卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及新的卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物，尤其是式(i)所示化合物，其制备方法、药物组合物及其在治疗和预防脑卒中和其他神经损伤性疾病中的用途。


背景技术：

[0002]
脑卒中是一种常见突发性疾病,主要由脑血管血栓形成或血管破裂,脑组织供血、供氧不足引起。按照其发病原因可分为缺血性卒中和出血性卒中,其中缺血性卒中约占全部卒中类型的80％～87％。脑卒中具有高发病率、高复发率、高致残率及经济负担重的特点，已被世界卫生组织列为目前人类健康的最大挑战之一。神经保护药物由于可减轻或消除因缺血和再灌注导致的损害，减少大脑病理状况下的应激反应，降低炎症损伤，促进神经细胞再生和修复，减少缺血所致的神经细胞病变程度及范围，称为治疗脑卒中和改善脑卒中预后的一类主要药物。另外，神经保护剂药物也被用于其他神经损伤性疾病，如脑外伤、脊损伤、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、亨廷顿舞蹈症、帕金森病、阿尔兹海默症等疾病治疗。但目前，临床中防止这些疾病的药物为数不多。
[0003]
依达拉奉具有自由基清除和抗氧化作用，是目前已经上市的为数不多的用于治疗急性中风药物和脊髓性肌萎缩症。该药的局限性是只能实现急性期的临床应用，而且有梗塞后出血以及轻、中度肾、肝功能损害等副反应。另外一个应用于临床的药物是3-丁基苯酞(简称丁苯酞，商品名“恩必普”)，它具有抗血小板凝集和微循环重构等作用，中国专利zl93117148.2公开了抗脑缺血的活性，但该药人体的绝对生物利用度很低，f％仅有6.94
±
3.86【叶仲凯，《丁苯酞的人体药代动力学研究》，中国协和医科大学博士学位论文，2004】，口服用量为0.6g/天(每日三次，每次0.2g),而静脉点滴给药为50mg/天(25mg/次，每天2次),由于生物利用度低，口服用药量是静脉点滴给药量的12倍之多。
[0004]
因此，对于该类疾病预防和恢复期的长期用药，药代稳定性好、生物利用度高的口服药较注射和静脉点滴给药具有更多的优点。
[0005]
本发明的化合物经过动物体内外的药效和药物代谢研究，证明了具有强的脑神经损伤保护作用、良好的药代稳定性和高的生物利用度，适合开发口服的脑卒中和其他神经损伤性疾病的药物。


技术实现要素：

[0006]
本技术的发明人针对现有技术的不足，经过广泛的研究，合成了一系列的化合物，并通过体外对氧化损伤的神经细胞、血管内皮细胞保护作用评价以及药物代谢稳定性，体内大鼠缺血再灌注脑卒中模型药效和药物生物利用度等试验，首次发现通式(ⅰ)表示的化合物具有很强的药效和良好的药代特性，特别适合脑卒中和其他神经损伤性疾病的预防和治疗。发明人在此基础上完成本发明。
[0007]
本发明的目的在于提供式(ⅰ)所示的卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物或其药学上可接受的盐、水合物或者前药：
[0008][0009]
其中，r1、r2为h,f,cl,br中的任意一种，且r1、r2不同时为h。
[0010]
更进一步地，本发明具有代表性的化合物为化合物1-9，依次为4-氟-7-羟基丁苯酞、6-氟-7-羟基丁苯酞、4,6-二氟-7-羟基丁苯酞、4-氯-7-羟基丁苯酞、6-氯-7-羟基丁苯酞、4,6-二氯-7-羟基丁苯酞、4-溴-7-羟基丁苯酞、6-溴-7-羟基丁苯酞和4,6-二溴-7-羟基丁苯酞。
[0011]
本发明的另一目的在于提供式(ⅰ)化合物的制备方法。
[0012]
下面具体描述式(ⅰ)新的卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物的制备方法，本发明的化合物可以通过如下的方法制得，然而该方法的条件，例如反应物、溶剂、所用化合物的量、反应温度、反应时间等不限于以下描述。
[0013]
式(ⅰ)的化合物可以通过如下的方法制备：
[0014][0015]
上述卤代化试剂包括氟代试剂、氯代试剂和溴代试剂，其中氟代试剂优选为1-氯甲基-4-氟-1,4-重氮化二环2.2.2辛烷双(四氟硼酸)盐(f-teda-bf4)；氯代试剂优选为n-氯代琥珀酰亚胺；溴代试剂优选为n-溴代琥珀酰亚胺。
