经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物多肽和使用方法1.相关申请2.要求对2018年12月28日提交的，题为“经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物多肽和使用方法”的，发明人为edwinl.madison、christopherthanos、mikhailpopkov、vanessasoros和kimberlytipton，申请人为催化剂生物科学公司的美国临时申请序列号62/786,302的优先权益。在允许的情况下，此申请的主题通过引用全文纳入。3.通过引用纳入电子形式提供的序列表4.在此提供电子版的序列表，其内容通过引用全文纳入。该电子文档在2019年12月26日建立，大小为2,294千字节，命名为4940seqpc1.txt。
技术领域：
：5.提供经修饰的u‑pa多肽，其切割补体蛋白，从而抑制补体激活。通过此抑制，经修饰的u‑pa多肽能用于治疗补体介导的或补体激活在其中发挥作用的疾病和病症。这些疾病和病症包括但不限于眼科适应症(包括黄斑变性如年龄相关的黄斑变性(amd)和stargardt病)、移植肾功能延迟(dgf)、缺血和再灌注失调(包括心肌梗塞和中风)、败血症、自身免疫病、炎症性疾病以及有炎性成分的疾病(包括阿尔茨海默氏病和其他神经退行性疾病)。6.发明背景7.补体(c)系统是免疫系统的一部分并在消除入侵病原体和起始炎症反应中发挥作用。人和其他哺乳动物的补体系统涉及超过30个可溶性和膜结合蛋白，所述蛋白参与引起补体激活的有序的一系列反应。血液补体系统具有大量与广谱宿主防御机制(包括抗微生物和抗病毒作用)相关的功能。衍生自c组分激活的产物包括非自我识别分子c3b、c4b和c5b，以及影响多种细胞免疫反应的过敏毒素c3a、c4a和c5a。这些过敏毒素充当促炎剂。8.补体系统由一系列酶和非酶蛋白及受体构成。补体激活通过三种主要模式之一发生，所述模式称为“经典”途径、“替代”途径和“凝集素”途径(参见图1)。补体通常由这3条途径之一激活或引发，其如图1所示在c3活化处汇集。在称为内源性途径的第四补体激活机制中，与凝血和纤溶级联相关的丝氨酸蛋白酶直接通过切割c3或c5来激活补体系统，不依赖经典、替代和凝集素途径。9.这些途径能通过起始补体激活的过程区分。经典途径由抗体‑抗原复合物或聚集形式的免疫球蛋白起始；替代途径由微生物和细胞表面的结构识别起始；凝集素途径是抗体依赖性途径，其通过甘露糖结合凝集素(mbl，也命名为甘露糖结合蛋白)与碳水化合物如细菌或病毒表面展示的那些相结合来起始。级联激活导致产生参与蛋白质水解或细胞裂解的复合物以及参与调理作用、过敏反应和趋化性的肽。10.补体级联是动物免疫应答的重要组分，是不可逆级联。许多蛋白辅助因子调节该过程。不恰当的调节，通常是不恰当激活，该过程，可能是参与不恰当炎症或免疫应答的多种失调的一方面或可能在其中出现，如在急性和慢性炎性疾病以及涉及不恰当免疫应答的其他病症中观察到的那些。这些疾病和失调包括自身免疫病如类风湿性关节炎和狼疮、心脏失调和其他炎性疾病如败血症和缺血再灌注损伤。11.由于补体途径参与多种疾病和病症，补体途径的组分是治疗性干预的靶标，尤其是用于抑制通路。这类治疗示例包括合成和天然小分子治疗剂、抗体抑制剂及重组可溶形式的膜补体调节剂。制备这类治疗剂的策略有限制。小分子的体内半衰期短且需要连续输注以维持补体抑制，从而限制其作用，尤其是在慢性病中。治疗性抗体可导致受试者的免疫应答并因而可能在治疗中，特别是设计成调节免疫应答的治疗中导致并发症。因此，需要治疗剂用于治疗补体介导疾病和补体激活在其中发挥作用的疾病。这些疾病包括急性和慢性炎性疾病。因此，本文的目的中，一个目的是提供这类治疗剂以靶向补体级联激活并提供治疗疾病的治疗剂和方法。12.发明概述13.提供经修饰尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽，其包括在蛋白酶结构域中的氨基酸插入、缺失和/或取代，导致对补体蛋白c3的切割活性相较于野生型u‑pa蛋白酶结构域(其中蛋白酶结构域可包括用ser取代游离cys以减少/消除聚集)增加。所述经修饰的u‑pa多肽包括蛋白酶结构域，如全长活化蛋白酶、其酶原形式以及含有经修饰的u‑pa多肽和赋予药学特性或活性的融合伴侣的融合蛋白。所述经修饰的u‑pa多肽和含有所述经修饰u‑pa的融合蛋白处于活性形式时，抑制补体激活。特别是，这些多肽和融合蛋白切割c3，从而c3活性被抑制或消除。14.本文提供的修饰(包括氨基酸缺失、取代和插入)在蛋白酶结构域内。经修饰的u‑pa多肽包括或者是蛋白酶结构域。经修饰的u‑pa多肽还可包括翻译后修饰和一级氨基酸序列以外的其他修饰，如缀合或连接其他多肽和改变性质的部分，所述性质如血清半衰期及耐受内源性蛋白酶。这类修饰包括但不限于连接白蛋白、连接多聚化结构域和聚乙二醇化。因此，经修饰的u‑pa多肽能通过聚乙二醇化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化和本领域已知其他多肽修饰来修饰。在多种修饰中包括在酶原中用丝氨酸或丙氨酸取代游离半胱氨酸，如根据胰凝乳蛋白酶编号的c122，以减少聚集，尤其是体外表达后的聚集。此取代是任选存在的，且不必需包括在待聚乙二醇化或体内表达的多肽中。15.经修饰的u‑pa多肽通过切割灭活补体蛋白c3。经修饰的u‑pa多肽切割c3以抑制补体激活，其在一个位点如活性位点切割c3，灭活或抑制c3活性，从而抑制补体激活。本文提供的经修饰的u‑pa多肽选择并设计成在qharashlg内切割，具体是其中p1‑p1'为ra(qhar↓ashl；参见seqidno:47残基737‑744，其中切割在残基740‑741之间)。因此，这些经修饰的u‑pa多肽能用作治疗剂以治疗失调、疾病和/或病症，其中补体激活发挥作用，从而其抑制能治疗失调、疾病和/或病症。经修饰的u‑pa多肽相较于野生型u‑pa或相较于仅具有通过胰凝乳蛋白酶编号对应c122s取代的那些，也可对天然底物如纤溶酶原活性下降。16.经修饰的u‑pa多肽所用于的疾病和病症是任意c3介导或补体介导或参与的疾病和病症。这些包括眼科失调如年龄相关的黄斑变性(amd)和糖尿病视网膜病变及器官排斥如移植肾功能延迟(dgf)以及能通过抑制补体激活治疗的其他疾病、失调和病症。amd通过施用到玻璃体液来治疗，如通过玻璃体腔注射或者视网膜内或视网膜下注射，而dgf通过静脉内或其他全身施用来治疗。经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白可进一步修饰，如通过聚乙二醇化，以提高或改善或赋予所需的药学性质，包括增加的半衰期和/或减少的免疫原性。其他疾病和病症包括例如类风湿性关节炎(ra)、眼疾病、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、阿尔茨海默氏病(ad)、缺血再灌注损伤、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)和补体3肾小球病(c3g)。17.未修饰的u‑pa多肽包括前体形式、成熟形式、催化结构域和其催化活性形式以及融合蛋白，如实施例14‑16所述的那些。未修饰的u‑pa多肽示例是序列如seqidno:1‑6所示的那些。未修饰的u‑pa多肽包括催化结构域中的游离半胱氨酸(通过胰凝乳蛋白酶编号对应于c122)被另一氨基酸如s或a，尤其是s取代，其不改变催化活性，但减少多肽聚集。应理解所有经修饰的u‑pa多肽能在通过胰凝乳蛋白酶编号对应于c122的残基处包括取代，一般是s。18.本文提供的经修饰尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽是含有选自对应于r35q、h37y、v41r、v41l、y40q、d60ap、l97ba、t97ai和h99q的取代的一个或多个氨基酸修饰，以及因此的保守氨基酸修饰的那些，其中经修饰的u‑pa多肽相较未修饰活性形式的u‑pa多肽，对补体蛋白的活性/特异性增加，其中：氨基酸修饰选自取代、插入和缺失；对应残基能通过与u‑pa天然形式比对来确定；经修饰的u‑pa多肽切割补体蛋白以相较不含氨基酸修饰的未修饰的u‑pa多肽抑制或减少补体激活；残基通过胰凝乳蛋白酶编号来标示；未修饰的u‑pa多肽包括seqidno:1‑6任一者(野生型人全长u‑pa、野生型蛋白酶(催化)结构域u‑pa、野生型成熟u‑pa、带有对应c122s取代的全长u‑pa、带有对应c122s取代的蛋白酶结构域u‑pa和带有对应c122s取代的成熟u‑pa)所示的序列和其含氨基酸取代的催化活性片段。保守修饰选自r35y、w、f或n；h37r、q、e、w或f、v41k、d60as、t97ad、l或v、l97bg或s和h99n，通过胰凝乳蛋白酶编号。19.具体地，这些经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽是含有一个或多个氨基酸修饰的那些，所述修饰选自对应以下的取代：r35q、h37y、v41r、v41l、y40q、d60ap、l97ba、t97ai和h99q。20.经修饰的u‑pa多肽切割纤溶酶原中的底物序列的活性和/或特异性降低。多肽对其特异性/活性增加的补体蛋白是c3；切割使c3失活。切割位点的示例在c3活性位点内。经修饰的u‑pa多肽是对c3切割活性增加的那些，所述活性比seqidno:5(有c122s取代的蛋白酶结构域)的未修饰的u‑pa多肽高至少3倍。21.经修饰的u‑pa多肽包括含有取代h37y如取代h37y/v38e的那些。经修饰的u‑pa多肽包括含有取代r35y/h37k或r35q/h37k的那些，如包含取代r35y/h37k/v38e或r35q/h37k/v38e的那些。22.还提供经修饰的u‑pa多肽，包括上述那些，其也含有取代l97ba和/或r35q，和/或h99q，和/或d60ap，和/或t97ai。23.经修饰的u‑pa多肽还能包括对应t39y、t39w、t39f如t39y的氨基酸取代，或选自t39m或t39l的保守取代。其他经修饰的u‑pa多肽包括或进一步包括氨基酸取代r35q/h37y和/或v38e/v41r/y149r。24.其他经修饰的u‑pa多肽是包含修饰v41r的那些，如包含修饰v38e/v41r的经修饰的u‑pa多肽，包括在位置r35、h37和v38的一个或多个进一步包含取代的那些。这些包括其中v38处的取代是e的经修饰的u‑pa多肽，例如包含r35y/h37s/v38e/v41r、h37y/v38e，以及有助于c3切割和/或稳定性(例如体液中)的其他残基组合的经修饰的u‑pa多肽。25.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽是体外测试中对c3灭活切割的ed50小于100nm或50nm或30nm或25nm的经修饰的u‑pa多肽。其示例是表14所示ed50是100nm或更少的那些，或表14所示ed50小于50nm的那些，或表14所示ed50小于30nm的那些，或表14所示ed50小于25nm的的那些。评估ed50的试验示例包括底物补体蛋白人c3与多种浓度的各修饰蛋白酶在37℃孵育1小时，以测定ed50。特别地，经修饰的u‑pa多肽是以ed50为50nm或更少切割c3的任意多肽。26.未修饰的u‑pa多肽可由seqidno:1‑6任一者所示的氨基酸序列组成，或能包括额外的修饰，包含额外的插入和缺失。本文任意取代、插入或缺失能纳入未修饰的u‑pa多肽，如蛋白酶结构域，尤其是seqidno:5的蛋白酶结构域。经修饰的u‑pa多肽可与seqidno:1‑6任一者多肽或其催化活性部分有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。