1.本发明系有关一种中国台湾藜壳发酵产物，特别是关于一种可用作益生元(prebiotic)的中国台湾藜壳发酵产物。
背景技术：
：：2.中国台湾藜(chenopodiumformosanumkoidz；djulis)素有中国台湾原乡「红宝石」的美誉，为中国台湾农业界和食品产业目前相当热门的杂粮谷物原料。依据中国台湾植物志(中国台湾植物志，第二版，第二卷，被子植物，1996，p385)的记载，中国台湾藜属藜科(chenopodiaceae)藜属(chenopodium)的中国台湾特有种一年生草本植物，籽实外壳富含多种不同色素，故果穗籽实在生长期时成熟转色过程中会呈现绿、红、橙、黄、紫等不同颜色。中国台湾藜为中国台湾原住民族种植和食用百年以上的传统杂粮作物，其原生地主要分布于中国台湾的屏东和台东等地区。中国台湾藜籽实富含多种人体所需营养素，如淀粉(～50％)、蛋白质(～14％)、膳食纤维(～14％)、钾、钙与镁等矿物质和谷类食材较缺乏的组胺酸、离胺酸、缬胺酸等必需胺基酸等，其亦富含酚酸和类黄酮等有益人体生体机能的多酚类植化素，为一极为优质的膳食来源。3.因中国台湾藜壳含具有微毒性的皂素，若连壳食用会有苦涩口感，故通常前会先将中国台湾藜的籽实去壳来获得其中的藜籽，再将藜籽作进一步的加工处理，也因此会产生大量的藜壳。twi632919即揭示一种具皮肤抗皱活性的红藜壳萃取物和其制造方法。tw201912177a另揭示一种可用于抗氧化、美白或抗皮肤老化的中国台湾藜壳酒精萃取物。4.中国台湾藜壳的功用尚待进一步的研究与开发，藉此提升中国台湾藜壳的经济价值。技术实现要素：5.本发明的主要目的在于提供一种可用做益生元的中国台湾藜壳发酵产物。6.因此，本发明一方面提供一种制备中国台湾藜壳发酵产物的方法。7.本发明另一方面提供一种由本发明方法所制得的中国台湾藜壳发酵产物。8.本发明另一方面提供一种包含本发明中国台湾藜壳发酵产物的益生元组合物。9.本发明另一方面提供一种使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来培养益生菌的方法。10.本发明另一方面提供一种使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来增加个体体内益生菌的用途。11.本发明的另一方面提供可通过本发明方法获得的糖蛋白-酬载偶联物。附图说明12.图1显示本发明中国台湾藜壳发酵产物对发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)atcc14931、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)atcc14917和动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)atcc25527生长的影响。具体实施方式13.除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术者通常所理解相同的含义。虽然可在实施或测试本发明时使用类似于或等效于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述较佳的方法和材料。本文特别提和的所有公开案和专利出于所有目的以引用的方式并入本文中。本说明书中所引用的所有参考文献视为此项技术的技能水平的指示。14.应注意，如本文和随附申请专利范围中所用，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式「一」和「所述的」包括复数个指示物。同样，在本文中，术语「一」、「一或多个」和「至少一个」可互换使用。亦应注意，术语「包含」、「包括」和「具有」可互换使用。15.通常，本文中范围表述为自「约」一个特定值和/或至「约」另一特定值。当表述此类范围时，实施例包括自一个特定值和/或至另一特定值的范围。类似地，当值藉由使用词语「约」表述为近似值时，应理解特定值形成另一实施例。将进一步理解，范围中的每一者的端点无论与另一端点相关还是与另一端点无关均为有意义的。如本文所用，术语「约」系指±20％、±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％或±0.25％。16.本文中「益生菌(probioticbacteria或probiotics)」系指可使个体获益的微生物(细菌或真菌)。有些益生菌自然性地存于宿主的肠道中。其他益生菌则可藉由膳食补充剂引入至宿主中。17.术语「益生元(prebiotic)」一般系指会引发益生菌的生长(因此提升活菌计数或cfu)或活性的物质。18.除非另外指定，否则本文所用的术语「个体」系指哺乳动物。在某些实例性实施例中，个体系人类，包含婴儿、儿童和成人。19.个体中有利共生菌群的质量和数量会因抗生素治疗、压力、饮食不均衡和疾病(尤其是胃肠道病症)而改变。益生菌的增加可明显减轻此现象。本发明惊人地发现中国台湾藜壳经发酵后所的到的产物可用做益生元，其可促进益生菌的生长，来增加益生菌的数量。20.因此，本发明的一目的为提供一种制备中国台湾藜壳发酵产物的方法，其包含：21.(1)将中国台湾藜壳研磨成中国台湾藜壳粉末；22.(2)将所述的中国台湾藜壳粉末灭菌干燥获得经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末；23.(3)将所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末与糖、酿酒酵母、戊糖乳杆菌、食窦魏斯氏菌、类植物乳杆菌、木聚醣酶和水混合成混合物；24.