盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2：(0至10％的甲醇的二氯甲烷溶液)处理，得到88(1.43g,60％)，为淡黄色固体。
[0542]
在0℃下，向三苯基膦(2.36g,9.0mmol)的二氯甲烷(24ml)溶液中加入咪唑(700mg,10.28mmol)。搅拌10分钟后，加入i2(2.3g,9.0mmol)。再搅拌10分钟后，加入化合物89(1.5g,4.8mmol)的二氯甲烷(12ml)溶液。将该混合物温热至室温，并搅拌5小时。然后将混合物用二氯甲烷(36ml)稀释，用盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法(sio2：石油醚：乙酸乙酯10：1)处理，得到89(4.0g)，为无色油状物。
[0543]
将碳酸铯(1.426g,4.4mmol)加入到粗品89(930mg,2.2mmol)和膦酸二苄酯(884mg,3.37mmol)在dmf(20ml)中的混合物中。将该混合物置于氮气气氛中，并在室温下搅拌3小时。一旦完成，将反应混合物过滤，并减压蒸发至干。色谱法(c18柱：水：乙腈，1：0至80：1)处理，随后冻干，得到二苄基中间体(750mg,79％)，为灰白色固体。将(4
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)苯乙基)膦酸二苄酯(230mg,0.41mmol)溶于meoh(20ml)中。加入pd/c(46mg,20％w/w)，并将该混合物在氢气气氛下在室温下搅拌24小时，并然后通过过滤。色谱法(制备型hplc，在酸性条件下)处理，得到化合物20(55.4mg,36％)，为黄色固体。lcms：[m h]

m/z 375.0.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6))：δ9.09(s,1h),7.75
‑
7.73(d,j＝8.0hz,2h),7.45
–
7.43(m,2h),7.41(s,1h),7.32(s,1h),4.08(s,1h),3.98(s,3h),3.91(s,1h),3.81(s,3h),2.89
–
2.87(m,3h)和1.89(m,2h).
[0544]
(4
‑
((6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)苯基)膦酸钠盐21(在表3a中)的合成
[0545][0546]
将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
喹唑啉67(0.67g,3.0mmol)和(4
‑
氨基苯基)膦酸二乙酯(0.69g,3.0mmol)在iproh(10ml)中的混合物加热回流过夜。将固体沉淀物过滤，用etoac洗涤并干燥，得到(4
‑
((6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)氨基)苯基)膦酸二乙酯(0.92g,73％产率)，为白色固体。将产物溶于mecn(20ml)中，并向其中加入三甲基甲硅烷基溴(2.8ml,22mmol)。将生成的混合物在60℃下搅拌6小时，冷却，并然后减压蒸发至干。将粗的残余物通过加入饱和的nahco3水溶液(调节至ph为8)终止。将生成的混合物通过制备型hplc(在中性条件下)纯化，并然后冻干，得到所需的产物21(300mg,35％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 362.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ7.73(s,1h),7.53(t,j＝9.8hz,2h),7.22(d,j＝7.4hz,2h),6.39(s,1h),6.16(s,1h)和3.39(s,6h).
[0547]
(4
‑
((6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)苄基)膦酸钠盐22(在表3a中)的合成
[0548][0549]
将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
喹唑啉67(0.34g,1.5mmol)和(4
‑
氨基苄基)膦酸二乙酯(0.36g,3.0mmol)在iproh(10ml)中的混合物加热回流过夜。将沉淀物过滤，用etoac洗涤，并减压蒸发至干，并然后溶于乙腈(20ml)中。向其中加入三甲基甲硅烷基溴(0.58ml,4.6mmol)。将该混合物在60℃下搅拌6小时。浓缩后，将残余物用饱和的nahco3水溶液处理，直至该溶液达到ph为8。将该混合物通过制备型hplc(中性)纯化，得到22(104mg,57％)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 376.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ7.77(s,1h),7.15(s,4h),6.49(s,1h),6.21(s,1h),3.47(s,6h)和2.70(d,j＝19.5hz,2h).
[0550]
(4
‑
(((6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苯基)膦酸钠盐23(也称为表1中的4).
[0551][0552]
a)iproh，δ；b)et3n，koac，pd(oac)2，dppf，(eto)2ph，thf；c)tmsbr，mecn，60℃.
[0553]
将4
‑
氯
‑
6,7
‑
二甲氧基
‑
喹唑啉63(0.93g,4.14mmol)和(4
‑
溴苯基)甲胺90(0.77g,4.14mmol)在iproh(10ml)中的混合物加热回流过夜。将该固体沉淀物过滤；用乙酸乙酯洗涤，并减压蒸发至干，得到n
‑
(4
‑
溴苄基)
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
胺盐酸盐91(1.5g,88％)，为白色固体。将三乙胺(0.37ml,2.68mmol)加入到koac(11mg,0.112mmol)、pd(oac)2(5.5mg,0.025mmol)、dppf(27mg,0.049mmol)在thf(10ml)中的混合物，并用氮气吹扫。加入三乙胺(0.37ml,2.68mmol)。在70℃下搅拌15分钟后，加入n
‑
(4
‑
溴苄基)
‑
6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
胺盐酸盐(0.5g,1.22mmol)和膦酸二乙酯(0.16g,1.22mmol)的thf(10ml)溶液。将该反应在回流下搅拌6小时，并然后在etoac(30ml)和水(20ml)之间分配。将有机相分离，用水、盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。通过柱色谱法(sio2；50％石油醚的乙酸乙酯溶液)纯化，得到(4
‑
(((6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苯基)膦酸二乙酯(0.2g,38％)，为黄色固体。
[0554]
向(4
‑
(((6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苯基)膦酸二乙酯(0.5g,1.16mmol)的mecn(20ml)溶液中加入tmsbr(1.45ml,11.5mmol)。将该混合物在60℃下搅拌6小时，冷却至室温，并然后减压蒸发。将残余物用饱和的nahco3水溶液(ph 9)终止，并将生成的混合物通过制备型hplc(中性)纯化，得到标题产物23，为灰白色固体(102mg,22％)。lcms：[m
–
h]

m/z：374.00.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.00(s,1h),7.61(s,2h),7.29(d,j＝7.6hz,2h),6.70(s,1h),6.55(s,1h),4.62(s,2h),3.75(d,j＝18.2hz,6h).
[0555]
合成(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯92和(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二乙酯93的一般操作
[0556][0557]
a)nah，phme；b)pd/c，h2，etoh.
[0558]
在室温下，将氢化钠(1.1mol.当量)小心地加入到搅拌下的双(二甲氧基磷酰基)甲烷92或双(二乙氧基磷酰基)甲烷93(1mol.当量)的甲苯溶液中。然后将反应混合物置于
氮气气氛中，并缓慢地加入1
‑
苄基哌啶
‑4‑
甲醛94(1mol.当量)的甲苯溶液，保持温度低于40℃。将生成的混合物在室温下搅拌16小时，并然后通过加入饱和的nh4cl水溶液终止。将有机相分离，用盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发至干。色谱法(120g sio2；5至100％梯度的etoac的己烷溶液)处理，得到(e)
‑
(2
‑
(1
‑
苄基哌啶
‑4‑
基)乙烯基)膦酸二甲酯或(e)
‑
(2
‑
(1
‑
苄基哌啶
‑4‑
基)乙烯基)膦酸二乙酯，为无色油状物。向(e)
‑
(2
‑
(1
‑
苄基哌啶
‑4‑
基)乙烯基)膦酸二甲酯或(e)
‑
(2
‑
(1
‑
苄基哌啶
‑4‑
基)乙烯基)膦酸二乙酯(1mol.当量)在乙醇中的混合物中加入催化量的pd/c。将混合物置于氢气气氛中，并在室温下搅拌12小时，过滤，并减压蒸发至干，得到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯95和(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二乙酯96，为无色油状物。
[0559]
合成(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二苄酯100的通用操作
[0560][0561]
a)pph3，i2，咪唑，ch2cl2；b)p(o)obn2，dbu，mecn；c)tfa，ch2cl2[0562]
将碘(1.5mol.当量)加入到pph3(1.5mol.当量)和咪唑(1.5mol.当量)的ch2cl2溶液中。搅拌10分钟后，滴加97(1.0mol.当量)的ch2cl2溶液。将混合物在室温下搅拌2小时，通过垫过滤，并用5％硫代硫酸钠溶液处理。将混合物用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。色谱法处理，得到油状的98。
[0563]
在40℃下，将dbu(5.0mol.当量)加入到化合物98(3.0mol.当量)的mecn溶液中。搅拌10分钟后，滴加膦酸二苄酯(1.0mol当量)的mecn溶液。搅拌2小时后，将反应混合物减压蒸发至干，并通过色谱法纯化，得到99。
[0564]
将化合物99(1.0mol.当量)的tfa/dcm溶液在室温下搅拌1小时，并然后减压蒸发至干，得到油状的100。
[0565]
合成(2
‑
(1
‑
(喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸、(2
‑
(1
‑
(喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸和(2
‑
(1
‑
(异喹啉
‑1‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸的通用方法
[0566]
方法a：
[0567]
将二异丙基乙胺(2mol.当量)加入到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯95或(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二乙酯96(1.1mol.当量)和4
‑
氯喹唑啉、4
‑
氯喹啉或1
‑
氯异喹啉(1mol.当量)在异丙醇(0.1m反应浓度)中的混合物中。在90℃搅拌3小时后，将反应混合物冷却，并蒸发至干。在硅胶(5％meoh的二氯甲烷溶液)上纯化，得到膦酸二甲酯或膦酸二乙酯。向冷却的(0℃)膦酸酯(1mol.当量)在氯仿或二氯甲烷(0.5m反应浓度)中的溶液中加入三甲基甲硅烷基溴(3mol.当量)。将反应混合物温热至室温，90分钟后，通过加入甲醇终止。将该混合物减压蒸发至干，并然后在甲醇中溶剂化。将反应混合物浓缩至一半体积，过滤以除去沉淀物，并然后蒸发至干。将残余物用二氯甲烷结晶，过滤并减压干燥，得到所需的膦
酸的氢溴酸盐。
[0568]
方法b：
[0569]
将二异丙基乙胺(3mol.当量)加入到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二甲酯95或(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二乙酯96(1.1mol.当量)和4
‑
氯喹唑啉、4
‑
氯喹啉或1
‑
氯异喹啉(1mol.当量)在二氯甲烷(0.1m反应浓度)中的混合物中。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物通过加入饱和的nh4cl水溶液终止。将有机相分离，并用水和盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。在硅胶(5％meoh的二氯甲烷溶液)上纯化，得到膦酸二甲酯或膦酸二乙酯。向冷却的(0℃)膦酸二甲酯或膦酸二乙酯(7mol.当量)的乙腈(0.1m反应浓度)溶液中加入三甲基甲硅烷基溴(3mol.当量)。将反应混合物在60℃下搅拌6小时，冷却，并减压蒸发至干，并将粗的残余物通过加入饱和的nahco3水溶液(直到观察到ph值为8～9)终止。将粗的残余物通过制备型hplc(中性)纯化，得到膦酸的钠盐。
[0570]
方法c：
[0571]
将二异丙基乙胺(3mol.当量)加入到(2
‑
(哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸二苄酯100(1.1mol.当量)和4
‑
氯喹唑啉、4
‑
氯喹啉或1
‑
氯异喹啉(1mol.当量)在二氯甲烷(0.1m反应浓度)中的混合物中。在室温下搅拌过夜后，将反应混合物通过加入饱和的nh4cl水溶液终止。将有机相分离，并用水和盐水洗涤，干燥(na2so4)，并减压蒸发至干。在硅胶(5％meoh的二氯甲烷溶液)上纯化，得到膦酸二苄酯。将膦酸二苄酯(1mol.当量)和pd/c在meoh中的混合物置于氢气气氛下，并在室温下搅拌2小时。然后将混合物通过过滤，并减压蒸发至干，得到膦酸。
[0572]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸(或化合物1)的制备
[0573][0574]
根据方法a制备得到15(2.1g,69％)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 381.8.1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.77(s,1h),7.34(s,1h),7.23(s,1h),4.71(d,j＝13.1hz,2h),3.99(s,3h),3.97(s,3h),3.48(t,j＝12.7hz,2h),3.18(s,1h),1.97
–
1.90(m,2h),1.62
–
1.43(m,4h),1.40
–
1.27(m,2h).
[0575]
(4
‑
(((6,7
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苄基)膦酸24(在文中的表格中也称为5)的制备
[0576][0577]
根据方法b制备。该产物通过制备型hplc分离(9％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 390.15.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.12(s,1h),7.22(s,4h),7.11(s,1h),6.91(s,1h),4.79(s,2h),4.76(s,2h),3.98(s,3h),3.91(s,3h),2.79(s,1h),2.74(s,1h)
[0578]
(2
‑
(1
‑
(6
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸25的制备
[0579][0580]
根据方法a制备得到25(50％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 352.10.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.57(s,1h),7.74
–
7.73(m,1h),7.68
–
7.66(m,1h),7.46(d,1h),4.96(br s,2h),3.98,(s,3h),3.57(br s,2h),2.65(s,2h),2.07
–
2.04(m,2h),1.81(m,1h),1.79
–
1.75(m,2h),1.66
–
1.63(m,2h)和1.46
–
1.44(m,2h).
[0581]
(2
‑
(1
‑
(6
‑
羟基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸26的制备
[0582][0583]
根据方法c制备得到26(7％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 338.15.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.48(s,1h),7.65(d,j＝8.8hz,1h),7.32(d,j＝8.8hz,1h),7.18(s,1h),4.21
–
4.17(m,2h),2.99
–
2.95(m,2h),1.82
–
1.79(m,2h),1.53
–
1.49(m,5h)和1.30
–
1.19(m,2h).
[0584]
(2
‑
(1
‑
(7
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸27的制备
[0585][0586]
根据方法a制备得到27(95％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 352.0 1
h nmr(500mhz,甲醇
‑
d4)δ8.55(s,1h),8.10(d,j＝10hz,1h),7.30(dd,j＝10hz and 5hz,1h),7.10(d,j＝5hz,1h),4.01(s,3h),3.57
–
3.48(m,2h),2.65(s,1h),2.05
–
2.02(m,2h),1.94
–
1.90(m,1h),1.80
–
1.74(m,2h),1.65
–
1.60(m,2h)和1.46
–
1.41(m,2h).
[0587]
(2
‑
(1
‑
(7
‑
乙氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸28的制备
[0588][0589]
根据方法b制备得到28，为灰白色固体。
[0590]
(2
‑
(1
‑
(7
‑
羟基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸29的制备
[0591][0592]
根据方法b制备得到29(4％产率)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 338.25.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ11.49(s,1h),8.64(s,1h),7.96(d,j＝9.2hz,1h),7.10(dd,j＝9.2and 2.2hz,1h),7.00(d,j＝2.2hz,1h),4.62(br s,2h),3.38(br s,2h),1.87(d,j＝12.7hz,2h),1.72(br s,1h),1.58
–
1.38(m,4h)和1.28
–
1.22(m,2h).
[0593]
(2
‑
(1
‑
(7
‑
氨基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸30的制备
[0594][0595]
根据方法c制备得到30(32％产率)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 337.10.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.35(s,1h),7.62(d,j＝8.8hz,1h),6.81(d,j＝8.8hz,1h),6.61(br s,1h),6.30(br s,2h),4.26
–
4.20(m,2h),3.10
–
2.90(m,2h),1.79
–
1.76(m,2h),1.60
–
1.30(m,5h)和1.25
–
1.20(m,2h).
[0596]
(2
‑
(1
‑
(7
‑
异丙氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸31的制备
[0597][0598]
根据方法b制备得到31，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 337.10.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.35(s,1h),7.62(d,j＝8.8hz,1h),6.81(d,j＝9.2hz,1h),6.66(s,1h),6.30(br s,2h),4.25
–
4.21(m,2h),3.08
–
2.96(m,2h),1.81
–
1.75(m,2h),1.65
–
1.31(m,5h)和1.27
–
1.18(m,2h).
[0599]
(2
‑
(1
‑
(8
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸32的制备
[0600][0601]
根据方法b制备得到32(32％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 352.15.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ7.92(s,1h),6.92
–
6.88(m,1h),6.80(d,j＝7.6hz,1h),6.71(d,j＝8.4hz,1h),3.76
–
3.70(m,2h),3.71(s,3h),2.72(t,j＝12hz,2h),1.64(d,j＝12hz,2h),1.51
–
1.28(m,5h)和1.02
–
0.94(m,2h).
[0602]
(2
‑
(1
‑
(8
‑
乙氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸33(在文中的表格中也称为226)的制备
[0603][0604]
根据方法b制备得到33，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 366.20.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ1h nmr(400mhz,d2o)δ8.17(s,1h),7.21
–
7.09(m,2h),4.13
–
3.98(m,4h),2.97(t,j＝12.4hz,2h),1.82(d,j＝13.0hz,2h),1.56
–
1.35(m,8h),1.26(q,j＝11.4hz,2h).
[0605]
(2
‑
(1
‑
(8
‑
异丙氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸34(在表3a中)的制备
[0606][0607]
根据方法b制备得到34(43％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 1
h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ1h nmr(400mhz,d2o)δ8.10(s,1h),7.11(d,j＝7.5hz,2h),7.03(d,j＝7.1hz,1h),3.94(d,j＝13.0hz,2h),2.86(t,j＝12.6hz,2h),1.67(d,j＝13.1hz,2h),1.40
–
1.07(m,13h).
[0608]
(2
‑
(1
‑
(8
‑
羟基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸36(在表3a中)的制备
[0609][0610]
根据方法b制备得到35，为灰白色固体。
[0611]
lcms：[m h]