相较于seqidno:1‑6任一者的未修饰的u‑pa多肽或其催化活性部分，经修饰的u‑pa多肽能包含1或多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸取代、插入或缺失。27.由此，提供含有修饰v41r或h37y或l97ba或r35q或h99q或d60ap或t97ai或其组合的经修饰的u‑pa多肽。任意经修饰的u‑pa多肽还能含有对应于t39y、t39w、t39f的氨基酸取代或者其选自t39m或t39l的保守取代。特别地，经修饰的u‑pa多肽还能含有氨基酸取代t39y，如组合t39y/v41r，和多至12或13个额外修饰以及任选存在的c122s。任意经修饰的u‑pa多肽还能包含氨基酸取代v38e，且可进一步含有氨基酸修饰r35q、y60bq和/或y149r的一个或多个。任意经修饰的u‑pa多肽还能含有氨基酸修饰r37ae或r37as。因此，本文提供的经修饰的u‑pa多肽可含有取代r35q/h37y/t39y/v41r或r35q/h37y/t39y/v41r/c122s。任意经修饰的u‑pa多肽可包含对应于h99q的取代。28.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽是含有氨基酸修饰r35q/h37y/t39y/v41r/l97ba/h99q/c122s或r35q/h37y/t39y/v41r/l97ba/h99q或t39y/v41r/y60bq/l97ba/h99q或t39y/v41r/y60bq/l97ba/h99q/c122s或t39y/v41r/d60ap/l97ba/h99q/c122s或t39y/v41r/d60ap/l97ba/h99q/c122s的那些。本文所提供的经修饰的u‑pa多肽也是含有对应于y40q/v41l/l97ba/c122s或y40q/v41r/l97ba/c122s或y40q/v41l/l97ba或y40q/v41r/l97ba或r37as/v41r/l97bg/h99q或r37as/v41r/l97bg/h99q/c122s或t39y/v41l/l97ba/h99q/c122s或t39y/v41r/l97ba/h99q/c122s的氨基酸修饰的那些。29.经修饰的u‑pa多肽包括含有以下修饰的那些：30.r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r。31.提供含氨基酸修饰的经修饰的u‑pa多肽，包括具有以下修饰的多肽：32.h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60aa/y60bp/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35l/h37d/r37as/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35m/h37g/r37ad/v38e/t39w/v41r/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37g/r37ap/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60be/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35a/h37g/r37ae/v38e/t39f/v41r/d60ae/y60bp/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37s/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bs/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37t/r37ap/v38e/t39y/v41r/d60ae/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37g/r37ae/v38e/t39h/v41r/d60ap/y60ba/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35w/h37d/r37as/v38e/t39y/v41r/d60ae/y60bs/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37g/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60b/t97a1/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35w/h37p/r37an/v3ge/t39y/v41r/d60ap/y60bl/d97t/t97ae/l97bg/a98s/h99l/c22s或r35w/h37p/r37an/v38e/t39y/v41k/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y151l/q192a或r35y/h37v/r37aw/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60be/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y151l/q192t或r35w/h37p/r37an/v38e/t39y/v41k/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y151l/q192t或33.各自在c122没有取代。这些经修饰的u‑pa多肽的示例是含有以下修饰的那些：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r。34.这些多肽的示例是序列如seqidno：8‑44和987如21和39‑44任一者所示的那些，以及前体和全长经修饰的u‑pa多肽，其含有序列如seqidno：8‑44所示的多肽和其催化活性部分。还应理解在本文所提供的任意经修饰的u‑pa多肽中，通过胰凝乳蛋白酶编号的残基122处cys能用ser取代，或能保持cys。保留cys用于其中含有经修饰u‑pa蛋白酶结构域的多肽包括融合蛋白旨在用作2条链的形式的实施方案，其中游离c122与多肽内的另一游离cys形成二硫键，或cys被修饰，如通过聚乙二醇化。在本文所述全部实施方案中，位置122可以是cys或ser。技术人员能根据预期用途选择适当残基35.未修饰的u‑pa多肽包含seqidno：1‑6任一者的蛋白酶结构域，或其催化活性部分，仅包括或含有seqidno：2或seqidno：5的蛋白酶结构域。36.经修饰的u‑pa多肽可含有额外的修饰，包括翻译后修饰，引入或移除糖基化位点的修饰，修饰如连接或缀合聚合物例如peg以增加血清半衰期和/或降低免疫原性或两者都有。特别地，本文所述和提供的任意及所有经修饰的u‑pa多肽能够聚乙二醇化。还提供含有本文所提供经的修饰的u‑pa多肽融合蛋白，如融合fc结构域，或特异于靶细胞或抗原的靶向剂。37.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白是pbs或体液如房水或血清中孵育7天后稳定性超过50％或80％的那些。经修饰的u‑pa多肽也是处于活性形式时，对纤溶酶活性相较于对应形式的未修饰的u‑pa多肽下降至少100倍的那些。38.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白包括体外测试中对c3灭活切割的ed50小于100nm或50nm或30nm或25nm或15nm或10nm的那些，如本文实施例中所例示的任一个。这些包括多肽，其含有或者是表14所示的蛋白酶结构域，表14列出许多经修饰的u‑pa多肽蛋白酶结构域的突变串(string)和ed50，所述结构域表现出如实施例2所述评估的ed50。ed50为100nm或更少、小于50nm、小于30nm、小于25nm、小于15nm、小于10nm的经修饰的u‑pa多肽和融合多肽能如本文所述用作蛋白酶结构域，或采用较长u‑pa形式和/或在融合蛋白中。39.提供缀合蛋白，包括融合蛋白，其含有与非蛋白酶多肽或其部分融合的经修饰的u‑pa多肽或任意经修饰的u‑pa多肽的催化活性部分。提供非蛋白酶多肽，例如包括多聚化结构域如fc结构域、增加血清稳定性的多肽如白蛋白或蛋白转导域(ptd)的那些。40.如上所讨论，所有修饰能在序列如seqidno:1‑6任一者所示的未修饰多肽和其催化活性部分中。所述多肽包括其中未修饰多肽具有seqidno:5所示的序列(有c122s取代的蛋白酶结构域)的那些多肽。41.还提供融合蛋白，其含有本文所提供的经修饰的u‑pa多肽以及额外的多肽如血清白蛋白、多聚化结构域、信号序列和其他运输序列及标签以促进表达和分离。融合蛋白还可包括激活序列以活化u‑pa部分。活性形式的融合蛋白在表达、去除信号序列和任何其他加工及运输信号后生成，以产生切割c3的活性融合蛋白。活性形式的融合蛋白包括2链激活形式以及二聚体，如纳入多聚化结构域产生的那些。42.融合蛋白是含有经修饰的u‑pa多肽或经修饰的u‑pa多肽催化活性部分的那些，如表14中的那些，所述多肽融合非蛋白酶多肽或其部分。融合蛋白也可包括激活序列，以及在加工前包括信号序列和其他运输信号。非蛋白酶多肽包括但不限于本领域技术人员已知的赋予所需药学活性或特性、多聚化结构域如fc、蛋白转导域(ptd)、透明质酸结合域(habd)、靶向特定抗原的抗体的任一种。融合蛋白还可包括激活序列，如天然u‑pa激活序列或弗林蛋白酶激活序列。弗林蛋白酶激活序列示例是，是或包括qsgqktlrrrkr(seqidno:996)或qcgqktlrrrkr(seqidno:995)或qsgqktlrrkr(seqidno:1044)或与其有至少98％的序列相同性的弗林蛋白酶激活位点的那些。43.例如，包含本文所述或提供的任意经修饰的u‑pa多肽的融合蛋白在加工或激活前也包括信号序列和经修饰的u‑pa多肽或其催化活性部分。为了融合蛋白分泌编码的信号序列包括例如来自il‑2、u‑pa或iggκ的信号序列。44.融合蛋白能包括融合伴侣，如多聚化结构域，或增加血清半衰期的多肽，或赋予另一所需药学特性或活性的多肽。这些的示例是白蛋白或fc结构域或单链抗体或抗体的其他抗原结合片段或透明质酸结合域(habd)。示范性融合伴侣包括但不限于肿瘤坏死因子刺激基因‑6(tsg‑6)、has、iggfc、抗体或其抗原结合片段如抗ii型胶原抗体scfv片段或抗vegfr抗体或其片段。45.融合蛋白还可包括激活序列，从而含有u‑pa的所得的融合蛋白处于活性形式，如2链形式。激活序列能包含或修饰成包含半胱氨酸，其能与经修饰的u‑pa多肽中的游离cys如c122形成二硫键，从而在激活后，所得的激活的多肽包括2条链。示范性激活序列是u‑pa激活序列和弗林蛋白酶激活序列以及其修饰形式，如序列如seqidno:995‑998,1041和1044任一者所示或序列与其有至少98％或99％序列相同性的激活序列。46.示范性融合蛋白包含激活序列、经修饰的u‑pa多肽和hsa，如包含任意seqidno:1014、1015、1016、1019和1040所示氨基酸序列或其具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列相同性(且含有u‑pa部分的序列中的修饰)的修饰形式。为用于治疗方法，融合蛋白一般不含有信号序列。为用于基因治疗方法，核酸能编码信号序列。