[0016]
将7-羟基丁苯酞溶于低级醇或乙腈等有机溶剂中，按照摩尔比1:1-1:2.5加入卤代化试剂，0-10％的lewis酸，在室温至回流条件下反应0.5～72小时，得到相应的化合物。
[0017]
本发明的另一个目的是提供式(ⅰ)所述卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物的一种或多种为主要活性成分的药物组合物。
[0018]
本发明的再一个目的就是提供式(ⅰ)所述卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物，以及含有式(ⅰ)化合物为主要活性成分的药物组合物在制备预防或治疗抗脑卒中和神经损伤疾病药物中的应用。
[0019]
本发明的医药用途，其中脑卒中疾病包括缺血性脑卒中，出血性脑卒中。
[0020]
本发明的医药用途，其中神经损伤性疾病为脑外伤、脊损伤、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、亨廷顿舞蹈症、帕金森病、阿尔兹海默症等疾病，包括但不限于所述疾病。
[0021]
将本发明的式(ⅰ)所示化合物用来制备抗脑卒中和神经损伤疾病药物时，可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂。
[0022]
本发明的化合物具有以下优异特性：
[0023]
(1)在神经细胞、血管内皮细胞的氧化损伤保护作用实验中，本发明化合物具有显著的神经细胞、血管内皮细胞保护作用。与依达拉奉和丁苯酞相比，本发明化合物具有更强的保护作用和更宽的浓度范围。
[0024]
(2)在原代肝细胞的稳定性试验中，本发明化合物具有显著的药物代谢稳定性。与7羟基丁苯酞相比，代谢稳定提高了30-70％。
[0025]
(3)在sd大鼠体内pk研究中，代表性化合物6的口服给药表现出优异的药代动力学特性，生物利用度高达81.1％。
[0026]
(4)大鼠缺血性脑卒中模型的抗脑卒中试验中，口服的化合物6可明显降低大鼠缺血再灌注对大脑的损伤。具体表现在即使小剂量1.0mg/kg给药时，也能明显减少脑梗塞面积，具有显著的抑制缺血再灌注大鼠模型的脑梗死的效果。说明该化合物具有明显药效和很好的生物利用度。
具体实施方式
[0027]
下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0028]
下列实施例所涉及的部分原材料的规格型号如下：
[0029]
核磁共振仪：bruker avance
ꢀⅲꢀ
500，tms为内标
[0030]
高分辨质谱：ltq orbitrap discovery(thermo scientific,germany)
[0031]
高压液相系统(分析)：waters公司，515型双泵，996检测器
[0032]
中压色谱系统：步琦c-601双泵，接收器c-660；armen spot ii中压系统
[0033]
分析型色谱柱：苏州纳微ods column(4.6
×
150mm,10μm)
[0034]
7-羟基丁苯酞：本实验室按照专利方法(cn201510113631.9)制备。
[0035]
实施例1 氟代2-苯并[c]呋喃酮类化合物1-3的制备
[0036]
7-羟基丁苯酞10.0g溶于200ml甲醇中，加入34.4g f-teda-bf4【1-氯甲基-4-氟-1,4-重氮化二环2.2.2辛烷双(四氟硼酸)盐，cas no.140681-55-6】，加热回流，hplc监测(流动相：50％乙腈)反应情况。72h反应结束，加入四倍体积的水，摇匀后减压蒸去甲醇，再用乙酸乙酯萃取剩余水相，萃取液加水洗涤，蒸干乙酸乙酯相得到产物粗提物。
[0037]
粗提取经ods中压色谱制备(4.9*50cm，华谱c18，30μm)，乙腈：水梯度洗脱，得到化合物1-3，分别是4-氟-7-羟基丁苯酞(化合物1，3.12g)、6-氟-7-羟基丁苯酞(化合物2，1.98g)和4,6-二氟-7-羟基丁苯酞(化合物3，120mg)。
[0038][0039]
化合物1-3的性状和核磁数据归属如下：
[0040]
化合物1：4-氟-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