(4)将所述的混合物于约15℃至约35℃下厌氧发酵约12至约36小时后，藉由高温灭菌停止发酵反应并获得中国台湾藜壳发酵混合物；及25.(5)将中国台湾藜壳发酵混合物干燥获得所述的中国台湾藜壳发酵产物。26.根据本发明，中国台湾黎壳系指将中国台湾藜的籽实去除胚乳、胚芽和麸皮后所取得的坚硬外种皮。但须注意，「中国台湾黎壳」乙词并不表示所述的壳中完全不含任何胚乳、胚芽和/或麸皮的成分。27.于本发明的一实施态样中，中国台湾藜壳系经干燥(例如自然风干和日照等)处理。于本发明的另一实施态样中，本发明步骤(1)中所使用的中国台湾藜壳系为经由色差仪测量后的红绿色差值(δa)为正值(较佳为约1至约10；更较佳为约4至约8；最佳为约6)的中国台湾藜壳。28.于本发明的一实施态样中，中国台湾藜壳粉末的平均粒径为约500μm至约1000μm；较佳为约700μm至约800μm；最佳为约750μm。29.于本发明的一实施态样中，步骤(2)系热风辅助射频干燥系统来灭菌干燥中国台湾藜壳粉末，于所述的热风辅助射频干燥系统中所使用的热风温度为约40℃至约70℃，较佳为约50℃；射频频率为约30mhz至约60mhz，较佳为约40mhz至约50mhz，最佳为约40.68mhz；且极板间距为约90cm至约130cm，较佳为约100cm至约120cm，最佳为约110cm。30.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末与所述的糖的重量比为约5:1至约15:1，较佳为约8:1至约12:1，最佳为约10:1。31.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中以该经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，酿酒酵母的量为约1x106cfu/g至约9x1010cfu/g，较佳为约5x106cfu/g至约7.5x108cfu/g，最佳为约4.3x108cfu/g。32.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中戊糖乳杆菌、食窦魏斯氏菌和类植物乳杆菌系以乳酸菌混合物的型态存在；其中戊糖乳杆菌与食窦魏斯氏菌的菌数比为约2:1至约1:6，较佳为约1:1至约1:4，更佳为约1:2，；其中食窦魏斯氏菌与类植物乳杆菌的菌数比为约4:1至约1:3，较佳为约2:1至约1:2，更佳为约1:1，；且其中以所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，所述的乳酸菌混合物的总菌数为约2.5x103cfu/g至约10x106cfu/g，较佳为约5x104cfu/g至约8.5x105cfu/g，最佳为约6.5x104cfu/g。33.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中以所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，所述的木聚醣酶的量为约0.5unit/g至约3unit/g，较佳为约15unit/g至约2unit/g，最佳为约1.4unit/g。34.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中水可为经高压灭菌的一次水；且以所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，水的量为约0.6ml/g至约2ml/g，较佳为约0.8ml/g至约1.5ml/g，最佳为约1.2ml/g。35.于本发明的一实施态样中，步骤(4)中的厌氧发酵可于发酵槽或发酵袋中进行；其中发酵温度为约15℃至约35℃，较佳为约20℃至约30℃，最佳为约25℃；且其中发酵时间为约12至36小时，较佳为约20至30小时，最佳为约24小时。36.于本发明的一实施态样中，步骤(4)中的所述的所述的高温灭菌系以约90至约100℃的水蒸煮约15至约30分钟，较佳为以约100℃的水蒸煮约20分钟。37.于本发明的一实施态样中，步骤(5)中的所述的干燥可藉由任何习知的干燥方法进行，例如真空干燥法、减压干燥法、冷冻干燥法、真空冷冻干燥法、喷雾干燥法和高温干燥法等。于本发明的一较佳实施态样中，步骤(5)中的所述的干燥系使用流动床干燥法，以约65℃至约95℃(更佳为约75℃至约85℃)的温度进行干燥。38.本发明的另一目的为提供可由本发明发酵方法所获得的中国台湾藜壳发酵产物。由于本发明的中国台湾藜壳发酵产物可促进益生菌的生长，故其用做益生元。因此，本发明的另一目的为提供由包含可由本发明发酵方法所获得的中国台湾藜壳发酵产物的益生元组合物。39.于本发明的一实施态样中，所述的益生元组合物可进一步包含一或多种额外益生元，而所述的额外益生元可包含，但不限定为，半乳寡糖、果寡糖、木寡糖、难消化性麦芽糖糊精、菊糖、异麦芽寡糖、乳糖醇、乳果糖、反式半乳寡糖、大豆寡糖和麦麸。40.于本发明的一实施态样中，所述的益生元组合物可为医药或营养配制品，例如营养食品、营养或饮食补充物、医疗或功能性食品或饮料产品、膳食替代品或食品添加物。因此，本发明的益生元组合物可以医药的形式或作为饮食补充物的形式给予，较佳系与一或多种医药或营养上可接受的载剂组合。41.本发明的另一目的为使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来培养益生菌的方法，其包括将益生菌于适当的条件下培养于含有本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物的培养基中。