47.提供这类融合蛋白，如含有seqidno:1004‑1019和1034‑1040任一者所示的氨基酸序列的那些或具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列相同性(且包含u‑pa部分序列中的修饰)的任意融合蛋白。融合蛋白的示例是具有seqidno:1015或1019所示的氨基酸序列的那些。特别地，信号序列在使用前或体内表达后或体外生成时去除。这些包括处于含有a链和b链的2链激活形式的那些。例如，融合蛋白，其中b链在经修饰的u‑pa多肽的残基iigg处起始并在融合蛋白c末端终止，如含有经修饰的u‑pa多肽和hsa的那些，含有seqidno:1005、1011、1014、1015和1036任一者所示的氨基酸序列，但缺乏信号序列的那些。处于激活形式的融合蛋白示例是含有残基21‑178的a链和残基179‑到蛋白c末端的b链，残基168‑299之间有二硫键的融合蛋白。应理解，这些还包括具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列相同性(且含有u‑pa部分的序列中的修饰)的融合蛋白。例如，提供含有a链和b链的融合蛋白，其中a链由seqidno:1015的残基21‑178组成，b链由残基179‑1022组成；a和b链经seqidno:1015的c168与c299之间二硫键连接。48.本文提供的其他融合蛋白包含多聚化结构域，从而在加工后，其形成多聚体，如通过互补多聚化结构域，例如fc结构域相互作用形成的二聚体。49.还提供组合，其可作为试剂盒包装，其含有第一组合物和第二组合物，所述第一组合物含有一或多种经修饰的u‑pa多肽，包括(如在所有实施方案中)融合蛋白，尤其处于非激活形式的那些，所述第二组合物含有用于治疗补体介导疾病或失调的一或多种第二药剂(agent)。例如，所述一或多种第二药剂可以是抗炎剂或抗凝血剂。这类药剂的示例是抗炎剂，选自以下的任意一种或多种：非甾体类抗炎药(nsaid)、抗代谢物、皮质类固醇、镇痛剂、细胞毒性剂、促炎性细胞因子抑制剂、抗炎性细胞因子、b细胞靶向剂、靶向t抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、ppar‑γ配体、补体抑制剂、肝素、华法林、苊香豆醇、苯茚二酮、edta、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。50.提供核酸分子，其编码本文所提供的任何经修饰的u‑pa多肽及融合蛋白。还提供含有这类核酸分子且编码经修饰的u‑pa多肽的载体。载体包括原核载体和真核载体，包括哺乳动物和昆虫载体如杆状病毒载体，酵母载体如毕赤酵母属(pichia)和酵母属(saccharomyces)，以及病毒载体如单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体、aav载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。载体可以是用于生成经修饰的u‑pa多肽的表达载体和/或用于基因治疗的载体，如腺病毒载体和aav载体，尤其是有感兴趣组织例如肝或眼趋向性的那些。51.提供生成经修饰的u‑pa多肽的方法，通过使细胞在载体表达的条件下生长，和任选地分离或回收所表达的经修饰的u‑pa多肽进行，所述细胞包含编码经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白的载体或核酸。52.还提供含有所述核酸分子或载体的经分离细胞和细胞培养物。细胞可以是非人细胞或人细胞培养物，但不包括发育成人的任何受精卵或细胞。细胞包括哺乳动物细胞和细菌细胞，包括但不限于细菌细胞如大肠杆菌(e.coli)、cho、balb/3t3、hela、mt2、小鼠ns0、bhk、昆虫细胞、酵母细胞以及常规用于多肽重组表达的其他细胞。生成经修饰的u‑pa多肽的方法包括使细胞在一定条件下生长，其中所编码的修饰u‑pa多肽得到表达，且任选地分离或纯化经修饰的u‑pa多肽。一般，经修饰的u‑pa多肽和其缀合物如融合蛋白，在使蛋白糖基化的细胞中生成。分离的经修饰的u‑pa多肽能进一步修饰，如通过聚乙二醇化。53.还提供含有所述经修饰的u‑pa多肽及融合蛋白和/或核酸和/或载体的药物组合物。提供所述药物组合物、核酸或经修饰的u‑pa多肽在抑制补体激活中的应用，从而治疗补体激活介导的疾病或失调或者其中补体激活在疾病或失调的病因学中起作用或是所述疾病或失调的病因学的基础的疾病或失调。特别地，提供所述核酸分子和/或载体在基因治疗中的应用，以治疗由补体激活介导的或涉及补体激活的这类疾病、失调和病症，其中抑制补体激活可实现治疗或缓解疾病或病症。还提供通过施用所述载体或施用核酸分子治疗由补体激活介导的或涉及补体激活的疾病或病症的方法。特别地，所述疾病、失调和病症是其中灭活c3以抑制或减少补体激活可实现治疗的那些。54.补体介导或者补体激活在病因学中发挥作用或是病因学基础的疾病、失调或病症，包括但不限于炎症性疾病、败血症、类风湿性关节炎(ra)、眼疾病或眼科疾病、心血管失调、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、阿尔茨海默氏病(ad)、缺血再灌注损伤、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、补体3肾小球病(c3g)和移植器官排斥，尤其是延迟性移植器官排斥。具体的疾病和失调包括眼失调或眼科失调，如黄斑变性或糖尿病视网膜病变或移植器官引起的炎症。所述疾病、失调和病症包括年龄相关的黄斑变性(amd)和移植肾功能延迟(dgf)。55.提供抑制补体激活的方法。所述方法如下进行：使经修饰的u‑pa多肽接触补体蛋白c3，其中补体蛋白c3被切割，从而补体激活减少或受抑制。接触能体外，但一般是体内，通过给需要补体失活或减少的对象施用经修饰的u‑pa多肽进行。施用可以是全身性的，如胃肠外，包括静脉内，或是局部，如通过接触受影响的组织如眼。施用于眼包括通过滴剂，通过连接经修饰的u‑pa多肽与蛋白转导结构域，或通过玻璃体注射、视网膜内或视网膜下注射或其他这类方法。对于疾病和病症如dgf，施用能通过静脉内施用实现。其他方法包括皮下和经皮施用。56.所述方法和应用包括治疗任何疾病、失调或病症，其中抑制补体激活会引起与补体介导疾病或失调相关的炎性症状减少，所述疾病或失调选自炎症性疾病、神经退行性疾病、眼科疾病和心血管障碍。这些包括但不限于炎症性疾病、病症和失调、败血症、类风湿性关节炎(ra)、眼失调、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、补体3肾小球病(c3g)、阿尔茨海默氏病(ad)、眼科失调如amd和糖尿病视网膜病变以及缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤可涉及选自以下的事件或治疗或由其引起：心肌梗塞(mi)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺转流术(cpb)和血液透析或治疗对象。用经修饰的u‑pa多肽治疗在对象治疗前完成。治疗包括器官移植。疾病、失调或病症包括眼科病症或是眼疾病或是移植器官引起的排斥或炎症，如糖尿病视网膜病变或黄斑变性。特别地，提供年龄相关的黄斑变性(amd)的治疗方法，以及移植肾功能延迟(dgf)的治疗方法。治疗能静脉内或皮下或局部实现，如通过注射经修饰的u‑pa多肽到眼内。包括玻璃体内或视网膜内、视网膜下注射或连接经修饰的u‑pa多肽与蛋白转导结构域以促进转导到玻璃体液内。经修饰的u‑pa多肽能连接或缀合某些部分，所述部分实现多肽靶向特定器官或组织，或增加血清半衰期或降低免疫原性，如聚乙二醇化和/或连接fc结构域或抗体或其抗原结合部分。57.由此，提供方法以治疗有补体介导失调或病症或者补体激活在这类失调或病症中发挥作用的对象，这是通过施用本文所提供经修饰的u‑pa多肽。本文还提供经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白的这类应用。经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白可实现治疗或能用于这些治疗，因为其切割补体蛋白c3，从而抑制或减少补体激活。抑制补体激活会导致与补体介导失调、疾病或病症相关的炎性症状减少，其涉及炎症反应，导致与补体介导疾病、病症或失调相关的炎性症状减少，其选自炎症性疾病、神经退行性疾病和心血管障碍。这些包括眼科疾病，如糖尿病视网膜病变和黄斑变性，以及延迟器官排斥如dgf。58.本文提供用于所述应用和方法的剂量以及单次剂量制剂。单次剂量能由熟练的医师凭经验确定，包括例如局部施用的单次剂量范围为0.1mg‑1mg，全身性如静脉内施用的范围为0.1mg‑10、15、20、30mg或更多。具体剂量取决于特定失调或疾病或病症，所治疗的对象，疾病、失调或病症的阶段，施用途径，方案和其他这类参数。剂量能每天，每2、3、4、5、6或7天，至少每周二次(bi‑weekly)，至少每2周、3周、4周或更长间隔重复。具体方案和剂量取决于例如所治疗的失调、施用模式和对象的具体情况如体重。其确定在熟练的医师的技术范围内。59.还提供方法、应用和组合以及经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白，其中经修饰的u‑pa多肽包含修饰v41r或v41l，尤其是v41r，如v41i或r和v38e，以及含有h37y/v38e的那些。这类经修饰的u‑pa多肽示例是含有修饰y40q/v41r/l97ba或y40q/v41l/l97ba或r37as/v41r/l97bg/h99q，或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r的经修饰的u‑pa多肽。所述修饰在任何未修饰的u‑pa多肽中，包括seqidno:1‑6任一者所示的那些，和其包括对应v41的残基的催化活性部分。这类经修饰的u‑pa多肽示例包括seqidno:21或987或seqidno:40‑44任一者所示的氨基酸残基序列，或seqidno:40‑44任一者所示的氨基酸残基序列而在通过胰凝乳蛋白酶编号的c122没有修饰，和其催化活性部分，以及其修饰形式如聚乙二醇化形式，融合蛋白和其修饰形式。60.还提供治疗失调如dgf的方法，通过静脉内施用本文所述和提供的经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白(处于激活形式)进行，所述经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白包括包含seqidno:21和40‑44任一者所示的氨基酸残基序列，及其修饰形式如聚乙二醇化形式的经修饰的u‑pa多肽。单次剂量能由熟练的医师凭经验确定，包括范围为0.1mg‑1mg的单次剂量。剂量取决于对象、疾病或失调如dgf的严重度或阶段。治疗可重复多次，如一天2、3或4次，一天一次，每1天、2天、3天、4天、5天、6天、每周、每月两次(bi‑monthly)或每月重复。所述经修饰的u‑pa多肽可以是包含取代/插入的多肽，根据胰凝乳蛋白酶编号为r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；以及根据成熟编号为r20q/h22y/r23e/v27e/t28y/v30r/d50p/y51q/t91i/l92a/h94q/c121s/y148r。其示例是含有seqidno:21所示蛋白酶结构域或其催化活性部分或者全长或前体形式(含有蛋白酶结构域)的经修饰的u‑pa多肽，和其修饰形式如聚乙二醇化形式及融合蛋白。