13
fo3，白色固体，熔点74.0-76.0℃，易溶
于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表1。
[0041]
化合物2：6-氟-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
13
fo3，白色固体，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表1。
[0042]
化合物3：4,6-二氟-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
12
f2o3，无色油状物，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表1。
[0043]
表1 化合物1-3的核磁数据归属表(溶剂：氘代氯仿)
[0044][0045][0046]
实施例2 氯代2-苯并[c]呋喃酮类化合物4-5的制备
[0047]
7-羟基丁苯酞11.0g溶于300ml乙腈中，加入7.4g n氯代琥珀酰亚胺(cas 128-09-6，阿拉丁)、0.5ml三氟乙酸，40℃反应，每0.5h取一次样，用hplc等度监测(流动相：50％乙腈)反应情况。2.0h反应结束，加入四倍体积的水，摇匀后减压蒸去乙腈，然后用乙酸乙酯萃取剩余水相，萃取液加水洗涤，蒸干乙酸乙酯相得到产物粗提物。
[0048]
粗提物经buchi中压系统，4.6x 50cm、30μm c
18 ods柱色谱分离，乙腈和水5％-80％ 150min线性梯度洗脱，流速25ml/min，218和310nm检测，手动接峰，得到化合物4和化合物5，分别是4-氯-7-羟基丁苯酞(化合物4，5.16g)、6-氯-7-羟基丁苯酞(化合物5，3.09g)。
[0049]
化合物4,5的化学结构、性状和核磁数据归属如下：
[0050][0051]
化合物4：4-氯-7-羟基丁苯酞，esi-hrms给出m/z为241.0628[m h]

，分子式c
12
h
13
clo3，白色固体，熔点105.4-107.2℃，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表2。
[0052]
化合物5：6-氯-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
13
clo3，白色固体，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表2。
[0053]
实施例3 4,6-二氯-7-羟基丁苯酞的制备
[0054]
7-羟基丁苯酞3.8g溶于100ml乙醇中，加入5.0g n氯代琥珀酰亚胺(cas 128-09-6，阿拉丁)、0.25ml三氟乙酸，38℃反应，每0.5h取一次样，用hplc等度监测(流动相：50％乙腈)反应情况。1.5h反应结束，加入四倍体积的水，摇匀后减压蒸去乙腈，然后用乙酸乙酯萃取剩余水相，萃取液加水洗涤，蒸干乙酸乙酯相得到产物粗提物。
[0055]
粗提物经buchi中压系统，3.5x 50cm、30μm c
18 ods柱色谱分离，乙腈和水30％-80％120min线性梯度洗脱，流速25ml/min，218和310nm检测，手动接峰，得到化合物6(4,6-二氯-7-羟基丁苯酞，3.2g)，收率63％，hplc纯度99.2％。
[0056]
化合物6的化学结构、性状和核磁数据归属如下：
[0057][0058]
化合物6：4,6-二氯-7-羟基丁苯酞，无色油状物，熔点30.8-32.2℃，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表2。
[0059]
表2 化合物4-6的核磁数据归属表(溶剂：氘代氯仿)
[0060][0061]
实施例4 溴代2-苯并[c]呋喃酮类化合物7-8的制备
[0062]
7-羟基丁苯酞8.0g溶于300ml乙腈中，加入6.9g n溴代琥珀酰亚胺(cas 128-08-5，阿拉丁)，室温反应1.0h，加入四倍体积的水，摇匀后减压蒸去乙腈，然后用乙酸乙酯萃取剩余水相，萃取液加水洗涤，蒸干乙酸乙酯相得到产物粗提物。
[0063]