42.根据本发明，所述益生菌包括，但不限定为，艾克曼菌(akkermansia)、拟杆菌(bacteroides)、双歧杆菌(bifidobacterium)、肠球菌(enterococcus)、普拉梭菌(faecalibacterium)、乳杆菌(lactobacillus)、摩根氏杆菌(morganella)、颤螺菌(oscillospira)、颤杆菌(oscillibacter)、副萨特氏菌(parasutterella)、丙酸杆菌(propionibacterium)、消化链球菌(peptostreptococcus)、足球菌(pediococcus)、链球菌(streptococcus)。于本发明的较佳实施态样中，所述的益生菌可为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)。43.根据本发明，「培养基」系指含有至少一种溶质，且容许益生菌生长和/或繁殖的液体或固体组成物。44.本发明的另一目的为提供使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来增加个体中一或多种益生菌的方法和用途，其特征在于将本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物投予所述的个体，并基于益生菌的增生，可达到例如预防或治疗炎症性肠病、改善排便质量、改善睡眠质量、改善血液脂蛋白脂质浓度、改善血液三酸甘油脂浓度、改善情绪和/或改善血液胆固醇浓度等功效。45.以下实施例系出于说明目的而提供，而并不意欲限制本发明范围。46.实例1、中国台湾藜壳发酵产物的制备47.收集经色差仪(minoltachromametercr-200,japan)检定红绿色差值(δa)大于6的干燥中国台湾藜壳约500g，利用快速食品均质机(retschknifemillgrindomixgm200,germany)进行微细化加工后，辅以70mesh筛网进行过筛，以择取平均粒径约为754.8μm的中国台湾藜壳粉末。将所述的中国台湾藜壳粉末利用热风辅助射频干燥系统，以热风50℃、频率40.68mhz、极板间距110cm处理6分钟，进行减菌干燥。48.于100g前述经灭菌干燥的中国台湾藜壳粉末中，依序加入10g糖、1g含酿酒酵母(saccharmycescerevisiae)atcc208353(4.3x108cfu/g)和2g乳酸菌(包含戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)atcc8041、食窦魏斯氏菌(weissellacibaria)dsm15878和类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)atcc10776混合菌株，总菌数为6.5x104cfu/g)的混合物和140unit木聚醣酶(xylanase,panlyve696)后，加入120ml经高压灭菌的一次水，将其混和均匀后，密封置于厌氧发酵袋内，于25℃反应24小时，随即取出中国台湾藜壳粉末，以100℃蒸煮20分钟后，再利用流动床(retschtg200,germany)以75～85℃进行干燥，即可得到中国台湾藜壳发酵产物。49.实例2、中国台湾藜发酵产物的成分分析50.为评估发酵作用对中国台湾藜壳营养成分和机能性化学成分的影响，将前述实例1所获得的中国台湾藜壳发酵产物进行包括总多酚化合物(totalpolyphenolcontents)、总类黄酮(totalflavonoidscontents)、膳食纤维、植酸(phyticacid)和皂素(saponin)含量分析。51.2-1总多酚和总类黄酮化合物含量分析52.中国台湾藜壳发酵前后总多酚化合物和总类黄酮含量分析，系分别参考singleton等人(analysisoftotalphenolsandotheroxidationsubstratesandantioxidantsbymeansoffolin-ciocalteureagent.methodsenzymol.1999,299:152-178.)、sarker等人(salinitystressenhancescolorparameters,bioactiveleafpigments,vitamins,polyphenols,flavonoidsandantioxidantactivityinselectedamaranthusleafyvegetables.jsci.foodagric.2018,99:2275-2284)和陈等人(2016，酸桔(citrussunkihort)和扁实柠檬(citrusdepressahayata)果实萃取物对发炎生化指标的影响，中国台湾农业化学与食品科学，49卷3期，p118–130)所发表的方法进行测定。取125μl0.2nfolin&ciocalteu'sphenol试剂和25μl未经发酵中国台湾藜壳粉末(对照组，a)或中国台湾藜壳发酵产物(发酵组，b)甲醇萃取液，混匀并静置3分钟，再分别加入100μlna2co3，震荡混匀后避光静置40分钟后测定反应终产物760nm吸光值。另取0、15.62、31.25、62.50、125和250ppm没食子酸(gallicacid)作为标准曲线，单位为mg没食子酸/g。在总类黄酮含量分析方面，则分别取100μl定量未经发酵中国台湾藜壳粉末(对照组，a)或中国台湾藜壳发酵产物(发酵组，b)甲醇萃取液，加入30μl5％亚硝酸钠，反应6分钟后，再加入30μl10％硝酸铝反应6分钟；接续地，加入100μl1m氢氧化钠，反应10分钟后测定515nm的吸光值变化。