一种基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法与流程

1.本发明涉及动物医学检测领域，具体地，是一种粪潜血替代检测方法，更具体地，是一种基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法。


背景技术：

2.实验室一直采用实验室自行配置15％的邻甲苯胺冰醋酸溶液，与3％过氧化氢溶液进行粪便隐血检测。配置所用的邻甲苯胺易燃，遇明火、高温，燃烧,释放出有毒的烟雾及氨等有毒气体。其蒸汽与空气能形成爆炸混合物；有毒，对皮肤、眼睛、粘膜有刺激作用。与眼和皮肤接触后会引起眼睛灼伤和皮炎。摄入、吸入其蒸气或经皮肤吸收都会引起中毒。可生成高铁血红蛋白，引起神经障碍的作用很强，有头痛、发绀、无力、眩晕、倦睡。并能直接刺激膀胱，引起严重的膀胱炎、膀胱出血和血尿，且存在致癌性。实验室并不设有防爆设施，且安全防护不完善，为保障员工的人身安全，应对此种检测方法予以替换，防止意外发生。为替换实验室原有的粪潜血检测方法(邻甲苯胺法)，结合市面上已有的匹拉米洞试纸检测法，用自配制的匹拉米洞试剂测定粪便中的血红蛋白量，敏感度大大提高。
3.现有动物粪潜血检测方法主要以化学法为主，如邻联苯胺法、联苯胺法和愈创木酯法均有用于动物粪潜血检测的报道，但采用上述方法，均存在检测结果敏感性低的情况。而现有的邻甲苯胺和匹拉米洞试纸检测法灵敏度分别在100μg/ml和10μg/ml左右。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的动物粪潜血检测结果敏感性低的问题，提供一种基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，基于现有的匹拉米洞法，对实验动物进行粪潜血替代检测，操作简单方便，敏感性高。
5.本发明涉及一种基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，还包括以下预处理步骤：
6.将粪便样品加入去离子水充分搅拌混匀，离心后取上清；
7.其中：所述的粪便样品与所述的去离子水的相对用量为(0.2-1.0)g:1ml。例如，当粪便样品的质量为0.5g时，加入去离子水1ml。
8.本发明中所述的匹拉米洞法即为本领域常规使用的匹拉米洞法。
9.本发明中，所述的粪便样品来源为动物，较佳地，为本领域常用实验动物，例如食蟹猴、比格犬和sd大鼠。
10.所述的粪便样品的质量为0.2-0.5g；较佳地，为0.5g。
11.所述的去离子水的体积为0.5-1ml，较佳地，为1ml。
12.所述的离心为4000rpm 15分钟。
13.所述的匹拉米洞试剂可为本领域常规，其包含匹拉米洞乙醇溶液、冰醋酸和过氧化氢。
14.其中，所述的匹拉米洞乙醇溶液中匹拉米洞的浓度可为本领域常规，较佳地为
0.15-0.2g/ml；更佳地为0.2g/ml。
15.其中，所述的过氧化氢的浓度可为本领域常规，例如为3％。
16.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
17.本发明所用试剂和原料均市售可得。
18.本发明的积极进步效果在于：
19.现有的邻甲苯胺和匹拉米洞试纸检测法灵敏度分别在100μg/ml和10μg/ml左右，而使用本发明的检测方法，即使很小的出血量(1μg/ml)也能被检测出，克服了目前市面上其他半定量粪潜血检测方法灵敏度低的局限。
附图说明
20.图1为实施例1食蟹猴对照组粪潜血检测结果示意图。
21.图2为实施例1sd大鼠对照组粪潜血检测结果示意图。
22.图3为实施例1比格犬对照组粪潜血检测结果示意图。
23.图4为实施例1实验组粪潜血检测结果示意图。
具体实施方式
24.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
25.实施例1
26.材料：
27.1、健康食蟹猴、比格犬、sd大鼠的粪便样本；
28.2、匹拉米洞试纸(贝索，ba-2020b)；
29.3、匹拉米洞试剂；
30.4、配制好的15％的邻甲苯胺冰醋酸溶液和3％的过氧化氢溶液。
31.方法：步骤1、通过血液分析仪检测动物血液样本中的血红蛋白含量，记录数据；并对血液样本进行分组，对照组为邻甲苯胺和匹拉米洞试纸检测组，实验组为匹拉米洞试剂检测组。
32.所述的动物在检测前不能食用大量维c。
33.步骤2、为验证阳性结果，取经过步骤1检测过的动物的粪便样本各0.5g分别加入1ml 1μg/ml、10μg/ml、102μg/ml、103μg/ml、104μg/ml的血红蛋白溶液，充分搅拌混匀，4000rpm离心15分钟，取上清300μl备用。
34.所述的血红蛋白溶液用去离子水和动物血液配制，使其达到所要求的浓度。
35.消化道出血时，血液经过消化道酶的作用，红细胞被破碎释放出血红蛋白，通常粪潜血结果阳性时，消化道出血量一般为5-250ml，所以本实施例中加入1ml去离子水去获取血红蛋白溶液，并不会影响阳性结果的呈现。
36.步骤3、对对照组，将配制好的50μl 15％的邻甲苯胺冰醋酸溶液和3％的过氧化氢溶液以1:1的体积比滴入各血红蛋白浓度的待测样本中；将各血红蛋白稀释浓度梯度的待
测样本滴在匹拉米洞试纸上。
37.步骤5、取2g匹拉米洞晶体(国药集团，30010226)，加95％乙醇至10ml，充分溶解混匀，制成0.2g/ml匹拉米洞溶液。
38.步骤6、将步骤5配制的50μl匹拉米洞溶液与冰醋酸、3％过氧化氢以1:1:1的体积比滴入各血红蛋白稀释浓度梯度的待测样本中，2分钟后观察对照组和实验组的显色结果。
39.结果：如图1-3所示，试纸为匹拉米洞试纸检测结果，试管中为邻甲苯胺检测结果，阳性对照为标准品显色，阳性时表示试剂有效；其中，图3中最左侧为阳性对照，从左至右血红蛋白原浓度依次为1.6*104μg/ml、1.6*103μg/ml、1.6*102μg/ml、16μg/ml和1.6μg/ml。
40.当血红蛋白浓度从10
4-1μg/ml递减时，显色从深变浅，匹拉米洞试纸检测极限在13-16μg/ml，邻甲苯胺检测法检测极限在130-160μg/ml左右，与目前报道中的化学检测法极限在20μg/ml基本一致。
41.如图4所示，从左至右血红蛋白浓度依次为104μg/ml、103μg/ml、102μg/ml、10μg/ml和1μg/ml，可以看出检测极限在1μg/ml左右，如表1-表3所示，实验组比匹拉米洞法和邻甲苯胺法具有更好的灵敏度。
42.表1食蟹猴粪潜血检测结果
[0043][0044]
表2 sd大鼠粪潜血检测结果
[0045][0046][0047]
表3比格犬粪潜血检测结果
[0048]


