T细胞修饰的制作方法

t细胞修饰
技术领域
1.本发明涉及修饰t细胞以增加其细胞毒活性以及修饰的t细胞在免疫疗法中，例如用于治疗癌症的用途。


背景技术：

2.免疫疗法有望改变癌症治疗领域，并有望带来长期生存(mcdermott et al.,cancer treat rev.2014 oct；40(9):1056
‑
64)。对于新的免疫调节药物，存在对扩大患者群体和肿瘤类型范围的明显未满足的医疗需求。另外，需要新的试剂来增强抗肿瘤反应的强度和持续时间。由于对过去二十年控制t细胞免疫的基本原理的深入了解，这些试剂的开发成为可能(sharma和allison,cell.2015 apr 9；161(2):205
‑
14)。这通常需要肿瘤特异性cd4 和cd8 t细胞识别由mhc分子呈递的肿瘤相关肽抗原。不同的疫苗接种策略和离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移在一些情况下已证明了肿瘤特异性t细胞治疗晚期癌症的能力(rosenberg et al.,nat med.2004 sep；10(9):909
‑
15)。然而，对肿瘤抗原的高耐受性与通常存在于肿瘤部位处的强免疫抑制微环境相结合，表现为t细胞抗肿瘤活性的次优激活。因此，由于t细胞对自身抗原的耐受性，缺乏高亲和力t细胞的个体可能对免疫检查点阻断疗法，如抗pd
‑
1和抗ctla
‑
4没有反应。
3.基因改造可能通过产生高亲和力t细胞受体(tcr)来帮助克服内源性高亲和力t细胞对肿瘤抗原的频率低的问题，并为对检查点抑制剂治疗无反应的患者提供临床益处。对于数种抗原，包括gp100、mage
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a3和ny
‑
eso
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1，该方法已被证明可以在体外将野生型tcrs对其天然配体肽/mhc i类复合物的亲和力增加10
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1000倍(li et al.,nat biotechnol.2005 mar；23(3):349
‑
54；robbins et al.,j immunol.2008 may 1；180(9):6116
‑
31)。
4.较高亲和力的tcrs允许t细胞对较低水平的抗原作出反应；这在肿瘤微环境已适应降低抗原表达和降低mhc i类分子表达的情况下很重要(barrett和blazar,n engl j med.2009年7月30日；361(5):524
‑
5；marincola et al.,adv immunol.2000；74:181
‑
273)。经由tcr改造的t细胞疗法或利用t细胞重定向生物制剂已实现将t细胞重定向肿瘤(bossi et al.,cancer immunol immunother.2014年5月；63(5):437
‑
48；fan et al.,j hematol oncol.2015 dec 21；8:130)。
5.t细胞治疗已显示出治疗一些复发性或高危肿瘤的治疗潜力(dudley et al.,j immunother.2003年7月
‑
8月；26(4):332
‑
42；dudley et al.,j clin oncol.2005年4月1日；23(10):2346
‑
57；kalos et al.,sci transl med.2011年8月10日；3(95):95ra73)。目前有两种方法用于对患者t细胞进行基因改造以识别肿瘤抗原，包括嵌合抗原受体(cars)和亲和力成熟的tcrs。然而，cars仅限于靶向细胞表面上的表位。基于tcr的疗法不仅能够识别细胞表面蛋白，还可以识别内部细胞蛋白。另外，tcr方法通过募集内源性信号分子和t细胞与其特定靶标之间的时空相互作用，更接近地模拟t细胞的天然功能。然而，它仅限于共有适当mhc限制的个体，由tcr识别，并且可能需要并行开发hla类型和抗原表达的患者选择测定。
6.mhc i类限制性t细胞结合受体(tcr)与肽
‑
mhc复合物的结合被称为cd8(分化簇8)的糖蛋白稳定，其也募集src家族激酶lck，并增强信号传导。cd8与mhc i类恒定部分的结合导致结合亲和力增加和对靶细胞上抗原的反应阈值降低(gao,nature.1997年6月5日；387(6633):630
‑
4；artyomov et al.,proc natl acad sci u s a.2010年9月28日；107(39):16916
‑
21)。将cd8转基因添加到tcr慢病毒载体中可以赋予cd4 t细胞类似的增强反应，增强它们为cd8 t细胞提供辅助功能以及另外的直接肿瘤细胞杀伤的能力，可能导致增强的临床疗效。cd8α/cd8β(分化簇8)是一种异二聚体跨膜糖蛋白，由细胞毒性t细胞、自然杀伤(nk)细胞和树突细胞表达。其结合i类肽
‑
主要组织相容性抗原(pmhcs，在男性中这通常被描述为肽
‑
人白细胞抗原或phlas)上的保守区域，并且在这样做时其充当mhc肽
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由t细胞受体(tcrs)特异性结合的通用共受体。cd8α/cd8β在成熟的cd4 t细胞中没有发现，其中它们的抗原特异性tcrs与相关但不同的ii类pmhc抗原结合，并且其中cd4同源二聚体充当tcr共受体。
7.最常见的共受体依赖性tcrs类型是异二聚体跨膜糖蛋白，其具有α和β多肽链。当α/βtcrs与i类pmhc抗原结合时，它们会触发磷酸化事件的细胞内信号传导级联，这会激活大量细胞事件，包括通过细胞毒性t细胞杀伤表达pmhc的靶细胞。这种信号传导级联由lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)磷酸化tcr结合的cd3跨膜蛋白起始。
8.cd8α/cd8β和lck之间的细胞内关联被认为可以增强tcr信号传导。在人类中，除了cd8α/cd8β异源二聚体外，约三分之一的cd8 细胞也显示出cd8α/cd8β同源二聚体形式。在一些肠道t细胞、nk细胞和γ/δt细胞中，仅发现这种同型二聚体形式。
9.有证据表明，在人类中，这种cd8α同源二聚体可以在功能上完全替代cd8α/cd8β异源二聚体(cole et al.,immunology.2012 oct；137(2):139
‑
48)。
10.在体内，tcrs和cd8二聚体与i类phla的同时结合会影响t细胞克隆的胸腺阳性/阴性选择。这决定了这些t细胞克隆表达的tcrs的phla抗原亲和力。一般来说，病原体相关phla反应性t细胞克隆中的tcr抗原亲和力高于识别癌症相关抗原的等效t细胞克隆。tcr亲和力增强技术可以将癌症反应性tcrs的亲和力提高到接近病原体反应性tcrs的亲和力。这些tcr亲和力的增加导致通常与cd8共受体无关的tcrs。利用表达这些tcrs的基因表达载体细胞转导cd4 t细胞产生了新的i类phla特异性cd4 t细胞实体，其具有杀伤和辅助功能，在其他情况下其通常只能被ii类特异性肽
‑
抗原激活(tan et al.,clin exp immunol.2017 jan；187(1):124
‑
137)。这些tcrs允许t细胞比它们的野生型亲本tcrs更有效地识别它们的癌症靶细胞。重要的是，即使在cd8 t细胞中，即在内源性cd8共受体存在的情况下，phla抗原特异性也能保持。
11.尽管共受体独立意味着这些亲和力增强的tcrs也可以在一定程度上在cd4 t细胞中起作用，但显然cd4 t细胞中的最佳tcr亲和力高于其在cd8 t细胞中的亲和力(tan et al.同上)。持续需要新的和改进的基于tcr的疗法，以增强患者中抗肿瘤反应的大小和持续时间。
12.发明概述
13.本发明发明人已认可表达异源t细胞受体的t细胞中异源cd8共受体的共表达增加了t细胞的活性。
14.本发明的第一方面提供了表达异源cd8共受体和异源t细胞受体(tcr)的t细胞或
修饰的t细胞群体。
15.优选地，异源tcr特异性结合展示癌细胞表达的肿瘤抗原(phla)的肽片段的hla。根据本发明，异源tcr可以特异性结合癌症或肿瘤抗原或其肽、抗原，优选癌症或肿瘤抗原的肽、抗原肽或肽片段，其任选地展示在hla(phla)上，优选地由肿瘤细胞或癌细胞表达。根据本发明，肿瘤抗原可以是癌
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睾丸抗原、ny
‑
eso
‑
1、mart
‑
1(t细胞识别的黑素瘤抗原)、wt1(wilms瘤1)、gp100(糖蛋白100)、酪氨酸酶、prame(优选地在黑素瘤中表达的抗原)、p53、hpv
‑
e6/hpv
‑
e7(人乳头瘤病毒)、hbv、trail、dr4、甲状腺球蛋白、tgfbii移码抗原、lage
‑
1a、kras、cmv(巨细胞病毒)、cea(癌胚抗原)、afp(α
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胎儿蛋白)、mage
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a1、mage
‑
a2、mage
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a3、mage
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a4、mage
‑
a6、mage
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a8和mage
‑
a9、mage
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a10或mage
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a12。优选地肿瘤抗原是mage
‑
a4。优选地肿瘤抗原肽片段具有氨基酸序列gvydgrehtv。根据本发明，tcr可以是展示肿瘤抗原(phla)的肽片段的hla，其中所述hla是hla i类和/或hla ii类，优选地hla i类。优选地所述hla是hla
‑
a2或hla
‑
a*02或hla
‑
a2 或hla
‑
a*02阳性hla，优选地hla
‑
a*0201。
16.修饰的t细胞或t细胞可以包含编码cr的异源核酸和编码cd8共受体的异源核酸，或者可以包含编码tcr和异源cd8共受体的异源核酸。
17.优选地，修饰的t细胞是cd4 或cd8 ，或者修饰的t细胞群体包含cd4 t细胞或cd8 t细胞或cd4 t细胞和cd8 t细胞的混合物或者由其组成。
18.优选地，cd8共受体是cd8α共受体。cd8α共受体可以包含seq id no:1的氨基酸序列或其变体。cd8α共受体可以是同源二聚体cd8αα。在替代选择中，cd8共受体可以包含cd8αβ共受体同源二聚体。
19.异源tcr可以是亲和力增强的tcr，例如特异性肽增强的受体(spear)tcr。作为亲和力增强的tcr或特异性肽增强的受体(spear)tcr，异源tcr可被改造以针对抗原肽优化特异性和/或活性，和/或任选地当hla呈递时降低交叉反应性和/或同种异体反应性的风险。因此，(spear)tcr特异性可以通过使用在每个氨基酸处用每种其他可能的氨基酸组合取代(x
‑
scan)将包含tcr的t细胞的反应映射到抗原肽的合成变体的面板上来评估，以识别人和常见病原体蛋白质组中的潜在的交叉反应肽。然后可以针对来自多个器官系统的正常(非肿瘤)原代细胞、诱导的多能干细胞来源的细胞(icells)和自体全血对(spear)tcr进行筛选，以测试脱靶反应性，并针对表达多种多样的hla分子的一组ebv来源的b淋巴母细胞系进行筛选，以评估交叉反应性和/或同种异体反应性的风险。同种异体反应性通过表达hla等位基因的抗原阴性细胞中的测定来确定，以确定排他性等位基因的存在。由此可以产生具有选择为没有交叉反应性和/或定义的hla等位基因排斥的抗原肽特异性的异源tcr的t细胞。可以按本文针对对于任选地hla呈递的抗原肽的结合亲和性和亲和力所述的，进一步选择tcr或表达异源tcr的t细胞。还可以按本文针对如通过多种体外测定，包括t细胞增殖、ifn
‑
γ释放和响应2d和3d培养物中的抗原阳性肿瘤系的细胞毒性，以及响应新鲜制备的抗原阳性原发肿瘤物质的细胞因子释放所评估的效力所述的，进一步选择tcr或表达异源tcr的t细胞。
20.本发明的第二方面提供了产生t细胞或修饰的t细胞群体的方法，包括修饰t细胞或t细胞群体以表达根据本发明的异源cd8共受体和异源t细胞受体。
21.可以从个体获得t细胞或t细胞群体，任选地其中所述个体包括肿瘤或癌症。
22.可以通过将编码tcr的核酸和编码cd8共受体的核酸引入t细胞中或通过引入编码
根据本发明的异源tcr和异源cd8共受体的异源核酸，来修饰t细胞。
23.本发明的第三方面提供了药物组合物，其包含根据第一方面的或通过第二方面的方法产生的t细胞或修饰的t细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。
24.本发明的第四方面提供了治疗癌症的方法，包括向有需要的个体施用根据第一方面的或通过第二方面的方法产生的修饰的t细胞群体；或者第三方面的药物组合物。
25.修饰的t细胞群体的tcr可以特异性和/或选择性结合个体中的肿瘤或癌细胞，任选地以高亲和性和/或高亲和力结合。例如，tcr可以结合或者特异性和/或选择性结合癌症或肿瘤抗原或其肽、抗原，优选地癌症或肿瘤抗原的肽、抗原肽或肽片段，其任选地呈递在hla(phla)上，优选地由肿瘤细胞或癌细胞表达。
26.本发明的第五方面提供了治疗个体中的癌症的方法，包括：
27.提供从供体个体获得的t细胞群体，
28.修饰t细胞群体以表达异源cd8共受体和异源t细胞受体，从而产生根据本发明的修饰的t细胞群体，和
29.向受体个体施用修饰的t细胞群体。
30.根据本发明以及第四和第五方面，癌症可以是滑膜肉瘤、粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤(mrcls)、头颈癌、头颈部scc(鳞状细胞癌)、黑素瘤、食管癌、卵巢癌、胃癌(胃)、膀胱癌、肺癌、非小细胞肺nsclc(鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌)、转移性或晚期nsclc、尿路上皮癌或肿瘤、食管胃交界处癌症(egj)，任选地其中所述癌症或肿瘤表达mage单倍或肽，优选地mage
‑
a4蛋白或肽。可选地，癌症可以是以下中的任一种：肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、转移性胃部癌症、转移性胃癌、转移性肝癌、转移性卵巢癌、转移性胰腺癌、转移性结直肠癌、转移性肺癌、结直肠癌或腺癌、肺癌或腺癌、胰腺癌或腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管癌。
31.供体个体和受体个体可以是相同的(即自体治疗；从随后用修饰的t细胞治疗的个体获得的修饰的t细胞)，或者供体个体和受体个体可以是不同的(即同种异体治疗；从一个个体获得修饰的t细胞并随后用于治疗不同的个体)。自体的是指来源于随后其被重新引入同一对象的对象的任何物质。
32.本发明的第六方面提供了根据第一方面的或根据第二方面产生的修饰的t细胞群体或第三方面的药物组合物用于第四个或第五方面的方法；以及根据第一方面的或根据第二方面产生的修饰的t细胞群体或第三方面的药物组合物在制备用于第四或第五方面的方法的药物中的用途。
33.本发明的第七方面提供了分离的核酸，其包含编码根据本发明的异源tcr的核苷酸序列，任选地在单个开放阅读框中，或在分别编码tcrα链和β链的不同的和/或多个开放阅读框中；和/或编码根据本发明的异源cd8共受体的核苷酸序列，任选地在单个开放阅读框中，或在分别编码cd8α链或者α链和β链的不同的开放阅读框中。可选地，tcr和/或cd8共受体的链可以在不同的核酸上编码。
34.本发明的第八方面提供了载体，其包含第七方面的分离的核酸。载体可以是表达载体，其还可以包含编码的本发明的核酸的tcr和cd8共受体表达的调控元件。本发明还提供了包含编码根据本发明的tcr的α链的核酸或核苷酸序列的第一构建体或载体，和/或包含编码根据本发明的tcr的β链的核酸的第二构建体或载体，以及包含编码cd8共受体链、α和/或β的核酸的第三和/或第四构建体或载体。本发明还提供了包含本发明的(分离的)核
酸或核苷酸序列的构建体或载体，其可以优选地是病毒载体、γ逆转录病毒载体或慢病毒载体，如vsvg假型慢病毒载体。优选地，所述构建体或载体包含有效的调控元件，其将驱动本发明的编码本发明的tcr和/或cd8共受体的核酸或核苷酸序列的转录和/或翻译，任选地在修饰的t细胞中。
35.优选地，载体可以是病毒载体、γ逆转录病毒载体或慢病毒载体，如vsvg假型慢病毒载体。优选地慢病毒载体。
36.本发明的第九方面提供了病毒颗粒，其包含第七方面的分离的核酸和/或第八方面的载体。
37.本发明的第十方面提供了制造病毒颗粒，任选地根据第九方面的病毒颗粒的方法，其包括：
38.用第八方面的病毒载体和一种或多种病毒包装和包封载体转导哺乳动物细胞，和
39.在培养基中培养转导的细胞，以使细胞产生释放至培养基中的病毒颗粒，任选地慢病毒颗粒。
40.例如，可以用编码病毒包装和包封元件的质粒以及包含本发明的核酸或核苷酸序列的慢病毒载体转染hek293t细胞。根据本发明，可以与水泡性口炎病毒(vsvg)的病毒包封糖蛋白g结合产生包含本发明的核酸或核苷酸序列的vsvg假型病毒载体，以产生假型病毒颗粒。
41.本发明还提供了产生根据本发明的t细胞或修饰的t细胞群体的方法，包括将一个或多于一个拷贝的根据第七方面的核酸和/或根据第八方面的载体引入t细胞或t细胞群体中，任选地其中所述核酸和/或载体包含在根据第九方面的或根据第十方面产生的病毒颗粒中，从而修饰t细胞或t细胞群体，以表达根据本发明的异源cd8共受体和异源t细胞受体。
42.下面更详细地描述本发明的这些和其他方面和实施方案。
43.下面更详细地描述本发明的这些和其他方面和实施方案。
44.发明详述
45.本发明涉及表达异源cd8共受体和异源t细胞受体(tcr)的修饰的t细胞，以及其制备和使用方法。
46.t细胞(也称为t淋巴细胞)是全血细胞，其在细胞介导的免疫中起主要作用。t细胞与其他淋巴细胞的区别可能在于在细胞表面上存在t细胞受体(tcr)。有数种类型的t细胞，每种类型具有不同的功能。
47.t辅助细胞(t
h
细胞)被称为cd4