另以芸香素(rutin)作为总类黄酮分析的对照标准，样品总类黄酮含量以相当于mg芸香素/g干燥粉末表示。53.总多酚和总黄酮含量分析结果显示(表1)，经酵母菌、乳酸菌混合物和木聚醣酶发酵处理后，中国台湾藜壳的总多酚化合物含量可提升1.7倍(19.84→53.65mg/g)。然而，若进一步分析总类黄酮化合物含量，却无显著改变。为厘清中国台湾藜壳发酵产物所包含的主要化学成分，进一步利用高解析液相层析串联质谱仪(lc-esi-ms/ms)进行分析，并与已知文献报告(chyau,c.c.等人,theiinhibitoryeffectsofdjulis(chenopodiumformosanum)anditsbioactivecompoundsonadipogenesisin3t3-l1adipocytes.molecules2018,23:1780；和hsua,b.y.,lin,s.w.,stepheninbaraj,b.,chen,b.h.,simultaneousdeterminationofphenolicacidsandflavonoidsinchenopodiumformosanumkoidz.(djulis)byhplc-dad-esi–ms/msb.j.pharm.biomed.anal.2017,132:109–116.)进行比对，依据初步分析结果推测中国台湾藜壳发酵产物主要含有香草酸(vanillicacid)[(m-h)-：167.00063]、香草酸己糖苷(vanillicacidhexoside)[(m-h)-：329.11140]、奎宁酸(quinicacid)[(m-h)-：191.03271]和原儿茶酸(protocatechuicacid)衍生物[(m-h)-：283.14080]等酚酸化合物。此结果支持中国台湾藜壳发酵产物中的主要成分应为非类黄酮类的酚类化合物。[0054]表1发酵对中国台湾藜壳总多酚和总黄酮含量变化的影响saponinfromasoapberry(sapindusmukorossigaertn)incleaningproductsbyachromatographicandtwocolorimetricassays.j.fac.agr.kyushuuniv.2009,54:215-221)所报导的方法进行分析。取未经发酵中国台湾藜壳粉末(对照组，a)与中国台湾藜壳发酵产物(发酵组，b)各5g，加入100ml甲醇于50℃反应12小时后，以1号滤纸过滤取上清液。将前述萃取液浓缩干燥后，分别以乙酸乙酯：水(1:1，v/v)和正丁醇:水(1:1，v/v)进行分馏萃取后，可获得正丁醇分馏萃取物。接续地，将正丁醇萃取物浓缩干燥后，利用vanillin-sulfuricacidassay测定中国台湾藜壳粉末经发酵前后总皂素含量的变化。测定结果见表4，相较于未经发酵中国台湾藜壳粉末(皂素：1.20±0.11mg/ml)，中国台湾藜壳发酵产物总皂素含量(0.47±0.02mg/ml)显著减少60.83％；此结果证实，利用本发明的中国台湾藜壳发酵产物除能有效减少其所含的总皂素含量，亦可提升中国台湾藜加工副产物的产业利用性。[0068]表4中国台湾藜壳粉末发酵前后的皂素含量变化[0069][0070]a变化率(％)＝(a-b/a)×100，p<0.05[0071]实例3[0072]将二株乳酸菌(发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)atcc14931和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)atcc14917与一株动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)atcc25527，分别以乳杆菌属培养液(mrsbroth)进行菌株厌氧培养活化，再将菌液序列稀释后涂抹于mrs琼脂平板，经厌氧培养后计数其起始菌数；取0.1ml前述经稀释10倍的菌液接种至内含2％未经发酵中国台湾藜壳粉末(a)或由实例1所得中国台湾藜壳发酵产物(b)的mrs培养液中，将所述的mrs培养液以厌氧35℃培养4天后，分别序列稀释涂抹于mrs琼脂平板，将其进行厌氧培养后，计数最终菌数(gibson,g.r.等人bifidogenicpropertiesofdifferenttypesoffructo-oligosaccharides.foodmicrobiology,1994,11:491-498)。[0073]比较添加未经发酵中国台湾藜壳粉末和中国台湾藜壳发酵产物两试验组对培养在mrs培养基中的发酵乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌动物亚种三菌株的生长情形。结果如图1所示，添加2％未经生物改质中国台湾藜壳粉的对照组(a)仅可使发酵乳杆菌和植物乳杆菌两株菌于mrs培养基中分别增殖1.6和2.1倍；然而，添加2％中国台湾藜壳发酵产物的实验组(b)则可使发酵乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌动物亚种三菌株的菌数分别显著地增加4、3.9与4倍。此实验结果证实，利用本发明的中国台湾藜壳发酵产物具有改善肠道机能益生菌生长的益生元(prebiotics)的作用。[0074]上述实施例仅为说明本发明的原理和其功效，而非限制本发明。习于此技术的人士对上述实施例所做的修改和变化仍不违背本发明的精神。本发明的权利范围应如后述的权力要求书所列。当前第1页12当前第1页12