m/z 1
h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ1h nmr(400mhz,d2o)
[0612]
(2
‑
(1
‑
(5,8
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸36的制备
[0613][0614]
根据方法b制备得到36，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 382.15.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.47(s,1h),7.54(d,j＝8.9hz,1h),7.15(d,j＝8.8hz,1h),3.95(d,j＝12.0hz,8h),1.82(s,2h),1.67(s,1h),1.59
–
1.30(m,6h),1.21(s,2h).
[0615]
(2
‑
(1
‑
(6,8
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸37的制备
[0616][0617]
根据方法c制备得到37(15％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 382.151h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.54(s,1h),7.11(s,1h),6.86
‑
6.82(m,1h),4.50(d,j＝12.4hz,1h),4.27(m,1h),3.85(m,6h),3.74(m,2h),3.27(m,2h),1.88
–
1.85(m,2h),1.66(m,1h),1.54
–
1.48(m,4h)和1.29(m,2h).
[0618]
(2
‑
(1
‑
(7,8
‑
二甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸38的制备
[0619][0620]
根据方法c制备得到38(16％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 382.15 1
h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.60(s,1h),7.90(d,j＝9.6hz,1h),7.49(d,j＝9.2hz,1h),4.69
(m,2h),4.02(s,3h),3.89(s,3h),3.46(m,2h),1.90(d,j＝12.8hz,2h),1.75(m,1h),1.53
–
1.49(m,4h)和1.31
–
1.28(m,2h).
[0621]
(2
‑
(1
‑
(7,8
‑
二氢
‑
[1,4]二氧杂环己二烯并[2,3
‑
g]喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸39(在表3a中)的制备
[0622][0623]
根据方法c制备得到39(7％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 380.15.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.64(s,1h),7.48(s,1h),7.19(s,1h),4.56(d,j＝11.8hz,2h),4.45(d,j＝3.0hz,2h),4.38(d,j＝3.3hz,2h),3.39(s,1h),3.33(s,1h),1.87(d,j＝12.2hz,2h),1.71(s,1h),1.58
–
1.38(m,4h),1.26(d,j＝10.2hz,2h).
[0624]
(2
‑
(1
‑
(5
‑
氟
‑8‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸40(在表3a中)的制备
[0625][0626]
根据方法c制备得到40(7％产率)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 370.10.1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.55(s,1h),7.44
–
7.38(m,2h),4.28
–
4.23(m,2h),3.94(s,3h),3.28
–
3.18(m,2h),1.82
–
1.78(m,2h),1.70
–
1.66(m,1h),1.49
–
1.23(m,4h)和1.26
–
1.09(m,2h).
[0627]
(2
‑
(1
‑
(6
‑
氟
‑8‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸41(在表3a中)的制备
[0628][0629]
根据方法b制备得到41(44％产率)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 366.15.1h nmr
(400mhz,dmso
‑
d6)δ8.02(d,j＝9.2hz,1h),7.21(d,j＝9.2hz,1h),7.04(s,1h),3.93(s,3h),2.49(s,3h),1.91
‑
1.88(m,2h),1.74(m,1h),1.53
‑
1.49(m,5h)和1.29
‑
1.27(m,3h).
[0630]
(2
‑
(1
‑
(6
‑
氯
‑8‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸42(在表3a中)的制备
[0631][0632]
根据方法b制备得到42(42％产率)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 386.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.03(s,1h),6.91
–
6.88(m,2h),3.92
–
3.89(m,2h),3.77(s,3h),2.93
–
2.87(m,2h),1.70
–
1.67(m,2h)和1.41
–
1.12(m,7h).
[0633]
(2
‑
(1
‑
(7
‑
氯
‑8‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸43(在表3a中)的制备
[0634][0635]
根据方法b制备得到43(50％产率)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 386.05.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.07(s,1h),7.10
–
7.06(m,2h),3.95
–
3.91(m,2h),3.71(s,3h),2.96
–
2.90(m,2h),1.71
–
1.68(m,2h)和1.42
–
1.01(m,7h).
[0636]2‑
[1
‑
[6,7
‑
二甲氧基
‑2‑
[(e)
‑2‑
(3
‑
吡啶基)乙烯基]喹唑啉
‑4‑
基]
‑4‑
哌啶基]乙基
‑
羟基
‑
次膦酸44的制备
[0637]
[0638]
根据方法b制备得到44(49％产率)，为淡黄色固体。lcms：[m h]

m/z 485.25.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.09(s,1h),7.94(s,1h),7.36(d,j＝8hz,1h),7.06(s,1h),6.74(d,j＝16.8hz 1h),6.58(d,j＝3.2hz,1h),6.40(d,j＝3.2hz,1h),6.24(d,j＝16.8hz,1h),3.94
–
3.91(m,2h),3.84(s,3h),3.67(s,3h),2.96
–
2.90(m,2h),1.96
‑
1.93(m,2h)和1.56
–
1.32(m,7h).
[0639]
(e)
‑
(2
‑
(1
‑
(8
‑
甲氧基
‑2‑
(2
‑
(吡啶
‑3‑
基)乙烯基)喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸45的制备
[0640][0641]
根据方法b制备得到45(79％产率)，为黄色固体。lcms：[m h]

m/z 455.20.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ9.07(br s,1h),8.70(br s,1h),8.62
–
8.60(m,1h),8.31(d,1h),7.89
–
7.88(m,1h),7.70
–
7.54(m,4h),5.20
–
5.00(m,2h)4.13(s,3h),3.58
–
3.50(m,2h),2.07
–
2.02(m,2h),1.88
–
1.82(m,1h),1.78
–
1.64(m,4h)和1.51
–
1.46(m,2h).
[0642]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸46的制备
[0643][0644]
根据方法c制备得到46(22％产率)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 381.30.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.35(d,j＝6.8hz,1h),7.29
–
7.27(m,2h),7.11(d,j＝6.8hz,1h),4.27
–
4.23(m,2h),4.03(s,3h),4.02(s,3h),3.40
–
3.32(m,2h),2.06
–
2.03(m,4h)1.82
–
1.79(m,3h)和1.62
–
1.48(m,2h).
[0645]
(2
‑
(1
‑
(3
‑
氰基
‑
6,7
‑
二甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸47(在表2中也称为42)的制备
[0646][0647]
根据方法b制备得到47(47％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 406.20.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.00(s,1h),6.62(s,1h),6.40(s,1h),3.75(s,3h),3.66(s,3h),3.18(d,j＝12.3hz,2h),2.94(t,j＝12.2hz,2h),1.72(d,j＝12.7hz,2h),1.43
–
1.30(m,6h),1.17
–
1.04(m,2h).
[0648]
(2
‑
(1
‑
(3
‑
氰基
‑6‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸48(在表2中也称为44)的制备
[0649][0650]
根据方法b制备得到48(16％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 376.20.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.15(s,1h),7.51(s,1h),7.18(s,1h),6.88(s,1h),3.71(s,3h),3.60
–
3.51(m,2h),3.15
–
3.08(m,2h),1.81
–
1.74(m,2h)和1.41
–
1.15(m,7h).
[0651]
(2
‑
(1
‑
(3
‑
氰基
‑7‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸49(在表2中也称为43)的制备
[0652][0653]
根据方法b制备得到49(23％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 376.20.1h nmr(400mhz,d2o)δ7.94(s,1h),7.39(d,j＝9.4hz,1h),6.84
–
6.64(m,2h),3.90(s,3h),3.59(d,j＝12.4hz,2h),3.22(t,j＝12hz,2h),1.89(d,j＝12.8hz,2h),1.62
–
1.45(m,5h)和1.33
–
1.25(m,2h).
[0654]
(2
‑
(1
‑
(3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸50(在表1中也称为45)的制备
[0655][0656]
根据方法b制备得到50，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z376.20.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.03(s,1h),7.27
–
7.23(m,1h),7.11
–
7.09(m,1h),7.04
–
7.02(m,1h),3.90(s,3h),3.43(br d,j＝12.4hz,2h),3.06(br t,j＝12hz,2h),1.80(br d,j＝12.8hz,2h),1.50
–
1.47(m,5h)和1.31
–
1.24(m,2h).
[0657]
(2
‑
(1
‑
(6,7
‑
二甲氧基异喹啉
‑1‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸51的制备
[0658][0659]
根据方法b制备得到51(30％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 381.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ1h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)：δ7.79(d,j＝6.4hz,1h),7.51
–
7.44(m,2h),7.31(s,1h),3.96(d,j＝4.8hz,6h),3.23(m,4h),1.88(m,2h),1.55(m,2h),1.48(m,1h)和1.45(m,4h).
[0660]
(2
‑
(1
‑
(4
‑
氰基
‑
6,7
‑
二甲氧基异喹啉
‑1‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)膦酸52(在表3a中)的制备
[0661][0662]
根据方法b制备得到52(50％产率)，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 1
h nmr
(400mhz,d2o)δ
[0663]
o
‑
((1
‑
(8
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲基)o,o
‑
二氢硫代磷酸酯53(在
[0664]
表3a中)的制备
[0665][0666]
在
–
15℃下，向(1
‑
(8
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)甲醇(使用与化合物80相同的方法制备)(500mg,1.83mmol)的吡啶(5ml)溶液中滴加三氯硫磷(1.6g,9.45mmol)。在0℃搅拌1小时后，在0℃下，将反应混合物加入到碳酸氢钠(923mg,10.98mmol)的水(20ml)溶液中。将生成的混合物在0℃下搅拌2小时，并然后减压蒸发至干。纯化(制备型hplc)，得到53(83mg,12％)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 354.10 1
h nmr(400mhz,,dmso
‑
d6)δ8.59(s,1h),7.59
–
7.50(m,2h),7.45(dd,j＝6.5,2.4hz,1h),4.53(d,j＝12.7hz,2h),3.97(s,3h),3.80
–
3.74(m,4h),2.03(s,1h),1.86(d,j＝13.5hz,2h),1.41(q,j＝11.8hz,2h).
[0667]
(((1
‑
(8
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)氧基)甲基)膦酸54(在表3a中)的制备
[0668][0669]
使用与化合物10和11相同的方法制备。将该混合物纯化(制备型hplc0.1％tfa)，得到54，为灰白色固体。
[0670]
lcms：[m h]