t细胞，因为它们表达cd4表面糖蛋白。cd4

t细胞在适应性免疫系统中发挥重要作用，并通过释放t细胞细胞因子和帮助抑制或调节免疫反应而有助于其他免疫细胞的活性。它们对于细胞毒性t细胞的激活和生长至关重要。
48.细胞毒性t细胞(tc细胞、ctls、杀伤t细胞)也称为cd8

t细胞，因为它们表达cd8表面糖蛋白。cd8

t细胞用于破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。大多数cd8

t细胞表达能够通过i类mhc分子识别感染或损伤的细胞表面上呈递的特定抗原的tcrs。tcr和cd8糖蛋白与抗原和mhc分子的特异性结合引起感染或损伤细胞的t细胞介导的破坏。
49.用于本文所述用途的t细胞可以是cd4

t细胞；或cd4

t细胞和cd8

t细胞。例如，t细胞可以是cd4

t细胞和cd8

t细胞的混合群体。因此，修饰的t细胞可以是修饰的t细胞，任选地cd4 t细胞或cd8 t细胞、修饰的t细胞，任选地cd4 t细胞的群体；或cd8 t细胞，或cd4 t
细胞和cd8 t细胞的混合群体。
50.可以从供体个体获得用于本文所述用途的合适的t细胞。在一些实施方案中，供体个体可以是与将在按本文所述修饰和扩增(自体处理)后施用t细胞的受体个体相同的个体。在其他实施方案中，供体个体可以是与将在按本文所述修饰和扩增(同种异体处理)后施用t细胞的受体个体不同的个体。例如，供体个体可以是与患癌症的受体个体人白细胞抗原(hla)匹配的(捐献前或捐献后)健康个体。
51.本文所述的方法可以包括从个体获得t细胞，和/或从获自个体，任选地患有肿瘤和/或癌症的个体的样品分离t细胞的步骤。
52.可以从血液样品中分离t细胞群体。用于分离t细胞的合适方法是本领域众所周知的，并且包括例如荧光活化细胞分选(facs:参见例如，rheinherz et al(1979)pnas 76 4061)、细胞淘选(参见例如，lum et al(1982)cell immunol 72 122)和使用抗体包被的磁珠分离(参见，例如，gaudernack et al 1986j immunol methods 90 179)。
53.可以从血液样品中获得的外周血单核细胞(pbmc)群体中分离cd4

和cd8

t细胞。可以使用标准技术从血液样品中提取pbmcs。例如，ficoll可与梯度离心结合使用( a.scand j clin lab invest.1968；21(suppl.97):77
‑
89)，以将全血分离成血浆的顶层，然后是pbmcs层和多形核细胞和红细胞的底部部分。在一些实施方案中，pbmcs可以耗尽cd14

细胞(单核细胞)。
54.分离后，t细胞可以被激活。用于激活t细胞的合适方法是本领域众所周知的。例如，分离的t细胞可以暴露于t细胞受体(tcr)激动剂。合适的tcr激动剂包括配体，如抗原呈递细胞，如树突细胞表面上的i类或ii类mhc分子上展现的肽，以及可溶性因子，如抗tcr抗体。
55.激活是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的t细胞的状态。激活也可能与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能有关。术语“活化的t细胞”是指正在进行细胞分裂的t细胞等。
56.抗tcr抗体可以特异性结合tcr的组分，如εcd3、αcd3或αcd28。适合于tcr刺激的抗tcr抗体是本领域众所周知的(例如okt3)，并且可从商业供应商(例如ebioscience co usa)获得。在一些实施方案中，t细胞可通过暴露于抗αcd3抗体和il2而被激活。更优选地，t细胞通过暴露于抗αcd3抗体和抗αcd28抗体而被激活。活化可能在cd14

单核细胞存在或不存在的情况下发生。优选地，可以用抗cd3和抗cd28抗体包被的珠子激活t细胞。例如，可以使用抗体包被的珠子，例如用抗cd3和抗cd28抗体，如人t活化剂cd3/cd28(thermofisher scientific)包被的磁珠激活pbmcs或包括cd4