施用可通过任何适当方法实现，包括静脉内、皮下、经皮、局部、肌肉内、口服和其他全身性施用途径。一般，本文所提供的经修饰的u‑pa多肽的施用形式是激活形式，其通常(取决于蛋白的组分(参见例如实施例15))是2链形式。61.本文以上和以下所述的方法包括通过将在本文中提供的经修饰的u‑pa多肽及其修饰形式如聚乙二醇化形式和融合蛋白，例如含有蛋白转导结构域的那些施用到眼治疗眼科失调或眼失调的方法。涉及补体激活的眼科失调、疾病或病症包括糖尿病视网膜病变和黄斑变性，如amd。剂量如上所述，且包括0.1mg‑1mg的单次剂量。经修饰的u‑pa多肽包括含有以下取代的那些：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r、y40q/v41l/l97ba/c122s或y40q/v41r/l97ba/c122s或y40q/v41l/l97ba或y40q/v41r/l97ba，和含有seqidno:21和40‑44任一者所示的氨基酸残基序列，和其催化活性部分以及其修饰形式的那些。治疗可重复多次，如一天一次。提供经修饰的u‑pa多肽和其修饰形式用于治疗amd或dgf的应用。经修饰的u‑pa多肽包括本文所述任意多肽，包括含有以下取代的那些：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r或y40q/v41l/l97ba/c122s或y40q/v41r/l97ba/c122s或y40q/v41l/l97ba或y40q/v41r/l97ba，以及其修饰形式(其是如本文所述的聚乙二醇化或融合蛋白)。62.附图简要说明63.图1概述了经典、凝集素和替代补体途径以及末端补体复合物、膜攻击复合物(mac)的激活。该图描述超过30种参与补体级联的蛋白中的许多，其在级联内的作用，以及适用时，其在补体途径中的汇合点。例如，这3个途径在c3转化酶产生后汇集，该酶切割c3以形成c5转化酶，产生mac复合物。该图还描述许多补体切割产物的产生。64.图2a‑2b是n末端u‑pa融合蛋白的示意图。图2a是n末端u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域n末端的融合伴侣(即fc)。示范性n末端融合蛋白如seqidno:1004所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、fc(融合伴侣)、ags(接头)、u‑pa激活序列和经修饰的u‑pa催化结构域。图2b是不含融合伴侣的n末端野生型蛋白的示意图。示范性n末端野生型蛋白如seqidno:1005所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端、u‑pa激活序列和经修饰的u‑pa催化结构域。65.图3a‑3c是c末端u‑pa融合蛋白的示意图。图3a是c末端u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域c末端的融合伴侣，其中融合蛋白没有u‑pa催化结构域n末端的激活序列。示范性c末端融合蛋白如seqidno:1006所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1007所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(人血清白蛋白，作为融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1008所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和结合胶原蛋白ii的scfv(c2scfv)(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1009所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和habd(透明质酸结合域)(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1012所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、野生型u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1013所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、野生型u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。图3b是c末端u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域c末端的融合伴侣(即fc或hsa)。示范性c末端融合蛋白如seqidno:1010所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、弗林蛋白酶激活位点、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1016所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、弗林蛋白酶激活序列、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。图3c是u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域c末端的融合伴侣(即fc或hsa)以及u‑pa催化结构域n末端的融合伴侣(即野生型u‑pa的n末端)。示范性融合蛋白如seqidno:1011所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端结构域、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1014所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端区、弗林蛋白酶激活位点、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1015所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端区、弗林蛋白酶激活位点、u‑pa激活序列、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。66.图4a‑4h是融合蛋白的激活形式的示意图，其中spd指丝氨酸蛋白酶结构域(本文所提供经修饰u‑pa多肽蛋白酶结构域；u‑pa的n末端一般指u‑pa残基1‑178或其任何修饰形式)。图4a是seqidno:1010的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)c末端的fc结构域和弗林蛋白酶激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。图4b是seqidno:1011的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的fc结构域和所述蛋白n末端的u‑pa的n末端以及u‑pa激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。图4c是seqidno:1036所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的fc结构域和融合蛋白n末端的u‑pa的n末端以及弗林蛋白酶激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。图4d是seqidno:1014所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的hsa和融合蛋白n末端的u‑pa的n末端以及弗林蛋白酶激活序列。图4e是seqidno:1015所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的hsa和融合蛋白n末端的u‑pa的n末端以及u‑pa激活序列。图4f是seqidno:1016所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的c末端的hsa和蛋白酶结构域n末端的弗林蛋白酶激活序列。图4f是seqidno:1017所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的c末端的hsa和蛋白酶结构域n末端的sumo激活序列。图4h是seqidno:1018所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的c末端的fc结构域和蛋白酶结构域n末端的u‑pa的n末端以及sumo激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。67.发明详述68.概要69.a.定义70.b.u‑pa结构和功能71.1.丝氨酸蛋白酶72.2.结构73.3.功能/活性。74.c.通过靶向c3来抑制补体75.1.补体蛋白c3和其在起始补体中的作用76.a.经典途径77.b.替代途径78.c.凝集素途径79.d.补体介导的效应子功能80.i.补体介导的裂解：膜攻击复合物81.ii.炎症82.iii.趋化83.iv.调理作用84.v.激活体液免疫应答85.2.c3结构和功能86.a.c3a87.b.c3b88.c.c3b抑制剂89.d.切割c3的经修饰的u‑pa多肽90.1.示范性经修饰的u‑pa多肽91.2.额外修饰92.a.减少免疫原性93.b.fc结构域94.c.缀合聚合物95.d.蛋白转导结构域96.e.评价或监测u‑pa对补体介导的功能的活性的试验1.评价u‑pa对补体蛋白c3功能的活性的方法97.a.蛋白检测98.i.sds‑page分析99.ii.酶免疫试验100.iii.放射免疫扩散(rid)101.b.溶血试验102.c.确定切割位点的方法103.2.评价野生型u‑pa活性的方法104.a.切割纤溶酶原105.b.纤溶酶原活化试验106.c.u‑pa‑upar结合试验107.d.c3切割108.acc‑agr elisa109.用肽文库评价特异性110.3.特异性111.4.疾病模型112.f.编码其经修饰的u‑pa多肽的核酸生成方法113.1.分离或制备编码u‑pa多肽的核酸114.2.产生突变或修饰核酸及编码的多肽115.3.载体和细胞116.4.表达117.a.原核细胞118.b.酵母细胞119.c.昆虫和昆虫细胞120.d.哺乳动物表达121.e.植物122.5.纯化123.6.额外修饰124.a.聚乙二醇化125.b.融合蛋白和其它缀合物126.7.核酸分子127.g.组合物、制剂和剂量128.1.施用经修饰的u‑pa多肽129.2.施用编码经修饰的u‑pa多肽的核酸(基因治疗)。130.h.治疗应用和治疗方法131.1.补体激活介导的疾病132.a.类风湿性关节炎133.b.败血症134.c.多发性硬化135.d.阿尔茨海默氏病136.e.缺血再灌注损伤137.f.眼失调138.年龄相关的黄斑变性(amd)139.g.器官移植与移植肾功能延迟恢复(dgf)140.2.治疗应用141.a.免疫介导的炎症性疾病142.b.神经退行性疾病143.c.心血管疾病144.d.年龄相关的黄斑变性(amd)145.e.器官移植146.