m/z 353.3.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.40(s,1h),7.54(s,2h),7.40(d,j＝7.0hz,1h),4.37(s,3h),4.01
–
3.88(m,9h),3.71(d,j＝9.3hz,4h),3.63(s,1h),2.11(s,2h),1.81(s,2h).
[0671]
(4
‑
(8
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)苯乙基)膦酸55(在表3a中)的制备
[0672][0673]
使用与化合物20相同的方法制备，为白色固体。
[0674]
lcms：[m h]

m/z 345.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ
[0675]
(4
‑
(((8
‑
甲氧基喹唑啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苯基)膦酸56的制备
[0676][0677]
根据与化合物23相同的方法制备。lcms：[m h]

m/z 346.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.20(s,1h),7.62
–
7.57(m,2h),7.43
–
7.41(m,2h),7.31
–
7.28(m,2h),7.23
–
7.21(m,1h)和2.93(s,3h).
[0678]
(4
‑
(((3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苯基)膦酸57(在表1中也称为52)的制备
[0679][0680]
根据与化合物23相同的方法制备，得到57，为灰白色固体。lcms：[m h]

m/z 370.10.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.02(s,1h),7.48
–
7.43(m,2h,7.36
–
7.30(m,2h),7.15
–
7.09(m,3h),4.77(s,2h)和3.81(s,3h).
[0681]
(4
‑
(((3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苄基)膦酸58(在表2中也称为211)的制备
[0682][0683]
根据与化合物23相同的方法制备，得到58，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 384.15.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.32(s,1h),7.77(d,j＝8.4hz,1h),7.50(t,j＝8.4hz,1h),7.35
–
7.33(m,2h),7.26(d,j＝7.6hz,1h),7.20(d,j＝8.4hz,2h),5.02(s,2h),3.99(s,3h)和2.85(d,j＝20hz,2h).
[0684]
(3
‑
(1
‑
(3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)丙基)膦酸59(在表2中也称为210)的制备
[0685][0686]
根据与化合物14相同的方法制备，得到59，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 390.20.1h nmr(400mhz,d2o)δ8.30(s,1h),7.39(br s,2h),7.19(br s,1h),3.98(s,3h),3.73
–
3.70(m,2h),3.30(t,j＝12hz,2h),1.92
–
1.88(m,2h),1.70
–
1.45(m,3h)和1.40
–
1.27(m,6h).
[0687]
(4
‑
(((3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)甲基)苯基)硼酸60(在表2中也称为214)的制备
[0688][0689]
a)et3n，ch3och2ch2oh；b)pdcl2(dppf)，koac，b2pin2，dmso，80℃；c)hcl，etoac
[0690]
向化合物101(0.97g,5.0mmol)的2
‑
甲氧基乙醇(10ml)溶液中加入(4
‑
溴苯基)甲胺90(1.74g,10.0mmol)和et3n(1.51g,15mmol)。将该混合物在100℃下加热过夜，冷却至室温，并然后减压蒸发至干。色谱法(35％etoac的石油醚溶液)处理，得到102(1.5g,88％)，为白色固体。向化合物102(69mg,0.2mmol)的dmso(3ml)溶液中加入双(频哪醇合)二硼(61.0mg,0.24mmol)、乙酸钾(58.8mg,3.0mmol)、pd(dppf)cl2(7.4mg,0.05mmol)。通过用氮气吹扫使该反应脱气，并然后于80℃加热48小时。将该混合物冷却至室温，并用乙酸乙酯稀释，并然后通过垫过滤。将该滤液减压蒸发至干。将残余物溶于etoac(10ml)中，加入hcl(4m,0.2ml,4.0mmol)的etoac溶液。将该混合物在室温下搅拌过夜，并然后减压蒸发至干。色谱法(制备型hplc(tfa))处理，得到60(40.5mg,65％，两步)，为白色固体。lcms：[m h]

m/z 334.15.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.69(s,1h),7.90(d,j＝8.4hz,1h),7.73(t,j＝8.3hz,2h),7.61(d,j＝8.1hz,2h),7.41(dd,j＝17.3,7.8hz,2h),5.05(s,2h),4.13(s,3h).
[0691]
(2
‑
(1
‑
(3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)哌啶
‑4‑
基)乙基)硼酸61(在表2中也称为216)的制备
[0692][0693]
根据与化合物7相同的操作制备。分离出化合物61，为黄色固体。lcms：[m h]

m/z 340.20.1h nmr(400mhz,甲醇
‑
d4)δ8.81(s,1h),7.83(d,j＝12hz,1h),7.72(t,j＝8hz,1h),7.60(d,j＝8hz,1h),4.51(d,j＝12hz,2h),3.81(t,j＝12hz,2h),3.31(s,3h),2.66(s,1h).2.05(br d,j＝12hz,2h),1.72
–
1.30(m,4h)和0.91
–
0.85(m,2h).
[0694]4‑
(((3
‑
氰基
‑8‑
甲氧基喹啉
‑4‑
基)氨基)甲基)
‑
n
‑
羟基苯甲酰胺62(在表2中也称为220)的制备
[0695][0696]
a)ch3och2ch2o；b)naoh，thf/h2o；c)nh2oh.hcl，bop，dipea，thf
[0697]
将101(2.0g,8.9mmol)和103(1.5g 8.9mmol)的2
‑
甲氧基乙醇(40ml)溶液加热回流过夜，并然后冷却至室温。将反应混合物减压蒸发至干，并然后用etoac研磨，过滤并干燥，得到粗的化合物104(1.7g)，为淡黄色固体。
[0698]
向化合物104(0.5g,1.55mmol)的thf(20ml)溶液中加入naoh(0.17g,4.65mmol,溶于2ml水)。将该混合物于45℃加热过夜。将该冷却的溶液减压浓缩，并将残余物用hcl水溶液(2n)处理，直至达到ph为5.5。将生成的沉淀物过滤并干燥，得到粗品酸中间体(0.3g,62％产率)，为淡黄色固体。将该粗品酸溶于dmf(10ml)中，并然后冷却至0℃，并置于氮气下。加入bop(0.48g,1.06mmol)和dipea(0.50g,3.88mmol)，随后加入honh2‑
hcl(0.09g,1.26mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜，用水(50ml)终止，并用etoac萃取。将有机相用水和盐水洗涤，并干燥(na2so3)，并减压蒸发至干。色谱法(5％meoh的ch2cl2溶液)处理，并然后进行制备型hplc(h

,0.1％tfa)，得到62(34mg,10％)，为灰白色固体。lcms：[m h]
1
h nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ11.19(s,1h),9.06(s,1h),8.55(s,1h),8.45(d,j＝8.7hz,1h),7.72(d,j＝7.4hz,2h),7.39(dd,j＝4.6,2.9hz,2h),7.29(dd,j＝12.3,5.0hz,2h),5.11(s,2h),3.93(s,3h).
[0699]
实施例2：评估化合物活性
[0700]
制备表1
‑
3的选定化合物和其他衍生物，并使用胸苷单磷酸对硝基苯酚(tmp
‑
pnp)作为底物在enpp1活性测定中对所述化合物和其他衍生物进行评估。在室温下用tmp
‑
pnp(2μm)、enpp1抑制剂的5倍稀释液和纯化的重组小鼠enpp1(0.5nm)在100mm tris、150mm nacl、2mm cacl2、200μm zncl2、ph 7.5中对酶反应进行准备。通过测量反应产生的对硝基苯酚酯在400nm下的吸光度来监测反应进程20分钟。求出产品形成的斜率，使用graphpad prism 7.03作图并拟合以获得ic
50
值。
[0701]
还使用cgamp作为底物在enpp1酶活性测定中评估了化合物。可用于评估主题化合物的方法包括li等人，在2018年9月7日提交的pct申请号pct/us2018/050018中描述的那些方法。下面阐述示例性方法。
[0702]
材料：
[0703]
小鼠enpp1：根据kato等人pnas(2012)109(42)：16876
‑
8.cgamp进行表达和纯化：根据li等人nat.chem.biol.(2014)10：1043
‑
8进行合成和纯化。多磷酸amp磷酸转移酶(pap)：将pap基因(genbank：ab092983.1)合成(integrated dna technologies)，并克隆到
带有his
‑
sumo c
‑
末端标签的ptb146载体中。用质粒转化的bl21(de3)细胞在od600＝1下用0.75mm iptg在16℃下生长并诱导过夜。将细胞重新悬浮在含有50mm tris ph 7.5、400mm nacl、10mm咪唑、2mm dtt、蛋白酶抑制剂(roche)的缓冲液中，并用两个冻融循环和超声处理进行裂解。所有后续步骤均在4℃下进行。通过以40,000rcf离心1小时清除裂解物，并将上清液与hispur钴树脂(thermo fisher scientific)孵育2小时。树脂用含有50mm tris ph 7.5、150mm nacl的30ml缓冲液洗涤两次，并用50mm tris ph 7.5、150mm nacl、600mm咪唑洗脱该蛋白质。进行阴离子交换色谱法(hitrap q hp)。肌激酶(milliporesigma).celltiterglo(promega)
[0704]
enpp1酶活性测定的示例性操作：
[0705]
在室温下，将3nm小鼠enpp1与5um cgamp和化合物的5倍连续稀释液在含有50mm tris ph 7.6、250nm nacl、500um cacl2和1um zncl2的缓冲液(总反应体积＝10ml)中孵育3小时，然后将反应在95℃下加热灭活10分钟。将amp降解产物转化为atp，其使用荧光素酶检测。为此，根据goueli等人在ep2771480中，制备了多磷酸:amp磷酸转移酶(pap)和肌激酶的酶混合物。简而言之，将pap在含有50mm tris ph 7.5、0.1％np
‑
40的缓冲液中稀释至2mg/ml。在含有3.2mm硫酸铵ph 6.0、1mm edta和4mm多磷酸盐的缓冲液中，将肌激酶稀释至2ku/ml。将热灭活的enpp1反应与pap(0.01mg/ml)和肌激酶(0.0075u/ml)在含有40mm tris ph 7.5、0.05mg/ml prionex、5mm mgcl2、20mm多磷酸盐和0.15g/l酚红(便于移液)的缓冲液中孵育3小时(总反应体积＝20ml)。根据制造商的方案将celltiterglo(20ul)添加到反应中并测量发光。在拟合成函数100/(1 ([化合物]/ic50))之前，将数据归一化为100％酶活性(无化合物)和0％酶活性(无酶)。
[0706]
ic50值落在字母a
‑
c表示的范围内，其中a表示小于50nm的ic50值，b表示介于50nm和100nm之间的ic50值，并且c表示大于100nm的ic50值。
[0707]
表4：enpp1酶活性。ic50值：a(<50nm)；b(50nm
–
100nm)；c(>100nm).
[0708]
[0709]
[0710]
[0711][0712]
表2化合物
[0713]
[0714]
[0715]
[0716]
[0717]
[0718]
[0719]
[0720][0721]
实施例3：细胞外enpp1的展示和细胞外enpp1的抑制
[0722]
参考图18a至18c，观察到enpp1控制细胞外cgamp水平，并且可以通过用enpp1抑制剂(例如化合物1)处理细胞来恢复cgamp水平。
[0723]
将293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞用人enpp1表达质粒转染，并确认了全细胞裂解物中的cgamp水解酶活性(图18a)。293t细胞购自atcc，并经病毒转染以稳定表达小鼠cgas。293t mcgas enpp1
‑
/
‑
是通过靶向人enpp1的crispr sgrna(5’caccgctggttctatgcacgtctcc
‑3’
)(seq id no：1)的病毒转染而产生的。将293t mcgas enpp1
‑
/
‑
细胞在补充有10％fbs(atlanta biologics)(v/v)和100u/ml青霉素
‑
链霉素(thermofisher)的dmem(corning cellgro)中涂铺在经组织培养物处理的板中，该板涂有purcol(advanced biomatrix)。涂铺后12
‑
24小时，用根据制造商的说明的fugene 6(promega)加上指定浓度的pcdna3质粒dna(空的或含有人enpp1)转染细胞。转染后24小时，将细胞裂解以通过蛋白质印迹(使用抗体家兔抗enpp1(l520,1:1000)和小鼠抗微管蛋白(dm1a,1:2,000),cell signaling technologies)分析enpp1表达。通过在10mm tris,150mm nacl,1.5mm mgcl2,1％np
‑
40,ph 9.0中裂解1x106个细胞而产生全细胞裂解物。将
32
p
‑
cgamp(5μm)与全细胞裂解物一起孵育，并按上文实施例2(图18a)中所描述的那样监测降解。
[0724]
在完整细胞中，enpp1表达耗尽细胞外cgamp，但不影响细胞内cgamp浓度(图18b)。在用pcdna3(空的或含人enpp1)转染293t mcgas enpp1
‑
/
‑
后24小时，除去培养基，并用补充有1％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
丙酮酸钠(thermofisher)和100u/ml青霉素
‑
链霉素的无血清dmem替代。更换培养基后12
‑
24小时，除去培养基，并用冷pbs将细胞从板上洗掉。将培养基和细胞两者均在4℃下以1000rcf离心10分钟，并针对通过液相色谱
‑
串联质谱(lc
‑
ms/ms)的cgamp浓度测量而进行准备。将细胞在30至100μl补充有作为内标的500nm环状gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp的50:50乙腈:水中裂解，并在4℃下以15,000rcf离心20分钟以除去不溶级分。除去补充有作为内标的500nm环状gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp和20％甲酸的培养基。在具有设定为4℃的自动进样器并连接至ab sciex 4000qtrap(foster city,ca)的shimadzu hplc(san francisco,ca)上分析样品中的cgamp、atp和gtp含量。将10μl的体积注入biobasic ax lc柱,5μm,50x 3mm(thermo scientific)上。流动相由含100mm碳酸铵(a)和0.1％甲酸的乙腈溶液(b)组成。初始条件为90％b，维持0.5min。流动相从0.5min至2.0min斜升至30％a，从2.0min至3.5min保持在30％a，从3.5min至3.6min斜升至90％b，并且从3.6min至5min维持在90％b。流速被设定为0.6ml/min。质谱仪以电极喷雾正离子模式运行，其中源温度设置为500℃。使用氮气实现去簇和碰撞
‑
诱导的离解。通过直接输注标准品优化去簇电位和碰撞
能。对于每个分子，mrm跃迁(s)(m/z)，dp(v)和ce(v)如下：atp(508>136,341,55)，gtp(524>152,236,43)，cgamp(675>136,121,97；675>312,121,59；675>152,121,73)，内标环状gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp(690>146,111,101；690>152,111,45；690>327,111,47)，萃取标准物环状
13
c
10
,
15
n5‑
gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp(705>156,66,93；705>162,66,73)。
[0725]
抑制enpp1能阻断胞外cgamp的降解(图18c)。如上那样进行相同的实验，这次还在更换培养基时纳入50μm的enpp1抑制剂(化合物1)。在存在该抑制剂时，培养基中胞外cgamp浓度恢复到先前的水平。
[0726]
图18a显示了用空载体和含有人enpp1的载体转染并在24小时后使用蛋白质印记分析了enpp1蛋白表达(顶部)，使用薄层色谱(tlc)分析了enpp1 32
p
‑
cgamp水解活性(底部)的293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞。图18b示出了使用lc
‑
ms/ms的胞内和胞外cgamp浓度。bql＝低于定量限。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.005(学生t检验)。图18c显示了在存在或不存在50μm化合物1的情况下，用空载体或含有人enpp1的载体转染的293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞的胞内和胞外cgamp浓度。bql＝低于定量限。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.0013(学生t检验)。
[0727]
实施例4：enpp1抑制能增加原代cd14 单核细胞的cgamp激活
[0728]
使用enpp1抑制剂(化合物1)，测试了由293t cgas enpp1
低
细胞系输出的cgamp是否可以被诸如人cd14