和/或cd8

细胞在内的t细胞亚群，而无需饲养细胞(抗原呈递细胞)或抗原。
57.在分离和活化后，t细胞可被修饰以表达如本文所述的cd8共受体和t细胞受体(tcr)。
58.根据本发明，cd8共受体可以包含二聚物或一对cd8链，其包含cd8
‑
α和cd8
‑
β链或者cd8
‑
α和cd8
‑
α链。优选地，cd8共受体是cd8α共受体。cd8α共受体可以包含与seq id no:1具有至少80％同一性、seq id no:1或其变体的氨基酸序列。cd8α共受体可以是同源二聚体。
59.cd8共受体结合1类mhcs并增强tcr信号传导。cd8共受体可以包含seq id no:1的
参考氨基酸序列或者可以是其变体。变体可以具有与参考氨基酸序列具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。cd8共受体可以由seq id no:2的参考核苷酸序列编码，或者可以是其变体。变体可以具有与参考核苷酸序列具有以至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
60.根据本发明，异源cd8共受体可以包含cd8共受体，其中在类似v型结构域的ig中包含具有以下序列的cdrs：
61.(i)vllsnptsg、cdr1、seq id no:15或seq id no:1的氨基酸45
‑
53，
62.(ii)ylsqnkpk、cdr2、seq id no:16或seq id no:1的氨基酸72
‑
79，
63.(iii)lsnsim、cdr3、seq id no:17或seq id no:1的氨基酸80
‑
117，或与其具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。
64.根据本发明，异源cd8共受体可以包含cd8共受体，其包含或者其中，在类似v型结构域的ig中包含seq id no:1的氨基酸序列的残基22
‑
135，或氨基酸序列，其中其氨基酸残基22
‑
44、54
‑
71、80
‑
117、124
‑
135分别与seq id no:1的氨基酸残基22
‑
44、54
‑
71、80
‑
117、124
‑
135、cdr1、cdr 2、cdr 3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且其中氨基酸残基45
‑
53、72
‑
79和118
‑
123分别与seq id no:1的氨基酸残基45
‑
53、72
‑
79和118
‑
123的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。
65.根据本发明，cd8共受体可以包含cd8共受体，其中或者其中在类似v型结构域的ig中，以下的序列：
66.(i)其氨基酸残基22
‑
44可以(a)分别与seq id no:1的氨基酸残基22
‑
44的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或(b)可以相对于seq id no:1的残基22
‑
44分别具有一个、两个或三个插入或缺失的氨基酸残基，
67.(ii)氨基酸残基45
‑
53是vllsnptsg、seq id no:15、cdr 1或seq id no:1的氨基酸45
‑
53，
68.(iii)其氨基酸残基54
‑
71可以(a)与seq id no:1的氨基酸残基54
‑
71的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者(b)相对于seq id no:1的氨基酸残基54
‑
71的序列可以具有一个、两个或三个插入或缺失的氨基酸残基，
69.(iv)氨基酸残基72
‑
79可以是ylsqnkpk、cdr 2、seq id no:16或seq id no:1的氨基酸72
‑
79，
70.(v)其氨基酸残基80
‑
117可以与seq id no:1的氨基酸残基80
‑
117的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者相对于seq id no:1的氨基酸残基80
‑
117的序列可以具有一个、两个或三个插入、缺失或取代；
71.(vi)氨基酸118
‑
123可以是lsnsim、cdr 3、seq id no:17或seq id no:1的氨基酸80
‑
117，
72.(vii)其氨基酸残基124
‑
135可以与seq id no:1的氨基酸残基124
‑
135的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者相对于seq id no:1的氨基酸残基
124
‑
135的序列可以具有一个、两个或三个插入、缺失或取代。
73.表达cd8共受体的根据本发明的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体任选地在呈递在hla上时可以显示针对或对于抗原肽、肿瘤或癌症抗原刺激的提高的亲和性和/或亲和力和/或提高的t细胞激活，如通过本文公开的测定所确定的。
74.根据本发明，修饰的t细胞或修饰的t细胞群体的cd8可以与mhc相互作用或特异性结合，所述mhc可以是i类或ii类，优选地i类主要组织相容性复合体(mhc)、hla
‑
i分子或与mhc i类hla
‑
a/b2m二聚物相互作用或特异性结合，优选地cd8
‑
α与i类mhc的α3部分(在残基223和229之间)相互作用，优选地经由cd8的igv样结构域。根据本发明，相比缺少异源cd8的t细胞，cd8提高t细胞或t细胞群体与由hla pmhci或phla结合或呈递的，任选地在抗原呈递细胞、树状细胞和/或肿瘤或癌细胞、肿瘤或癌症组织表面上的hla和/或抗原肽的tcr结合。根据本发明，相比缺少异源cd8的t细胞，cd8可以改善或增加任选地在抗原呈递细胞、树状细胞和/或肿瘤或癌细胞、肿瘤或癌症组织表面上的本发明的t细胞或其群体的t细胞(tcr)/肽
‑
主要组织相容性复合体i类(pmhci)相互作用的解离速率(k
off
)，并因此改善或增加其半衰期，并因此也可以提供改善的连接亲和性和/或亲和力。在这种情况下，cd8可能在组织t细胞表面上的tcr中提供重要作用，以实现phla结合的协同性，并可能提供改善的治疗亲和力。根据本发明，异源cd8共受体修饰的t细胞或修饰的t细胞群体可以以锌依赖性方式与lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)结合或相互作用，引起转录因子如nfat、nf
‑
κb和ap
‑
1的激活。
75.如本文所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体也表达特异性结合癌症或肿瘤抗原或其肽和/或肿瘤和/或癌细胞和/或来自其的肽或抗原肽的t细胞受体(tcr)。tcrs是二硫键连接的膜锚定异二聚体蛋白，通常包含表达为具有不变cd3链分子的复合物的高度可变的alpha(α)和beta(β)链。表达这些类型的tcrs的t细胞被称为α:β(或αβ)t细胞。少数t细胞表达替代的tcr，其包含可变gamma(γ)和delta(δ)链，并被称为γδt细胞。
76.根据本发明的t细胞或t细胞群体可以包含异源tcr，其可以特异性结合和/或以高亲和力结合癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的并由异源tcr识别的，任选地在与hla的复合物中的肽、抗原肽、肽片段。根据本发明，异源tcr可以以下述解离常数结合：0.01μμ至100μμ、0.01μμ至50μμ、0.01μμ至20μμ、0.05μμ至20μμ或0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1μμ、0.15μμ、0.2μμ、0.25μμ、0.3μμ、0.35μμ、0.4μμ、0.45μμ、0.5μμ、0.55μμ、0.6μμ、0.65μμ、0.7μμ、0.75μμ、0.8μμ、0.85μμ、0.9μμ、0.95μμ、1.0μμ、1.5μμ、2.0μμ、2.5μμ、3.0μμ、3.5μμ、4.0μμ、4.5μμ、5.0μμ、5.5μμ、6.0μμ、6.5μμ、7.0μμ、7.5μμ、8.0μμ、8.5μμ、9.0μμ、9.5μμ、10.0μμ；10μμ至1000μμ、10μμ至500μμ、50μμ至500μμ或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μμ、150μμ、200μμ、250μμ、300μμ、350μμ、400μμ、450μμ、500μμ；任选地利用表面等离子体共振，任选地在25℃，任选地在7.0
‑
7.5的ph测得。解离常数k
d
或k
off
/k
on
可以通过实验测量解离速率常数k
off
和结合速率常数k
on
来确定。可以使用tcr的可溶形式测量解离常数，其中tcr包括tcrα链可变域和tcrβ链可变域。因此，根据本发明的异源tcr能够例如以0.01μμ至100μμ，如50μμ、100μμ、200μμ、500μμ，优选地0.05μμ至20.0μμ的解离常数，有效地和/或以高亲和力结合展示gvydgrehtv的hla，例如在与hla
‑
a*02或hla
‑
a*0201的复合物中。
77.根据本发明的，异源tcr可以选择性结合癌症或肿瘤抗原或其肽、抗原，优选地癌症或肿瘤抗原的，任选地在hla(phla)上呈递的，优选地由肿瘤细胞或癌细胞或组织表达的肽、抗原肽或肽片段。选择性结合表示异源tcr相比另一种以更大的亲和力与抗原，优选地癌症或肿瘤抗原的，任选地呈递在hla(phla)上的一种肽、抗原肽或肽片段结合。根据本发明，结合是对于癌症或肿瘤抗原或其肽选择性的和/或特异性的，所述癌症或肿瘤抗原或其肽可以是癌
‑
睾丸抗原、ny
‑
eso
‑
1、mart
‑
1(由t细胞识别的黑素瘤抗原)、wt1(wilms瘤1)、gp100(糖蛋白100)、酪氨酸酶、prame(优选地在黑素瘤中表达的抗原)、p53、hpv
‑
e6/hpv
‑
e7(人乳头瘤病毒)、hbv、trail、dr4、甲状腺球蛋白、tgfbii移码抗原、lage
‑
1a、kras、cmv(巨细胞病毒)、cea(癌胚抗原)、afp(α
‑
胎儿蛋白)、mage
‑
a1、mage
‑
a2、mage
‑
a3、mage
‑
a4、mage
‑
a6、mage
‑
a8和mage
‑
a9、mage
‑
a10或mage
‑
a12。优选地，肿瘤抗原是mage
‑
a4。另外和/或可选地，结合的选择性可以针对hla类型，即对应于mhc i类(a、b和c)的hla，它们都是hla 1类或其特定等位基因或对应于mhc ii类(dp、dm、do、dq和dr)的hlas或其特定等位基因，优选地hla为1类，优选地等位基因为hla
‑
a2或hla
‑
a*02或hla
‑
a2 或hla
‑
a*02阳性hla,优选地hla
‑
*0201。
78.合适的tcrs与展示肿瘤抗原的肽片段的肿瘤或癌细胞的表面上的主要组织相容性复合体(mhc)特异性结合。mhc是一组细胞表面蛋白，它允许获得性免疫系统识别“外来”分子。蛋白质在细胞内被mhc降解并呈递在细胞表面上。展示“外来”肽，如病毒或癌症相关的肽的mhcs被具有适当tcrs的t细胞识别，促进细胞破坏途径。肿瘤或癌细胞表面上的mhcs可以展示癌症或肿瘤抗原，即在肿瘤或癌细胞但非相应的非癌症或非肿瘤细胞上呈递的抗原的肽片段。识别这些肽片段的t细胞可以赋予对肿瘤或癌细胞的细胞毒性效应。
79.优选地，tcr并非由t细胞天然表达(即tcr是外源的或异源的)。异源tcrs可以包括αβtcr异二聚体。合适的异源tcrs可以特异性结合表达肿瘤或癌症抗原的肿瘤或癌细胞。例如，t细胞可被修饰以表达特异性结合展示由癌细胞表达的，任选地在特定癌症患者中的肿瘤抗原的肽片段的mhcs的异源tcr。可以使用标准技术鉴定由癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原。
80.异源tcr可以是重组或合成的或人工tcr，即天然下不存在的tcr。例如，异源tcr可被改造以增加其对肿瘤抗原的亲和性或亲和力(即，亲和力增强的tcr)。相对于天然存在的tcr，亲和力增强的tcr可以包括一个或多个突变，例如，tcrα和β链的可变区的高变互补决定区(cdr)中的一个或多个突变。这些突变可能会增加tcr对mhcs的亲和力，任选地当由癌细胞表达时，mhcs会显示肿瘤抗原的肽片段。合适的产生亲和力增强的或成熟的tcrs的方法包括使用噬菌体或酵母展示来筛选tcr突变体的文库并且是本领域众所周知的(参见例如robbins et al j immunol(2008)180(9):6116；san miguel et al(2015)cancer cell 28(3)281
‑
283；schmitt et al(2013)blood 122 348
‑
256；jiang et al(2015)cancer discovery 5 901)。
81.亲和力是一个分子与另一个分子，例如tcr或t细胞的分子的结合强度，所述分子包含任选地当存在于与mhc的复合物中时癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的肽、抗原肽、肽片段的异源tcr。可以通过平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(elisa)或放射免疫测定(ria))或动力学(例如biacore
tm
分析)确定抗原结合蛋白与其靶标的结合亲和力。亲和力是两个分子在多个位点相互结合的强度总和，例如考虑
相互作用的效价。相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以显示相比或对包含此类抗原的癌症或肿瘤细胞或组织，对癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段的提高的亲和性和/或亲和力。
82.优选的亲和力增强的tcrs可以结合表达肿瘤抗原mage a4的肿瘤或癌细胞。
83.magea4 tcr可以包含seq id no:3的α链参考氨基酸序列或其变体和seq no:5的β链参考氨基酸序列或其变体。变体可以具有与参考氨基酸序列具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。magea4 tcr可以由seq id no:4的α链参考核苷酸序列或其变体和seq no:6的β链参考核苷酸序列或其变体编码。变体可以具有与参考核苷酸序列具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
84.根据本发明，tcr可以包含tcrα链可变域和tcrβ链可变域，其中：
85.(i)α链可变域包含具有以下序列的cdrs：
86.vspfsn(αcdr1)、seq id no:9或seq id no:3的氨基酸48
‑
53，ltfsen(αcdr2)、seq id no:10或seq id no:3的氨基酸71
‑
76，和cvvsggtdswgklqf(αcdr3)、seq id no:11或seq id no:3的氨基酸111
‑
125，和
87.(ii)β链可变域包含具有以下序列的cdrs：
88.kghdr(βcdr1)、seq id no:12或seq id no:5的氨基酸50
‑
54，sfdvkd(βcdr2)、seq id no:13或seq id no:5的氨基酸68
‑
73，和catsgqgayeeqff(βcdr3)、seq id no:14或seq id no:5的氨基酸110
‑
123，或与其具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性，任选地与其具有100％序列同一性的序列。
89.因此，tcr可以包含tcr，其中α链可变域包含与seq id no:3或seq id no:3的氨基酸残基1
‑
136的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，和/或β链可变域包含与seq id no:5或seq id no:5的氨基酸残基1
‑
144的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
90.术语“祖tcr”在本文中用于指分别包含seq id nos:3和5的mage a4 tcrα链和mage a4 tcrβ链的tcr。可取的是提供相对于祖tcr突变的或修饰的tcrs，其相比祖tcr对肽
‑
hla复合体具有相同、等效或更高的亲和力和/或相同、等效或更慢的解离速率的。相对于祖tcr，根据本发明的tcrs在α链可变域和/或β链可变域中可能存在多于一个突变。“改造的tcr”和“突变tcr”在本文中同义使用并且通常意指相对于祖tcr，特别是在其α链可变域和/或β链可变域中引入了一个或多个突变的tcr。这些突变可以提高对mage a4的结合亲和性和/或特异性和/或选择性和/或亲和力。在某些实施方案中，α链可变域中有1、2、3、4、5、6、7或8个突变，例如4或8个突变，和/或在β链可变域中有1、2、3、4或5个突变，例如5个突变。在一些实施方案中，本发明的tcr的α链可变域可以包含与seq id no:7的氨基酸残基的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的tcr的β链可变域可以包含与seq id no:8的氨基酸残基的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
91.根据本发明，tcr可以包含tcr，其中α链可变域包含seq id no:7或seq id no:7的氨基酸残基1
‑
136的氨基酸序列，或氨基酸序列，其中其氨基酸残基1
‑
47、54
‑
70、77
‑
110和126
‑
136分别与seq id no:7的氨基酸残基1
‑
47、54
‑
70、77
‑
110和126
‑
136的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和/或其中氨基酸残基48
‑
53、71
‑
76和111
‑
125、cdr 1、cdr 2、cdr 3分别地与seq id no:7的氨基酸残基48
‑
53、71
‑
76和111
‑
125、cdr 1、cdr 2、cdr 3的序列分别具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
92.根据本发明，tcr可以包含tcr，其中在α链可变域中，序列：
93.(i)其氨基酸残基1
‑
47可以(a)与seq id no:7的氨基酸残基1
‑
47的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或(b)可以相对于seq id no:7的残基1
‑
47具有一个、两个或三个插入或缺失的氨基酸残基，
94.(ii)氨基酸残基48
‑
53是seq id no:7的vspfsn、cdr 1、seq id no:9或氨基酸48
‑
53，
95.(iii)其氨基酸残基54
‑
70可以(a)与seq id no:7的氨基酸残基54
‑
70的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或(b)可以相对于seq id no:7的氨基酸残基54
‑
70的序列具有一个、两个或三个插入或缺失的氨基酸残基，
96.(iv)氨基酸残基71
‑
76可以是ltfsen、cdr 2、seq id no:10或seq id no:7的氨基酸71
‑
76，
97.(v)其氨基酸残基77
‑
110可以与seq id no:7的氨基酸残基77
‑
110的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者可以相对于seq id no:7的氨基酸残基77
‑
110的序列具有一个、两个或三个插入、缺失或取代，
98.(vi)氨基酸111
‑
125可以是cvvsggtdswgklqf、cdr 3、seq id no:11或seq id no:7的氨基酸111
‑
125，
99.(vii)其氨基酸残基126
‑
136可以与seq id no:7的氨基酸残基126
‑
136的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者可以相对于seq id no:7的氨基酸残基126
‑
136的序列具有一个、两个或三个插入、缺失或取代。
100.根据本发明，tcr可以包含tcr，其中在β链可变域中包含seq id no:8的氨基酸序列，或氨基酸序列，其中其氨基酸残基1
‑
45、46
‑
50、74
‑
109、124
‑
133分别与seq id no:8的氨基酸残基1
‑
45、46
‑
50、74
‑
109、124
‑
133的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，并且其中氨基酸残基46
‑
50、68
‑
73和110
‑
123分别与seq id no:8的氨基酸残基46
‑
50、68
‑
73和110
‑
123、cdr 1、cdr 2、cdr 3的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。
101.根据本发明，tcr可以包含tcr，其中在β链可变域中，序列：
102.(i)其氨基酸残基1
‑
45可以(a)与seq id no:8的氨基酸残基1
‑
45的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或(b)可以相对于seq id no:8的残基1
‑
45具有
一个、两个或三个插入或缺失的氨基酸残基，
103.(ii)氨基酸残基46
‑
50是kghdr、cdr 1、seq id no:12或seq id no:8的氨基酸46
‑
50，
104.(iii)其氨基酸残基51
‑
67可以(a)与seq id no:8的氨基酸残基51
‑
67的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或(b)可以相对于seq id no:8的氨基酸残基51
‑
67的序列具有一个、两个或三个插入或缺失的氨基酸残基，
105.(iv)氨基酸残基68
‑
73可以是sfdvkd、cdr 2、seq id no:13或seq id no:8的氨基酸68
‑
73，
106.(v)其氨基酸残基74
‑
109可以与seq id no:8的氨基酸残基74
‑
109的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者可以相对于seq id no:8的氨基酸残基74
‑
109的序列具有一个、两个或三个插入、缺失或取代；
107.(vi)氨基酸110
‑
123可以是catsgqgayeeqff、cdr 3、seq id no:14或seq id no:8的氨基酸110
‑
123，
108.(vii)其氨基酸残基124
‑
133可以与seq id no:8的氨基酸残基124
‑
133的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性，或者可以相对于seq id no:8的氨基酸残基124
‑
133的序列具有一个、两个或三个插入、缺失或取代。
109.氨基酸和核苷酸序列同一性通常参考算法gap(gcg wisconsin packagetm,accelrys,san diego ca)来定义。gap使用needleman&wunsch算法(j.mol.biol.(48):444