移植肾功能延迟恢复(dgf)147.3.联合疗法148.i.实施例149.a.定义150.除非另有定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的意义。除非另有说明，本文完整公开内容引用的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、genbank序列、网址和其他发表的材料通过引用全文纳入。在本文术语有多种定义的情况下，以该章节的为准。涉及url或其他这类标识符或地址时，应理解这些标识符能改变且互联网上的特定信息可以来来去去，但已知等价信息并易获得，如通过搜索互联网和/或合适数据库。提及其证明了这类信息的可用性和公共传播性。151.如本文所用，切割指通过蛋白酶使肽键断裂。蛋白酶的切割位点基序涉及切割键n‑末端和c‑末端的残基(蛋白酶的切割位点定义为...p3‑p2‑p1‑p1'‑p2'‑p3'...，且切割在p1与p1'残基之间发生，则分别是无'的一侧和有'的一侧(unprimedandprimedsides))。在人中，通过c3转化酶切割在c3的残基r与s之间发生(参见seqidno:47的残基746‑751，在人c3的残基748与749之间切割)：152.p3ꢀꢀp2ꢀꢀp1ꢀꢀꢀp1'p2'p3'153.leualaarg↓serasnleu154.通常，生化途径中的底物切割是激活切割或抑制切割。激活切割指从失活形式切割多肽到活性形式。这包括例如切割酶原到活性酶。激活切割也是其中蛋白切割成一种或多种自身具有活性的蛋白的切割。例如，补体系统是蛋白裂解事件的不可逆级联，其终端导致多个效应分子形成，其刺激炎症、促进抗原吞噬作用和直接裂解一些细胞。因此，通过c3转化酶切割成c3a和c3b是激活切割。相反，本文提供的经修饰的u‑pa多肽实现c3的抑制切割，如通过在活性位点切割。155.如本文所用，抑制切割或灭活切割是将蛋白切割成一个或多个无功能的降解产物。抑制切割导致蛋白活性减少或降低。通常，蛋白活性降低会降低该蛋白参与的途径或过程。在一个示例中，任意一种或多种补体蛋白的切割(其是抑制切割)会导致补体经典、凝集素或替代功能途径的任意一种或多种的伴随降低或抑制。为了成为抑制性，切割使活性相较于蛋白天然形式下降至少或至少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。抑制切割所需的蛋白切割百分比在蛋白之间可变，但能通过分析蛋白活性来确定。156.如本文所用，“补体激活”指激活补体途径，例如补体激活指任意一种或多种补体途径的功能或活性被蛋白酶增加，或补体途径中的任意蛋白活性增加。补体激活能导致补体介导的细胞裂解或能导致细胞或组织破坏。宿主组织的不恰当补体激活在许多自身免疫疾病和炎症性疾病病理学中起重要作用，并且还引起许多与生物不相容性相关的疾病状态或与之相关联。应理解激活可指现有活性增加以及诱导新活性。补体激活可体外或体内发生。可测定并如本文所述的补体示范性功能包括溶血试验，测量任意一种或多种补体效应分子的试验，如通过sdspage然后进行蛋白质印迹或考马斯亮蓝染色或elisa。在一些实施方案中，相较于没有蛋白酶时的补体活性，补体激活被蛋白酶如本文所述蛋白酶抑制40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％或更多。157.如本文所用，“抑制补体激活”或“补体灭活”指任意一种或多种补体途径的补体介导的功能或活性被蛋白酶降低或减少，或途径中的任意蛋白活性降低或减少。补体功能或活性能体外或体内发生。可测定并如本文所述的补体示范性功能包括溶血试验，测量任意一种或多种补体效应分子的试验，如通过sdspage然后进行蛋白质印迹或考马斯亮蓝染色或elisa。蛋白酶能使补体激活抑制1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在其他实施方案中，相较于没有蛋白酶时的补体活性，补体激活被蛋白酶抑制40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％或更多。158.如本文所用，“补体蛋白”或“补体组分”是补体系统的蛋白，其在宿主防御感染和炎症过程中发挥作用。补体蛋白包括在经典途径、替代途径和凝集素途径中发挥作用的那些。补体蛋白包括参与补体途径的蛋白酶。159.如本文所用，补体蛋白包括任意“切割产物”(也称为“片段”)，其在补体级联激活后形成。补体蛋白还包括失活或改变形式的补体蛋白，如ic3b和c3a‑desarg。因此，补体蛋白包括但不限于：c1q、c1r、c1s、c2、c3、c3a、c3b、c3c、c3dg、c3g、c3d、c3f、ic3、c3a‑desarg、c4、c4a、c4b、ic4、c4a‑desarg、c5、c5a、c5a‑des‑arg、c6、c7、c8、c9、masp‑1、masp‑2、mbl、因子b、因子d、因子h、因子i、cr1、cr2、cr3、cr4、备解素、c1inh、c4bp、mcp、daf、cd59(mirl)、凝聚素和hrf以及任意补体蛋白的等位基因和物种变体。160.如本文所用，“天然”形式的补体蛋白在没有补体激活情况下分离自生物如脊椎动物，且没有被人在实验室中有意修改。天然补体蛋白示例包括c1q、c1r、c1s、c2、c3、c4、因子b、因子d、备解素、c5、c6、c7、c6和c9。161.一般，“天然补体蛋白”是失活的且在激活后获取活性。激活可能需要激活切割、成熟切割和/或与其他蛋白形成复合物。一个例外是天然形式具有酶活性的因子i和因子d。在一些示例中，天然补体蛋白的激活在蛋白切割后发生。例如，补体酶原如c3是蛋白酶，其自身通过蛋白酶切割活化，从而通过c3转化酶c4b2b切割c3可产生活性片段c3a和c3b。在另一示例中，切割失活天然补体蛋白导致蛋白结构稳定性变化，引起蛋白激活。例如，c3包含内部硫酯键，其在天然蛋白中稳定，但在蛋白切割导致构象变化后可能变成高反应性和活性。因此，c3切割产物具有生物活性。c3激活也能在没有切割情况下自发产生。天然c3中硫酯键的自发转换是补体替代途径的起始事件。另一示例中，天然补体蛋白的激活在复合调控分子释放后发生，该分子抑制另外活性天然补体的活性。例如，c1inh结合c1s和c1r并使之失活，除非其与c1q复合。162.如本文所用，“成熟切割”是通用术语，指酶原激活所需的任何切割。这包括导致构象变化的切割，其引起活性(即激活切割)。还包括其中关键结合位点暴露或位阻暴露或者抑制性区段被去除或移动的切割。163.如本文所用，“改变形式”的补体蛋白指以非天然形式存在的补体蛋白，该形式由其分子结构的修饰引起。例如，硫酯与水的c3反应能在没有转化酶切割的情况下发生，产生c3的水解失活形式，称为ic3。另一示例中，包括c3a、c5a和c4a在内的过敏毒素可通过羧肽酶n来脱精氨酸(desarginated)，变成更稳定、不太活跃的形式。164.如本文所用，补体蛋白的“片段”或“切割产物”是补体蛋白的区域或区段，其包含天然补体蛋白的多肽序列的部分。补体蛋白片段通常在补体级联激活后产生。一般，片段产生自天然补体蛋白的蛋白裂解切割。例如，补体蛋白c3通过c3转化酶酶促切割，产生2个片段：c3a，构成c3的n末端部分；和c3b，构成c末端部分且含有丝氨酸蛋白酶位点。补体蛋白片段还产生自另一补体蛋白片段的蛋白裂解切割。例如，c3b(产生自c3切割的片段)由因子i切割产生片段ic3b和c3f。一般，补体蛋白的切割产物是生物活性产物且作为补体系统的切割效应分子发挥作用。因此，补体蛋白片段或部分包括补体蛋白切割产物，以及所述蛋白的部分，其保留或显示至少一种补体蛋白活性。165.如本文所用，“切割效应分子”或“切割效应蛋白”指产生自补体系统激发酶级联的活性切割产物。补体激活引起的切割效应分子、片段或切割产物能有助于任意一种或多种补体介导的功能或活性，其包括调理作用、过敏性反应、细胞裂解和炎症。切割或效应分子示例包括但不限于c3a、c3b、c4a、c4b、c5a、c5b‑9和bb。补体系统的切割效应分子通过参与级联表现出活性，包括刺激炎症、促进抗原吞噬作用和直接裂解一些细胞。补体切割产物促进或参与补体途径激活。166.如本文所用，“过敏毒素”是切割效应蛋白，其激发肥大细胞或嗜碱粒细胞脱粒或物质从其释放，所述肥大细胞或嗜碱粒细胞参与炎症反应，尤其是作为抵御寄生虫的部分防御。如果脱粒过强，其能导致过敏反应。过敏毒素包括例如c3a、c4a和c5a。过敏毒素还间接介导平滑肌细胞痉挛(如支气管痉挛)，增加毛细血管渗透性以及趋化性。167.如本文所用，“趋化性”指受体介导的白血球向趋化因子移动，通常沿着其浓度增加的方向，如过敏毒素浓度增加的方向。168.如本文所用，“调理作用”指病原体或其他颗粒表面的改变，从而其能被吞噬细胞摄取。结合或改变病原体表面的蛋白被称为调理素。抗体和补体蛋白使胞外细菌易受调理，以用于吞噬细胞如中性粒细胞和巨噬细胞的摄取和破坏。169.如本文所用，“细胞裂解”指细胞通过破坏其壁或膜来裂开。红细胞溶血是细胞裂解的量度。170.如本文所用，“补体蛋白c3”或“c3”指补体系统的补体蛋白c3，在宿主防御感染和炎症过程中发挥作用。人补体蛋白c3是seqidno:47所示的1663氨基酸单链前原蛋白或酶原，其包含22氨基酸信号肽(seqidno:47的氨基酸1‑22)和四精氨酸序列(seqidno:47的氨基酸678‑671)，所述四精氨酸序列通过弗林蛋白酶样酶去除，产生成熟的2链蛋白，该蛋白含有通过残基c559与c816之间二硫键连接的β链(seqidno:47的氨基酸23‑667)和α链(seqidno:47的氨基酸672‑1663)。补体蛋白c3由seqidno:47氨基酸748与749之间的c3转化酶(c4b2b或c3bbb)通过蛋白裂解进一步激活，产生过敏毒素c3a和调理素c3b。171.如本文所用，“酶原”指通过蛋白裂解激活的蛋白，包括成熟切割如激活切割，和/或与其他蛋白和/或辅因子形成络合物。酶原是蛋白的失活前体。这类前体一般大于活性形式，尽管不必需更大。对于u‑pa或补体蛋白c3，酶原通过特异性切割转化成活性酶，包括催化和自催化切割，或是通过结合激活辅因子，其产生活性酶。因此，酶原是无酶活性的蛋白，其通过活化剂作用转换成蛋白水解酶。切割能自催化实现。一些补体蛋白是酶原；它们失活，但在感染后的补体系统起始之后被切割和激活。酶原一般无活性，能通过催化或自催化切割前区域(proregion)从酶原转化为成熟活性多肽。172.如本文所用，“前区域”、“前导肽”或“前序列”指被切割以产生成熟蛋白的蛋白区域或区段。这可包括功能是通过掩蔽催化组件(machinery)并因而防止形成催化中间物(即通过空间上封闭底物结合位点)抑制酶活性的区段。前区域是位于成熟生物活性多肽氨基末端的氨基酸序列，且能少至几个氨基酸或可以是多域结构。173.如本文所用，“激活序列”指酶原中的氨基酸序列，其是激活切割或成熟切割以形成活性蛋白酶所需的位点。激活序列切割可自催化或通过激活伴侣来催化。激活切割是成熟切割的一种类型，其中发生活性所需的构象变化。这是经典激活途径，例如对于丝氨酸蛋白酶，其中切割产生新的n末端，该末端与催化组件的保守区如催化残基相互作用，以诱导活性所需的构象变化。激活能引起多链形式蛋白酶生成。在一些情况中，单链形式蛋白酶可显示蛋白裂解活性。174.如本文所用，“结构域”指分子如蛋白或编码核酸的部分，其在结构和/或功能上不同于分子的其他部分并且可鉴别。示范性多肽结构域是多肽的部分，其能在的多肽内形成由一个或多个结构基序构成的独立折叠的结构(如通过环区域连接的α螺旋和/或β链的组合)和/或通过特定功能活性识别，如酶活性、二聚化或底物结合。多肽可具有一个或多个，通常多于一个不同结构域。例如，多肽可具有一个或多个结构域和一个或多个功能域。单一多肽结构域能基于结构和功能区分。