单核细胞的抗原呈递细胞(apc)检测到(图19a)。将293t cgas enpp1
低
细胞用pcdna(空的或含有人enpp1的pcdna)转染。通过使来自全血的经富集的血沉棕黄层经受percoll密度梯度来分离原代人类外周血单核细胞(pbmc)。使用cd14

microbeads(miltenyi)分离cd14

单核细胞。在补充有2％人血清和100u/ml青霉素
‑
链霉素的rmpi中培养cd14

单核细胞。在转染293t cgas enpp1
低
细胞后8小时，在添加或不添加示例性enpp1抑制剂化合物1的情况下将培养基更换为补充有2％人血清和100u/ml青霉素
‑
链霉素的rmpi。在更换培养基后24小时，将来自293t cgas enpp1
低
细胞的上清液转移至cd14

单核细胞(图19a)中。在上清液转移后24
‑
26小时，使用trizol(thermo fisher scientific)提取总rna，并用maxima h minus逆转录酶(thermo fisher scientific)进行逆转录。在7900ht快速实时pcr系统(applied biosystems)上用accupower 2x greenstar qpcr master mix(bioneer)一式两份地执行实时rt
‑
pcr。对于每个样品，将数据针对cd14表达作归一化。使用δδct计算诱导倍数。人ifnb1的引物：fwd(5
’‑
aaactcatgagcagtctgca
‑3’
)(seq id no:2)，rev(5
’‑
aggagatcttcagtttcggagg
‑3’
)(seq id no:3)；人cd14的引物：fwd(5
’‑
gccttccgtgtccccactgc
‑3’
)(seq id no:4)，rev(5
’‑
tgagggggccctcgacg
‑3’
)(seq id no:5)。
[0729]
来自表达cgas的293t cgas enpp1
低
细胞的上清液诱导了cd14 ifnb1表达，而来自无cgas(cgas
‑
null)293t细胞的上清液未能如此，这表明癌细胞输出的胞外cgamp可以被cd14

细胞检测为信号传导因子(图19b)。enpp1在293t cgas enpp1
低
细胞上的瞬时过表达导致胞外cgamp降解和cd14

ifnb1表达减少，但是化合物1的添加拯救了胞外cgamp水平并诱导了cd14

ifnb1表达(图19b)。
[0730]
参考图19a示出了上清液转移实验的示意图。图19b示出了用dna转染并在化合物1存在或不存在的情况下孵育的无cgas 293t细胞或293t cgas enpp1
低
细胞。将来自这些细胞的上清液转移至原代cd14

人pbmc中。将ifnb1 mrna水平针对cd14作归一化，并相对于未处理的cd14

细胞计算诱导倍数。平均值
±
sem(n＝2)。*p<0.05,***p<0.001(单向anova)。
[0731]
实施例5：enpp1抑制与电离放射(ir)处理协同作用以增加与肿瘤相关的树突状细胞
[0732]
已经测试了癌细胞系是否输出cgamp以及电离放射(ir)是否影响所产生的胞外cgamp的水平。电离放射(ir)已被证明能增加肿瘤细胞中的胞质dna并激活肿瘤细胞中的cgas
‑
依赖性ifn
‑
β产生(bakhoum等人nat.commun.(2015)6:1
‑
10；和vanpouille nat.commun.(2017)8:15618)。在涂铺后24小时，使用铯源用20gy ir处理4t1细胞，并更换培养基，补加50um的enpp1抑制剂(化合物1)以抑制细胞培养物中存在的enpp1。在指定的时间收集培养基，以1000x g离心以去除残留的细胞，用0.5％乙酸酸化，并补加作为提取标准品的环状
‑
13
c
10
,
155
‑
gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp(在100μl中最终浓度为2μm的适宜量)。如先前所述(gao等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2015)112:e5699
‑
705)，将培养基施加至hypersep aminopropyl spe柱(thermofisher scientific)以富集cgamp。将洗脱液蒸发至干，并在补充有500nm内标物的50:50乙腈:水中复溶。将培养基提交用于cgamp的质谱定量。
[0733]
在48小时内在4t1细胞中检测到连续的cgamp输出。在48小时时，用ir处理的细胞与未处理的细胞相比具有明显较高的胞外cgamp水平。
[0734]
接下来，研究了ir与示例性enpp1抑制剂化合物1的组合对小鼠4t1肿瘤模型中的与肿瘤相关的树突细胞数量的影响(图20b)。在7至9周龄的雌性balb/c小鼠(jackson laboratories)中，将悬浮在50μl pbs中的1x 106个4t1
‑
荧光素酶肿瘤细胞接种至乳腺脂肪垫中。注射后两天，使用用0.5mm cu滤光的225kvp柜式x射线辐照器(ic 250,kimtron inc.,ct)以20gy辐照肿瘤。用带有放置有肿瘤的15x 20mm孔的3.2mm铅屏蔽物屏蔽麻醉的动物。将小鼠肿瘤内注射100μl 1mm在pbs中的化合物1或单独的pbs。第二天，提取肿瘤，并在含20μg/ml dna i酶iv型(sigma
‑
aldrich)和1mg/ml来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶(sigma
‑
aldrich)的rpmi 10％fbs中在37℃下孵育30min。使肿瘤通过100μm细胞过滤器(sigma
‑
aldrich)，并在室温下使用红细胞裂解缓冲液(155mm nh4cl,12mm nahco3,0.1mm edta)裂解红细胞5分钟。将细胞用活/死的可固定的近红外死细胞染色试剂盒(thermo fisher scientific)染色，使用trustain fcx进行fc封闭10min，并然后用cd11c、cd45和i
‑
a/i
‑
e(全部来自biolegend)进行抗体染色。使用sh800s细胞分选仪(sony)或lsr ii(bd biosciences)分析细胞。通过使用flowjo v10软件(treestar)和prism 7.04软件(graphpad)进行统计分析来分析数据，并使用未配对的t检验和welch校正对统计学显著性进行评估。
[0735]
与pbs对照相比，瘤内注射化合物1没有改变与肿瘤相关的白细胞组成(图20b)，表明enpp1在该肿瘤模型中在清除基础水平的胞外cgamp中没有显著作用。然而，当用ir预处理肿瘤时，观察到化合物1增加了与肿瘤相关的cd11c