‑
453(1970))来将两个完整序列对齐，其将匹配数最大化并将缺口数最小化。通常，使用默认参数，缺口产生罚分＝12，且缺口延伸罚分＝4。gap的使用可能是优选的，但可以使用其他算法，例如blast、psiblast或tblastn(其使用altschul et al.(1990)j.mol.biol.215:405
‑
410的方法)、fasta(其使用pearson和lipman(1988)pnas usa 85:2444
‑
2448的方法)，或smith
‑
waterman算法(smith和waterman(1981)j.mol biol.147:195
‑
197)，通常采用默认参数。
110.特定的氨基酸序列变体可能通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸、2、3、4、5
‑
10、10
‑
20或20
‑
30个氨基酸而与参考序列不同。在一些实施方案中，变体序列可以包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个残基插入、缺失或取代的参考序列。例如，可以插入、缺失或取代多达15个、多达20个、多达30个或多达40个残基。
111.在一些优选的实施方案中，变体可以与参考序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个保守取代。保守取代涉及用具有相似特性的不同氨基酸取代氨基酸。例如，脂肪族残基可以被另一个脂肪族残基取代，非极性残基可以被另一个非极性残基取代，酸性残基可以被另一个酸性残基取代，碱性残基可以被另一个碱性残基取代，极性残基可以被另一个极性残基取代，或者芳香族残基可以被另一个芳香族残基取代。
112.例如，保守取代可能发生在以下组内的氨基酸之间：
113.(i)丙氨酸和甘氨酸；
114.(ii)谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；
115.(iii)精氨酸和赖氨酸；
116.(iv)天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；
117.(v)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；
118.(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；
119.(vii)丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。
120.t细胞中表达的重组cd8共受体和/或tcr可以在c端，或更优选地在n端处包含异源标签。标签是与cd8和/或tcr非天然相关联并形成特定结合对的一个成员的肽序列。表达重组cd8和tcr的t细胞可以通过特定结合对的另一个成员与标签的结合来鉴定和/或纯化。例如，标签可以形成被抗标签抗体结合的表位。这可能有助于在过程中识别修饰的t细胞。
121.合适的标签包括例如mrgs(h)6、dykddddk(flagtm)、t7
‑
、s
‑
(ketaaakferqhmds)、聚arg(r5
‑
6)、聚his(h2
‑
10)、聚cys(c4)聚phe(f11)聚asp(d5
‑
16)、sumo标签(invitrogen champion pet sumo表达系统)、strept
‑
标签ii(wshpqfek)、c
‑
myc(eqkliseedl)、influenza
‑
ha标签(murray,p.j.et al(1995)anal biochem 229,170
‑
9)、glu
‑
glu
‑
phe标签(stammers,d.k.et al(1991)febs lett 283,298
‑
302)、tag.100(qiagen；来源于哺乳动物map激酶2的12aa标签)、cruz标签09
tm
(mkaefrrqesdr,santa cruz biotechnology inc.)和cruz标签22
tm
(mrdaldrldrla,santa cruz biotechnology inc.)。已知的标签序列在terpe(2003)appl.microbiol.biotechnol.60 523
‑
533中有综述。在优选的实施方案中，可以使用血凝素(ha)标签ypydvpdya。
122.在修饰的t细胞中表达的cd8共受体和tcr是由异源核酸编码的重组蛋白，即cd8和tcr从已通过重组技术掺入t细胞的基因组中的编码核酸表达而来。
123.修饰t细胞以表达cd8共受体和tcr可以包括将编码如本文所述的cd8共受体和tcr的异源核酸引入t细胞中。用于在t细胞中引入和表达异源核酸的合适的方法是本领域众所周知的，并在下文中有更详细的描述。
124.在引入后，如本文所述的根据本发明的修饰的t细胞可以包含编码cd8共受体和tcr的一个或多于一个拷贝的异源核酸。
125.异源tcr的表达可能会改变t细胞的免疫原特异性，以便它们特异性地、选择性地、以高或提高的亲和性或高或提高的亲和力识别患有癌症个体的癌细胞表面上存在的一种或多种肿瘤抗原，或显示对其提高的识别。
126.在一些实施方案中，在不存在异源cd8共受体和tcr的情况下，t细胞可以显示与癌细胞减少的结合或无结合。例如，异源cd8共受体和tcr的表达可以增加修饰的t细胞相对于无修饰的t细胞的癌细胞结合亲和力和/或特异性。
127.术语“异源”是指对特定生物系统，如宿主细胞而言是外来的，并且不天然存在于该系统中(即外源性多肽或核酸)的多肽或核酸。可以通过人工手段，例如使用重组技术，将异源多肽或核酸引入生物系统中。例如，可以将编码多肽的异源核酸插入合适的表达构建体或载体中，该表达构建体或载体包含合适的调控序列，能够表达编码的异源tcr和异源cd8共受体，其进而用于转化宿主细胞以产生多肽。异源多肽或核酸可能是合成的或人工的，或者可能存在于不同的生物系统中，如不同的物种或细胞类型。内源性多肽或核酸是特定生物系统，如宿主细胞固有的，并且天然存在于该系统中。重组多肽从已通过人工手段，例如使用重组技术引入细胞中的异源核酸表达而来。如本文所述的重组多肽，例如异源tcr或异源cd8共受体可以与细胞中天然存在的多肽相同，或者可以与细胞或修饰的t细胞中天然存在的多肽不同。
128.t细胞可被修饰以表达异源tcr，其特异性地结合癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或
肿瘤抗原或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的，优选地癌症患者的肽、抗原肽、肽片段。随后可以用修饰的t细胞处理癌症患者。可以通过这样的方法鉴定可利用修饰的t细胞治疗的合适的癌症患者，包括：
129.从患癌个体获得癌细胞样品；
130.将癌细胞鉴定为结合由修饰的t细胞表达的tcr。
131.可以通过鉴定由优选地通过结合测定任选地确定为结合tcr的癌症或肿瘤细胞表达的一种或多种肿瘤抗原，将癌症或肿瘤细胞鉴定为结合与修饰的t细胞或其群体的tcr或异源tcr。鉴定从患有癌症或肿瘤的个体获得的癌症或肿瘤细胞上的抗原的方法在本领域是众所周知的。
132.在一些实施方案中，可以通过以下方式鉴定适于治疗特定癌症患者的异源tcr：
133.从患癌个体获得癌细胞样品，和
134.鉴定特异性结合癌细胞的抗原受体。
135.可以例如通过由癌细胞表达的一种或多种肿瘤抗原鉴定与癌细胞特异性结合的tcr。鉴定从患癌个体获得的癌细胞表面上的抗原的方法是本领域众所周知的。然后可以鉴定与一种或多种肿瘤抗原结合的或与一种或多种抗原的mhc展示肽片段结合的tcr，例如从已知特异性的tcrs或通过筛选具有不同特异性的tcrs的组或文库。可以使用常规技术产生与具有一种或多种定义的肿瘤抗原的癌细胞特异性结合的tcrs。
136.t细胞可被修饰以表达鉴定的如本文所述的tcr或异源tcr。可以通过hla特异性将根据本发明的修饰的t细胞或t细胞群体限制于对应于均为hla 1类或其特定等位基因的mhc i类(a、b和c)的hlas，或对应于mhc ii类(dp、dm、do、dq和dr)或其特定等位基因的hlas，优选地所述hla是1类，优选地所述等位基因是hla
‑
a2或hla
‑
a*02或hla
‑
a2 或hla
‑
a*02阳性hla，优选地hla
‑
a*0201。
137.适于如本文所述的治疗的个体的肿瘤或癌细胞可以表达抗原并且可以具有正确的hla类型以结合tcr。
138.癌症或肿瘤细胞可以通过表达一种或多种抗原(即如上文所述的癌症肿瘤抗原)与个体中的正常体细胞区分开来。个体中的正常体细胞可能不表达一种或多种抗原或可能以不同的方式表达它们，例如以较低水平、在不同组织中和/或在不同发育阶段。肿瘤抗原可能在个体中引发免疫反应。特别地，肿瘤抗原可能会在表达肿瘤抗原的个体中引发t细胞介导的针对癌细胞的免疫反应。一种或多种由肿瘤或携带者表达的肿瘤抗原可能会被选择作为目标抗原，用于异源细胞t细胞上的异源细胞受体。可以将由患者中的肿瘤或癌细胞表达的一种或多种肿瘤抗原选择为修饰的t细胞上的异源t细胞受体的靶标抗原。
139.抗原是通过抗原结合蛋白，诸如例如抗体或tcr选择性识别的大分子结构，并且可以是癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的，任选地在与mhc的复合物中的，并且任选地由根据本发明的异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段。抗原包括但不限于包含一个或多个t细胞表位，即由异源tcr的cdrs特异性识别和/或结合的抗原、蛋白质或肽的表位或表位区域的蛋白质或肽(有或无多糖)或蛋白质组合物。如本文所预期的，本发明的tcr分子的靶结合域或cdrs可以识别糖蛋白或其表位的糖侧链，而不是特定氨基酸序列或大分子。因此，糖部分或硫酸化糖部分用作抗原。
140.由癌细胞表达的肿瘤抗原可以包括例如由癌症
‑
生殖细胞系基因编码的癌
‑
睾丸
(ct)抗原，如mage
‑
a4(simpson et al.nature rev(2005)5,615
‑
625,gure et al.,clin cancer res(2005)11,8055
‑
8062；velazquez et al.,cancer immun(2007)7,1 1；andrade et al.,cancer immun(2008)8,2；tinguely et al.,cancer science(2008)；napoletano et al.,am j of obstet gyn(2008)198,99e91
‑
97)。
141.可以在体外和/或离体下进行t细胞的修饰及其随后的扩增。
142.通过任选地在如本文所述的载体和/或病毒颗粒中将异源编码核酸引入t细胞中，t细胞可被修饰以表达cd8共受体和tcr。
143.在一些实施方案中，编码cd8共受体和tcr的异源核酸在相同的表达载体中被引入t细胞中。这可能有助于增加转导后表达两种基因的t细胞比例。在其他实施方案中，编码cd8共受体和tcr的异源核酸可以在不同的表达载体中引入t细胞中。
144.cd8共受体和tcr可以在相同的转录物中作为融合蛋白表达并随后分离，例如使用位点特异性蛋白酶。可选地，cd8共受体和tcr可以在不同的转录物中表达。
145.编码tcr和/或cd8共受体的核酸可以编码受体的所有亚单位。例如，编码tcr的核酸可以包含编码tcrα链的核苷酸序列和编码tcrβ链的核苷酸序列。编码cd8共受体的核酸可以包含编码cd8α链的核苷酸序列和编码cd8β链的核苷酸序列。更优选地，编码cd8共受体的核酸可以包含编码cd8α链的核苷酸序列，并且cd8共受体可以是cd8α异二聚体。
146.可以通过任何方便的方法将核酸引入到t细胞中。在将异源核酸引入或并入t细胞中时，必须考虑某些因素，这是本领域技术人员所众所周知的。要插入的核酸应组装在包含有效调控元件的构建体或载体中，这些调控元件将驱动编码的异源cd8共受体和tcr在t细胞中的转录。用于将构建体或载体转运到t细胞中的合适技术是本领域众所周知的，并且包括磷酸钙转染、deae
‑
葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒，例如牛痘或慢病毒的转导。例如，可以在没有选择的情况下通过在逆连接蛋白包被的、逆转录病毒载体预加载的组织培养板上培养来进行固相转导。
147.优选地，编码cd8共受体和tcr的核酸可以包含在病毒载体，最优选地γ逆转录载体或慢病毒载体，如vsvg假型慢病毒载体中。可以通过与包含核酸的病毒颗粒接触来转导t细胞。可以根据已知的方法产生用于转导的病毒颗粒。例如，可以用编码病毒包装和包封元件的质粒以及包含编码核酸的慢病毒载体转染hek293t细胞。可以与水疱性口炎病毒(vsvg)的病毒包封糖蛋白g组合产生vsvg假型病毒载体，以产生假型病毒颗粒。
148.用于核酸的操作和转化，例如在核酸构建体的制备中、将dna引入细胞中和基因表达的许多已知的技术和方案在protocols in molecular biology,second edition,ausubel et al.eds.john wiley&sons,1992中有详细描述。
149.在将编码异源tcr和cd8共受体的核酸引入t细胞中后，可以在体外培养修饰的t细胞的初始群体，以使得修饰的t细胞增殖并扩增群体。
150.例如，可以例如使用涂有抗cd3和/或抗cd28的磁珠来扩增修饰的t细胞群体。可以使用任何方便的技术来培养修饰的t细胞，以产生扩增的群体。合适的培养系统包括搅拌罐发酵罐、气升发酵罐、滚瓶、培养袋或培养皿，以及其他生物反应器，特别是中空纤维生物反应器。这种系统的使用在本领域中是众所周知的。
151.有许多适于t细胞离体增殖的培养基，特别是完全培养基，如aim
‑
v、iscoves培养基和rpmi
‑
1640(invitrogen
‑
gibco)。培养基可以补充其他因子，如血清、血清蛋白和选择
剂。例如，在一些实施方案中，可以采用rpmi
‑
1640培养基，含有2mm谷氨酰胺、10％fbs、25mm hepes、ph 7.2、1％青霉素
‑
链霉素和55μmβ
‑
巯基乙醇，且任选地补充有20ng/ml重组il
‑
2。培养基可补充有标准浓度的上述激动剂或拮抗剂因子，其可由技术人员通过常规实验容易地确定。
152.方便地，于37℃，在含有5％co2的湿润气氛中，在合适的培养基中培养细胞。
153.用于培养t细胞和其他哺乳动物细胞的方法和技术在本领域是众所周知的(参见，例如basic cell culture protocols,c.helgason,humana press inc.u.s.(15oct 2004)isbn:1588295451；human cell culture protocols(methods in molecular medicine s.)humana press inc.,u.s.(9dec 2004)isbn:1588292223；culture of animal cells:a manual of basic technique,r.freshney,john wiley&sons inc(2aug 2005)isbn:0471453293,ho wy et al j immunol methods.(2006)310:40
‑
52)
154.在一些实施方案中，可以方便地从群体分离和/或纯化修饰的t细胞。可以使用任何方便的技术，包括包被有磁粒的facs和抗体。
155.任选地，可以在使用前，例如通过冷冻干燥和/或低温贮藏保存按本文所述产生的修饰的t细胞群体和/或纯化的修饰的t细胞群体。
156.可以将修饰的t细胞群体与其他试剂混合，如缓冲剂、载体、稀释剂、防腐剂和/或药学上可接受的赋形剂混合。下文更详细地描述了合适的试剂。本文描述的方法可以包括将修饰的t细胞群体与药学上可接受的赋形剂混合。
157.适于给药(例如通过输注)的药物组合物包括水性和非水性等渗、无热原、无菌注射液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和使制剂与预期受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。用于此类制剂的合适等渗媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。合适的媒介物可以在标准药物文本中找到，例如remington’s pharmaceutical sciences,第18版,mack publishing company,easton,pa.,1990。
158.在一些优选的实施方案中，根据本发明的修饰的t细胞或t细胞群体可以配制成适于经静脉内输注至个体中的药物组合物。
159.如本文所用，术语“药学上可接受的”涉及在合理医学判断范围内的适合用于与对象(例如，人)的组织接触的化合物、物质、组合物和/或剂型，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。每种载体、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
160.本发明的一个方面提供了表达异源和/或重组cd8共受体和异源和/或重组tcr的修饰的t细胞群体，所述异源和/或重组cd8共受体和异源和/或重组tcr特异性结合癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的，和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段，和/或优选地个体，优选地患有肿瘤或癌症的个体的或来自其的肿瘤或癌细胞。可以通过上述方法产生合适的群体。
161.修饰的t细胞群体可以用作药物。例如，如本文所述的修饰的t细胞群体可以用于癌症免疫疗法治疗，例如过继性t细胞治疗。
162.根据本发明的t细胞或t细胞群体可以显示相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体中的提高的i类抗原反应。
163.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以显示提高的或增加的cd40l表达、对apc或dc的亲和力、细胞因子产生、细胞毒活性、树状细胞突变的诱导或树状细胞细胞因子产生的诱导，任选地响应于癌症或肿瘤抗原或癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的肽或癌症肽、抗原肽、肽片段
164.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以显示增加的cd40l表达和/或增加的或提高的对apc(抗原呈递细胞)或dc(树状细胞)和/或表达cd40的apc或dc的亲和力。相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞群体可以显示t细胞群体中cd4 cd40 t细胞数量的增加。
165.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以在激活后显示增加的t细胞扩增、分裂或增殖水平。可以在细胞因子、白介素、抗体、肽或抗原肽，例如癌症或肿瘤抗原或其肽、由异源tcr或细胞或组织，例如展示肽或抗原肽或肽片段的肿瘤或癌细胞或组织识别的癌症或肿瘤抗原的肽片段的存在下起始活化。
166.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以响应于癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段而显示增加的细胞因子产生水平。细胞因子可以是粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、ifn
‑
γ、il
‑
2、肿瘤坏死因子(tnf)
‑
α、mip
‑
1β(ccl4)、il
‑
17、il
‑
10、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
13、il
‑
2受体、il
‑
12或mig(cxcl9)；优选地ifnγ、il
‑
2、tnfα、gm
‑
csf或mip1β；优选地ifnγ、il
‑
2、tnfα、gm
‑
csf和mip1β。
167.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以在癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段存在下促进提高的树状细胞成熟。提高的成熟可以包括树状细胞cd80、cd40或hla
‑
dr标记物的增加的表达。
168.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以响应于癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段而显示树状细胞中增加的细胞因子产生水平的诱导。细胞因子可以是粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、ifn
‑
γ、il
‑
2、肿瘤坏死因子(tnf)
‑
α、mip
‑
1β(ccl4)、il
‑
17、il
‑
10、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
13、il
‑
2受体、il
‑
12或mig(cxcl9)；优选地ifn
‑
γ、il
‑
12或mig；可选地ifn
‑
γ、il
‑
12和mig。
169.根据本发明的t细胞或t细胞群体可以显示以相比由单独的肿瘤细胞响应于癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段，任选地相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体所产生的降低的水平诱导树突细胞产生il
‑
6。
170.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以响应于癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段而显示提高的细胞毒活性和/或增加的颗粒酶和/或ifn
‑
γ产生水平。
171.相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，根据本发明的t细胞或t细胞群体可以显示呈递癌症或肿瘤抗原或其肽、由异源tcr识别的癌症或肿瘤抗原的肽、抗原肽、肽片段的肿瘤或癌细胞的提高的杀伤。
172.根据前文，t细胞或t细胞群体可以是或包含cd4 、cd8 或cd4 和cd8 t细胞的混合物。
173.过继性细胞治疗或过继性免疫疗法是指通过基因转移改造的人t淋巴细胞或nk淋巴细胞的过继转移，以表达靶细胞上的表面抗原或肽mhc复合物表达特异性的遗传修饰的tcrs和/或共受体(例如cd8)。这可用于治疗一系列疾病，具体取决于所选靶标，例如，用以治疗癌症或肿瘤的肿瘤或癌症特异性抗原。过继性细胞治疗涉及使用称为白细胞去除术的过程去除供体或患者的一部分白细胞。然后可以扩增t细胞或nk细胞并与包含tcr多核苷酸和/或共受体(例如cd8)的表达载体混合，以将tcr和/或共受体(例如cd8)转移至t细胞或nk细胞。再次扩增t细胞或nk细胞，并在扩增最后，洗涤改造的t细胞或nk细胞，浓缩，然后冷冻以允许测试、运输和存储的时间，直到患者准备好接受输注的改造的细胞。
174.本发明的其他方面提供了如本文所述的修饰的t细胞群体用于制造用于治疗癌症和/或肿瘤的药物的用途、如本文所述的修饰的t细胞群体用于治疗癌症和/或肿瘤的用途，和治疗癌症和/或肿瘤的方法，其可以包括向有需要的个体施用如本文所述的修饰的t细胞群体。