结构域可涵盖氨基酸的连续线性序列。或者，结构域可涵盖多个非连续氨基酸部分，它们沿着多肽的氨基酸线性序列是非连续的。通常，多肽含有多个结构域。例如，丝氨酸蛋白酶能基于蛋白酶结构域序列表征。本领域技术人员熟悉多肽结构域且能通过与其他这类结构域的结构和/或功能同源性对其进行鉴定。对于本文的示例，提供定义，但应理解通过名称识别特定结构域完全在本领域技术范围内。需要时，合适的软件能用于鉴定结构域。175.如本文所用，多肽的“结构区域”是含有至少一个结构域的多肽区域。176.如本文所用，“蛋白酶结构域”是蛋白酶的催化活性部分。提及蛋白酶的蛋白酶结构域，包括单链、2链和多链形式的任意这些蛋白。蛋白的蛋白酶结构域含有蛋白就其蛋白裂解活性而言所需的所有必要特性，例如其催化中心。177.如本文所用，蛋白酶如u‑pa多肽的“催化活性部分”或“催化活性结构域”指蛋白酶结构域，或保留蛋白酶活性的其任何片段或部分。例如，u‑pa多肽的催化活性部分可以是u‑pa蛋白酶结构域，包括分离的单链形式蛋白酶结构域或激活的2链形式。显著的是，至少在体外，单链形式蛋白酶和催化结构域或其蛋白裂解活性部分(一般是c末端截短)显示蛋白酶活性。178.如本文所用，“编码蛋白酶结构域或蛋白酶催化活性部分的核酸”指仅编码所示举单链蛋白酶结构域或其活性部分的核酸，而没有蛋白酶的其他连续部分作为连续序列。179.如本文所用，基本由蛋白酶结构域组成的叙述意味着，仅多肽的部分是蛋白酶结构域或其催化活性部分。多肽可任选地或通常包括额外的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。180.如本文所用，“蛋白酶活性位点”指发生底物催化的底物结合位点。活性位点的结构和化学性质允许底物识别和结合以及底物中切割键的后续水解和切割。蛋白酶活性位点含有有助于肽切割催化机制的氨基酸，如氨基酸glnhisalaargalaserhisleu(c3活性位点；seqidno:47的残基737‑744)以及有助于底物序列识别的氨基酸，如有助于延伸的底物结合特异性的氨基酸。例如，c3活性位点中的切割能抑制其活性，如：181.qhar↓ashl(seqidno:47的残基737‑744)182.p4p3p2p1↓p1'p2'p3'p4'.183.如本文所用，“底物识别位点”或“切割序列”指由蛋白酶活性位点识别的序列，其通过蛋白酶切割。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列是6个残基长度以匹配许多蛋白酶的延伸底物特异性，但根据蛋白酶可以更长或更短。一般，例如对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的p1‑p4和p1’‑p4’氨基酸构成，其中切割在p1位置后发生。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列是6个残基长度以匹配许多蛋白酶的延伸的底物特异性，但根据蛋白酶可以更长或更短。184.如本文所用，“靶底物”指由蛋白酶切割的底物。通常，靶底物在其底物识别位点通过蛋白酶特异性切割。最低限度地，靶底物包括构成切割序列的氨基酸。任选地，靶底物包括含切割序列和任何其他氨基酸的肽。全长蛋白、等位基因变体、同种型或其含有蛋白酶所识别的切割序列的任意部分，是该蛋白酶的靶底物。例如，出于预期补体失活的本文目的，靶底物是补体蛋白c3，或其含有u‑pa多肽所识别的切割序列的任何部分或片段。这种靶底物可以是纯化蛋白，或能存在于混合物，如体外混合物或体内混合物。混合物可包括例如血液或血清，或其他组织液体。另外，靶底物包括肽或蛋白，含有不影响蛋白酶切割底物的额外部分。例如，靶底物可包括化学连接荧光部分的四氨基酸肽或全长蛋白。蛋白酶能修饰成显示对靶底物更高的底物特异性。185.如本文所用，“u‑pa”或“upa”或“u‑pa多肽”指任何u‑pa多肽，包括但不限于重组生成的多肽、合成生成的多肽和提取或分离自细胞或组织的u‑pa多肽，包括但不限于肝和血。就u‑pa而言可互换使用的替代名称包括尿激酶以及尿纤溶酶原激活物和尿激酶纤溶酶原激活物和尿型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物。u‑pa包括来自不同物种的相关多肽，包括但不限于人和非人来源。人u‑pa包括u‑pa、等位基因变体、同种型、来自核酸的合成分子、分离自人组织及细胞的蛋白以及其修饰形式。示范性未修饰人u‑pa多肽包括但不限于未修饰和野生型天然成熟u‑pa多肽(seqidno:3)、包括前肽和/或信号肽的未修饰和野生型前体u‑pa多肽(如seqidno:1所示u‑pa多肽)及蛋白酶结构域(如seqidno:2所示的u‑pa蛋白酶结构域)。本领域技术人员会认识到，成熟u‑pa多肽(seqidno:3)的参考位置相较于前体u‑pa多肽(seqidno:1，其是含有信号肽序列的u‑pa多肽)差异20个氨基酸残基。因此，seqidno:3的第一个氨基酸残基“对应于”seqidno:1的第21个氨基酸残基。[0186]“u‑pa”涵盖激活或2链形式的u‑pa多肽，其包含通过残基148c与279c(对应于seqidno:3所示成熟u‑pa多肽)之间二硫键连接的n末端a链(seqidno:3的氨基酸1‑158)和c末端b链(seqidno:3的氨基酸159‑411)。2链形式或高分子量(hmw)u‑pa形成自成熟u‑pa多肽(如seqidno:3所示)，这是通过在氨基酸残基lys158之后、残基ile159之前的蛋白裂解。例如，蛋白裂解能通过纤溶酶、激肽释放酶、组织蛋白酶b、蛋白裂解酶和神经生长因子‑γ完成。本文提供的u‑pa多肽能进一步修饰，如化学修饰或翻译后修饰。这类修饰包括但不限于糖基化、聚乙二醇化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化以及本领域已知的其他多肽修饰。[0187]u‑pa包括来自任何物种的u‑pa，包括人和非人物种。非人来源的u‑pa多肽包括但不限于鼠、犬、野兔、禽类、牛、羊、猪和其他灵长类u‑pa多肽。示范性非人来源的u‑pa多肽包括例如小鼠(小家鼠(musmusculus)，seqidno:52)、大鼠(大家鼠(rattusnorvegicus)，seqidno:53)、牛(家牛(bostaurus)，seqidno:54)、猪(野猪(susscrofa)，seqidno:55)、兔(家兔(oryctolaguscuniculus)，seqidno:56)、鸡(原鸡(gallusgallus)，seqidno:57)、黄狒狒(草原狒狒(papiocynocephalus)，seqidno:58)、苏门答腊猩猩(苏门答腊猩猩(pongoabelii)，seqidno:59)、狗(狼(canislupus)，seqidno:60)、绵羊(家绵羊(ovisaries)，seqidno:61)、狨猴(普通狨(callithrixjacchus)，seqidno:62)、恒河猴(猕猴(macacamulatta)，seqidno:63)、北部白颊长臂猿(北白颊长臂猿(nomascusleucogenys)，seqidno:64)和黑猩猩(黑猩猩(pantroglodytes)，seqidno:65)。[0188]提及u‑pa多肽，还包括单链或2链形式的前体多肽和成熟u‑pa多肽、其具有活性的截短形式、经分离蛋白酶结构域，包括等位基因变体和物种变体、通过剪接变体编码的变体以及其他变体，包含与seqidno:1所示的前体多肽或其成熟形式(seqidno:3)或其蛋白酶结构域(seqidno:2)有至少或至少约40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。u‑pa多肽包括但不限于组织特异性同种型和其等位基因变体，通过翻译核酸制备的合成分子，通过化学合成产生的蛋白如包括经重组方法连接较短多肽的合成，分离自人和非人组织及细胞的蛋白，嵌合u‑pa多肽和其修饰形式。u‑pa多肽还包括u‑pa多肽片段或部分，其有足够长度或包括保留至少一种全长成熟多肽活性(若需要，在激活后)的合适区域。在一个示例中，u‑pa的部分是蛋白酶结构域，例如seqidno:2所示的蛋白酶结构域，其对应于seqidno:1所示的u‑pa序列的氨基酸179‑431。u‑pa多肽还包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含化学或翻译后修饰的那些。这类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化、hes化(通过药物分子偶联生物可降解羟乙基淀粉(hes)来延长半衰期)、pas化(用由小l‑氨基酸pro、ala和/或ser构成的天然无序的生物合成聚合物经基因融合或化学偶联缀合药物活性化合物如蛋白、肽和低分子量药物)和本领域已知的其他多肽修饰。[0189]如本文所用，“u‑pa蛋白酶”或“u‑pa蛋白酶结构域”指任何u‑pa多肽，包括但不限于重组生成的多肽、合成生成的多肽和提取或分离自细胞或组织的u‑pa多肽，包括但不限于肝和血。u‑pa蛋白酶包括来自不同物种的相关多肽，包括但不限于人和非人来源的动物。人u‑pa蛋白酶或u‑pa蛋白酶结构域包括u‑pa、等位基因变体、同种型、来自核酸的合成分子、分离自人组织及细胞的蛋白以及其修饰形式。示范性参考人u‑pa蛋白酶结构域包括但不限于未修饰和野生型u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:2)和替代的蛋白酶结构域(如seqidno:5所示的u‑pa蛋白酶结构域)。本领域技术人员会认识到，u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:2)的参考位置相较于成熟u‑pa多肽(seqidno:1，其是含有全长wt序列的u‑pa多肽)差异178个氨基酸残基。因此，seqidno:2的第一个氨基酸残基“对应于”seqidno:1的第179个氨基酸残基。[0190]如本文所用，“修饰”涉及多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，且分别包括氨基酸或核苷酸的缺失、插入和取代。修饰多肽的方法对本领域技术人员而言是常规的，如采用重组dna方法。在多肽氨基酸序列修饰与多肽修饰之间有区别。前者指氨基酸的插入、缺失和取代或置换；后者指多肽修饰，如翻译后修饰、聚乙二醇化和其他这类蛋白修饰以改变性质和/或活性。[0191]如本文所用，“置换”或“取代”指天然、靶标、野生型或其他核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸被替代的核苷酸或氨基酸取代，而没有改变分子长度(如残基数所述)。因此，分子中的一个或多个置换不改变分子的氨基酸残基或核苷酸数目。相较于特定多肽的氨基酸取代可以沿着多肽序列长度的氨基酸残基数的形式表示。例如，在氨基酸序列第35个位置处有精氨酸(arg；r)被谷氨酰胺(gln；q)置换/取代的氨基酸修饰的修饰多肽，可以r35q、arg35gln或35q表示。简单地，r35能用于指示经修饰第35个位置处的氨基酸是精氨酸。[0192]如本文所用，“经修饰的u‑pa”或“经修饰的u‑pa多肽”指相较于未修饰形式显示活性改变的u‑pa蛋白酶，如底物特异性改变。这种蛋白酶包括相较于野生型u‑pa的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰(即氨基酸变化)，从而u‑pa蛋白酶就切割补体蛋白c3而言的活性如底物特异性或选择性改变。经修饰的u‑pa可以是全长u‑pa蛋白酶，或可以是全长蛋白酶的部分，如u‑pa的蛋白酶结构域，只要经修饰的u‑pa蛋白酶在区域中包含改变蛋白酶活性或底物特异性的修饰且蛋白酶具有蛋白裂解活性。