群(图20b)。
[0736]
结果在图20a和图20b中示出。图20a示出了4t1细胞在48小时内产生的胞外cgamp。在时间0时，将细胞不作处理或者用20gy ir处理并更新了补充有50μm化合物1的培养基。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.004(学生t检验)。图20b示出了在第0天被原位注射到balb/cj小鼠中的4t1细胞(1x106)。将肿瘤不作处理或用20gy ir处理，并在第2天在瘤内注射pbs(对于ir(0gy)，n＝5；对于ir(20gy)，n＝4，)或化合物1(n＝5)。在第3天收获肿瘤并通过facs分析。*p＝0.047(welch t检验)。
[0737]
实施例6：enpp1抑制与ir处理和抗
‑
ctla
‑
4协同地发挥抗
‑
肿瘤作用
[0738]
已经研究了通过使用电离辐射(ir)和示例性enpp1抑制剂如化合物1进一步体内增加细胞外cgamp，是否可以提高肿瘤的免疫检测和清除率。
[0739]
在7至9周龄的雌性balb/c小鼠(jackson laboratories)中，将悬浮在50μl pbs中的5x 104个4t1
‑
荧光素酶细胞接种至乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积(确定长度2x宽度/2)达到80mm3至120mm3时，使用用0.5mm cu滤光的225kvp柜式x射线辐照器(ic 250,kimtron inc.,ct)以20gy辐照肿瘤。用带有放置有肿瘤的15x 20mm孔的3.2mm铅屏蔽物屏蔽麻醉的动物。在ir后的第2、4和7天，在肿瘤内注射100μl的在pbs中的100μm化合物1和/或10μg cgamp，或单独的pbs。可替代地，在ir后第2天、第5天和第7天，在肿瘤内注射1mm在pbs中的化合物1或单独的pbs，并在腹膜内注射200μg抗
‑
ctla
‑
4抗体或叙利亚仓鼠igg抗体(两者都来自bioxcell)。将来自不同治疗组的小鼠共同饲养在每个笼子中，以消除笼子效应。在整个研究过程中，对实验者设盲。每隔一天记录一次肿瘤体积。用广义估计方程分析肿瘤体积，以解释小鼠内的相关性。使用事后检验对治疗组在每个时间点进行成对比较，并且使用tukey调整进行多次比较。使用graphpad prism7.03将动物死亡绘制在kaplan meier曲线中，并使用logrank mantel
‑
cox检验评估统计学显著性。所有动物程序均由实验室动物护理管理小组批准。
[0740]
化合物1的施用增强了ir治疗的肿瘤缩小作用，但不显著(图21a)。尽管瘤内注射cgamp对ir治疗无作用，但是除注射cgamp之外还注射化合物1则可协同地缩小肿瘤，延长生存期，并达到10％的治愈率(图21a和图21b)。
[0741]
还测试了与适应性免疫检查点阻断剂抗
‑
ctla
‑
4的协同作用。在不存在ir的情况下，抗ctla
‑
4和化合物1的治疗对延长生存期没有作用(图21c)。然而，将ir预处理与化合物1和抗
‑
ctla
‑
4结合发挥了显著的协同作用，并且达到10％治愈率。总之，这些结果表明，通过将ir处理与enpp1抑制结合来增强胞外cgamp能增加肿瘤免疫原性并发挥抗肿瘤作用。
[0742]
结果示于图21a中，该图示出化合物1与ir组合的肿瘤缩小作用。将已建立的肿瘤(100
±
20mm3)用20gy ir处理一次，然后在ir后第2、4和7天进行pbs或治疗剂的3次瘤内注射(n＝9/治疗组)。将来自不同治疗组的小鼠一起饲养，并且对实验者设盲。在广义估计方程中分析肿瘤体积以解释小鼠内的相关性。使用事后检验对治疗组在每个时间点进行成对比较，并且使用tukey调整进行多次比较。图21b示出了图21a的kaplan meier曲线，p值由对数秩mantel
‑
cox检验确定。图21c除了示出了与图21b相同的程序外，还示出了在ir后第2、5和7天腹膜内注射的抗
‑
ctla 4或igg同种型对照抗体(对于ir(0) 化合物1 ctla
‑
4治疗组，n＝8；对于所有其他治疗组，n＝17
–
19)。如图21b所示的那样进行统计分析。
[0743]
总之，这些结果表明cgamp存在于胞外，并且主题enpp1抑制剂可在胞外起作用；因此，表明enpp1的胞外抑制足以达到治疗效果。enpp1有资格作为先天免疫检查点。这些实验表明，在胞外抑制enpp1使cgamp能够增强抗癌免疫力并能够与已经可用作疗法的免疫检查点阻断药物协同地组合(图22)。
[0744]
实施例7：2
’3’‑
cgamp是由癌细胞产生并由enpp1调节的免疫递质
[0745]
介绍
[0746]2’3’‑
环状gmp
‑
amp(cgamp)的特征是作为细胞内的第二信使，其是响应胞质dsdna合成的，并激活先天免疫sting通路。它的细胞外水解酶enpp1暗示细胞外cgamp的存在。使用质谱法，检测到cgamp作为可溶性因子被工程细胞系持续输出，但随后被enpp1有效清除。
iptg在16℃下诱导过夜。使用蛋白质和细胞裂解物的所有后续操作均在4℃下进行。细胞在50mm tris ph7.5、400mm nacl、10mm咪唑、2mm dtt和蛋白酶抑制剂(complete,不含edta的蛋白酶抑制剂混合物，roche)中沉淀并裂解。细胞通过超声裂解，并且裂解物通过以50,000rcf超速离心1小时清除。将澄清的上清液与hispur钴树脂(thermofisher scientific；每1l细菌培养物1ml树脂)一起孵育30分钟。用50倍柱体积的50mm tris ph 7.5、150mm nacl、2％triton x
‑
114，50cv的50mm tris ph 7.5、1m nacl(每次洗涤的滴速设置为1滴/2
‑
3秒，耗时2
‑
3小时)和20cv的50mm tris ph 7.5、150mm nacl洗涤该树脂结合的蛋白质。将蛋白质用50mm tris ph 7.5、150mm nacl中的600mm咪唑从树脂上洗脱下来。合并含有his
‑
sumo
‑
sting的级分，浓缩，并用50mm tris ph 7.5、150mm nacl透析，同时与sumolase酶his
‑
ulp1一起孵育过夜以去除his
‑
sumo标签。将该溶液再次与hispur钴树脂一起孵育以去除his
‑
sumo标签，并从流出液中收集sting。将蛋白质用50mm tris ph 7.5进行透析，使用 fplc(ge healthcare)加载到hitrapq阴离子交换柱(ge healthcare)上，并用nacl梯度洗脱。将含有sting的级分合并，并将缓冲液更换成pbs，并在4℃下储存直至使用。
[0760]
enpp1：menpp1按照kato,k.等人(expression,purification,crystallization and preliminary x
‑
ray crystallographic analysis of enpp1.acta crystallogr.sect.f struct.biol.cryst.commun.68,778
–
782(2012)；和crystal structure of enpp1,an extracellular glycoprotein involved in bone mineralization and insulin signaling.proc.natl.acad.sci.u.s.a.109,16876
–
81(2012))中所述进行制备。
[0761]
液相色谱
‑
串联质谱
[0762]
环状gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp用作内标，并且环状
13
c
10
,
155
‑
gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp用作萃取标准物。同位素标记的cgamp标准品是通过在100mm tris,ph 7.5中孵育1mm atp(同位素标记的)、1mm gtp(同位素标记的)、20mm mgcl2、0.1mg/ml鲱鱼睾丸dna(sigma)和2μm sscgas过夜合成的。将反应在95℃加热并通过3kda离心过滤器过滤。在旋转蒸发器上除去水。在与uv
‑
vis检测器(prostar；agilent technologies)和级分收集器(440
‑
lc；agilent technologies)相连的制备型hplc(1260infinity lc系统；agilent technologies)上，使用plrp
‑
s聚合物反相制备型柱(8μm,300x 25mm；agilent technologies)从粗的反应混合物中纯化cgamp。流速设置为25ml/min。流动相由10mm三乙基乙酸铵的水溶液和乙腈组成。前5分钟的流动相为2％乙腈。然后乙腈从5
‑
20分钟上升到30％，从20
‑
22分钟上升到90％，从22
‑
25分钟保持在90％，然后从25
‑
28分钟下降到2％。将含有cgamp的级分冻干并重新悬浮在水中。通过测量280nm处的吸光度来确定浓度。在shimadzu hplc(san francisco,ca)上分析样品的cgamp、atp和gtp含量，自动进样器设置为4℃并连接到ab sciex 4000qtrap(foster city,ca)。将10μl体积注入biobasic ax lc柱,5μm,50x 3mm(thermo scientific)。流动相由100mm碳酸铵(a)和0.1％甲酸的乙腈溶液(b)组成。初始条件为90％b，保持0.5分钟。流动相从0.5分钟到2.0分钟上升到30％a，从2.0分钟到3.5分钟保持在30％a，从3.5分钟到3.6分钟上升到90％b，从3.6分钟到5分钟保持在90％b。流速设置为0.6ml/min。质谱仪在电极喷雾正离子模式下操作，源温度设置为500℃。使用氮气实现去簇和碰撞诱导解离。通过直接注入标准品来优化解簇电位和碰撞能。对于每个分子，mrm跃迁(m/z)、dp(v)和ce(v)如下：atp(508>136,341,55)、gtp(524>152,236,43)、cgamp(675>136,
121,97；675>312,121,59；675>152,121,73)、内标环状gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp(690>146,111,101；690>152,111,45；690>327,111,47)、萃取标准物环状
13
c
10
,
15
n5‑
gmp
‑
13
c
10
,
15
n5‑
amp(705>156,66,93；705>162,66,73)。
[0763]
293tcgas enpp1
‑
/
‑
细胞中的输出测定
[0764]
将293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞接种在用purcol(advanced biomatrix)涂覆的组织培养处理过的板中。24小时后，轻轻地去除培养基，并用补充有1％胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒
‑
丙酮酸钠(thermofisher)和100u/ml青霉素
‑
链霉素的无血清dmem替代。在指定的时间，除去培养基，并用冷pbs将细胞从板上洗掉。将培养基和细胞两者均在4℃下以1000rcf离心10分钟。将细胞在30至100μl补充有500nm内标的50:50乙腈:水中裂解，并在4℃下以15,000rcf离心20分钟以除去不溶级分。如果不需要浓缩，则除去等份培养基，补充500nm的内标和20％甲酸。如果需要浓缩，则该培养基用0.5％乙酸酸化，并用萃取标准物(100μl中最终浓度为2μm的适当量)补充。如gao,d.等人(activation of cyclic gmp
‑
amp synthase by self
‑
dna causes autoimmune diseases.proc.natl.acad.sci.u.s.a.112,e5699
‑
705(2015))中所述，将培养基施用于hypersep aminopropyl spe柱(thermofisher scientific)以富集cgamp。将洗脱液蒸发至干，并在补充有500nm内标的50:50乙腈:水中重构。将培养基和细胞萃取物提供用于cgamp、atp和gtp的质谱定量。
[0765]
293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞的转染刺激
[0766]
用根据制造商的说明的fugene 6(promega)加上指定浓度的pcdna3质粒dna(空的或含有人enpp1)转染293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞。转染后24小时，如上所述进行输出测定。
[0767]
条件培养基转移
[0768]
如上所述，将293t cgas enpp1
低
细胞铺板并用质粒dna转染。转染后24小时，将培养基更换为rpmi 2％人血清 1％青霉素
‑
链霉素、 /
‑
2μm cgamp、 /
‑
20nm重组menpp1或 /
‑
50um化合物1。更换培养基后24小时，从293t cgas enpp1
低
细胞中去除条件培养基，并与新鲜分离的cd14

pbmc孵育。14
‑
16小时后分析cd14

pbmc的基因表达。
[0769]
rt
‑
pcr分析
[0770]
使用trizol(thermo fisher scientific)萃取总rna，并使用maxima h minus逆转录酶(thermo fisher scientific)进行逆转录。在7900ht快速实时pcr系统(applied biosystems)上使用accupower 2x greenstar qpcr master mix(bioneer)重复进行实时rt
‑
pcr。每个样品的数据均归一化为cd14、actb或gapdh表达。使用δδct计算倍数诱导。人ifnb1的引物：fwd(5
’‑
aaactcatgagcagtctgca
‑3’
),rev(5
’‑
aggagatcttcagtttcggagg
‑3’
)；人cd14的引物：fwd(5
’‑
gccttccgtgtccccactgc
‑3’
),rev(5
’‑
tgagggggccctcgacg
‑3’
)；人actb的引物：fwd(5
’‑
ggcatcctcaccctgaagta
‑3’
),rev(5
’‑
agaggcgtacagggatagca
‑3’
)；人gapdh的引物：fwd(5
’‑
ccaaggtcatccatgacaac
‑3’
)；rev(5
’‑
cagtgagcttcccgttcag
‑
3')。
[0771]
32
p
‑
cgamp降解tlc测定
[0772]
通过将未标记的atp(1mm)和掺杂有
32
p
‑
atp的gtp(1mm)与2μm纯化的重组猪cgas一起在20mm tris ph 7.5,2mm mgcl2,100μg/ml鲱鱼睾丸dna中在室温下孵育过夜来合成放射标记的
32
p cgamp，并将剩余的核苷酸原材料在37℃下用碱性磷酸酶降解4小时。细胞裂解物是通过在100μl的10mm tris、150mm nacl、1.5mm mgcl2、1％np
‑
40,ph 9.0中刮取和裂解
1x106个细胞(293t)或10x106个细胞(4t1
‑
luc、e0771和mda
‑
mb
‑
231)产生的。对于4t1
‑
luc、e0771和mda
‑
mb
‑
231，使用bca测定(pierce,thermo fisher)测量裂解物的总蛋白质浓度，并对样品进行归一化，因此每个裂解物反应使用相同量的蛋白质。将探针
32
p
‑
cgamp(5μm)与menpp1(20nm)或全细胞裂解物在100mm tris、150mm nacl、2mm cacl2、200μm zncl2、ph 7.5或ph 9.0中孵育指定的时间。为了生成抑制曲线，在反应中包括5倍稀释的enpp1抑制剂。通过tlc评估降解(参见例如，li,l.等人hydrolysis of 2
’3’‑
cgamp by enpp1 and design of nonhydrolyzable analogs.nat.chem.biol.10,1043
–
8(2014))。将板暴露在荧光屏(molecular dynamics)上并在typhoon 9400上成像，并使用imagej对
32
p信号进行定量。使用graphpad prism 7.03拟合抑制曲线以获得ic
50
值。使用cheng
‑
prusoff方程k
i,app
＝ic
50
/(1 [s]/k
m
)将ic
50
值转换为k
i,app
值。
[0773]
alpl和enpp2抑制测定
[0774]
通过在室温下在96
‑
孔板格式中孵育反应组分并通过在读板器(tecan)中测量400nm处的吸光度监测4
‑
硝基苯酚的产生来进行其他外核苷酸酶的抑制测定。alpl：在室温下，在缓冲液ph 9.0(含有50mm tris、20μm zncl2、1mm mgcl2)中的0.1nm alpl、2μm 4
‑
硝基苯基磷酸酯和不同浓度的抑制剂。enpp2：在缓冲液ph 9.0(含有100mm tris、150mm nacl、200μm zncl2、2mm cacl2)中的2nm enpp2、500μm双(4
‑
硝基苯基)磷酸酯和不同浓度的抑制剂。
[0775]
癌细胞系中的输出测定
[0776]
将4t1
‑
luc、e0771和mc38细胞更换为补充有50μm化合物1的新培养基。在指定的时间，收集培养基；用pbs将细胞从板上洗掉，以1000rcf沉淀，用4ml 50：50乙腈：水裂解，并以15,000rcf离心。如上所述，使用hypersep aminopropyl spe柱从培养基和细胞上清液中富集cgamp，并提交进行质谱定量。
[0777]
4t1
‑
luc肿瘤小鼠模型
[0778]
在7至9周龄的雌性balb/c小鼠(jackson laboratories)中，将悬浮在50μl pbs中的5x 104或5x 10
5 4t1
‑
luc
‑
萤光素酶细胞接种至乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积(确定长度2x宽度/2)达到80mm3至120mm3时，使用用0.5mm cu滤光的225kvp柜式x射线辐射器(ic
‑
250,kimtron inc.,ct)以20gy辐射肿瘤。用带有放置有肿瘤的15x 20mm孔的3.2mm铅屏蔽物屏蔽麻醉的动物。在ir后的第2、4和7天，在肿瘤内注射100μl的100μm在pbs中的化合物1和/或10μg cgamp，或单独的pbs。可替代地，在ir后第2天、第5天和第7天，在肿瘤内注射1mm在pbs中的化合物1或单独的pbs，并在腹膜内注射200μg抗
‑
ctla
‑
4抗体或叙利亚仓鼠igg抗体(两者都来自bioxcell)。将来自不同治疗组的小鼠共同饲养在每个笼子中，以消除笼子效应。在整个研究过程中，对实验者设盲。每隔一天记录一次肿瘤体积。用广义估计方程分析肿瘤体积，以解释小鼠内的相关性。使用事后检验对治疗组在每个时间点进行成对比较，并且使用tukey调整进行多次比较。使用graphpad prism 7.03将动物死亡绘制在kaplan meier曲线中，并使用log
‑
rank mantel
‑
cox检验评估统计学显著性。所有小鼠均按照斯坦福大学机构动物护理和使用委员会的规定在斯坦福大学饲养，并且程序均由斯坦福大学实验室动物护理管理小组批准。
[0779]
肿瘤的facs分析
[0780]
在7至9周龄的雌性balb/c wt(4t1
‑
luc肿瘤)或c57bl/6(e0771肿瘤)wt、cgas
‑
/
‑
或
sting
gt/gt
(称作sting
‑
/
‑
)小鼠(jackson laboratories)中，将悬浮在50μl pbs中的1x 106肿瘤细胞接种至乳腺脂肪垫中。注射后两天，如所述对肿瘤进行照射，并在肿瘤内注射100μl的1mm在pbs中的化合物1，或单独的pbs。对于使用sting和menpp1的实验，在肿瘤内注射100μl的100μm中和sting或非结合的sting(r237a)或700nm menpp1或pbs。第二天，提取肿瘤，并在含20μg/ml dnase i型iv(sigma
‑
aldrich)和1mg/ml来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原酶(sigma
‑
aldrich)的rpmi 10％fbs中在37℃下孵育30min。使肿瘤通过100μm细胞过滤器(sigma
‑
aldrich)，并在室温下使用红细胞裂解缓冲液(155mm nh4cl、12mm nahco3、0.1mm edta)裂解红细胞5分钟。将细胞用活/死的可固定的近红外死细胞染色试剂盒(thermo fisher scientific)染色，使用trustain fcx进行fc封闭10min，并然后用cd11c、cd45和i
‑
a/i
‑
e(全部来自biolegend)进行抗体染色。使用sh800s细胞分选仪(sony)或lsr ii(bd biosciences)分析细胞。通过使用flowjo v10软件(treestar)和prism 7.04软件(graphpad)进行统计分析来分析数据，并使用未配对的t检验和welch校正对统计学显著性进行评估。
[0781]
体内成像
[0782]
向小鼠腹腔内注射3mg xenolight d
‑
荧光素(perkin
‑
elmer)的200μl水溶液，并使用lago x体内成像系统(spectral instruments imaging)成像。目标高度设置为1.5cm，像素合并(binning)为4，fstop为1.2，曝光时间为120s。使用aura 2.0.1软件(spectral instruments imaging)分析图像。
[0783]
结果
[0784]
cgamp作为可溶性因子从293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞中输出
[0785]
为了检验cgamp存在于细胞外的假设，我们首先开发了一种液相色谱
‑
串联质谱(lc
‑
ms/ms)法来检测复杂混合物中的cgamp。使用两种同位素标记的cgamp标准品(图1,小图a)，我们可以在基础细胞培养基和含血清培养基中量化低至0.5nm的cgamp浓度，并且我们可以在同一实验中量化细胞提取物中的细胞内cgamp浓度(图1,小图b和图8,小图a和b)。我们选择使用不表达cgas或sting的293t细胞。通过稳定表达小鼠cgas并使用crispr敲除enpp1，我们创建了293t cgas enpp1
低
细胞系(图8,小图c)。然后我们分离了一个克隆以创建293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞系(图8,小图c)。我们还使用了无血清培养基，因为血清含有enpp1的蛋白水解可溶形式。使用这种不含enpp1的细胞培养系统，我们在没有任何刺激的293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞中检测到恒定的低微摩尔基础细胞内cgamp浓度(图1,小图c)。这并不奇怪，因为错误的dna分离导致癌细胞中存在丰富的胞质dsdna(参见例如，mackenzie,k.j.等人cgas surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity.nature 548,461
–
465(2017)；harding,s.m.mitotic progression following dna damage enables pattern recognition within micronuclei.nature 548,466
–
470(2017)；和bakhoum,s.f.等人chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic dna response.nature 553,467
–
472(2018))。用新鲜培养基补充细胞后，我们测量到30小时后细胞外cgamp浓度线性增加至100nm(图1,小图d)。在30小时时，细胞外的cgamp分子数与细胞内的数量相等(图1,小图e)。我们检测到基于细胞外乳糖脱氢物(lactose dehydrogenate)(ldh)活性的细胞死亡数量可以忽略不计，这表明培养基中的cgamp是由活细胞输出的(图1,小图e)。我们计算输出率(v
export
)为220个分子细胞
‑1s
‑1(图
1,小图f)。最后，培养基中的cgamp可以通过10kda过滤器而没有任何保留(其应该保留细胞外囊泡和蛋白质)，这表明cgamp作为可自由溶解的分子输出(图1,小图h)。
[0786]
为了进一步证实由293t细胞分泌的细胞外cgamp主要以可溶性形式存在，但不在细胞外囊泡中，我们使用cd14