粗提物经armen spotii中压系统，3.6x 46cm、30μm c18 ods柱色谱分离，60％乙腈洗脱，流速25ml/min，315nm检测，手动接峰，得到4-溴-7-羟基丁苯酞(化合物7，4.4g)和6-溴-7-羟基丁苯酞(化合物8，3.2g)。
[0064]
化合物7,8的化学结构、性状和核磁数据归属如下：
[0065][0066]
化合物7：4-溴-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
13
bro3，白色固体，熔点101.4-101.8℃，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表3。
[0067]
化合物8：6-溴-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
13
bro3，白色固体，熔点37.8-39.2℃，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表3。
[0068]
实施例5 4,6-二溴7-羟基丁苯酞的制备
[0069]
7-羟基丁苯酞4.0g溶于300ml甲醇中，加入6.9g n溴代琥珀酰亚胺(cas 128-08-5，阿拉丁)，室温反应2.0h，hplc检测7-羟基丁苯酞完全反应，加入四倍体积的水，摇匀后减压蒸去乙腈，然后用乙酸乙酯萃取剩余水相，萃取液加水洗涤，蒸干乙酸乙酯相得到产物粗提物。
[0070]
粗提物经armen spot ii中压系统，3.6x 46cm、30μm c18 ods柱色谱分离，60％乙
腈洗脱，流速25ml/min，315nm检测，手动接峰，得到4,6-二溴-7-羟基丁苯酞(化合物9，7.3g)。摩尔收率75％，hplc纯度99.2％
[0071]
化合物9的化学结构、性状和核磁数据归属如下：
[0072][0073]
化合物9：4,6-二溴-7-羟基丁苯酞，分子式c
12
h
12
br2o3，无色透明油状物，熔点57-58℃，易溶于甲醇、乙醇、乙腈、dmso，不溶于水。其核磁数据及归属见表3。
[0074]
表3 化合物7-9的核磁数据归属表(溶剂：氘代氯仿)
[0075][0076][0077]
实施例6.化合物1-9对神经细胞、血管内皮细胞的氧化损伤保护作用
[0078]
(1)试验材料和方法：神经细胞sh-sy5y和血管内皮细胞huv-ec培养于96孔板，待汇合度达到85％，细胞用50μm的h2o2处理损伤，3个小时以后加入不同浓度的化合物，48h后利用细胞线粒体膜电位检测试剂jc-1(碧云天生物技术有限公司)检测化合物对细胞线粒体膜损伤程度的保护强度和有效浓度范围。
[0079]
(2)试验结果与结论：结果见表3。化合物1-9化合物对神经细胞/血管内皮细胞氧化损伤均具有很强的保护作用，从保护强度和有效浓度范围相比，化合物1-9比丁苯酞和依
达拉奉具有更显著的神经细胞和血管内皮细胞氧化损伤作用和更宽的药物有效浓度范围。
[0080]
表4 化合物1-9对神经细胞/血管内皮细胞氧化损伤保护作用
[0081][0082][0083]
注：“ ”表示对细胞氧化损伤保护强度
[0084]
实施例7.化合物1-9在原代肝细胞中的稳定性
[0085]
(1)实验方法：将化合物样品用dmso配制成10mm储存液后，再用dmso稀释至500μm浓度的工作液，再用肝细胞培养液稀释至1μm浓度的给药溶液，使样品在孵育体系中的终浓度为0.5μm；将50μl的给药溶液分别与50μl的肝细胞(人、比格犬、大鼠)溶液或者空白细胞培养液(阴性对照组)混匀后加入96孔板，在培养箱中孵育120分钟(2小时)；预冷甲醇终止代谢反应并沉淀细胞蛋白，并以12000rpm转速离心5分钟后取上清，用液质联用仪(lc-ms/ms)相对定量检测上清中测定化合物样品的母体含量，并计算残余百分比％。(2)试验结果：测定化合物样品母体残余含量百分比％见表5
[0086]
表5 化合物1-9在三个种属原代肝细胞中的代谢稳定性(母体残余％)
[0087][0088]
(3)试验结论：该结果可以看出，卤代2-苯并[c]呋喃酮类化合物比7羟基丁苯酞代谢稳定显著提升。
[0089]
实施例8.化合物6在sd大鼠体内pk研究
[0090]