经修饰的u‑pa蛋白酶或经修饰的u‑pa蛋白酶结构域还可在区域中包括不影响蛋白酶底物特异性的其他修饰。因而，经修饰的u‑pa多肽通常具有与野生型u‑pa多肽对应氨基酸序列60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。经修饰的全长u‑pa多肽或者经修饰的u‑pa多肽的催化活性部分或其蛋白酶结构域可包括作为融合蛋白的多肽，只要融合蛋白具有靶特异性。[0193]如本文所用，胰凝乳蛋白酶编号指seqidno:76的成熟胰凝乳蛋白酶多肽的氨基酸编号。另一蛋白酶的蛋白酶结构域例如u‑pa蛋白酶结构域能与胰凝乳蛋白酶进行比对。这种示例中，对应于胰凝乳蛋白酶氨基酸的u‑pa多肽氨基酸根据胰凝乳蛋白酶氨基酸编号给出。对应位置可通过这样的比对如下确定：由本领域技术人员用手工比对或采用许多可获得的比对程序(如blastp)。对应位置还能基于结构比对，例如用计算机模拟比对蛋白结构。列举多肽的氨基酸对应于公开序列的氨基酸，涉及用标准比对算法如gap算法将多肽与公开序列比对后鉴定的氨基酸，以最大化相同性或同源性(其中匹配保守氨基酸)。表1中提供了seqidno:3所示的u‑pa多肽氨基酸位置159‑411对应的胰凝乳蛋白酶的编号。相对于seqidno:3所示的序列的氨基酸位置采用常规字体，这些位置处的氨基酸残基采用粗体，对应的胰凝乳蛋白酶编号采用斜体。例如，u‑pa的丝氨酸蛋白酶结构域(seqidno:2)与成熟胰凝乳蛋白酶比对后，u‑pa中159位的异亮氨酸(i)以i16的胰凝乳蛋白酶编号给出。后续氨基酸相应编号。在一个示例中，成熟u‑pa(seqidno:3)的氨基酸位置173处的苯丙氨酸(f)根据胰凝乳蛋白酶编号对应氨基酸位置f30。如果残基存在于蛋白酶但不存在于胰凝乳蛋白酶时，氨基酸残基以字母符号给出。例如，胰凝乳蛋白酶中残基是具有基于胰凝乳蛋白酶编号的氨基酸60环的一部分，但相较于胰凝乳蛋白酶在u‑pa序列中是插入的，所述残基称为例如d60a、y60b或p60c。这些残基相对于seqidno:3所示成熟u‑pa序列编号分别对应d208、y209和p210。[0194]表1.u‑pa的胰凝乳蛋白酶编号[0195][0196][0197]如本文所用，kcat测量酶的催化活性；kcat单位是秒‑1。kcat的倒数是酶分子“周转(turnover)”一个底物分子所需的时间；kcat测量每秒周转的底物分子数/酶分子。kcat有时称为周转数。在酶学中，kcat(也称为周转数)是每秒底物分子的化学转化最大数，这是单一催化位点就给定酶实施的。当所有酶催化位点用底物饱和时，这是反应最大速度(vmax)。[0198]如本文所用，靶底物的特异性指相较于称为非靶底物的另一底物，蛋白酶偏好切割靶底物。特异性反映于特异性常数(kcat/km)，其是蛋白酶对其底物亲和性及酶效率的量度。kcat/km是酶效率的量度；大数值kcat(迅速周转)或小数值km(底物高亲和性)使得kcat/km大。[0199]如本文所用，切割的特异性常数是(kcat/km)，其中km是米氏常数(一半vmax处的[s])且kcat是vmax/[et]，et是最终的酶浓度。参数kcat、km和kcat/km可如下计算：绘制底物浓度倒数vs底物切割速度倒数的图，拟合到lineweaver‑burk方程(1/速度＝(km/vmax)(1/[s]) 1/vmax；其中vmax＝[et]kcat)。存在多种底物浓度下，确定切割随着时间增加的速度的任何方法能用于计算特异性常数。例如，底物连接荧光部分，其在蛋白酶切割后释放。通过确定不同酶浓度下的切割速度，能测定特定酶的kcat。特异性常数能用于确定蛋白酶对一种靶底物相比于另一底物的优先性。[0200]如本文所用，底物特异性指蛋白酶对靶底物相比于另一底物的优先性。底物特异性能作为特异性常数比例测量。[0201]如本文所用，底物特异性比例是特异性常数比例且能用于比较2种或更多蛋白酶的特异性或者蛋白酶对2个或更多底物的特异性。例如，蛋白酶对于竞争底物的底物特异性或竞争性蛋白酶对于一种底物的底物特异性能通过比较kcat/km来对比。例如，蛋白酶对靶底物的特异性常数是2x106m‑1sec‑1，对非靶底物是2x104m‑1sec‑1，对靶底物的特异性更高。使用上述特异性常数，蛋白酶对靶底物的底物特异性比例是100。[0202]如本文所用，对靶底物的优先性或底物特异性能以底物特异性比例表示。反映优先性的该比例具体值是所讨论的底物和蛋白酶函数。大于1的底物特异性比例表明对靶底物的优先性，小于1的底物特异性表明对非靶底物的优先性。一般，至少为或约为1的比例反映对于待考虑为候选治疗剂的蛋白酶的足够的差异。[0203]如本文所用，改变的特异性指经修饰蛋白酶相较起始野生型蛋白酶的底物特异性变化。一般，特异性变化反映相较蛋白酶的野生型底物(本文称为非靶底物)，经修饰的蛋白酶对靶底物的优先性变化。通常，本文提供的经修饰的u‑pa蛋白酶显示对补体蛋白c3的底物特异性相较于野生型u‑pa蛋白酶的底物特异性增加。例如，对靶底物相比于非靶底物的底物特异性比例为100的经修饰蛋白酶，相较于底物特异性比例为10的支架蛋白酶表现出10倍增加的特异性。另一示例中，底物特异性比例为1的经修饰的蛋白酶相较于0.1的比例，表现出底物特异性增加10倍。为显示特异性相较于骨架蛋白酶上升，经修饰的蛋白酶对任意一种或多种补体蛋白的底物特异性提高1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更大。[0204]如本文所用，“选择性”指蛋白酶从竞争底物混合物中选择和切割靶底物的能力时，能与特异性互换使用。例如，蛋白酶对靶底物相较任何其他一个或多个靶底物的选择性可通过比较蛋白酶切割靶底物的特异性常数来确定。例如，若蛋白酶对靶底物的切割特异性常数为2x106m‑1sec‑1且对任何其他一个或多个靶底物为2x104m‑1sec‑1，蛋白酶对靶底物更具有选择性。[0205]如本文所用，多肽如蛋白酶的“活性”或“功能活性”指多肽显示的任何活性。这种活性能凭经验确定。示范性活性包括但不限于与生物分子相互作用的能力，例如经底物‑结合、dna结合或二聚化，酶活性例如激酶活性或蛋白裂解活性。对于蛋白酶(包括蛋白酶片段)，活性包括但不限于特异性结合特定底物的能力，底物‑结合的亲和性和/或特异性(如高或低亲和性和/或特异性)，效应功能如促进底物(如蛋白，即c3)抑制、中和、切割或清除的能力，以及体内活性如促进蛋白切割或清除的能力。活性能体外或体内评价，使用公认的试验如elisa、流式细胞术、表面等离子体共振或测量缔合或解离速率(on‑oroff‑rate)的等价试验、免疫组化及免疫荧光组织学和显微镜检查、基于细胞的试验和结合试验。例如，对于蛋白酶如经修饰的u‑pa蛋白酶，可通过体外和/或体内测量底物蛋白切割、周转、剩余活性、稳定性和/或水平来评价活性。这种表明多肽显示活性的体外试验结果可能与体内多肽活性相关，其中体内活性能称为治疗活性或生物活性。经修饰的多肽的活性可以是未修饰多肽活性的任意水平的百分比，包括但不限于相较于未修饰多肽1％或约1％的活性，2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的活性。确定经修饰的(或变体)蛋白酶功能或活性的试验为本领域熟知。[0206]功能活性包括但不限于生物活性、催化或酶活性、抗原性(结合抗多肽抗体或与多肽竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、特异性结合多肽受体或配体的能力。[0207]如本文所用，涉及补体蛋白的功能活性指补体介导的功能，包括但不限于过敏性、调理作用、趋化性或细胞裂解。测试补体活性的试验示例包括红细胞溶血以及检测补体效应分子，如通过elisa或sds‑page。[0208]如本文所用，催化活性或切割活性指体外蛋白裂解试验中评价的蛋白酶活性，所述试验检测选定底物的蛋白裂解。通过评价蛋白酶催化效率，可测量切割活性。[0209]如本文所用，针对靶底物的活性指切割活性和/或功能活性，或反映蛋白酶在靶底物上或对其活性的其他量度。蛋白酶对补体蛋白靶底物的功能活性能如下测量：在补体试验如红细胞溶血或者本领域技术人员已知或本文所提供其他这类试验中评估ic50，以评价补体活性。通过评价蛋白酶催化效率，可测量切割活性。出于本文目的，相较没有蛋白酶时，如果蛋白酶显示对靶靶底物的更高蛋白裂解或切割和/或调节(即激活或抑制)补体蛋白功能活性，则活性增加。[0210]如本文所用，涉及经修饰的u‑pa多肽的“活性增加”指，在相同条件下测试时，经修饰的u‑pa多肽相较于不含氨基酸取代的未修饰的u‑pa多肽，显示活性更高。例如，经修饰的u‑pa多肽表现出至少或至少约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多的未修饰参考u‑pa多肽活性。[0211]如本文所用，术语“相同”用于指抗体结合亲和性时，意味着ec50、缔合常数(ka)或解离常数(kd)在参考抗体的1‑100倍或1‑10倍范围内(亲和性比参考抗体高1‑100倍或亲和性低1‑100倍，或这些范围内的任何数值或范围或值)。[0212]如本文所用，“结合活性”指分子如多肽的特征，涉及其是否或如何结合一个或多个结合伴侣。结合活性包括与结合伴侣结合的能力，与结合伴侣结合的亲和性(如高亲和性)，与结合伴侣的键强度和/或与结合伴侣结合的特异性。[0213]如本文所用，ec50也称为表观kd，是在固定量底物上观察到50％最大活性的蛋白酶浓度(如nm)(例如，切割50％可用的hc3所需的经修饰的u‑pa多肽的浓度)。通常，ec50值确定自s形剂量反应曲线，其中ec50是拐点处的浓度。蛋白酶对其底物的高亲和性与低ec50值相关，低亲和性则对应高ec50值。亲和性常数可通过用于蛋白酶反应的标准动力学方法确定，例如免疫测定如elisa，然后进行曲线拟合分析。[0214]如本文所用，“亲和性常数”指缔合常数(ka)，用于测量蛋白酶与底物之间的亲和性或分子结合强度。亲和性常数越高，蛋白酶对底物的亲和性越高。亲和性常数以摩尔浓度倒数(即m‑1)单位表示，且能计算自缔合及解离反应的速度常数，如用于蛋白酶‑底物反应的标准动力学方法所测(例如免疫测定、表面等离子体共振或本领域已知的其他动力学相互作用分析)。蛋白酶的结合亲和性还可以解离常数或kd表示。解离常数是缔合常数的倒数，kd＝1/ka。因此，亲和性常数还能由kd表示。亲和性常数可通过用于蛋白酶反应的标准动力学方法确定，例如免疫测定、表面等离子体共振(spr)(rich和myszka(2000)curr.opin.biotechnol11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用分析(参见例如paul编,fundamentalimmunology,第2版,纽约的raven出版社(ravenpress),第332‑336页(1989))。已知用于实时检测和监测结合速度的仪器及方法并且市售可得(例如，biacore2000,biacoreab,瑞典乌普萨拉和通用电气医疗集团生命科学部门(gehealthcarelifesciences)；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)[0215]熟知用于计算亲和性的方法，如确定ec50值的方法或确定缔合/解离常数的方法，包括本文示例的那些。例如，关于ec50，高结合亲和性指特异性结合靶蛋白的蛋白酶，ec50小于约10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、1ng/ml或更小。