人外周血单核细胞(pbmc)作为报道物。这些细胞先前已被证明吸收可溶性cgamp，从而导致ifn
‑
β的产生
17
。我们观察到cd14

pbmc通过上调ifnb1对亚微摩尔浓度的可溶性cgamp有反应(图9)。条件培养基(其得自dna转染的表达cgas的293t cgas enpp1
低
细胞，而不是得自dna转染的cgas
‑
null 293t细胞)在cd14

细胞中诱导ifnb1表达，这表明该活性是293t细胞产生的细胞外cgamp的结果(图1,小图h和i)。添加纯化的可溶性重组小鼠enpp1(menpp1)(图8,小图d)耗尽了条件培养基中可检测的cgamp，也消除了这种活性(图1,小图h和j)。因为可溶性enpp1(mw＝～100kda)不能渗透膜，因此只能接近可溶性细胞外cgamp，我们得出结论293t细胞分泌可溶性cgamp。总之，我们的数据表明这种人工癌细胞系通过将其作为可溶性因子输出到细胞外培养基中，使其细胞内cgamp保持在稳定状态。
[0787]
图1,小图a至j：cgamp作为可溶性因子从293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞中输出。a,cgamp和单个同位素标记的cgamp的化学结构。b,cgamp由lc
‑
ms/ms检测，定量下限＝4nm。(左侧)0、4和10nm的cgamp和500nm的单同位素标记的cgamp(重15da)作为内标的液相色谱图；(右侧)cgamp的外标曲线，r2＝0.996。数据代表>10次独立的实验。c
‑
d,使用lc
‑
ms/ms测量来自293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞(没有外源刺激)的cgamp的细胞内和细胞外浓度。在时间0时，用无血清培养基补充细胞。平均值
±
sem(n＝2)，一些误差条太小而无法可视化。数据代表三次独立的实验。e,从(c)和(d)中的数据计算的细胞外cgamp分子/总cgamp分子的比例(左侧y
‑
轴)与细胞外乳糖脱氢物/总乳糖脱氢物(ldh)活性的比例(右侧y
‑
轴)相比。f,从(d)中的数据计算出的每个细胞随时间输出的cgamp量。输出率是使用线性回归找到的。g,在培养基通过10kda过滤器之前和之后测量的293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞产生的细胞内和细胞外cgamp浓度。平均值
±
sem(n＝2)。数据代表两次独立的实验。h,(i)和(j)的条件培养基转移实验的示意图。cgas
‑
null293t或293t cgas enpp1
低
细胞用空pcdna载体转染，并处理 /
‑
20nm重组小鼠enpp1(menpp1)。将得自这些细胞的条件培养基转移到原代cd14

人pbmc中。i,将ifnb1 mrna水平针对cd14进行归一化，并相对于未处理的cd14

细胞计算诱导倍数。平均值
±
sem(n＝4)。***p＝0.0003(单向anova)。在条件培养基中测量cgamp浓度。平均值
±
sem(n＝2)。***p＝0.0002(单向anova)。数据代表两次独立的实验。j,将ifnb1 mrna水平针对cd14进行归一化，并相对于未处理的cd14

细胞计算诱导倍数。平均值
±
sem(n＝2)。*p＝0.04(单向anova)。在条件培养基中测量cgamp浓度。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.002(单向anova)。数据代表两次独立的实验。
[0788]
图8,小图a至d：开发lc
‑
ms/ms方法并构建293t cgas enpp1
低
和293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞系。a,cgamp在0、20和80nm时的液相色谱图；单同位素标记的内标cgamp(重15da)在500nm时的液相色谱图；和双同位素标记的萃取标准物cgamp(重30da)在2μm时的液相色谱图。所有分析物的化学结构。b,将细胞数对lc
‑
ms/ms测量的atp浓度校准。平均值
±
sem(n＝2).c,通过蛋白质印迹分析293t、293t cgas enpp1
‑
/
‑
和293t cgas enpp1
低
细胞系的cgas表达(左侧)。293t cgas、293t cgas enpp1
‑
/
‑
和293t cgas enpp1
低
细胞各100万个的全细胞裂解物中
32
p
‑
cgamp的enpp1水解活性通过tlc和放射自显影法测量(右侧)。裂解物数
据代表两次独立的实验。d,从培养基中纯化的重组小鼠enpp1的考马斯凝胶(coomassie gel)；使用前将洗脱级分合并(左侧)。tlc分析小鼠enpp1对
32
p
‑
cgamp的降解(右侧)。
[0789]
图9,小图a：cd14

pbmc对细胞外cgamp有反应。a,用细胞外cgamp刺激cd14

pbmc的示意图。b,通过rt
‑
qpcr测量的人cd14

pmbc的ifnb1诱导，该人cd14

pmbc用增加浓度的细胞外cgamp刺激16小时。平均值
±
sem(n＝2个技术性qpcr重复)。
[0790]
enpp1仅调节细胞外cgamp
[0791]
由于当我们从293t细胞中敲除enpp1并将它们培养在不含enpp1的培养基中时，我们第一次能够观察到细胞外cgamp，因此我们研究了是否只有细胞外cgamp受enpp1调节。尽管有细胞外注释(annotation)，但enpp1可能会在膜上翻转方向，如酶cd38(参见例如，zhao,y.j.,lam,c.m.c.&lee,h.c.the membrane
‑
bound enzyme cd38 exists in two opposing orientations.sci.signal.5,ra67(2012))，或者它可能在er腔内合成时具有活性，并且cgamp可能会穿过er膜(图2,小图a)。为了研究enpp1活性的定位，我们用人enpp1表达质粒转染293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞，并确认其在全细胞裂解物中的活性(图2,小图b)。在完整细胞中，enpp1表达消耗细胞外cgamp，但不影响细胞内cgamp浓度(图2,小图c)。因此，在这些细胞中，细胞外而非细胞内的cgamp受enpp1调节。
[0792]
图2,小图a至c：enpp1仅调节细胞外cgamp。a,enpp1活性的三个可能的细胞位置。b,293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞用空载体或含有人enpp1的载体转染，并在24小时后使用蛋白质印记分析了enpp1蛋白表达(顶部)，使用薄层色谱(tlc)分析了enpp1 32
p
‑
cgamp水解活性(底部)。数据代表两次独立的实验。c,使用lc
‑
ms/ms测量细胞内和细胞外cgamp浓度。bql＝低于定量限。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.002(学生t检验)。数据代表三次独立的实验。
[0793]
开发细胞不可渗透的enpp1抑制剂
[0794]
为了研究细胞外cgamp的生理相关性以及为什么它需要由特定水解酶调节，我们试图通过药理学抑制enpp1来调节其浓度。我们首先测试了非特异性enpp1抑制剂qs1(图10,小图a)(patel,s.d.等人quinazolin
‑4‑
piperidin
‑4‑
methyl sulfamide pc
‑
1inhibitors：alleviating herg interactions through structure based design.bioorganic med.chem.lett.19,3339
–
3343(2009)；和shayhidin,e.e.等人quinazoline
‑4‑
piperidine sulfamides are specific inhibitors of human npp1 and prevent pathological mineralization of valve interstitial cells.br.j.pharmacol.172,4189
–
4199(2015))。尽管qs1可以抑制过表达enpp1的细胞中的细胞外cgamp降解，但它也部分阻断了enpp1敲除细胞中的cgamp输出(图10,小图b)。qs1处理的细胞具有升高的细胞内cgamp，再次证明输出是维持癌细胞中cgamp稳态的重要机制。在我们的输出研究中，输出阻断活性排除qs1作为研究细胞外cgamp的工具。膦酸(phosphonate)类似物(化合物1)旨在螯合enpp1催化位点处的zn
2
，并最大限度地减少细胞渗透性并避免细胞内脱靶(图3,小图a)。化合物1的k
i,app
为110
±
10nm(图3,小图b)，其有效性为qs1的约60倍(图10,小图a)。
[0795]
我们通过进行三次独立的渗透性测定证实化合物1是细胞不可渗透的：平行人工膜渗透性测定(pampa)(图11,小图a)；肠细胞caco
‑
2渗透性测定(图11,小图b)；和上皮细胞mdck渗透性测定(图11,小图c)。与具有高细胞渗透性和低细胞渗透性的对照化合物相比，化合物1在所有三种测定中都属于不可渗透化合物的类别。此外，它对密切相关的外核苷酸
酶碱性磷酸酶(k
i,app
>100μm)和enpp2(k
i,app
＝5.5μm)的活性较低(图11,小图d)。尽管我们不希望化合物1由于其低细胞渗透性而在细胞内脱靶，但我们测试了其与一组468种激酶的结合，以进一步确定其特异性。尽管其结构与amp相似，但化合物1以1μm仅与两种激酶结合(图11,小图e)。化合物1在人和小鼠肝微粒体中也显示出高稳定性(t
1/2
>159min)。总之，我们证明了化合物1是一种有效的、细胞不可渗透的、特异性的、稳定的enpp1抑制剂。
[0796]
然后，我们测量了化合物1在维持过表达enpp1的293t cgas细胞的细胞外cgamp浓度中的功效，并获得了340
±
160nm的ic
50
值(图3,小图c)，其中10μm足以完全阻断细胞外cgamp降解(图3,小图d)。与qs1不同，化合物1对细胞内cgamp没有影响，表明它不影响cgamp输出(图3,小图d)。因此，化合物1是一种极好的enpp1抑制剂工具化合物，可特异性地增加细胞外cgamp浓度。
[0797]
最后，我们测试了化合物1在增强对cd14

pbmc可检测到的细胞外cgamp信号方面的功效。我们首先证实化合物1在使用的浓度下对pbmc没有毒性(图11,小图f)。得自enpp1过表达的293t cgas细胞的条件培养基未能在cd14