175.修饰的t细胞群体可以是自体的，即修饰的t细胞最初获自随后给药的同一个体(即，供体和受体个体是相同的)。可以通过以下方法产生用于施用个体的合适的修饰的t细胞群体，包括提供获自个体的t细胞的初始群体，修饰t细胞以在个体中表达特异性结合肿瘤或癌细胞或者癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的cd8共受体和tcr的肽、抗原肽、肽片段，和培养修饰的t细胞。
176.修饰的t细胞群体可以是同种异体的，即修饰的t细胞最初获自与随后给药的个体不同的个体(即供体和受体个体是不同的)。同种异体是指来源于同一物种的不同动物的移植物。
177.同体和受体个体可以是匹配的以避免gvhd和其他不良免疫反应的hla。可以通过以下方法产生用于向受体个体给药的合适的修饰的t细胞群体，包括提供获自供体个体的初始t细胞群体，修饰t细胞以在受体个体中表达特异性结合肿瘤或癌细胞或癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段的cd8共受体和tcr，以及培养修饰的t细胞。
178.在施用修饰的t细胞后，受体个体可以显示针对受体个体中任选地呈递癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的和由异源tcr识别的肽、抗原肽、肽片段的肿瘤或癌细胞或组织的t细胞介导的免疫反应。这可能对个体中的癌症病况具有有益效果。
179.如本文所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换使用，并且以单数或复数形式是指已经发生恶性转化的细胞，该恶性转化使它们对宿主生物体成为病理性的。
180.通过成熟的技术，特别是组织学检查，可以很容易地将原发性癌细胞与非癌细胞区分开来。如本文所用的癌细胞的定义，不仅包括初代癌细胞，还包括任何来源于癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞和体外培养物和来源于癌细胞的细胞系。当提到一类通常表现为实体瘤的癌症时，“临床可检测的”肿瘤是指基于肿瘤质量可检测到的肿瘤；例如，通过诸如计算机断层扫描(ct)扫描、磁共振成像(mri)、x射线、超声或体格检查触诊等程序，和/或由于可从患者获得的样本中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测到的那
些。
181.癌症病况，包括可以根据发明治疗的癌症病况或癌症，其特征可以在于恶性癌细胞的异常增殖，并且可以包括白血病，如aml、cml、all和cll、淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤，以及实体癌症，如肉瘤、皮肤癌、黑素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食管癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊癌和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌，以及原发性不明的癌症(cup)。
182.在一些优选的实施方案中，癌症，包括可根据本发明治疗的癌症病况或癌症，可以是造血的(或血液的或血液学的或血液相关的)癌症，例如，来源于血液细胞或免疫细胞的癌症，其可称为“液体肿瘤”。基于血液肿瘤的临床病况的具体实例包括白血病，如慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病；血浆细胞恶性肿瘤，如多发性骨髓瘤、mgus和waldenstrom巨球蛋白血症；淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等等。癌症可以是任何癌症，其中存在异常数量的原始细胞或不需要的细胞增殖，或者被诊断为血液学癌症，包括淋巴和骨髓恶性肿瘤。髓系恶性肿瘤包括但不限于急性髓系(或髓细胞或髓系或成髓细胞)白血病(未分化或分化的)。
183.个体中的癌细胞可能在免疫学上与个体中的正常体细胞不同(即癌性肿瘤可能具有免疫原性)。例如，癌细胞可能能够在个体中引发针对由癌细胞表达的一种或多种抗原的系统性免疫反应。引发免疫反应的肿瘤抗原可能是癌细胞特异性的，或者可能由个体中的一种或多种正常细胞共有。
184.适于上述治疗的个体可以是哺乳动物，如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马(例如马)、灵长类动物、猿猴(例如猴子或猿)、猴子(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。
185.在优选的实施方案中，个体是人。在其他优选的实施方案中，可以采用非人哺乳动物，尤其是通常用作证明对人的治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠、灵长类、猪、犬或兔子动物)。
186.在一些实施方案中，个体在初始癌症治疗后可能具有最小残留疾病(mrd)。
187.根据本领域已知的临床标准，患癌症的个体可以显示至少一种足以诊断癌症的可识别体征、症状或实验室发现。此类临床标准的实例可以在药物教科书中找到，如harrison’s principles of internal medicine,第15版,fauci as et al.,eds.,mcgraw
‑
hill,new york,2001。在一些情况下，诊断个体中的癌症可以包括鉴定从个体获得的体液或组织样本中的特定细胞类型(例如癌细胞)。
188.例如可能与根据本发明的修饰的t细胞群体、药物组合物、治疗方法或修饰的t细胞群体用于治疗的用途相关的抗肿瘤效应是生物效应，其可以通过肿瘤生长速度的降低、肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移数量的减少、预期寿命的增加或与癌性病况相关的各种生理症状的改善来证明。这可以任选地与对照或对照个体相比进行体内或体外测量，包括用媒介物处理或不处理，或包括用缺少cd8共受体的t细胞群体处理。“抗肿瘤效应”还可以通过如本文所述的肽、多核苷酸、细胞和抗体、修饰的t细胞或修饰的t细胞群体防止第一位置中肿瘤发生，例如作为预防性治疗的能力来证实。抗肿瘤效果可以通过测量治疗个体例如相比如上文所述的对照或对照个体的改进的ttp(进展时间)、os(总体存活)或pfs
(无进展存活)来确定。
189.治疗可以是任何处理和治疗，无论是对人还是动物(例如在兽医应用中)，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制或延迟病况的进展，并且包括减少进展速度、进展速度的停止、病况的改善、病况的治愈或缓解(无论是部分还是全部)、预防、延迟、减轻或阻止一种或多种症状和/或病况的迹象或延长对象或患者的存活超过在没有治疗的情况下预期的存活，或例如与上文所述的对照或对照个体相比，例如如通过改善的ttp(进展时间)、os(总体存活)或pfs(无进展生存)测量的。
190.治疗也可以是预防性的(即预防法)。例如，对癌症的发生或复发敏感或有风险的个体可按本文所述进行治疗。这种治疗可以防止或延迟个体中癌症的发生或复发，任选地，例如与如上文所述的对照或对照个体相比。
191.特别地，治疗可以包括抑制癌症生长，包括癌症的完全缓解，和/或抑制癌症的转移。癌症生长通常是指许多指标中的任何一个，这些指标表明在癌症中改变为更发展的形式。因此，用于测量癌症生长抑制的指标包括癌细胞存活的降低、肿瘤体积或形态的减少(例如，如使用计算机断层扫描(ct)、超声或其他成像方法确定的)、肿瘤生长延迟、肿瘤血管系统的破坏、延迟的超敏反应皮肤测试的性能改善、t细胞活性的增加，以及肿瘤特异性抗原水平的降低。如本文所述修饰的t细胞的给药可以提高个体对抗癌症生长的能力，特别是对象已经存在的癌症的生长和/或降低个体中癌症生长的倾向。
192.可以通过任何方便的给药途径将修饰的t细胞或包含修饰的t细胞药物组合物施用对象，无论是系统性/外周性还是在所需作用的部位，包括但不限于：肠胃外，例如通过输注、静脉内或皮下。输注涉及通过针或导管在合适的组合物中施用t细胞。通常，经静脉内或皮下输注t细胞，尽管可以经由其他非经口途径输注t细胞，如肌内注射和硬膜外途径。合适的输注技术是本领域已知的并且通常用于治疗中(参见，例如，rosenberg et al.,new eng.j.of med.,319:1676,1988)。
193.通常，施用的细胞数量为每kg体重约105个至约10
10
个，通常为每个体2x108至2x10
10
个细胞，通常在30分钟的过程中，必要时重复治疗，例如以数天至数周的间隔。将理解，适当剂量的修饰的t细胞和包含修饰的t细胞的组合物，可以因患者而异。确定最佳剂量将通常涉及治疗益处水平与本发明治疗的任何风险或有害副作用的平衡。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定细胞的活性、给药途径、给药时间、细胞丢失或失活的速度、治疗的持续时间、其他药物、化合物和/或组合使用的物质，以及患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史。细胞的量和给药途径最终将由医生决定，尽管通常剂量将为达到作用部位处的局部浓度，其实现所需的效果而不会引起实质性的有害或不利的副作用。
194.虽然可以单独施用修饰的t细胞，但在一些情况下，修饰的t细胞可以与目标抗原、展示目标抗原的apcs和/或il
‑
2组合施用细胞，以促进修饰的t细胞群体的体内扩增。
195.修饰的t细胞群体可以与一种或多种其他的疗法，如细胞因子，例如il
‑
2、细胞毒性化疗、放射和免疫肿瘤学试剂，包括检查点抑制剂，如抗b7
‑
h3、抗b7
‑
h4、抗tim3、抗kir、抗lag3、抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1和抗ctla4抗体组合，任选地单独、依序或同时给药。
196.根据本发明，修饰的t细胞或修饰的t细胞群体还可以包含和/或表达至少一种外源性和/或重组共刺激配体，任选地一种、两种、三种或四种。tcr与至少一种外源共刺激配
体之间的相互作用可提供非抗原特异性信号和细胞的活化。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(tnf)超家族的成员和免疫球蛋白(ig)超家族配体。tnf是一种参与全身炎症的细胞因子，并可刺激急性期反应。它的主要作用是调节免疫细胞。tnf超家族的成员共有许多共同特征。大多数tnf超家族成员被合成为ii型跨膜蛋白(胞外c端)，其包含短的细胞质片段和相对较长的细胞外区域。tnf超家族成员包括但不限于：神经生长因子(ngf)、cd40l(cd40l)/cdl54、cd137l/4
‑
1bbl、tnf
‑
α、cd134l/ox40l/cd252、cd27l/cd70、fas配体(fasl)、cd30l/cd153、肿瘤坏死因子β(tnfp)/淋巴毒素
‑
α(lta)、淋巴毒素
‑
β(ttb)、cd257/b细胞活化因子(baff)/blys/thank/tall
‑
l、糖皮质激素诱导的tnf受体配体(gitrl)和tnf相关的凋亡诱导配体(trail)、light(tnfsf14)。免疫球蛋白(ig)超家族是一大群细胞表面和可溶性蛋白，其参与细胞的识别、结合或粘附过程。这些蛋白质与免疫球蛋白共有结构特征—它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于cd80和cd86，这两种配体都是cd28的配体。在某些实施方案中，至少一种共刺激配体选自4
‑
1bbl、cd275、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14和以上的组合。根据本发明，修饰的t细胞或修饰的t细胞群体还可以包含至少一种外源的和/或重组共刺激配体，可以是4
‑
1bbl或cd80，优选地4
‑
1bbl，可选地4
‑
1bbl和cd80。
197.可以通过如本文所述的任何方便的手段或治疗途径施用一种或多种其他疗法，优选地在与修饰的t细胞的给药部位分开的部位处。
198.可以在整个治疗过程中以一剂、连续地或间断地(例如，以适当的间隔在分开的剂量中)进行修饰的t细胞的给药。确定最有效的给药手段和剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且将随着用于治疗的制剂、治疗的目的、被治疗的靶细胞和被治疗的对象而变化。可以利用由治疗医生选择的剂量水平和模式进行单次或多次给药。优选地，在任选地至少1x 109个t细胞的单次输注中施用修饰的t细胞。通常，施用的细胞数量为每kg体重约105个至约10
10
个，通常每个体2x108个至2x10
10
个细胞，通常在30分钟的过程中，根据需要重复治疗，例如以数天至数周的间隔。将理解，细胞的合适剂量、细胞量和给药途径最终将由医生决定。
199.本发明的其他方面提供了用于产生如本文所述的修饰的t细胞的核酸和其他试剂。
200.根据本发明的分离的核酸可以包含编码特异性结合癌细胞或癌症或肿瘤抗原或其肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的肽、抗原肽、肽片段的tcr的核苷酸序列和编码cd8共受体的核苷酸序列，优选地tcr特异性结合mage
‑
a4。
201.编码序列可以与相同或不同的启动子或其他调控元件可操作地连接。合适的调控元件或启动子是本领域众所周知的，并且包括哺乳动物启动子，如人延伸因子
‑
1α(ef1α)。在一些实施方案中，编码序列可以被切割识别序列分开。这允许cd8共受体和tcr作为单个融合体表达，该融合体通过位点特异性蛋白酶，如弗林蛋白酶进行细胞内切割，以产生两种单独的蛋白质。合适的切割识别序列包括2a
‑
弗林蛋白酶序列。
202.编码cd8共受体和tcr的核苷酸序列可以位于相同的表达载体中。例如，合适的表达载体可以包含如上所述的核酸。可选地，编码序列可以位于单独的表达载体中。
203.合适的载体是本领域众所周知的，并且在上文中有更详细描述。
204.可以选择或构建合适的载体，其包含合适的调控序列，包括启动子序列、终止子片
段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。优选地，载体包含适当的调控序列以驱动哺乳动物细胞中核酸的表达。载体还可以包含序列，如复制起点、启动子区域和可选择的标记，其允许其在细菌宿主如大肠杆菌中选择、表达和复制。优选的载体包括逆转录病毒载体，如慢病毒载体，包括vsvg假型自失活载体。
205.病毒载体，如慢病毒，可以包含在包含由一种或多种病毒蛋白包封的载体载体的病毒颗粒中。可以通过以下方法产生病毒颗粒，包括用如本文所述的病毒载体和一种或多种病毒包装和包封载体转导哺乳动物细胞，并在培养基中培养转导的细胞，使得细胞产生释放到培养基中的病毒或慢病毒颗粒，任选地对病毒或慢病毒颗粒进行纯化。
206.病毒颗粒释放后，可以收集包含病毒颗粒的培养基，并任选地可以浓缩病毒颗粒。
207.在产生和任选浓缩之后，可以储存病毒颗粒，例如通过在
‑
80℃冷冻以准备用于转导t细胞。
208.本发明的其他方面和实施方案提供了上文描述的将术语“包含(comprising)”替换为术语“由
…
组成(consisting of)”的方面和实施方案以及上文描述的将术语“包含(comprising)”替换为术语”基本上由
…
组成(consisting essentially of)”的方面和实施方案。
209.应当理解，除非上下文另有要求，否则本技术公开了任何上述方面和上述实施方案彼此的所有组合。类似地，除非上下文另有要求，否则本技术单独或与任何其他方面一起公开了优选的和/或任选特征的所有组合。
210.在阅读本公开内容后，上述实施方案的修改、其他实施方案及其修改对于本领域技术人员将是显而易见的，并因此，这些都在本发明的范围内。
211.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管在本公开的方法的实践或测试中可以使用与本文所述的那些相似或等效的任何组合物和方法，但是在本文中被描述了示例性的组合物和方法。还可以组合本文描述的公开内容的任何方面和实施方案。例如，本文公开的任何从属或独立权利要求的主题可以多重组合(例如，来自每项从属权利要求的一个或多个引用可以根据它们所从属的独立权利要求合并为单个权利要求)。
212.本文提供的范围包括所描述的特定范围内的所有值和特定范围的端点附近的值。本公开的图和表也描述了范围和离散值，其可以构成本文公开的任何方法的要素。本文所述的浓度是在环境温度和压力下确定的。例如，这可以是室温下或在工艺流的特定部分内的温度和压力。优选地，浓度是在25℃和1bar压力的标准状态下确定的。术语“约”意指任何特定测量值的平均值的两个标准偏差内的值。
213.如本文和权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“肽链(a peptide chain)”是提及一条或多条肽链，并且包括本领域技术人员已知的其等价物。
214.本说明书中提及的所有文件和序列数据库条目均出于所有目的通过引用以其整体并入本文中。
215.本文使用的“和/或”将被视为两种特定特征或组件中的每一个的具体公开，无论是否包含另一个。例如，“a和/或b”将被视为(i)a，(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，就如同每一个在本文中被单独列出一样。
216.本发明还提供了以下方面：
217.1.包含异源共受体和异源t细胞受体(tcr)的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，任选地其中所述tcr和共受体是重组的，任选地其中所述共受体是cd8共受体。
218.2.如方面1所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr结合或特异性结合癌症或肿瘤抗原或其肽。
219.3.如方面1所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr结合或特异性结合任选地与癌性病况相关联的肽、肽抗原或抗原肽，或结合任选地由癌细胞或组织的肿瘤呈递的癌症或肿瘤抗原的肽或肽片段。
220.4.如方面2或3所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述肽、肽抗原、抗原肽或肽片段与肽呈递分子，任选地主要组织相容性复合体(mhc)或人白细胞抗原(hla)，任选地i类或ii类复合，任选地其中所述肽与hla
‑
a2或hla
‑
a*02或hla
‑
a*0201复合。
221.5.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr结合肽、肽抗原、抗原肽或肽片段、癌症或肿瘤抗原或其肽，其为癌
‑
睾丸抗原。
222.6.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr结合以下中的任一个：ny
‑
eso
‑
1、mart
‑
1(由t细胞识别的黑素瘤抗原)、wt1(wilms瘤1)、gp100(糖蛋白100)、酪氨酸酶、prame(优选地在黑素瘤中表达抗原)、p53、hpv
‑
e6/hpv
‑
e7(人乳头瘤病毒)、hbv、trail、dr4、甲状腺球蛋白、tgfbii移码抗原、lage
‑
1a、kras、cmv(巨细胞病毒)、cea(癌胚抗原)、afp(α
‑
胎儿蛋白)、mage
‑
a1、mage
‑
a2、mage
‑
a3、mage
‑
a4、mage
‑
a6、mage
‑
a8和mage
‑
a9、mage
‑
a10或mage
‑
a12，或以上的肽。
223.7.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr结合肿瘤抗原mage
‑
a4或其肽，优选地序列gvydgrehtv(seq id no:18)。
224.8.如方面2
‑
7中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr特异性地和/或选择性地结合癌症或肿瘤抗原或其肽和/或肽呈递分子。
225.9.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源cd8共受体是异源二聚体或同源二聚体、cd8αβ异源二聚体或cd8αα同源二聚体。
226.10.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源cd8共受体包含：
227.(a)与氨基酸序列vllsnptsg seq id no:15具有至少80％序列同一性的cdr 1、与氨基酸序列ylsqnkpk seq id no:16具有至少80％序列同一性的cdr 2，和与氨基酸序列lsnsim seq id no:17具有至少80％序列同一性的cdr 3，
228.(b)氨基酸序列vllsnptsg,seq id no:15的cdr 1、氨基酸序列ylsqnkpk seq id no:16的cdr 2，和氨基酸序列lsnsim seq id no:17的cdr 3，
229.(c)与seq id no:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或
230.(d)具有seq id no:1的序列的氨基酸序列。
231.11.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr包含tcrα链可变域和tcrβ链可变域，其中：
232.(i)α链可变域包含具有以下序列的cdrs：
233.vspfsn(αcdr1)、seq id no:9或seq id no:3的氨基酸48
‑
53，
234.ltfsen(αcdr2)、seq id no:10或seq id no:3的氨基酸71
‑
76，和
235.cvvsggtdswgklqf(αcdr3)、seq id no:11或seq id no:3的氨基酸111
‑
125，和
236.(ii)β链可变域包含具有以下序列的cdrs：
237.kghdr(βcdr1)、seq id no:12或seq id no:5的氨基酸50
–
54，
238.sfdvkd(βcdr2)、seq id no:13或seq id no:5的氨基酸68
‑
73，和
239.catsgqgayeeqff(βcdr3)、seq id no:14或seq id no:5的氨基酸110
‑
123或与其具有至少80％序列同一性的序列。
240.12.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中所述异源tcr包含tcr，其中α链可变域包含与seq id no:3具有至少80％同一性的氨基酸序列，和/或β链可变域包含与seq id no:5具有至少80％同一性的氨基酸序列。
241.13.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中t细胞是cd4 或cd8 ，和/或所述t细胞群体包含cd4 、cd8 或cd4 和cd8 t细胞的混合物。
242.14.如任何前述方面所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其中相比缺少异源cd8共受体的t细胞或t细胞群体，所述修饰的t细胞或修饰的t细胞群体具有提高的或增加的cd40l表达、细胞因子产生、细胞毒活性、树状细胞成熟的诱导或树状细胞细胞因子产生的诱导，任选地响应于癌症或肿瘤抗原或肽或癌症肽、抗原肽、癌症或肿瘤抗原的或由癌细胞或组织的肿瘤呈递的肽片段。