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：：2.中国台湾藜(chenopodiumformosanumkoidz；djulis)素有中国台湾原乡「红宝石」的美誉，为中国台湾农业界和食品产业目前相当热门的杂粮谷物原料。依据中国台湾植物志(中国台湾植物志，第二版，第二卷，被子植物，1996，p385)的记载，中国台湾藜属藜科(chenopodiaceae)藜属(chenopodium)的中国台湾特有种一年生草本植物，籽实外壳富含多种不同色素，故果穗籽实在生长期时成熟转色过程中会呈现绿、红、橙、黄、紫等不同颜色。中国台湾藜为中国台湾原住民族种植和食用百年以上的传统杂粮作物，其原生地主要分布于中国台湾的屏东和台东等地区。中国台湾藜籽实富含多种人体所需营养素，如淀粉(～50％)、蛋白质(～14％)、膳食纤维(～14％)、钾、钙与镁等矿物质和谷类食材较缺乏的组胺酸、离胺酸、缬胺酸等必需胺基酸等，其亦富含酚酸和类黄酮等有益人体生体机能的多酚类植化素，为一极为优质的膳食来源。3.因中国台湾藜壳含具有微毒性的皂素，若连壳食用会有苦涩口感，故通常前会先将中国台湾藜的籽实去壳来获得其中的藜籽，再将藜籽作进一步的加工处理，也因此会产生大量的藜壳。twi632919即揭示一种具皮肤抗皱活性的红藜壳萃取物和其制造方法。tw201912177a另揭示一种可用于抗氧化、美白或抗皮肤老化的中国台湾藜壳酒精萃取物。4.中国台湾藜壳的功用尚待进一步的研究与开发，藉此提升中国台湾藜壳的经济价值。技术实现要素：5.本发明的主要目的在于提供一种可用做益生元的中国台湾藜壳发酵产物。6.因此，本发明一方面提供一种制备中国台湾藜壳发酵产物的方法。7.本发明另一方面提供一种由本发明方法所制得的中国台湾藜壳发酵产物。8.本发明另一方面提供一种包含本发明中国台湾藜壳发酵产物的益生元组合物。9.本发明另一方面提供一种使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来培养益生菌的方法。10.本发明另一方面提供一种使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来增加个体体内益生菌的用途。11.本发明的另一方面提供可通过本发明方法获得的糖蛋白-酬载偶联物。附图说明12.图1显示本发明中国台湾藜壳发酵产物对发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)atcc14931、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)atcc14917和动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)atcc25527生长的影响。具体实施方式13.除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术者通常所理解相同的含义。虽然可在实施或测试本发明时使用类似于或等效于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述较佳的方法和材料。本文特别提和的所有公开案和专利出于所有目的以引用的方式并入本文中。本说明书中所引用的所有参考文献视为此项技术的技能水平的指示。14.应注意，如本文和随附申请专利范围中所用，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式「一」和「所述的」包括复数个指示物。同样，在本文中，术语「一」、「一或多个」和「至少一个」可互换使用。亦应注意，术语「包含」、「包括」和「具有」可互换使用。15.通常，本文中范围表述为自「约」一个特定值和/或至「约」另一特定值。当表述此类范围时，实施例包括自一个特定值和/或至另一特定值的范围。类似地，当值藉由使用词语「约」表述为近似值时，应理解特定值形成另一实施例。将进一步理解，范围中的每一者的端点无论与另一端点相关还是与另一端点无关均为有意义的。如本文所用，术语「约」系指±20％、±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％或±0.25％。16.本文中「益生菌(probioticbacteria或probiotics)」系指可使个体获益的微生物(细菌或真菌)。有些益生菌自然性地存于宿主的肠道中。其他益生菌则可藉由膳食补充剂引入至宿主中。17.术语「益生元(prebiotic)」一般系指会引发益生菌的生长(因此提升活菌计数或cfu)或活性的物质。18.除非另外指定，否则本文所用的术语「个体」系指哺乳动物。在某些实例性实施例中，个体系人类，包含婴儿、儿童和成人。19.个体中有利共生菌群的质量和数量会因抗生素治疗、压力、饮食不均衡和疾病(尤其是胃肠道病症)而改变。益生菌的增加可明显减轻此现象。本发明惊人地发现中国台湾藜壳经发酵后所的到的产物可用做益生元，其可促进益生菌的生长，来增加益生菌的数量。20.因此，本发明的一目的为提供一种制备中国台湾藜壳发酵产物的方法，其包含：21.(1)将中国台湾藜壳研磨成中国台湾藜壳粉末；22.(2)将所述的中国台湾藜壳粉末灭菌干燥获得经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末；23.(3)将所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末与糖、酿酒酵母、戊糖乳杆菌、食窦魏斯氏菌、类植物乳杆菌、木聚醣酶和水混合成混合物；24.