细胞中诱导ifnb1表达(图3,小图e和f)。然而，化合物1恢复了培养基中的细胞外cgamp水平和cd14

细胞中ifnb1表达的诱导作用(图3,小图f)。这些结果表明enpp1的酶活性(而不是作为跨膜蛋白的潜在支架效应)抑制了cd14

pbmc对细胞外cgamp的反应。总之，我们的数据表明，细胞外cgamp水平可以通过enpp1表达降低并通过enpp1抑制增加，这会影响体外cd14

pbmc的激活。
[0798]
图3,小图a至f：细胞不可渗透的enpp1抑制剂的活性。a,化合物1的化学结构。b,以
32
p
‑
cgamp作为底物在ph 7.5时化合物1对纯化的小鼠enpp1的抑制活性(k
i,app
＝110
±
10nm)。平均值
±
sem(n＝3次独立的实验)，一些误差条太小而无法可视化。c,化合物1对293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞中瞬时表达的人enpp1的抑制活性(ic
50
＝340
±
160nm)。平均值
±
sem(n＝2)。d,在存在或不存在10μm化合物1的情况下，用空pcdna载体或含有人enpp1的载体转染的293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞的细胞内和细胞外cgamp浓度。bql＝低于定量限。平均值
±
sem(n＝3)。****p<0.0001(单向anova)。数据代表两次独立的实验。e,条件培养基实验的示意图。293t cgas enpp1
低
细胞用含有人enpp1的载体转染，并在存在或不存在化合物1的情况下孵育。将得自这些细胞的条件培养基转移至原代cd14

人pbmc。f,将ifnb1 mrna水平针对cd14进行归一化，并相对于未处理的cd14

细胞计算诱导倍数。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.007(单向anova)。在条件培养基中测量cgamp浓度。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.006(单向anova)。数据代表两次独立的实验。
[0799]
图10,小图a至b：化合物1相对于qs1的改进
[0800]
a,qs1的结构及其在ph 7.5下以
32
p
‑
cgamp为底物对纯化小鼠enpp1的抑制活性(与化合物1相比)(qs1 k
i,app
＝6.4
±
3.2μm)。平均值
±
sem(n＝2次独立的实验)。b,在存在或不存在qs1的情况下，用空载体或含有人enpp1的载体转染的293t cgas enpp1
‑
/
‑
细胞的细胞内、细胞外和总cgamp。平均值
±
sem(n＝2).*p<0.05.**p<0.01(单向anova)。
[0801]
图11,小图a至f：化合物1是细胞不可渗透的，对enpp1具有特异性，并且无毒。a,人工膜渗透性测定(pampa)中化合物1的渗透性。
[0802]
b,化合物1在肠细胞caco
‑
2测定中的渗透性。pa＝峰面积，is＝内标。将化合物(包括化合物1)、阿替洛尔(低被动渗透性阴性对照)和普萘洛尔(高被动渗透性阳性对照)在caco
‑
2单层的顶面孵育2小时。通过lc
‑
ms/ms监测基底外侧的化合物浓度。根据斜率计算表
观渗透率(p
app
)。数据代表两次独立的实验。c,化合物1在上皮细胞mdck渗透性测定中的渗透性。d,化合物1对碱性磷酸酶(alpl)和enpp2的抑制活性。平均值
±
sem(n＝2)。e,化合物1的激酶组相互作用图(测试的468种激酶)，将激酶抑制描述为对照的百分比。使用treespot
tm
软件工具生成图像，经kinome(discoverx公司的一个部门)许可再版。discoverx公司2010。f,通过celltiterglo测定的细胞活力。总pbmc和cd14

pbmc与化合物1一起孵育16小时，并然后使用celltiterglo检测atp水平。将数据归一化为无化合物1以计算细胞活力百分比。
[0803]
癌细胞表达cgas并在培养中持续输出cgamp
[0804]
为了确定细胞外cgamp是否可以作为体内癌细胞分泌的危险信号，我们首先试图确定输出cgamp的肿瘤模型。我们在培养物中测试了一种人癌细胞系(mda
‑
mb
‑
231)和三种小鼠癌细胞系(e0771、mc38和4t1
‑
luc，其是用于体内成像的表达荧光素酶的4t1细胞系)，所有这些细胞系都表达cgas(图4,小图a)。这些细胞中的细胞内cgamp浓度很难检测。然而，通过额外的浓缩和纯化步骤，我们能够在4t1
‑
luc细胞中检测到5.8x 10
‑
10
nmol/细胞(～150nm)细胞内cgamp(图4,小图b)。使用shrna敲低cgas导致cgas蛋白水平降低和细胞内cgamp水平降低，证明cgas表达控制4t1
‑
luc细胞中存在的cgamp量(图12,小图a和b)。使用化合物1抑制细胞培养基中的细胞表面和可溶性enpp1，我们检测到所有这些细胞系中的cgamp持续输出，并且细胞外cgamp水平在48小时内达到约6x 10
‑9nmol/细胞(当稀释到培养基中时为约10nm)(图4,小图c和d以及图12,小图c和d)。值得注意的是，其大约是存在于细胞内cgamp量的10倍，这表明癌细胞通过输出有效地清除了它们的cgamp。电离辐射(ir)可增加胞质dna并激活肿瘤细胞中cgas依赖性ifn
‑
β的产生(参见例如，bakhoum,s.f.等人numerical chromosomal instability mediates susceptibility to radiation treatment.nat.commun.6,1
–
10(2015)；和vanpouille
‑
box,c.等人dna exonuclease trex1 regulates radiotherapy
‑
induced tumour immunogenicity.nat.commun.8,15618(2017))。事实上，ir处理也增加了2天后4t1
‑
luc细胞内的细胞外cgamp的产生(图4,小图e和图12,小图e)。总之，我们的数据表明，这些癌细胞系不断产生并有效地输出cgamp，并且可以用ir刺激以产生更多的细胞外cgamp。
[0805]
图4,小图a至e：癌细胞表达cgas并在培养物中不断输出cgamp。a,通过蛋白质印迹分析4t1
‑
luc、e0771、mda
‑
mb
‑
231和mc38的cgas表达。b,在无外源刺激的4t1
‑
luc细胞中细胞内cgamp浓度的估计。平均值
±
sem(n＝2)。c,mc38细胞在48小时内产生的细胞外cgamp。在时间0时，用补充有50μm化合物1的培养基更新细胞。平均值
±
sem(n＝2)。数据代表两次独立的实验。d,在50μm化合物1存在下，在48小时后测量由4t1
‑
luc、e0771和mda
‑
mb
‑
231细胞产生的细胞外cgamp。bql＝低于定量限。平均值
±
sem(n＝2)。e,4t1
‑
luc细胞在48小时内产生的细胞外cgamp。在时间0时，细胞未经处理或用20gy ir处理，并用补充有50μm化合物1的培养基更新。平均值
±
sem(n＝2)。*p＝0.04(学生t检验)。
[0806]
图12,小图a至e：癌细胞在培养物中不断输出cgamp。a,通过蛋白质印迹分析4t1
‑
luc wt和4t1
‑
luc shcgas细胞系的cgas表达。b,无外源刺激的4t1
‑
luc wt和4t1
‑
luc shcgas细胞系的细胞内cgamp。平均值
±
sem(n＝2)。4t1
‑
luc wt数据由图4,小图b中重复用于进行比较。c,图4,小图c所示实验的细胞外cgamp(以培养基浓度单位表示)。d,图4,小图d所示实验的细胞外cgamp(以培养基浓度单位表示)。bql＝低于定量限。平均值
±
sem(n＝
2)。e,图4,小图c所示实验的细胞外cgamp(以培养基浓度单位表示)。平均值
±
sem(n＝2)。**p＝0.004(学生t检验)。
[0807]
细胞外cgamp的隔离(sequestration)减少了依赖于肿瘤cgas和宿主sting的肿瘤相关的树突细胞
[0808]
在肿瘤中，细胞外空间估计是细胞内空间体积的0.3
‑
0.8倍
28
。然而，在细胞培养物中，细胞外空间的体积大约是细胞内空间体积的250
‑
1000倍。我们每1x 106个细胞使用1ml培养基，并估计使用大约1
‑
4pl的细胞体积来进行此计算。因此，与肿瘤微环境相比，我们的细胞培养系统将细胞外空间稀释了300
‑
3000倍。鉴于这种稀释因子和我们对癌细胞体外输出的纳摩尔细胞外cgamp的测量，我们预测肿瘤微环境中的细胞外cgamp可以达到微摩尔范围，这可能导致肿瘤细胞的先天免疫识别。认识到我们体外细胞实验的局限性，我们转向体内实验来研究细胞外cgamp的作用(图5,小图a)。首先，我们试图通过敲除肿瘤细胞中的cgas(图13,小图a)并在c57bl/6背景中利用cgas
‑
/
‑
和sting
‑
/
‑
小鼠来确定肿瘤相对宿主cgamp的重要性。我们还开发了一种中和剂作为专门隔离细胞外cgamp的工具(图5,小图a)。我们利用sting的可溶性胞质域(图5,小图b)，其以73
±
14nm的k
d
结合cgamp(图5,小图c)。我们还生成了r237a突变体sting(参见例如，gao,p.等人,cell 154,748
–
762(2013))作为非结合性sting对照(图5,小图b
‑
d)。为了测试这些蛋白质在细胞培养物中的中和功效，我们使用cd14

pbmc。野生型(wt)sting(中和sting)能够以预测的2：1化学计量比中和细胞外cgamp，而非结合的sting即使在200倍高浓度下也没有效果(图5,小图e)。
[0809]
我们在小鼠中建立了e0771原位肿瘤，然后肿瘤内注射中和sting以消耗细胞外cgamp，并切除肿瘤以染色肿瘤相关的白细胞。在wt e0771肿瘤中，中和sting显著减少了总cd45

/mhc
‑
ii

肿瘤相关的抗原呈递细胞(apc)群中的cd11c

树突细胞群，这表明免疫系统可以检测到细胞外cgamp(图5,小图f和g以及图13,小图b)。当肿瘤在cgas
‑
/
‑
小鼠中生长时，细胞外cgamp消耗也减少了cd11c

群，这表明宿主细胞对细胞外cgamp的产生没有显著贡献(图5,小图g以及图13,小图b)。相比之下，当使用cgas
‑
/
‑
e0771细胞(合并多个克隆以实现干净的敲除，但最大限度地减少克隆效应)或sting
‑
/
‑
小鼠时，细胞外cgamp消耗不影响cd11c

群。这表明肿瘤细胞而非宿主细胞是细胞外cgamp的主要生产者，其然后由宿主sting感知(图5,小图g以及图13,小图b)。我们还在balb/c背景下测试了原位4t1
‑
luc肿瘤模型。尽管在此背景下尚未建立cgas和sting敲除菌株，但我们在4t1
‑
luc肿瘤中敲除了cgas。将中和sting肿瘤内注射到wt 4t1
‑
luc肿瘤中显著降低了cd45

/mhc ii

群中肿瘤相关的cd11c

群(图5,小图h以及图13,小图c)。相比之下，细胞外cgamp消耗对cgas
‑
/
‑
4t1
‑
luc肿瘤没有影响(图5,小图h以及图13,小图c)。我们还通过肿瘤内注射menpp1蛋白消耗了细胞外cgamp(图8,小图d)，并再次观察到cd45