243.15.编码根据任何前述方面所述的异源tcr和异源共受体的核酸。
244.16.如方面15所述的核酸，其中所述核酸包含编码所述异源共受体的第一核苷酸序列和编码所述异源tcr的第二核苷酸序列。
245.17.包含方面15或16中任一项所述的核酸的载体，任选地其中所述载体是表达载体，还任选地包含表达编码的所述核酸的异源tcr和异源共受体的调控元件。
246.18.如方面17所述的载体，其包含方面16所述的核酸，其中所述第一核苷酸序列在分别编码所述tcrα链和所述tcrβ链的单个开放阅读框或两个不同的开放阅读框中，并且其中所述第二核苷酸序列在分别编码所述共受体α链和所述共受体β链或分别编码共受体α链和所述共受体α链的单个开放阅读框或两个不同的开放阅读框中。
247.19.包含方面15或16所述的核酸或方面17或18所述的载体的病毒颗粒。
248.20.如方面1
‑
14所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其包含方面15或16所述的核酸或方面17或18所述的载体。
249.21.如方面1
‑
14或20中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，其还包含一种或多种外源或重组共刺激配体。
250.22.制造方面1
‑
14中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体的方法，包括将一个或多于一个拷贝的方面15或16中任一项所述的核酸或方面17
‑
18中任一项所述的载体引入t细胞或t细胞群体中，任选地其中所述核酸或载体包含在方面19所述的病毒颗粒中，任选地另外包括在所述t细胞或t细胞群体中引入编码包含所述核酸的一种或多种外源或重组的共刺激配体或载体的核酸。
251.23.如方面22所述的方法，还包括体外培养所述修饰的t细胞或修饰的t细胞群体，使得所述修饰的t细胞或其群体增殖和/或扩增所述群体，并且任选地随后以分离和/或纯化所述群体的修饰的t细胞。
252.24.药物组合物，其包含方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t
细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体或方面19所述的病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
253.25.方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒，或方面24所述的药物组合物，其用于药物。
254.26.方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒，或方面24所述的药物组合物，其用于治疗癌症和/或肿瘤，任选地，其中所述治疗是癌症免疫疗法治疗和/或过继性t细胞治疗，任选地自体或同种异体过继性t细胞治疗。
255.27.治疗个体中的癌症和/或肿瘤的方法，包括向所述个体施用方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒，或方面24所述的药物组合物，任选地其中所述治疗是癌症免疫疗法治疗和/或过继性t细胞治疗，任选地自体或同种异体过继性t细胞治疗。
256.28.方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒，或方面24所述的药物组合物在制备用于治疗癌症和/或肿瘤的药物中的用途，任选地其中所述治疗是癌症免疫疗法治疗和/或过继性t细胞治疗，任选地自体或同种异体过继性t细胞治疗。
257.29.方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒、方面24所述的药物组合物用于方面26、方面27的方法或方面28的用途，其中所述癌症是实体瘤。
258.30.方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒、方面24所述的药物组合物用于方面26、方面27的方法或者方面28或29的用途，其中所述癌症选自以下中的任一种：滑膜肉瘤、粘液样/圆形细胞脂肪肉瘤(mrcls)、头颈癌、头颈部scc(鳞状细胞癌)、黑素瘤、食管癌、卵巢癌、胃癌(胃)、膀胱癌、肺癌、非小细胞肺nsclc(鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌)、转移性或晚期nsclc、尿路上皮癌或肿瘤、食管胃交界处癌症(egj)，任选地其中所述癌症或肿瘤表达mage蛋白或肽，任选地mage
‑
a4蛋白或肽。
259.31.方面1
‑
14、20或21中任一项所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中任一项所述的核酸、方面17或18中任一项所述的载体、方面19所述的病毒颗粒、方面24所述的药物组合物用于方面26、方面27的方法或者方面28或29的用途，其中所述癌症选自以下中的任一种：肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、转移性胃部癌症、转移性胃癌、转移性肝癌、转移性卵巢癌、转移性胰腺癌、转移性结直肠癌、转移性肺癌、结直肠癌或腺癌、肺癌或腺癌、胰腺癌或腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管癌。
260.32.方面1
‑
14、20或21所述的修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、方面15或16中所述的核酸、方面17或18所述的载体、方面19所述的病毒颗粒、方面24所述的药物组合物用于方面26、方面27的方法或者方面28或29的用途，其中所述修饰的t细胞或修饰的t细胞群体、核酸、载体、病毒颗粒或药物供用于或用于与一种或多种其他的治疗剂组合，任选地用于或供用于单独、依序或同时施用。
261.在以下非限制性实施例中并参考以下附图进一步描述本发明。
262.附图的简要说明
263.图1.cd4 t细胞亚群中cd40l 细胞的频率。在未刺激的t细胞(仅t细胞)中的、以抗原阴性靶细胞(colo205)或抗原阳性靶细胞(a375)刺激的cd4 t细胞群体的tcr阴性(tcr
‑
)和tcr阳性(tcr )亚群中确定了cd40l t细胞的频率。肽
‑
脉冲( p)靶细胞用作对照(右侧图)。箱线图总结了所有五种测试的wave产品的数据，其中每个单个数据点代表一种wave产品。使用r利用3因素重复测量anova评估统计显著性，其中子集(即cd4/8)、tcr /
‑
和转导水平作为对象内因素，然后对子集/tcr组合内的每个转导组合进行成对事后检验，并使用holm方法调整p值。
264.图2.转导cd4 和cd8 淋巴细胞响应抗原阳性a375的增殖指数。对于表达mage
‑
a4 tcr(白色)和cd8α_mage
‑
a4 tcr(白色)的cd8 vα24 (a)和cd4 vα24 (b)细胞，绘制了所有响应细胞经历的平均分裂数。显示了四个单独供体的pi，并作为四个供体的组合均值
±
sem。使用2因素anova评估统计显著性，然后使用sidak事后多重比较检验各组间的方差。
265.图3.响应抗原产生的ifnγ。将5x104个t细胞与以下共同孵育：a)5x104个t2细胞和如x轴上所示的mage
‑
a4 gvydgrehtv肽的滴定，或b)5x104个抗原阳性a375细胞。24小时后收获上清液并冷冻以供随后通过分析。使用r(cel_ana18_021)整理和分析来自5项测定的数据。列表示t细胞供体(wave213
‑
217)，且行表示不同的t细胞部分(混合的pbl产品、分离的cd4 或分离的cd8 )。t细胞转导用颜色表示，未转导的ntd＝灰色，mage
‑
a4 tcr＝白色，cd8α_mage
‑
a4 tcr＝黑色。a).数据表示为2个生物学重复的均值
±
sem。响应曲线使用4参数对数
‑
逻辑斯谛函数拟合，基线限制为0。b)每个点代表一个生物学重复。在cel_ana18_021中整理的数据。
266.图4.响应抗原产生的il
‑
2。将5x104个t细胞与以下共同孵育：a)5x104个t2细胞和如x轴上所示的mage
‑
a4 gvydgrehtv肽的滴定，或b)5x104个抗原阳性a375细胞。24小时后收获上清液并冷冻以供随后通过分析。使用r(cel_ana18_021)整理和分析来自5项测定的数据。列表示t细胞供体(wave213
‑
217)，且行表示不同的t细胞部分(混合的pbl产品、分离的cd4 或分离的cd8 )。t细胞转导通过颜色表示，ntd＝灰色，mage
‑
a4 tcr＝白色，且cd8α_mage
‑
a4 tcr＝黑色。a)数据表示为2个生物学重复的均值
±
sem。使用4参数对数
‑
逻辑斯蒂函数拟合响应曲线，基线限制为0。b)每个点代表一个生物学重复。在cel_ana18_021中整理的数据。
267.图5.树状细胞共培养测定中il
‑
12(p40/p70)的产生。左侧、中间和右侧的图显示如同所示的来自混合的pbls、分离的cd4 和分离的cd8 t细胞的数据。x轴表示t细胞和仅肿瘤(“t细胞”)、t细胞、肿瘤和dcs(“t细胞 dcs”)、仅肿瘤细胞(“媒介”)或dcs和没有t细胞的肿瘤细胞(“dcs”)。t细胞转导通过颜色表示，ntd＝灰色，mage
‑
a4 tcr＝空心黑色，且cd8α_mage
‑
a4 tcr＝实心黑色。dc激活的另外阳性对照是lps(实心三角形)。显示了多个供体的单独的图(tea和tsa＝具有自体dcs的小规模t细胞；wave216和wave217＝与来自供体tsa的dcs共培养的大规模t细胞)。
268.图6.在dc共培养测定中产生的mig(cxcl9)。左侧、中间和右侧的图显示如同所示的来自混合的pbls、分离的cd4 和分离的cd8 t细胞的数据。x轴表示t细胞和仅肿瘤(“t细
胞”)、t细胞、肿瘤和dcs(“t细胞 dcs”)、仅肿瘤细胞(“媒介”)或dcs和没有t细胞的肿瘤细胞(“dcs”)。t细胞转导通过颜色表示，ntd＝灰色，mage
‑
a4 tcr＝空心黑色，且cd8α_mage
‑
a4 tcr＝实心黑色。dc激活的另外阳性对照是lps(实心三角形)。显示了多个供体的单独的图(tea和tsa＝具有自体dcs的小规模t细胞；wave216和wave217＝与来自供体tsa的dcs共培养的大规模t细胞)。
269.图7.在dc共培养测定中产生的il
‑
6。左侧、中间和右侧的图显示了如同所示的来自混合的pbls、分离的cd4 和分离的cd8 t细胞的数据。x轴表示t细胞和仅肿瘤(“t细胞”)、t细胞、肿瘤和dcs(“t细胞 dcs”)、仅肿瘤细胞(“媒介”)或dcs和没有t细胞的肿瘤细胞(“dcs”)。t细胞转导通过颜色表示，ntd＝灰色，mage
‑
a4 tcr＝空心黑色，且cd8α_mage
‑
a4 tcr＝实心黑色。dc激活的另外阳性对照是lps(实心三角形)。显示了多个供体的单独的图(tea和tsa＝具有自体dcs的小规模t细胞；wave216和wave217＝与来自供体tsa的dcs共培养的大规模t细胞)。
270.图8.在dc共培养测定中产生的ifny。左侧、中间和右侧的图显示了如同所示的来自混合的pbls、分离的cd4 和分离的cd8 t细胞的数据。x轴表示t细胞和仅肿瘤(“t细胞”)、t细胞、肿瘤和dcs(“t细胞 dcs”)、仅肿瘤细胞(“媒介”)或dcs和没有t细胞的肿瘤细胞(“dcs”)。t细胞转导通过颜色表示，ntd＝灰色，mage
‑
a4 tcr＝空心黑色，且cd8α_mage
‑
a4 tcr＝实心黑色。dc激活的另外阳性对照是lps(实心三角形)。显示了多个供体的单独的图(tea和tsa ＝具有自体dcs的小规模t细胞；wave216和wave217＝与来自供体tsa的dcs共培养的大规模t细胞)。
271.图9.adp
‑
a2m4cd8 t细胞对表达mage
‑
a4的大型a375.gfp微组织(～800μm直径
–
接种1200个细胞/孔)的细胞毒活性。测量了每种处理的每个孔中微组织中央核心的gfp荧光面积随时间推移的变化(显示了所有条件下6次重复的均值 /
‑
sem))。虚线表示t细胞添加。黑色箭头表示在测定终点具有cd4 adp
‑
a2m4和adp
‑
a2m4cd8 t细胞的微组织面积差异。数据表示为每种条件的微组织核心荧光面积随时间的变化。
272.图10.adp
‑
a2m4cd8 t细胞对表达mage
‑
a4的大型a375.gfp微组织的细胞毒活性。散点图显示了pbl、cd4 分离的和cd8 分离的t细胞部分的ntd、adp
‑
a2m4或adp
‑
a2m4cd8的曲线下微组织面积(auc)。每个数据点显示每种wave产品所有条件下n＝6的均值。所有数据都显示为标准化到t细胞添加的时间点。对于小微组织，使用重复测量anova来比较每个供体部分内的总体标准化auc数据(ns＝不显著；****＝p<0.0001)。
273.图11adp
‑
a2m4cd8 t细胞对表达mage
‑
a4的大型a375.gfp微组织(～800μm直径
–
接种1200个细胞/孔)的细胞毒活性。测量了每种处理的每个孔中微组织中央核心的gfp荧光面积随时间的变化(显示了所有条件下的6次重复 /
‑
sem的均值))。虚线表示t细胞添加。黑色箭头表示在测定终点具有cd4 adp
‑
a2m4和adp
‑
a2m4cd8 t细胞的微组织面积差异。数据是随着时间的推移，作为每个条件的微组织核心荧光区域的表达。数据表示为每种条件的微组织核心荧光面积随时间的变化。
274.图12adp
‑
a2m4cd8 t细胞对表达mage
‑
a4的大型a375.gfp微组织的细胞毒活性。散点图显示了pbl、cd4 分离的和cd8 分离的t细胞部分的ntd、adp
‑
a2m4或adp
‑
a2m4cd8的曲线下微组织面积(auc)。每个数据点显示每种wave产品的所有条件下n＝6的均值。所有数据都显示为标准化到t细胞添加的时间点。对于小微组织，使用重复测量anova来比较每个供
体部分内的总体标准化auc数据(ns＝不显著；****＝p<0.0001)。
275.图13.cd8α_mage
‑
a4 t细胞对表达mage
‑
a4的小型(a)和大型(b)a375.gfp微组织的细胞毒活性。(～800μm直径
–
接种1200个细胞/孔)。wave供体217t细胞的代表性图像显示了在测定过程中的以下时间点具有cd4 ntd、mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr转导的t细胞(80,000个细胞/孔)的gfp荧光微组织：t细胞添加前4小时(＝目标接种后143小时)；t细胞添加后0小时(＝目标接种后147小时)；t细胞添加后141小时(＝目标接种后288小时)；t细胞添加后438小时(＝目标接种后585小时)。
276.图14.与a375.gfp 3d微组织的共培养物中ntd、adp
‑
a2m4和adp
‑
a2m4cd8 t细胞释放的ifnγ和颗粒酶b。在加入t细胞后～50h从一式两份的测定板中收集上清液。在样品稀释4倍后，通过elisa测量上清液中ifnγ(a)和颗粒酶b(b)的水平。图表显示由用小(～505
‑
600μm直径)或大(～800μm直径)a375.gfp 3d微组织孵育的pbl、cd4 或cd8 mage
‑
a4 tcr t细胞、mage
‑
a4
‑
cd8 tcr t细胞或ntd t细胞产生的细胞因子水平。每个数据点显示每种wave产品的所有条件下n＝6的均值。使用重复测量anovas来比较每个供体部分内的总体ifnγ和颗粒酶b释放与小或大微组织(ns＝不显著；****＝p<0.0001)。注意，测量的超过最大可检测范围的颗粒酶b细胞因子值被指定为等于最高可测量值的值(＝40,000pg/ml)。
实施例
277.在该二代tcr研究中，我们向特异性肽增强的亲和力受体(spear)mage
‑
a4c1032tcr(本文中的mage
‑
a4 tcr)添加cd8α同源二聚体，目前正在临床试验(nct03132922)中测试一代tcr。
278.将hla i类限制的特异性肽增强的亲和力受体(spear)tcrs转导至外周血淋巴细胞中产生了具有相同特异性的细胞毒性(cd8 )和辅助(cd4 )t细胞；然而，cd4 t细胞上缺乏cd8共受体可能会影响改造的tcr的结合亲和力。预期将cd8α共受体与改造的tcr cd8α_mage
‑
a4c1032(本文中的cd8α_mage
‑
a4)一起添加到cd4 t细胞中将增加tcr结合亲和力，并增强cd4 t细胞对肿瘤抗原的多功能反应，从而通过树突细胞(dc)激活和增强的细胞毒性扩大对肿瘤的免疫反应。
279.实施例1.修饰的t细胞的制备
280.以下实验的目的是研究在转导的辅助cd4 t细胞中，tcr与hlai类和肽抗原复合物的相互作用的稳定性是否会通过cd8共受体的存在而得到帮助，cd8共受体通常存在于细胞毒性t细胞上，并从而提供改善的响应i类抗原的cd4 t细胞功能，并增强cd4 t细胞对肿瘤抗原的多功能反应。
281.对人t细胞进行慢病毒转导以构成性共表达亲和力增强的mage
‑
a4 tcr[seq id no:3和5]，其识别hla
‑
a*02:01限制的mage
‑
a4肽gvydgrehtv和分化簇cd8α(同源二聚体)共受体[seq id no:1]。还提供了缺少cd8α的对照t细胞。
[0282]
通过瞬时转染hek293t/17细胞产生编码具有或不具有cd8α的增强亲和力的tcr的慢病毒粒子。于转染前48
‑
72小时在5层细胞工厂中接种hek293t/17细胞，以确保它们在用单个慢病毒转基因质粒(编码tcr，有或没有cd8α)和一组互补的慢病毒包装质粒转染时，具有60％
‑
80％融合。复制缺陷型慢病毒颗粒在48
‑
72小时内产生，将其从上清液中收获，经由离心浓缩并冷冻保存。进行慢病毒生物滴度测定以提供最佳转导效率，并提供给出对于t细
胞转导的～1的感染复数(moi)所需的慢病毒载体体积。
[0283]
通过添加高滴度的慢病毒悬浮液并扩增，获得了用于转导的“wave”t细胞。对于“wave”扩增，使用cd3/cd28抗体包被的微珠(dynabeads cts,life technologies)从冷冻保存的健康人供体leukopaks(从正常外周血中收集的浓缩白细胞分离产品)分离和刺激cd3 t细胞。使用
‘
wave’平台(xuri cell expansion system,ge healthcare life sciences)扩增cd3 细胞，以提供t细胞产品。
[0284]
大规模的“wave”t细胞获自人pbmcs。将含有2.0x109‑
2.5x109个人pbmcs的leukopak解冻，使用cd3/cd28抗体包被的微珠分离cd3 t细胞，并用cd3 细胞接种vuelife袋。对于每个供体，接种了几个vuelife袋：三个用于产生非转导的(ntd)t细胞，三个用于产生单独的mage
‑
a4 tcr，两个用于产生用cd8α_mage
‑
a4 tcr转导的t细胞。随后用适当体积的慢病毒载体转导cd3 细胞，以给出1的moi。在生长期后，洗涤细胞并放入新的vuelife袋中。每天监测细胞计数，并根据需要将培养基体积增加到最大500ml。一旦所有条件都超过150x106个细胞，就将细胞就被转移到wave袋和xuri细胞扩增系统中。此后，从wave袋中收获扩增的t细胞，洗涤并合并t细胞。从细胞中去除珠子，然后收获、洗涤，并以多个等分试样冷冻保存以供以后分析。
[0285]
对于一些实验，必须从t细胞产物中分离纯化的cd4 或cd8 细胞。细胞分离程序在冷冻保存当天进行，产生可用于测定的预分离小瓶。通过cd4 细胞的耗竭来负选择cd8 细胞群体。根据制造商的说明，将miltenyi biotec cd4微珠用于此目的。针对仅结合具有α/βcd8异源二聚体的天然cd8细胞的cd8β抗体，负选择cd4 细胞群体。简言之，将1.0x107个t细胞与5μg小鼠抗人cd8β抗体(克隆3tu96i8，creative diagnostics)在4℃一起孵育30分钟(数量根据需要缩放)。在单次洗涤循环后，根据制造商的方案使用抗小鼠igg微珠(miltenyi)在ld柱(miltenyi)上负选择未结合的部分。通过流式细胞术测定所得部分的纯度。
[0286]
按如下测量t细胞活化，重点是cd4细胞，确定cd40l活化、细胞因子释放和靶细胞的直接杀伤，并通过研究t细胞和树状细胞之间的相互作用。
[0287]
实施例2.刺激后cd40l表面表达的评估
[0288]
cd40配体(cd40l，也称为cd154)是tnf家族的成员。它主要是在活化的t细胞，优选地cd4 t细胞上表达。它用作结合抗原呈递细胞(apcs)上的cd40的共刺激分子，在这种情况下，最重要的是其允许那些apcs激活抗原特异性幼稚cd8 t细胞。
[0289]
在过夜刺激后，在wave t细胞上分析cd40l的表面表达。为此，将0.1x106个靶细胞在第0天接种到96孔平底板中，并在37℃和5％co2下放置贴附过夜。a375细胞被用作抗原阳性靶细胞系，并且colo205细胞被用作抗原阴性靶细胞系。在第1天，以5:1的效应子：靶标比例(0.5x106个细胞/孔)连同抗cd40l bv421抗体(5μl/孔)一起加入t细胞。同时加入golgistoptm(2.64μl/ml的r10最终浓度)，以保留/稳定细胞表面上的cd40l
‑
抗体复合物。然后将平板在37℃和5％co2孵育20小时，然后用cd3 fitc、cd4 bv650、cd8 apcef780、vα24pe和aqua对细胞进行染色，以允许鉴定活的、转导的t细胞和特定亚群。使用facsdiva 8.0.1版软件在fortessa x20仪器上采集数据；使用flowjo 10.3版或10.4.1版进行数据分析。利用graphpad prism 7.02版生成图形。使用r利用3因素重复测量anova评估统计显著性，其中子集(即cd4/8)、tcr /
‑
和转导水平作为对象内因素，然后对子集/tcr组合内的每
个转导组合和使用holm方法调整的p值进行成对事后检验。
[0290]
图1总结了测试的五种wave t细胞产品的cd4 t细胞子集的数据。在与抗原阴性细胞系(colo205)共培养后，在未转导的(ntd)、mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 cd4 tcr wave t细胞之间未观察到cd40l 细胞频率的差异。对于转导的(tcr )细胞和那些缺少mage
‑
a4 tcr(tcr
‑
)表达的细胞都是如此。这些频率也与在单独培养的t细胞(仅t细胞)中观察到的那些频率非常相似。当细胞呈现抗原阳性靶细胞(a375)时，在mage
‑
a4 tcr转导的wave t细胞的cd4 tcr 子集中观察到cd40l 细胞频率的增加。与未刺激的t细胞相比，cd40l 在cd4 tcr细胞上的频率增加。在识别和激活抗原后，在cd8α_mage
‑
a4 tcr转导的wave产物中检测到显著更高比例的cd4 cd40l t细胞。
[0291]
实施例3.t细胞增殖
[0292]
还通过计算响应于mage
‑
a4阳性细胞系a375的mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞产物中vα24 cd8 (tcr)和cd4 t细胞亚群的增殖指数(pi)评估了cd8α同源二聚体对t细胞抗原特异性功能的影响(图2)。增殖指数说明了响应细胞经历的平均分裂数。
[0293]