(4)将所述的混合物于约15℃至约35℃下厌氧发酵约12至约36小时后，藉由高温灭菌停止发酵反应并获得中国台湾藜壳发酵混合物；及25.(5)将中国台湾藜壳发酵混合物干燥获得所述的中国台湾藜壳发酵产物。26.根据本发明，中国台湾黎壳系指将中国台湾藜的籽实去除胚乳、胚芽和麸皮后所取得的坚硬外种皮。但须注意，「中国台湾黎壳」乙词并不表示所述的壳中完全不含任何胚乳、胚芽和/或麸皮的成分。27.于本发明的一实施态样中，中国台湾藜壳系经干燥(例如自然风干和日照等)处理。于本发明的另一实施态样中，本发明步骤(1)中所使用的中国台湾藜壳系为经由色差仪测量后的红绿色差值(δa)为正值(较佳为约1至约10；更较佳为约4至约8；最佳为约6)的中国台湾藜壳。28.于本发明的一实施态样中，中国台湾藜壳粉末的平均粒径为约500μm至约1000μm；较佳为约700μm至约800μm；最佳为约750μm。29.于本发明的一实施态样中，步骤(2)系热风辅助射频干燥系统来灭菌干燥中国台湾藜壳粉末，于所述的热风辅助射频干燥系统中所使用的热风温度为约40℃至约70℃，较佳为约50℃；射频频率为约30mhz至约60mhz，较佳为约40mhz至约50mhz，最佳为约40.68mhz；且极板间距为约90cm至约130cm，较佳为约100cm至约120cm，最佳为约110cm。30.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末与所述的糖的重量比为约5:1至约15:1，较佳为约8:1至约12:1，最佳为约10:1。31.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中以该经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，酿酒酵母的量为约1x106cfu/g至约9x1010cfu/g，较佳为约5x106cfu/g至约7.5x108cfu/g，最佳为约4.3x108cfu/g。32.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中戊糖乳杆菌、食窦魏斯氏菌和类植物乳杆菌系以乳酸菌混合物的型态存在；其中戊糖乳杆菌与食窦魏斯氏菌的菌数比为约2:1至约1:6，较佳为约1:1至约1:4，更佳为约1:2，；其中食窦魏斯氏菌与类植物乳杆菌的菌数比为约4:1至约1:3，较佳为约2:1至约1:2，更佳为约1:1，；且其中以所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，所述的乳酸菌混合物的总菌数为约2.5x103cfu/g至约10x106cfu/g，较佳为约5x104cfu/g至约8.5x105cfu/g，最佳为约6.5x104cfu/g。33.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中以所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，所述的木聚醣酶的量为约0.5unit/g至约3unit/g，较佳为约15unit/g至约2unit/g，最佳为约1.4unit/g。34.于本发明的一实施态样中，步骤(3)中水可为经高压灭菌的一次水；且以所述的经灭菌干燥中国台湾藜壳粉末的重量为基础，水的量为约0.6ml/g至约2ml/g，较佳为约0.8ml/g至约1.5ml/g，最佳为约1.2ml/g。35.于本发明的一实施态样中，步骤(4)中的厌氧发酵可于发酵槽或发酵袋中进行；其中发酵温度为约15℃至约35℃，较佳为约20℃至约30℃，最佳为约25℃；且其中发酵时间为约12至36小时，较佳为约20至30小时，最佳为约24小时。36.于本发明的一实施态样中，步骤(4)中的所述的所述的高温灭菌系以约90至约100℃的水蒸煮约15至约30分钟，较佳为以约100℃的水蒸煮约20分钟。37.于本发明的一实施态样中，步骤(5)中的所述的干燥可藉由任何习知的干燥方法进行，例如真空干燥法、减压干燥法、冷冻干燥法、真空冷冻干燥法、喷雾干燥法和高温干燥法等。于本发明的一较佳实施态样中，步骤(5)中的所述的干燥系使用流动床干燥法，以约65℃至约95℃(更佳为约75℃至约85℃)的温度进行干燥。38.本发明的另一目的为提供可由本发明发酵方法所获得的中国台湾藜壳发酵产物。由于本发明的中国台湾藜壳发酵产物可促进益生菌的生长，故其用做益生元。因此，本发明的另一目的为提供由包含可由本发明发酵方法所获得的中国台湾藜壳发酵产物的益生元组合物。39.于本发明的一实施态样中，所述的益生元组合物可进一步包含一或多种额外益生元，而所述的额外益生元可包含，但不限定为，半乳寡糖、果寡糖、木寡糖、难消化性麦芽糖糊精、菊糖、异麦芽寡糖、乳糖醇、乳果糖、反式半乳寡糖、大豆寡糖和麦麸。40.于本发明的一实施态样中，所述的益生元组合物可为医药或营养配制品，例如营养食品、营养或饮食补充物、医疗或功能性食品或饮料产品、膳食替代品或食品添加物。因此，本发明的益生元组合物可以医药的形式或作为饮食补充物的形式给予，较佳系与一或多种医药或营养上可接受的载剂组合。41.本发明的另一目的为使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来培养益生菌的方法，其包括将益生菌于适当的条件下培养于含有本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物的培养基中。42.