/mhc ii

群中cd11c

细胞减少(图5,小图i以及图13,小图d)。我们的e0771和4t1
‑
luc模型的结果共同证明，由肿瘤细胞产生的细胞外cgamp以依赖于宿主sting但不依赖于宿主cgas的方式激活先天免疫反应。总之，我们的数据表明，癌细胞产生的细胞外cgamp是引发先天免疫反应的危险信号。
[0810]
图5,小图a至i：细胞外cgamp的隔离以肿瘤cgas和宿主sting依赖性方式减少肿瘤相关的树突细胞。a,评估细胞外cgamp在体内作用的实验装置。b,重组小鼠wt sting和r237a sting的coomasie凝胶。c,小鼠wt sting(中和)和r237a sting(非结合)的胞质结构域的结合曲线，其通过使用放射性标记的
35
s
‑
cgamp作为探针的膜结合测定法确定。平均值
spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class ii and b7.1 cell
‑
based tumor vaccines.cancer res.58,1486
–
1493(1998))。enpp1
‑
/
‑
肿瘤在达到100mm3之前的初始肿瘤生长速率与wt肿瘤相同，这表明我们没有选择生长缓慢的克隆(图14,小图d)。然而，已建立的enpp1
‑
/
‑
肿瘤侵袭性较低(图6,小图b)，对ir反应更灵敏(图6,小图b)。如果没有ir，适应性免疫检查点阻滞剂抗
‑
ctla
‑
4不会与enpp1
‑
/
‑
协同缩小肿瘤(图14,小图e和f)。引人注意的是，当我们使用ir诱导cgamp产生时，抗
‑
ctla
‑
4治愈了40％的enpp1
‑
/
‑
肿瘤，但没有治愈wt肿瘤任一个(图6,小图c)。直接瘤内注射细胞外cgamp在enpp1
‑
/
‑
肿瘤中比在wt肿瘤中更有效，并且与ir协同可治愈30％的小鼠(图6,小图d)，且没有抗
‑
ctla
‑
4存在。总之，enpp1抑制细胞外cgamp、4t1
‑
luc肿瘤的先天免疫检测，并对它们对ir和适应性免疫检查点阻滞的反应产生负面影响。
[0815]
图6,小图a至d：enpp1
‑
/
‑
肿瘤募集先天免疫浸润，攻击性较低，更容易受到ir和抗ctla
‑
4疗法的影响。a,在第0天将wt或enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc细胞(1x106)原位注射到wt balb/cj小鼠中(每组n＝5)。在第2天用20gy的ir治疗肿瘤。在第3天收获肿瘤并通过facs进行分析。在注射前合并多个enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc细胞克隆，以尽量减少克隆效应。**p＝0.008(welch t检验)。b,将已确定的wt或enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc肿瘤(100
±
20mm3)用0gy或20gy ir治疗一次，然后在ir后第2、5和7天进行3次腹膜内注射igg(对于wt 4t1
‑
luc，n＝9，对于enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc，n＝10)。显示了肿瘤体积和kaplan meier曲线。使用第20天的事后检验和tukey调整(肿瘤体积)和对数秩mantel
‑
cox检验(kaplan meier)进行成对比较来确定p值。****p<0.0001.c,将已确定的wt或enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc肿瘤(100
±
20mm3)用0gy或20gy ir治疗一次，然后在ir后第2、5和7天进行3次腹膜内注射抗
‑
ctla
‑
4(对于所有的组，n＝10)。显示了肿瘤体积和kaplan meier曲线。使用第20天的事后检验和tukey调整(肿瘤体积)和对数秩mantel
‑
cox检验(kaplan meier)进行成对比较来确定p值。****p<0.0001。在enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc ir(20) 抗
‑
ctla
‑
4治疗组中，4/10(40％)小鼠是通过生物发光成像验证的无肿瘤存活者。d,已确定的感染有乱序sgrna序列的4t1
‑
luc肿瘤或enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc肿瘤(100
±
20mm3)用20gy ir治疗一次，然后在ir后第2、4和7天进行3次肿瘤内注射10μg cgamp(n＝10，两组)。显示了肿瘤体积和kaplan meier曲线。使用第20天的事后检验和tukey调整(肿瘤体积)和对数秩mantel
‑
cox检验(kaplan meier)进行成对比较来确定p值。*p<0.05,****p<0.0001。在enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc ir(20)cgamp治疗组中，3/10(30％)小鼠是通过生物发光成像验证的无肿瘤存活者。得自b
‑
d中的不同治疗组的小鼠被共同饲养，实验者是不知情的。
[0816]
图14,小图a至f：已确定的enpp1
‑
/
‑
肿瘤导致肿瘤相关的树突细胞增加，攻击性较低，更容易受到ir和抗ctla
‑
4疗法的影响。a,使用
32
p
‑
cgamp降解测定的enpp1在4t1
‑
luc、e0771和mda
‑
mb231细胞中的活性。数据代表三次独立的实验。b,使用
32
p
‑
cgamp降解测定验证enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc克隆。将得自不同克隆的裂解物由蛋白质浓度归一化。在注射入小鼠前将enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc克隆2
‑
6和13
‑
18合并。c,图6a所示的实验的几何平均值。平均值
±
sd.*p＝0.012(welch t检验)。d,(左侧)wt(n＝55)与enpp1
‑
/
‑
(n＝55)4t1
‑
luc细胞在治疗当天的肿瘤体积；(右侧)初始肿瘤生长速率表示为达到100mm3±
20mm3大小所需的肿瘤体积/天数。平均值
±
sd(welch t检验).e,荷瘤小鼠的生物发光图像。f,重新绘制图6a、b中显示的数据以突出igg和抗
‑
ctla
‑
4治疗组之间的比较。在肿瘤达到所需大小后的第2、5和7天，用3次腹
膜内注射igg或抗ctla
‑
4治疗已建立的wt或enpp1
‑
/
‑
4t1
‑
luc肿瘤(100
±
20mm3)(对于wt 4t1
‑
luc igg，n＝9，对于所有其他组，n＝10)。显示了肿瘤体积和kaplan meier曲线。使用第20天的事后检验和tukey调整(肿瘤体积)和对数秩mantel
‑
cox检验(kaplan meier)进行成对比较来确定p值。
[0817]
我们的遗传结果表明enpp1是药理学抑制的潜在靶点。我们开发的enpp1抑制剂(化合物1)在肿瘤内注射时表现出快速清除。在没有制药公司通常在药物开发后期进行的给药途径和相应的配方优化的广泛研究的情况下，我们询问化合物1在体内是否有作用。我们在ir治疗后立即用化合物1注射肿瘤，并观察到肿瘤相关的cd11c

群在24小时后增加(图7,小图a以及图15)。值得注意的是，化合物1与ir和抗
‑
ctla
‑
4协同作用达到了10％的治愈率(图7,小图b)。最后，观察到化合物1与ir和cgamp协同缩小肿瘤，延长生存期，并达到10％的治愈率(图7,小图c)。总之，这些结果表明enpp1可以在药理学上被靶向以增强对癌症的先天免疫识别。
[0818]
图7,小图a至c：enpp1抑制与ir治疗和抗
‑
ctla
‑
4协同发挥抗肿瘤作用。a,将4t1
‑
luc细胞(1x106)在第0天原位注射到wt balb/cj小鼠中。用20gy ir治疗肿瘤，并在第2天瘤内注射pbs(n＝4)或化合物1(n＝5)。在第3天收获肿瘤并通过facs进行分析。*p＝0.047(welch t检验)。b,将已确定的4t1
‑
luc肿瘤(100
±
20mm3)用20gy ir治疗一次，然后在第2、4和7天进行3次瘤内注射pbs或化合物1，并在第2、5和7天腹膜内注射抗
‑
ctla
‑
4(对于所有治疗组，n＝17
‑
19)。显示了肿瘤体积和kaplan meier曲线。使用第40天的事后检验和tukey调整(肿瘤体积)和对数秩mantel
‑
cox检验(kaplan meier)进行成对比较来确定p值。c,将已确定的4t1
‑
luc肿瘤(100
±
20mm3)用20gy ir治疗一次，然后在ir后第2、4和7天进行3次单独的cgamp或cgamp 化合物1的瘤内注射(每个治疗组n＝9)。显示了肿瘤体积和kaplan meier曲线。使用第40天的事后检验和tukey调整(肿瘤体积)和对数秩mantel
‑
cox检验(kaplan meier)进行成对比较来确定p值。
[0819]
图15显示enpp1抑制与ir治疗协同增加肿瘤相关的树突细胞。实验的几何平均值如图7,小图a中所示。平均值
±
sd。*p<0.05(welch t检验)。
[0820]
图16：从合成细胞到靶细胞的cgamp传递的不同模式。(1)通过间隙连接传播；(2)包装成萌芽的病毒颗粒并在下一轮感染中传播；和(3)输出到细胞外空间。
[0821]
图17：cgamp是癌症危险信号。apc可以通过不同的cgas依赖机制感知肿瘤细胞：(1)通过肿瘤来源的dsdna激活apc cgas，(2)肿瘤细胞分泌的i型ifn的apc感应，以及(3)cgamp的apc感应由肿瘤细胞组成型产生和输出。
[0822]
讨论
[0823]
本公开的结果提供了cgamp输出的证据。细胞间cgamp转移可以通过间隙连接和病毒颗粒发生。本公开提供了cgamp可以穿过细胞外空间的体外和体内证据(参见例如，图16)。cgamp输出是癌细胞的标志，因为我们测试的所有细胞系都可以在没有外部刺激的情况下合成和输出cgamp。由于染色体不稳定和异常胞质dsdna被认为是肿瘤的内在特性，肿瘤细胞很少使cgas失活(参见例如，bakhoum,s.f.等人chromosomal instability drives metastasis through a cytosolic dna response.nature 553,467
–
472(2018))，我们推断恒定的cgamp产生和输出也可能是肿瘤细胞固有的特性。由于尚未鉴定出胞质cgamp水解酶且enpp1不能降解细胞内cgamp，因此输出是目前cgamp从胞质溶胶中去除的唯一机制，并
代表了除泛素介导的sting降解外另一种关闭细胞内sting信号传递的方法(参见例如konno,h.,konno,k.&barber,g.n.cyclic dinucleotides trigger ulk1(atg1)phosphorylation of sting to prevent sustained innate immune signaling.cell 155,688
–
698(2013))。然而，这种清除机制使癌细胞暴露于免疫检测中。
[0824]
事实上，我们的结果表明由癌细胞输出的cgamp是免疫系统检测到的危险信号。来自癌细胞的新抗原由apc呈递，以交叉(cross)初始细胞毒性cd8

t细胞，最终执行癌症特异性杀伤。然而，人们对apc最初如何检测癌细胞的了解较少。免疫原性肿瘤释放dsdna作为对cd11c

树突状细胞(一种重要的apc类型)的危险信号(参见例如，xu,m.m.等人dendritic cells but not macrophages sense tumor mitochondrial dna for cross
‑
priming through signal regulatory protein a signaling.immunity 47,363
–
373(2017))。此外，癌细胞对辐射诱导的自身胞质dsdna作出反应，并产生ifn作为危险信号(vanpouille
‑
box,c.等人dna exonuclease trex1 regulates radiotherapy
‑
induced tumour immunogenicity.nat.commun.8,15618(2017))。肿瘤cgas的催化活性以宿主sting依赖性方式与b16黑色素瘤模型中的肿瘤免疫相关(参见例如，marcus,a.等人tumor
‑
derived cgamp triggers a sting
‑
mediated interferon response in non
‑
tumor cells to activate the nk cell response.immunity 49,754
–
763.e4(2018))，这表明cgamp可以从肿瘤细胞转移到宿主细胞，但机制未知。在这里，我们提供了直接证据表明癌细胞产生可溶性细胞外cgamp作为危险信号，从而导致肿瘤微环境中的树突状细胞数量增加(图17)。cgamp输出是非物理连接但距离较近的细胞之间cgamp通信的重要模式。与细胞因子不同，cgamp不能在细胞外空间中长距离传播而不被降解和/或稀释到低于其有效浓度。该特性与神经递质共享，使cgamp成为第一个确定的免疫递质。
[0825]
因此，如果不能快速清除cgamp，那么将cgamp释放到细胞外空间是癌症的致命要害。我们证明enpp1在体外负调节细胞外cgamp信号传导及其在小鼠中的下游抗癌免疫激活。由于肿瘤来源的可溶性cgamp可自由扩散，因此在一个细胞表面过表达enpp1肯定可以清除附近微环境中的cgamp并为其邻域提供适应性。在人类中，乳腺癌中的enpp1表达水平与耐药性(参见例如，umar,a.等人mol.cell.proteomics 8,1278
–
1294(2009))、骨转移(参见例如，lau,w.m.等人plos one 8,1
–
5(2013))和不良预后(takahashi,r.u.等人nat.commun.6,1
–
15(2015))相关。enpp1可以作为先天免疫检查点被靶向用于抑制，以用于癌症免疫治疗。
[0826]
尽管为了清楚理解起见，通过举例说明和实施例对前述发明进行了详细描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对本发明作出某些改变和更改。
[0827]
因此，前述内容仅举例说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出尽管未在本文中明确描述或示出、但体现了本发明的原理并且被包括在其精神和范围内的各种布置。此外，本文列举的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而做出的构思，并且应解释为不限于此类具体列举的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案及其特定实施例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等效物。另外，此类等同物意在包括当前已知的等效物和将来开发的等效物，即，开发的执行相同功能的任何元件，而与结构无关。因此，本发明的范围不旨在限于本
文示出和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
[0828]
因此，本发明的范围并不旨限于文中所示和所述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在权利要求中，35u.s.c.
§
112(f)或35u.s.c.
§
112(6)被明确定义为仅当在权利要求中的此类限制的开头引用准确的短语“用于
……
的方法”或准确的短语“用于
……
的步骤”时才被援引以对权利要求中的限制进行限制；如果在权利要求的限制中未使用此类准确的短语，则不援引35u.s.c.
§
112(f)或35u.s.c.
§
112(6)。