使用荧光染料通过流式细胞术评估响应抗原的t细胞增殖，该染料允许简单检测细胞分裂数。将细胞用紫罗兰激光可激发染料vpd450染色，该染料均匀标记亲本细胞。分裂后，染料均匀分布在子细胞之间，然后每个子细胞都保留其亲本荧光强度的约一半。因此，染料强度的降低表明细胞分裂和因此的增殖。
[0294]
将来自四个不同供体的非转导(ntd)、mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr wave t细胞产物解冻，并以2.0x106个细胞/ml在色氨酸耗尽的rpmi中静置26小时以促进细胞同步。然后将t细胞用vpd450染色，并在存在或不存在10
‑5m mage
‑
a4肽gvydgrehtv的情况下单独或以t细胞与靶细胞比例为5:1与抗原呈递细胞共培养。在共培养前照射抗原呈递a375(mage
‑
a4阳性)和colo205(mage
‑
a4阴性)(分别为～48和～33gy)，以防止靶细胞增殖。在共培养3天后，收获并染色t细胞标记物(cd3、cd4、cd8和vα24以标记tcr)和活力。
[0295]
使用流式细胞术评估cd4和cd8总t细胞群体以及tcr阳性和阴性部分内的增殖。使用来自转导的和ntd样品的仅t细胞作为设置g0门的指导来手动门控增殖峰。这代表未分裂的细胞。在g0门之后发生的每一代分裂细胞被门控(g1、g2
…
gx)作为峰值vpd450减少，并且通过计算分裂百分比和增殖指数来评估抗原驱动的增殖。根据cbp079v00，使用bd
tm
高通量采样器(hts)系统在bd
tm lsrfortessa x
‑
20上采集样品。对于数据采集，使用facsdiva 8.0.1版，并使用flowjo v10.4.1和graphpad prism v7.02进行采集后分析。
[0296]
在cd4 部分内，在4个wave供体中，与mage
‑
a4 tcr相比，利用cd8α_mage
‑
a4 tcr转导的细胞显示出更大的扩增(图2)。与mage
‑
a4 tcr相比，cd4 细胞上存在另外的cd8α同源二聚体，导致经历分裂的细胞百分比和增殖指数增加。
[0297]
实施例4.响应肿瘤细胞系的细胞因子产生
[0298]
cd4 t细胞的主要效应子功能是通过向抗原呈递细胞以及其他t细胞亚群提供反馈信号来协调免疫反应。这种作用可以通过共刺激信号，如cd40l的表达或细胞因子和趋化因子的分泌来介导。
[0299]
为了研究由cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞产生的细胞因子，将t细胞与t2细胞与具有mage
‑
a4 gvydgrehtv肽滴定的t2细胞或抗原阳性a375肿瘤细胞共培养24小时。t细胞用作收获物(pbl)以及纯化的cd4 或cd8 t细胞产物。
[0300]
将t细胞和靶细胞以每孔50,000个目标和50,000个t细胞一式两份加入96孔u型底培养板的孔中。靶细胞是添加了范围为10
‑6至10
‑
10
m的外源性肽gvydgrehtv的t2，或作为阴性对照的无肽，或mage
‑
a4阳性肿瘤细胞系a375。测定板在37℃/5％co2孵育24小时。收集培养基(150μl)用于通过luminex
tm
进行细胞因子分析。
[0301]
使用invitrogen 25
‑
plex人细胞因子组试剂盒通过magpixtm进行细胞因子和趋化因子分析。使用bio
‑
radmagpixtm multiplex读数仪，使用magpix版本4.2build 1705的采集软件luminex xponent采集样品。使用r(v3.3.2)进行采集后分析。任何高于标准曲线顶部的值都被调整为顶部值。对每种细胞因子单独运行双因素重复测量anovas，将转导和t细胞部分作为对象内因素，然后对转导/t细胞部分组合内的每种转导组合进行成对事后检验，并使用holm方法调整p值。分析了预先定义的相关细胞因子子集：粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、ifn
‑
γ、il
‑
2、肿瘤坏死因子(tnf)
‑
α、mip
‑
1β(ccl4)、il
‑
17、il
‑
10、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
13、il
‑
2受体。
[0302]
图3中显示的数据与ifnγ的产生有关。图4中的数据与il2的产生有关。如图3所示，当共培养包括分离的cd4 细胞时(上面)，尽管细胞因子的绝对水平较低(尤其是对于ifnγ，其中y轴上的最大值为750pg/ml对比于图4中的il2的4000pg/ml)，与mage
‑
a4 tcr(白色)相比，cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞(黑色)的细胞因子释放的改善更为一致。这种模式在所有5个供体中都是一致的(除了wave214，它在该测定中响应不佳。在对抗原阳性a375肿瘤细胞的ifnγ响应中可以看到类似的结果(图3，下图)。通常，pbls或cd8 部分中的两个tcr构建体之间的差异很小，但是当研究cd4 时，可以在5个供体中的4个中看到构建体之间细胞因子释放的改善。
[0303]
在图4中，cd4 细胞数据(上面)表明，与mage
‑
a4 tcr(白色)相比，cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞(黑色)在细胞因子释放方面也有一致的改善。
[0304]
同样的趋势适用于粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、肿瘤坏死因子(tnf)
‑
α和mip
‑
1β(ccl4)的产生，数据未示出。其余六种细胞因子(il
‑
17、il
‑
10、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
13、il
‑
2受体)在五分之四的wave供体中显示出最小产生，尽管对于cd4 和cd8 分离的细胞，来自cd8α_mage
‑
a4 tcr t的细胞相比mage
‑
a4 tcr t细胞所产生的水平都更高。
[0305]
总之，从分析的细胞因子，且特别是ifnγ、il
‑
2、tnfα、gm
‑
csf和mip1β，与mage
‑
a4 tcr t细胞相比，cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞的细胞因子释放有所改善。
[0306]
实施例5.树状细胞共培养物中响应肿瘤细胞系的细胞因子产生
[0307]
希望通过引入cd8α到tcr转导的cd4 t细胞中可以促进与免疫系统的其他要素的结合，以引发持续的抗肿瘤反应，因此我们的目标是评估dc成熟和t细胞活化期间cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞与树状细胞(dcs)的相互作用。在肿瘤微环境的背景下，改善的dcs的成熟和活性可能有助于促进整体抗肿瘤免疫反应和t细胞的激活。
[0308]
为了研究dc成熟和t细胞活化过程中t细胞和树状细胞之间的相互作用，建立了两种测定类型，涉及未成熟的dcs、t细胞和肿瘤细胞系的共培养。这旨在反映体内情况，其中dcs从周围肿瘤细胞中吸收抗原并呈现在其mhc ii类上，而不是简单地加载外源性肽(其将仅在mhc i类上存在)。为了解决自体情况并确认在临床大规模t细胞中的应用，测定包括从具有匹配树状细胞的血液供体制成的小规模t细胞，以及wave级t细胞。
[0309]
(a)细胞制备和共培养
[0310]
共培养建立48小时，并且每种测定类型包括具有供体匹配的dcs的两种小规模t细胞制剂(供体tea和tsa，或nla和oba)，以及具有不匹配的dcs(如图例中所指定的)的两种大规模供体(wave213和wave217或wave216和wave217)。对于这些测定，包括抗原阳性靶细胞系(a375或nci
‑
h1755)和抗原阴性靶细胞系(nalm6)。作为树状细胞成熟的阳性对照，包括含有细胞因子混合物或脂多糖(lps)的孔。
[0311]
cd14 单核细胞分化7天后，将未成熟的树状细胞在r10中洗涤3次，计数并接种到48孔板中，以与mage
‑
a4阳性或mage
‑
a4阴性肿瘤细胞系和tcr转导的t细胞共培养。建立共培养48小时并在37℃/5％co2下孵育以评估这种共培养对dc成熟和活化的影响。所有共培养实验均使用100,000个靶细胞(a375、nci
‑
h1755或nalm6)、100,000个树状细胞和400,000个t细胞。将从同一供体产生的t细胞和树状细胞用于每种测定。共培养48小时后，收集上清液(每孔150μl)并在
‑
80℃下冷冻，用于随后通过magpixtm进行细胞因子和趋化因子分析或收获细胞用于流式细胞术分析。
[0312]
(b)对树状细胞成熟状态的影响
[0313]
为了评估48小时共培养期结束时树状细胞的成熟状态，使用流式细胞术进行多色免疫表型分析以确定树状细胞上成熟标志物的表达。将用于免疫表型共培养的靶细胞系用核gfp标记，以允许方便区分树状细胞和靶细胞。使用的单克隆抗体针对cd1a、cd14、cd40、cd80、hla
‑
dr、cd3、cd4和cd40l。除cd1a外，还针对cd40、cd80和hla
‑
dr(mhc ii)对dcs进行染色。所有这三种标志物在未成熟的树状细胞中都处于低水平表达，并在dc成熟后上调。未成熟树状细胞的预期表型为：cd1a 、hla
‑
dr低、cd80低、cd40低、cd14
‑
/低，并且成熟树状细胞的预期表型为：cd1a 、hla
‑
dr高、cd80高、cd14
‑
/低。
[0314]
与cd8α_mage
‑
a4 tcr或mage
‑
a4 tcr t细胞共孵育的树状细胞显示cd80、cd40和hla
‑
dr标记物响应抗原阳性a375细胞但不与抗原阴性nalm6细胞或非转导的t细胞等效的上调，因此激活是tcr和抗原特异性的。在与cd8α_mage
‑
a4或mage
‑
a4 pbls孵育的dcs之间没有差异。由抗原特异性激活的cd8α_mage
‑
a4和mage
‑
a4转导的t细胞都可以促进未成熟树状细胞的成熟(数据未示出)。
[0315]
(c)细胞因子测定
[0316]
用于细胞因子测定的方法描述于实施例4中。
[0317]
(c.i.)il
‑
12
[0318]
il
‑
12是由活化的成熟树状细胞产生的主要细胞因子，并通过cd40信号传导增强。在il
‑
12和/或ifnγ存在下激活的幼稚cd4 t细胞倾向于分化为th1细胞，这反过来支持ifnγ的产生并增加cd8 t细胞的细胞毒活性。
[0319]
将1x105个抗原阳性(a375和nci
‑
h1755)或抗原阴性(nalm6)肿瘤细胞系在48孔板中与1x105个未成熟树状细胞和4x105个t细胞共培养。48小时后收获培养物上清液并通过分析细胞因子。数据如图5所示。超过标准曲线顶部的任何数据点都已被绘制为最大值。由于il
‑
12的标准曲线在标准曲线的最高点处始终处于线性范围内，为了数据分析和图表生成的目的，将il
‑
12(p40/p70)的标准范围扩展到100,000pg/ml。所有实验条件都以生物学重复进行测试，并绘制了两种数据点。对每种细胞因子和阳性对照靶标单独运行三因素重复测量anovas，以转导、t细胞部分和dc的存在或不存在作为对象内因素，然后对转导/t细胞部分/dc组合内的每种转导组合进行成对的事后检验，并使用holm方法调整p
值。在图上仅示出了mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr之间的显著性比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
[0320]
在图5中，仅在含有dcs(x轴上的“t细胞 dcs”)的那些条件下观察到il
‑
12，证实这是dc特异性分析物。响应a375或nci
‑
h1755抗原阳性靶细胞系，dcs与未分离的t细胞(“pbls”，左图)共培养产生大量il
‑
12。当与cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞共培养时，il
‑
12的量是与lps一起孵育的阳性对照样品中所见量的两倍(实心三角形)。在每个供体中一致，暴露于cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞(黑点)的dcs产生的il
‑
12显著多于与mage
‑
a4 tcr t细胞(空心点)一起培养的那些(p＝0.002779a375和p＝0.0000964nci
‑
h1755)。dcs与t细胞或仅媒介物一起培养未产生il
‑
12，证实这是mage
‑
a4抗原特异性反应。
[0321]
当共培养物包括分离的cd4 t细胞(中图)时，dc仍会产生il
‑
12。由大规模cd4 cd8α_mage
‑
a4 tcr转导的t细胞(wave216和wave217)诱导的il
‑
12水平与混合pbls所见的大致相似，但仅略高于mage
‑
a4 tcr t细胞的背景。与小规模供体(tea和tsa)共培养产生的il
‑
12水平较低，但仍高于背景。总之，cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞有更大的响应。cd4 和混合的pbls条件之间il
‑
12产生的增加突出表明，尽管dc成熟的许可主要是cd4 功能，但cd8 t细胞也在dcs和t细胞响应抗原之间的正反馈回路中发挥重要作用。当共培养物包括分离的cd8 t细胞时，dcs在与小规模t细胞结合时不会产生任何il
‑
12，并且在与大规模供体结合时产生中等水平，并且这不受cd8α修饰的影响。(c.ii.)通过γ干扰素(mig或cxcl9)诱导的单核因子
[0322]
mig是t细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞的化学引诱物，其由树状细胞、巨噬细胞和其他细胞类型响应ifnγ产生。其主要功能是将引发的t淋巴细胞募集到炎症部位。
[0323]
将1x105个抗原阳性(a375和nci
‑
h1755)或抗原阴性(nalm6)肿瘤细胞系在48孔板中与1x105个未成熟的树状细胞和4x105个t细胞共培养。48小时后收获培养物上清液并通过分析细胞因子。
[0324]
图6中显示了数据。任何超过标准曲线顶部的数据点都被绘制为最大值。所有实验条件都以生物学重复进行测试，并绘制了两种数据点。对每种细胞因子和阳性对照靶标单独运行三因素重复测量anovas，以转导、t细胞部分和dcs的存在或不存在作为对象内因素，然后对转导/t细胞部分/dc组合内的每种转导组合进行成对的事后检验，并使用holm方法调整p值。在图上仅示出了mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr之间的显著性比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
[0325]
mig的分泌模式(图6)类似于il
‑
12。与混合的pbl t细胞共培养的dcs产生的mig高于测定的定量限制，且不能测量到差异。然而，当与分离的cd4 细胞孵育时，与利用大规模和小规模供体的mage
‑
a4 tcr t细胞相比，dcs产生的mig对cd8α_mage
‑
a4 tcr的响应存在明显差异。与大规模cd8 t细胞共培养的dcs也产生了高水平的mig。
[0326]
(c.iii.)il
‑6[0327]
il
‑
6由数种细胞类型产生，包括dcs。在临床上，它与预后不良有关，并且是与细胞因子释放综合征(crs)相关的主要细胞因子之一。il
‑
6的magpix数据如图7所示。nci
‑
h1755细胞系分泌约3
‑
4000pg/ml的il
‑
6，尽管在共培养时转导的t细胞的响应通常高于仅靶标的响应(x轴上的“媒介”，或ntd(灰点))，因此dcs有一些产生。响应于与t细胞和a375细胞共培养，dcs也会产生一些il
‑
6(多达～1000pg/ml)。
[0328]
将1x105个抗原阳性(a375和nci
‑
h1755)或抗原阴性(nalm6)肿瘤细胞系在48孔板中与1x105个未成熟的树状细胞和4x105个t细胞共培养。48小时后收获培养物上清液并通过分析细胞因子。任何超过标准曲线顶部的数据点都已被绘制为最大值。所有实验条件都以生物学重复进行测试，并绘制了两种数据点。对每种细胞因子和阳性对照靶标单独运行三因素重复测量anovas，以转导、t细胞部分和dcs的存在或不存在作为对象内因素，然后对转导/t细胞部分/dc组合内的每种转导组合进行成对的事后检验，并使用holm方法调整p值。在图上仅示出了mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr之间的显著性比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
[0329]
虽然与cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞共培养dcs产生的il
‑
6比与mage
‑
a4 tcr共培养多(1.8
‑
2.9倍，a375为p＝0.027115)，但是该量比在以阳性对照(lps，实心三角形)或肿瘤细胞自身(nci
‑
h1755)制造的il
‑
6刺激dcs时观察到的量要低得多。相比之下，在相同测定中产生的il
‑
12(一种前t细胞因子)的水平高于任一阳性对照(图5)。
[0330]
(c.iv.)ifnγ
[0331]
ifnγ是激活的t细胞响应抗原而分泌的一种关键细胞因子，并且在抗肿瘤反应中具有多种作用。
[0332]
将1x105个抗原阳性(a375和nci
‑
h1755)或抗原阴性(nalm6)肿瘤细胞系在48孔板中与1x105个未成熟树状细胞和4x105个t细胞共培养。48小时后收获培养物上清液并通过分析细胞因子。数据显示在图8中。t细胞在48h时在没有dcs的情况下分泌的ifnγ(x轴上的“t细胞”，图8)广泛反映了在之前24h共培养测定中看到的情况(低数千；图3)，并且在mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞产物之间观察到有限(无统计学意义)差异。任何超过标准曲线顶部的数据点都已被绘制为最大值。25
‑
plex测定试剂盒中ifnγ的标准范围高达～4,450pg/ml。由于标准曲线在标准曲线的最高点处始终处于线性范围内，为了数据分析和图表生成的目的，将标准范围扩展到20,000pg/ml，并且每个图表的y轴已设置为这个值。所有实验条件都以生物学重复进行测试，并绘制了两种数据点。对每种细胞因子和阳性对照靶标单独运行三因素重复测量anovas，以转导、t细胞部分和dcs的存在或不存在作为对象内因素，然后对转导/t细胞部分/dc组合内的每种转导组合进行成对的事后检验，并使用holm方法调整p值。在图上仅示出了mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr之间的显著性比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
[0333]
当将dcs加入到cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞和抗原阳性靶细胞(a375或nci
‑
h1755)的共培养物中时，ifnγ释放大幅增加(高达29倍，供体tea，nci
‑
h1755)，而在mage
‑
a4 tcr t细胞上添加dcs的影响更小(高达7倍，供体tea，nci
‑
h1755)。与mage
‑
a4 tcr t细胞相比，在dcs存在下由cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞产生的ifnγ之间存在显著差异(p＝0.000111a375，p＝0.000197nci
‑
h1755)。当与抗原阳性靶细胞和dcs共培养时，小规模cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞供体(tea和tsa)显示出甚至更明显的ifnγ水平增加。该数据说明了dc:t细胞相互作用的另一臂，即cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞对dcs激活的改善反过来又允许dcs改善t细胞激活。当mage
‑
a4 tcr或cd8α_mage
‑
a4 tcr转导的t细胞与mage
‑
a4阴性nalm6细胞共培养时，无论是否添加dcs，均未观察到ifnγ产生，从而证明观察到的反应是抗原特异性的。
[0334]
实施例6.cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞对抗原阳性微组织的杀伤
[0335]
研究了cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞对抗原阳性微组织的杀伤。对肿瘤细胞的细胞毒活性针通常被定征为cd8 细胞的函数，但也可以是cd4 t细胞的下函数。通过3d癌细胞微组织的incucyte测定确定mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞对gfp标记的3d癌细胞系微组织的细胞毒活性。
[0336]
将用细胞质gfp慢病毒转导的mage
‑
a4和hla
‑
a2阳性a375.gfp黑素瘤细胞以150个细胞/孔和1200个细胞/孔的起始细胞密度接种在超低附着(ula)384孔微孔板中，并短暂离心沉淀，然后在37℃/5％co2孵育以允许自然形成不同大小的3d微组织。成像从细胞接种点开始，并在添加t细胞后继续，直到使用incucyte zoom 40768(essen bioscience)以10x放大率以3小时间隔采集图像完成检测为止。在添加t细胞之前，在每个孔中确认了一致的微组织形成。6天后，从接种的150个细胞/孔形成的微组织直径为～550
‑
600μm(下文称为“小微组织”)，而从接种的1200个细胞/孔形成的那些直径为～800μm(下文称为“大微组织”)。接种到ula板中的a375.gfp细胞在加入t细胞之前的6天内形成了两种一致大小(小的和大的)的稳定微组织，图13a和图13b上图分别显示了表达mage
‑
a4的小型和大型a375.gfp微组织在wave 217细胞的背景下的此情况。
[0337]
添加t细胞群体作为未分离的pbls(20,000个细胞/孔)，以及纯的分离的cd4 (80,000个细胞/孔)和cd8 (20,000个细胞/孔)部分。10μm gvydgrehtv mage
‑
a4肽也被添加到指定的孔中，作为所有条件的另外的对照(数据未显示)。
[0338]
测定完成后，分析所有时间点来自每个孔的绿色荧光的原始图像，从而掩盖核心微组织荧光区域，允许计算所有研究时间点的每个重复和处理条件的微组织面积。荧光指标随时间的增加或减少分别表示3d微组织的生长或死亡。产生了3d微组织杀伤度量图。
[0339]
所有数据均针对t细胞添加的时间点进行标准化，以补偿t细胞杀伤前重复之间微组织大小的任何小差异。测定随时间变化的微组织面积和曲线下面积(auc)数据，直至测定终点，数据显示在图9
‑
图13中。
[0340]
图9和图11的数据表明，在147h(a)或145h(b)形成稳定的微组织后，添加来自供体wave214、wave215和wave217(a)或wave213和wave216(b).a&b)的adp
‑
a2m4和adp
‑
a2m4cd8 tcr转导的或ntd pbl(20,000个细胞/孔)、cd4 分离的(80,000个细胞/孔)或cd8 分离的(20,000个细胞/孔)t细胞。图9和图11
‑
a &b显示在添加ntd t细胞后，a375.gfp微组织在测定过程中继续稳定生长，然后减慢并在加入t细胞后～6
‑
8天达到测定板孔的极限大小。将来自未分离的pbl或纯的cd8