(1)实验方法：spf级sd大鼠，6只(220-250g)，化合物6按照10mg/kg静脉推注和100mg/kg灌胃给药，各3只。给药后采血，采血时间点为5、15、30min，1、2、4、6、8、10、24h。采血后，血样置于草酸钾-氟化钠抗凝的ep管中，在4，℃离心5min，分离血浆，转移血浆于-20℃保存待测。
[0091]
取待测血浆100μl，加入200μl的乙腈沉淀，涡旋5min，12000rpm 4℃离心5min，取200μl上清。取10.0μl上清样，用建立的lc-ms/ms检测方法对采集的血浆样品中目标化合物浓度进行测定。采用winnonlin 5.2，对药动学参数进行计算。生物利用度f＝aucig(mean)
·
div/auciv(mean)
·
dig
×
100％
[0092]
(2)试验结果：化合物6的大鼠体内pk结果见表6
[0093]
表6 sd大鼠给予化合物6后各项药代参数
[0094][0095]
化合物6的生物利用度f＝aucig(mean)
·
div/auciv(mean)
·
dig
×
100％＝81.1％
[0096]
(3)结论：化合物6的口服给药表现出优异的药代动力学特性，t1/2z为4.9h，tmax仅为0.5h，生物利用度高达81.1％。
[0097]
实施例9 化合物6对大鼠缺血性脑卒中的神经保护作用
[0098]
(1)实验材料和方法
[0099]
试验动物：wistar大鼠，体重250-280g。动物购入后稳定1周,并保持饮食、饮水正常及昼夜节律正常。
[0100]
大鼠局灶性脑缺血模型的制备：采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery,mcao)脑缺血再灌注模型。动物用7％水合三氯乙醛(6ml/kg)麻醉后，俯卧位固定于手术台上，消毒皮肤，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎并剪断颈外动脉，循颈内动脉向前，结扎翼膊动脉。夹闭颈总动脉近心端，从颈外动脉的结扎线的远端作一切口，插入栓线，经过颈总动脉分叉进入颈
内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止(自分叉处约20mm)，阻断大脑中动脉的所有血供。右侧脑缺血2.0h后，轻轻拔出栓线，恢复血供进行再灌注，用固定栓线的丝线结扎颈外动脉，缝合皮肤，消毒。将大鼠放置干净饲料中，观察一般情况和呼吸直至麻醉苏醒；加食进水，常规饲养。
[0101]
动物分组与给药：动物随机分组,即假手术组、模型组、依达拉奉对照组(静脉推注)、三个剂量的口服给药组。假手术组12只，其他各组每组13-20只。
[0102]
给药途径：缺血2小时再灌注后立即给药，25.0mg/kg依达拉奉静脉推注1次，化合物6三个剂量灌胃给药1次。
[0103]
检测：脑缺血后24小时后，处死动物，取脑，染色，计算脑梗死面积。经ttc染色后，正常组织深染呈红色，梗死组织呈白色。求算每片的梗死面积，并最终叠加换算成梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，脑梗塞体积(％)＝(手术对侧半球体积-手术侧半球未梗塞部分的体积)/手术对侧半球的体积*100％。
[0104]
(2)试验结果：
[0105]
在缺血再灌注24h后，模型组、化合物6低剂量组、化合物6中剂量组、化合物6高剂量组和阳性药物组动物脑梗死范围分别为46.08
±
4.05％、32.16
±
3.25％、29.62
±
2.21％、27.54
±
4.48％和32.97
±
4.22％，化合物6高剂量组和阳性药物组动物脑梗死范围显著低于模型对照组，见表7。
[0106]
表7 化合物6对大鼠脑缺血再灌急性损伤保护作用(mean
±
sem)
[0107]
组别样本量(只)脑梗死范围(％)假手术组120模型组1346.08
±
4.051.0mg/kg2032.16
±
3.25
#
3.0mg/kg1629.62
±
2.21
##
9.0mg/kg1327.54
±
4.48
##
依达拉奉25.0mg/kg1732.97
±
4.22
#
[0108]
与模型组相比，
##
p＜0.01，
#
p＜0.05
[0109]
(3)试验结论：结果说明化合物6可明显降低大鼠缺血再灌注对大脑的损伤，减少脑梗塞面积，具有显著的抑制缺血再灌注大鼠模型的脑梗死的效果。