技术特征：
1.一种基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，包括以下预处理步骤：向粪便样品中加入去离子水充分搅拌混匀，离心后取上清；其中，所述的粪便样品与所述的去离子水的相对用量为(0.2-1.0)g:1ml。2.如权利要求1所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的粪便样品与所述的去离子水的相对用量为0.5g:1ml。3.如权利要求1或2所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的匹拉米洞试剂包含匹拉米洞乙醇溶液、冰醋酸和过氧化氢；其中，所述的匹拉米洞乙醇溶液中匹拉米洞的浓度为0.15-0.2g/ml；其中，所述的过氧化氢的浓度为3％。4.如权利要求3所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的匹拉米洞乙醇溶液中匹拉米洞的浓度为0.2g/ml。5.如权利要求1所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的粪便样品来源为动物。6.如权利要求5所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的粪便样品来源为实验动物。7.如权利要求6所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述实验动物为食蟹猴、比格犬或sd大鼠。8.如权利要求1所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的粪便样品质量为0.2-0.5g；所述的去离子水的体积为0.5-1ml。9.如权利要求8所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的粪便样品质量为0.5g，所述的去离子水的体积为1ml。10.如权利要求1～9任一项所述的基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其特征是，所述的离心为4000rpm 15分钟。

技术总结
一种基于匹拉米洞法的动物粪潜血检测方法，其包括以下预处理步骤：将粪便样品加入相对用量为(0.2-1.0)g:1mL的去离子水充分搅拌混匀，离心后取上清。本发明的检测方法敏感性高，即使很小的出血量(1μg/mL)也能被检测出，操作简单方便，适用于实验动物的粪潜血的检测。测。测。


技术研发人员：王欣 高馨桐
受保护的技术使用者：益诺思生物技术海门有限公司
技术研发日：2020.05.14
技术公布日：2021/11/19