群体的mage
‑
a4 tcr或cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞添加到两种尺寸的a375.gfp微组织中，导致微组织的短期扩增，因为t细胞在快速和完全破坏微组织之前浸润组织。这是通过标准化的微组织区域的快速损失来测量的(图9和图11
‑
a&b)。
[0341]
图10和图12表明，来自未分离的pbls或纯的cd8 t细胞群体的mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞之间的总体杀伤率没有显著差异(图10和图12
‑
中间和右侧图)。然而，与仅用mage
‑
a4 tcr转导的cd4

t细胞相比，用cd8α_mage
‑
a4 tcr转导分离的cd4

t细胞引起了对两种大小的a375.gfp微组织的细胞毒性的显著增强(图10和图12
‑
左图)。测试的所有五种wave cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞产品均一致显示提高的对3d微组织的杀伤。此外，到五个供体中的三个的测定结束时，实现了cd4 cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞对两种微组织大小的完全破坏(图9和图11，a
‑
b
‑
左侧图；图13参见
‘
iii’)。这些数据表明，cd8α共受体的表
达显著增强了用mage
‑
a4 tcr转导的cd4 t细胞的效应子功能。
[0342]
实施例7.ifnγ和颗粒酶b响应a375.gfp 3d微组织的cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞产生
[0343]
评估了mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr未分离的pbl、纯化的cd4

和cd8

t细胞响应a375.gfp 3d微组织产生ifnγ和颗粒酶b的能力。
[0344]
在加入t细胞后～50h，从与incucyte测定板平行设置的重复板收集上清液。通过elisa在384孔板中分析上清液的ifnγ和颗粒酶b。在加入elisa板之前，将样品上清液在r10测定培养基中稀释4倍。使用glo底物发光hrp底物对板进行显影，并且在bmg labtech fluostar omega读板器上读数之前，将每个板孵育五分钟。在omega数据分析软件(版本3.10r6)中进行数据分析，并将4倍稀释因子应用于获得的细胞因子值以考虑样品稀释。将分析的数据导出到excel并使用r版本3.2.2中的自定义r脚本绘制图形。在r脚本中，具有的值超过最高标准浓度的样品孔被指定为最高标准的值。具有的值低于标准曲线范围的孔被指定为0的值。超过在没有外源mage
‑
a4肽的靶标存在下相应的ntd t细胞的最高值100pg/ml被用于区分背景信号和阳性ifnγ反应。超过在没有外源mage
‑
a4肽的靶标存在下相应的ntd t细胞的最高值200pg/ml被用于区分背景信号和阳性颗粒酶b反应。对于每种目标微组织大小，重复测量anovas被用于比较所有wave的组合数据的每个部分中的ifnγ和颗粒酶b释放的水平。
[0345]
在加入t细胞后～50小时从平行测定板收集上清液并通过elisa进行测定。利用来自所有五种测试的wave t细胞产品的未分离的pbl和cd8 亚群的mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞观察到强烈的细胞因子反应(图14)。未观察到由分别来自未分离的pbl或纯化的cd8

亚群的mage
‑
a4 tcr和cd8α_mage
‑
a4 tcr t细胞释放的ifnγ或颗粒酶b的水平的显著差异。这表明cd8

t细胞中另外的cd8α共受体表达不会导致对抗原阳性靶标的细胞毒性增强。
[0346]
在测试的响应两种尺寸的a375.gfp 3d微组织的所有wave产品中，与mage
‑
a4 tcr cd4

t细胞相比，cd8α_mage
‑
a4 tcr显著增加了ifnγ和颗粒酶b的产生水平(图14
‑
左图)。与mage
‑
a4 tcr cd4

t细胞相比，这些数据与cd8α_mage
‑
a4 tcr cd4

t细胞增强的杀伤能力相匹配(图9
‑
图13)。
[0347]
总之，这些数据表明，与仅mage
‑
a4 tcr转导的cd4

t细胞相比，cd8α同源二聚体与mage
‑
a4 tcr在cd4

t细胞中的改造共表达引起对抗原阳性3d微组织的细胞毒性反应的大幅增加。这提供了使用cd8α来增强重组tcr转导的cd4

t细胞的基本原理，以增强对抗原阳性靶标的细胞毒性反应的效力。
[0348]
序列
[0349][0350]
seq id no:1(cd8α)cdrs下划线加粗，信号序列下划线斜体
[0351]
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgagccagttccgggtgtcgccgctggatcggacctggaacctgggcgagacagtggagctgaagtgccaggtgctgctgtccaacccgacgtcgggctgctcgtggctcttccagccgcgcggcgccgccgccagtcccaccttcctcctatacctctccc
aaaacaagcccaaggcggccgaggggctggacacccagcggttctcgggcaagaggttgggggacaccttcgtcctcaccctgagcgacttccgccgagagaacgagggctactatttctgctcggccctgagcaactccatcatgtacttcagccacttcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaaccgaagacgtgtttgcaaatgtccccggcctgtggtcaaatcgggagacaagcccagcctttcggcgagatacgtcggttcaagagctaaaagaagtggtagtggtgcccctgtga
[0352]
seq id no:2(cd8α)
[0353][0354]
seq id no:3(mage a4 tcrα链)cdrs下划线加粗
[0355]
atgaagaagcacctgaccacctttctcgtgatcctgtggctgtacttctaccggggcaacggcaagaaccaggtggaacagagcccccagagcctgatcatcctggaaggcaagaactgcaccctgcagtgcaactacaccgtgtcccccttcagcaacctgcggtggtacaagcaggacaccggcagaggccctgtgtccctgaccatcctgaccttcagcgagaacaccaagagcaacggccggtacaccgccaccctggacgccgatacaaagcagagcagcctgcacatcaccgccagccagctgagcgatagcgccagctacatctgcgtggtgtccggcggcacagacagctggggcaagctgcagtttggcgccggaacacaggtggtcgtgacccccgacatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgcgggacagcaagagcagcgacaagagcgtgtgcctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaatagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagccccgagagcagctgcgacgtcaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaggtggccggcttcaacctgctgatgaccctgagactgtggtccagcggcagccgggccaagagaseq id no:4(mage a4 tcrα链编码序列)
[0356][0357]
seq id no:5(mage a4 tcrβ链)cdrs下划线加粗
[0358]
atggccagcctgctgttcttctgcggcgccttctacctgctgggcaccggctctatggatgccgacgtgacccagaccccccggaacagaatcaccaagaccggcaagcggatcatgctggaatgctcccagaccaagggccacgaccggatgtactggtacagacaggaccctggcctgggcctgcggctgatctactacagcttcgacgtgaaggacatcaacaagggcgagatcagcgacggctacagcgtgtccagacaggctcaggccaagttcagcctgtccctggaaagcgccatccccaaccagaccgccctgtacttttgtgccacaagcggccagggcgcctacgaggagcagttctttggccctggcacccggctgacagtgctggaagatctgaagaacgtgttccccccagaggtggccgtgttcgagccttctgaggccgaaatcagccacacccagaaagccacactcgtgtgtctggccaccggcttctaccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtccaccgatccccagcctctgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaaccccagaaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacagatcgtgtct
gccgaagcttgggggcgcgccgattgtggctttaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctgctgggaaaggccacactgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggacagccggggc
[0359]
seq id no:6(mage a4 tcrβ链编码序列)
[0360][0361]
seq id no:7(mage a4 tcrα链可变区)136aa
–
cdrs下划线加粗
[0362]
seq id no:8(mage a4 tcrβ链可变区)133aa
–
cdrs下划线加粗
[0363]
vspfsn seq id no:9；cdr1 mage a4 tcrα链，(残基48
‑
53)
[0364]
ltfsen seq id no:10；cdr2 mage a4 tcrα链，(残基71
‑
76)
[0365]
cvvsggtdswgklqf seq id no:11；cdr3 mage a4 tcrα链，(残基111
‑
125)
[0366]
kghdr seq id no:12；cdr1 mage a4 tcrβ链，(残基46
–
50)
[0367]
sfdvkd seq id no:13；cdr2 mage a4 tcrβ链，(残基68
‑
73)
[0368]
catsgqgayeeqff seq id no:14；cdr3 mage a4 tcrβ链，(残基110
–
123)
[0369]
vllsnptsg seq id no:15；cdr1 cd8α(残基45
‑
53)
[0370]
ylsqnkpk seq id no:16；cdr2 cd8α(残基72
‑
79)
[0371]
lsnsim seq id no:17；cdr3 cd8α(残基118
‑
123)
[0372]
gvydgrehtv
‑
seq id no:18