根据本发明，所述益生菌包括，但不限定为，艾克曼菌(akkermansia)、拟杆菌(bacteroides)、双歧杆菌(bifidobacterium)、肠球菌(enterococcus)、普拉梭菌(faecalibacterium)、乳杆菌(lactobacillus)、摩根氏杆菌(morganella)、颤螺菌(oscillospira)、颤杆菌(oscillibacter)、副萨特氏菌(parasutterella)、丙酸杆菌(propionibacterium)、消化链球菌(peptostreptococcus)、足球菌(pediococcus)、链球菌(streptococcus)。于本发明的较佳实施态样中，所述的益生菌可为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)。43.根据本发明，「培养基」系指含有至少一种溶质，且容许益生菌生长和/或繁殖的液体或固体组成物。44.本发明的另一目的为提供使用本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物来增加个体中一或多种益生菌的方法和用途，其特征在于将本发明中国台湾藜壳发酵产物或益生元组合物投予所述的个体，并基于益生菌的增生，可达到例如预防或治疗炎症性肠病、改善排便质量、改善睡眠质量、改善血液脂蛋白脂质浓度、改善血液三酸甘油脂浓度、改善情绪和/或改善血液胆固醇浓度等功效。45.以下实施例系出于说明目的而提供，而并不意欲限制本发明范围。46.实例1、中国台湾藜壳发酵产物的制备47.收集经色差仪(minoltachromametercr-200,japan)检定红绿色差值(δa)大于6的干燥中国台湾藜壳约500g，利用快速食品均质机(retschknifemillgrindomixgm200,germany)进行微细化加工后，辅以70mesh筛网进行过筛，以择取平均粒径约为754.8μm的中国台湾藜壳粉末。将所述的中国台湾藜壳粉末利用热风辅助射频干燥系统，以热风50℃、频率40.68mhz、极板间距110cm处理6分钟，进行减菌干燥。48.于100g前述经灭菌干燥的中国台湾藜壳粉末中，依序加入10g糖、1g含酿酒酵母(saccharmycescerevisiae)atcc208353(4.3x108cfu/g)和2g乳酸菌(包含戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)atcc8041、食窦魏斯氏菌(weissellacibaria)dsm15878和类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)atcc10776混合菌株，总菌数为6.5x104cfu/g)的混合物和140unit木聚醣酶(xylanase,panlyve696)后，加入120ml经高压灭菌的一次水，将其混和均匀后，密封置于厌氧发酵袋内，于25℃反应24小时，随即取出中国台湾藜壳粉末，以100℃蒸煮20分钟后，再利用流动床(retschtg200,germany)以75～85℃进行干燥，即可得到中国台湾藜壳发酵产物。49.实例2、中国台湾藜发酵产物的成分分析50.为评估发酵作用对中国台湾藜壳营养成分和机能性化学成分的影响，将前述实例1所获得的中国台湾藜壳发酵产物进行包括总多酚化合物(totalpolyphenolcontents)、总类黄酮(totalflavonoidscontents)、膳食纤维、植酸(phyticacid)和皂素(saponin)含量分析。51.2-1总多酚和总类黄酮化合物含量分析52.中国台湾藜壳发酵前后总多酚化合物和总类黄酮含量分析，系分别参考singleton等人(analysisoftotalphenolsandotheroxidationsubstratesandantioxidantsbymeansoffolin-ciocalteureagent.methodsenzymol.1999,299:152-178.)、sarker等人(salinitystressenhancescolorparameters,bioactiveleafpigments,vitamins,polyphenols,flavonoidsandantioxidantactivityinselectedamaranthusleafyvegetables.jsci.foodagric.2018,99:2275-2284)和陈等人(2016，酸桔(citrussunkihort)和扁实柠檬(citrusdepressahayata)果实萃取物对发炎生化指标的影响，中国台湾农业化学与食品科学，49卷3期，p118–130)所发表的方法进行测定。取125μl0.2nfolin&ciocalteu'sphenol试剂和25μl未经发酵中国台湾藜壳粉末(对照组，a)或中国台湾藜壳发酵产物(发酵组，b)甲醇萃取液，混匀并静置3分钟，再分别加入100μlna2co3，震荡混匀后避光静置40分钟后测定反应终产物760nm吸光值。另取0、15.62、31.25、62.50、125和250ppm没食子酸(gallicacid)作为标准曲线，单位为mg没食子酸/g。在总类黄酮含量分析方面，则分别取100μl定量未经发酵中国台湾藜壳粉末(对照组，a)或中国台湾藜壳发酵产物(发酵组，b)甲醇萃取液，加入30μl5％亚硝酸钠，反应6分钟后，再加入30μl10％硝酸铝反应6分钟；接续地，加入100μl1m氢氧化钠，反应10分钟后测定515nm的吸光值变化。另以芸香素(rutin)作为总类黄酮分析的对照标准，样品总类黄酮含量以相当于mg芸香素/g干燥粉末表示。53.总多酚和总黄酮含量分析结果显示(表1)，经酵母菌、乳酸菌混合物和木聚醣酶发酵处理后，中国台湾藜壳的总多酚化合物含量可提升1.7倍(19.84→53.65mg/g)。然而，若进一步分析总类黄酮化合物含量，却无显著改变。为厘清中国台湾藜壳发酵产物所包含的主要化学成分，进一步利用高解析液相层析串联质谱仪(lc-esi-ms/ms)进行分析，并与已知文献报告(chyau,c.c.等人,theiinhibitoryeffectsofdjulis(chenopodiumformosanum)anditsbioactivecompoundsonadipogenesisin3t3-l1adipocytes.molecules2018,23:1780；和hsua,b.y.,lin,s.w.,stepheninbaraj,b.,chen,b.h.,simultaneousdeterminationofphenolicacidsandflavonoidsinchenopodiumformosanumkoidz.(djulis)byhplc-dad-esi–ms/msb.j.pharm.biomed.anal.2017,132:109–116.)进行比对，依据初步分析结果推测中国台湾藜壳发酵产物主要含有香草酸(vanillicacid)[(m-h)-：167.00063]、香草酸己糖苷(vanillicacidhexoside)[(m-h)-：329.11140]、奎宁酸(quinicacid)[(m-h)-：191.03271]和原儿茶酸(protocatechuicacid)衍生物[(m-h)-：283.14080]等酚酸化合物。此结果支持中国台湾藜壳发酵产物中的主要成分应为非类黄酮类的酚类化合物。[0054]表1发酵对中国台湾藜壳总多酚和总黄酮含量变化的影响saponinfromasoapberry(sapindusmukorossigaertn)incleaningproductsbyachromatographicandtwocolorimetricassays.j.fac.agr.kyushuuniv.2009,54:215-221)所报导的方法进行分析。取未经发酵中国台湾藜壳粉末(对照组，a)与中国台湾藜壳发酵产物(发酵组，b)各5g，加入100ml甲醇于50℃反应12小时后，以1号滤纸过滤取上清液。将前述萃取液浓缩干燥后，分别以乙酸乙酯：水(1:1，v/v)和正丁醇:水(1:1，v/v)进行分馏萃取后，可获得正丁醇分馏萃取物。接续地，将正丁醇萃取物浓缩干燥后，利用vanillin-sulfuricacidassay测定中国台湾藜壳粉末经发酵前后总皂素含量的变化。测定结果见表4，相较于未经发酵中国台湾藜壳粉末(皂素：1.20±0.11mg/ml)，中国台湾藜壳发酵产物总皂素含量(0.47±0.02mg/ml)显著减少60.83％；此结果证实，利用本发明的中国台湾藜壳发酵产物除能有效减少其所含的总皂素含量，亦可提升中国台湾藜加工副产物的产业利用性。[0068]表4中国台湾藜壳粉末发酵前后的皂素含量变化[0069][0070]a变化率(％)＝(a-b/a)×100，p<0.05[0071]实例3[0072]将二株乳酸菌(发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)atcc14931和植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)atcc14917与一株动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)atcc25527，分别以乳杆菌属培养液(mrsbroth)进行菌株厌氧培养活化，再将菌液序列稀释后涂抹于mrs琼脂平板，经厌氧培养后计数其起始菌数；取0.1ml前述经稀释10倍的菌液接种至内含2％未经发酵中国台湾藜壳粉末(a)或由实例1所得中国台湾藜壳发酵产物(b)的mrs培养液中，将所述的mrs培养液以厌氧35℃培养4天后，分别序列稀释涂抹于mrs琼脂平板，将其进行厌氧培养后，计数最终菌数(gibson,g.r.等人bifidogenicpropertiesofdifferenttypesoffructo-oligosaccharides.foodmicrobiology,1994,11:491-498)。[0073]比较添加未经发酵中国台湾藜壳粉末和中国台湾藜壳发酵产物两试验组对培养在mrs培养基中的发酵乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌动物亚种三菌株的生长情形。结果如图1所示，添加2％未经生物改质中国台湾藜壳粉的对照组(a)仅可使发酵乳杆菌和植物乳杆菌两株菌于mrs培养基中分别增殖1.6和2.1倍；然而，添加2％中国台湾藜壳发酵产物的实验组(b)则可使发酵乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌动物亚种三菌株的菌数分别显著地增加4、3.9与4倍。此实验结果证实，利用本发明的中国台湾藜壳发酵产物具有改善肠道机能益生菌生长的益生元(prebiotics)的作用。[0074]上述实施例仅为说明本发明的原理和其功效，而非限制本发明。习于此技术的人士对上述实施例所做的修改和变化仍不违背本发明的精神。本发明的权利范围应如后述的权力要求书所列。当前第1页12当前第1页12
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