高结合亲和性也可通过平衡解离常数为10‑6m或更低来鉴定，如10‑7m、10‑8m、10‑10m、10‑11m或10‑12m或更低。在平衡缔合常数(ka)方面，高结合亲和性一般与ka值相关，ka值大于或等于约106m‑1、大于或等于约107m‑1、大于或等于约108m‑1、或大于或等于约109m‑1、1010m‑1、1011m‑1或1012m‑1。亲和性能凭经验估计或亲和性能相对确定，例如通过比较2个或更多抗体对特定抗原的亲和性，如，通过成对计算所测试抗体的亲和性比例。例如，这种亲和性易用常规技术测定，如elisa；平衡透析；表面等离子体共振；用放射性标记靶抗原的放射免疫分析；或技术人员已知的另一方法。可分析亲和性数据，例如通过scatchard等,annn.y.acad.sci.,51:660(1949)的方法或曲线拟合分析，例如采用4参数逻辑非线性回归模型，用方程y＝((a‑d)/(1 ((x/c)^b))) d，其中a是最小渐近线，b是斜率因数，c是拐点(ec50)，而d是最大渐近线。[0216]如本文所用，“ed50”是蛋白酶(如经修饰的u‑pa)的剂量(如mg/kg或nm)，其在50％的总群体(如样品中存在的c3总量)中生成指定结果(如切割补体蛋白c3)。[0217]如本文所用，术语“表面等离子体共振”指光学现象，允许通过检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度变化来分析实时相互作用，例如使用biacore系统(通用电气医疗集团生命科学部门)。[0218]如本文所用，人蛋白由存在于人基因组的核酸分子如dna编码，包括所有等位基因变体和其保守变化。如果修饰是基于人蛋白的野生型或突出序列，则蛋白变体或修饰是人蛋白。[0219]如本文所用，天然产生的α‑氨基酸残基是自然界中发现的这20个α‑氨基酸残基，其通过特异识别带电trna分子与其在人中的同源mrna密码子来纳入蛋白。[0220]如本文所用，非天然产生的氨基酸指非基因编码的氨基酸。[0221]如本文所用，“核酸”指至少2个相关的核苷酸或核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核苷酸(dna)和核糖核苷酸(rna)及其类似物，它们通常经磷酸二酯键连接在一起。术语“核酸”还包括核酸如肽核酸(pna)、硫代磷酸dna的类似物，以及其他这种类似物和其衍生物或组合。核酸还包括dna和rna衍生物，含有例如核苷酸类似物或磷酸二酯键以外的“主干”键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸键、硫酯键或肽键(肽核酸)。术语还包括rna或dna的等价物、衍生物、变体和类似物，所述rna或dna制备自核苷酸类似物、单链(有义或反义)和双链核酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷,脱氧胞苷,脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于rna，尿嘧啶碱基是尿苷。核酸可以是单链或双链的。当涉及探针或引物(其任选地是如用可检测标记如荧光或放射性标记来标记的)时，考虑单链分子。这类分子通常具有一定长度，从而其靶标在统计上独特或有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)以用于探针识别(probing)或引物识别(priming)文库。一般，探针或引物包含至少14、16或30个连续核苷酸，序列与感兴趣基因互补或相同。探针和引物长度可以是10、20、30、50、100或更多个核苷酸。[0222]如本文所用，“经分离的核酸分子”与所述核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分开。“经分离”的核酸分子如cdna分子能在通过重组技术生成时几乎没有其他细胞材料或培养基，或在化学合成时几乎没有化学前体或其他化学物。本文提供的示范性经分离的核酸分子包括编码所提供的u‑pa蛋白酶的经分离的核酸分子。[0223]如本文所用，“合成”涉及例如合成核酸分子或合成基因或合成肽时，指通过重组方法和/或化学合成方法生成的核酸分子或多肽分子。[0224]如本文所用，“多肽”指2个或更多共价连接的氨基酸。术语“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用。[0225]如本文所用，“肽”指长度为2‑约40个氨基酸的多肽。[0226]如本文所用，在本文所提供多种氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知、三字母或一字母缩写鉴定(表2)。多个核酸片段中出现的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名法指定。[0227]如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有机化合物。多肽包含2个或更多氨基酸。出于本文目的，氨基酸包括20个天然存在的氨基酸(表2)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即α‑碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，在本文所呈现多个多肽氨基酸序列中出现的氨基酸根据其熟知、三字母或一字母缩写鉴定(表2)。在多个核酸分子和片段中出现的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名法指定。[0228]如本文所用，“氨基酸残基”指多肽在其肽键化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文所述氨基酸残基推定为采用“l”异构形式。如此命名的“d”异构形式中的残基能取代任何l‑氨基酸残基，只要多肽保留所需功能性质。nh2指多肽氨基末端存在的游离氨基。cooh指多肽羧基末端存在的游离羧基。与j.biol.chem.,243:3557‑3559(1968)所述的标准多肽命名一致且如37c.f.r.§§1.821‑1.822所采用，氨基酸残基的缩写如表2所示：[0229]表2–对应表[0230][0231][0232]本文通过公式所示的全部氨基酸残基序列具有氨基末端到羧基末端常规方向的从左向右定向。短语“氨基酸残基”包括对应表(表2)所示氨基酸、修饰、非天然和不常见的氨基酸。此外，氨基酸残基序列开始或结束处的破折号指示肽键，结合一个或多个氨基酸残基的进一步序列或者氨基末端基团如nh2或羧基末端基团如cooh。[0233]如本文所用，“天然存在的氨基酸”指多肽中存在的20个l‑氨基酸。如本文所用，天然产生的α‑氨基酸残基是自然界中发现的这20个α‑氨基酸残基，其通过用人的mrna密码子特异识别携带其的trna分子纳入蛋白，所述密码子与所述trna是同源(cognate)的。[0234]如本文所用，“非天然氨基酸”指结构与天然氨基酸类似，但经结构上修饰以模拟天然氨基酸结构和反应性的有机化合物。因此，非天然产生的氨基酸包括例如20个天然产生氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的d‑立体异构体。本领域技术人员已知示范性非天然氨基酸，包括但不限于对乙酰苯丙氨酸、对叠氮苯丙氨酸、2‑氨基己二酸(aad)、3‑氨基己二酸(baad)、β‑丙氨酸/β–氨基‑丙酸(bala)、2‑氨基丁酸(abu)、4‑氨基丁酸/哌啶酸(4abu)、6‑氨基己酸(acp)、2‑氨基庚酸(ahe)、2‑氨基异丁酸(aib)、3‑氨基异丁酸(baib)、2‑氨基庚二酸(apm)、2,4‑二氨基丁酸(dbu)、锁链素(des)、2,2'‑二氨基庚二酸(dpm)、2,3‑二氨基丙酸(dpr),n‑乙基甘氨酸(etgly)、n‑乙基天冬酰胺(etasn)、羟赖氨酸(hyl)、别羟赖氨酸(ahyl)、3‑羟脯氨酸(3hyp)、4‑羟脯氨酸(4hyp)、异锁链素(ide)、别异亮氨酸(aile)、n‑甲基甘氨酸、肌氨酸(megly)、n‑甲基异亮氨酸(meile)、6‑n‑甲基赖氨酸(melys)、n‑甲基缬氨酸(meval)、正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)和鸟氨酸(orn)。示范性非天然氨基酸如本文所述且为本领域技术人员已知。[0235]如本文所用，等动力混合物是其中氨基酸摩尔比根据其报告的反应速度调整(参见例如ostresh等.(1994)biopolymers34:1681)的混合物。[0236]如本文所用，dna构建体是单链或双链、线性或环状dna分子，其包含以自然界未发现形式组合及并列的dna区段。dna构建体作为人为操作的结果存在，包括所操纵分子的克隆和其他拷贝。[0237]如本文所用，dna区段是具有指定属性的较大dna分子部分。例如，编码指定多肽的dna区段是较大dna分子部分，如质粒或质粒片段，其从5’到3’方向阅读时，编码指定多肽的氨基酸序列。[0238]如本文所用，术语直系同源物指获自一个物种的多肽或蛋白，其是来自不同物种的多肽或蛋白的功能对应物。直系同源物之间的序列差异是物种形成的结果。[0239]如本文所用，术语多核苷酸指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单或双链聚合物，从5’到3’末端阅读。多核苷酸包括rna和dna，且能分离自天然来源，体外合成，或制备自天然和合成分子的组合。多核苷酸分子的长度在本文中以核苷酸(缩写“nt”)或碱基对(缩写“bp”)给出。上下文允许时，术语核苷酸用于单和双链分子。当术语应用于双链分子时，其用于指示总长度且应理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员应理解双链多核苷酸的2条链可能长度略有差异，其末端能交错；因而双链多核苷酸分子内的所有核苷酸无法配对。这种未配对末端一般不超过20个核苷酸长度。[0240]如本文所用，序列比对指使用同源性以匹配核苷酸或氨基酸的2种或更多序列。通常，以50％或更高相同性相关的2条或更多序列是匹配的。一组匹配的序列指在相应位置匹配的2条或更多序列，且能包括衍生自rna的匹配序列，如与基因组dna序列匹配的est和其他cdna。相关或变异多肽或核酸分子能通过本领域技术人员已知的任何方法比对。这类方法通常使匹配最大化，且包括方法如使用手动比对和采用多种可用的比对程序(例如blastp)以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽或核酸序列，本领域技术人员能鉴定类似部分或位置，使用保守和相同氨基酸残基作为指导。此外，本领域技术人员还能采用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导以发现人与非人序列之间的对应氨基酸或核苷酸残基。对应位置还能基于结构比对，例如用计算机模拟比对蛋白结构。其他示例中，可鉴定对应区域。本领域技术人员还能采用保守氨基酸残基作为指导以发现人与非人序列之间的对应氨基酸残基。[0241]如本文所用，“序列相同性”指在测试与参考多肽或多核苷酸比较中相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基数目。序列相同性能能通过核酸或蛋白序列比对确定，以鉴定相似或一致的区域。出于本文目的，序列相同性一般通过比对确定，以鉴定相同残基。比对可以是局部或全部。匹配、错配和缺口能在对比序列之间鉴定。缺口是比对序列残基之间插入的无效氨基酸或核苷酸，从而比对相同或相似特性。一般，可以有内部和末端缺口。通过考虑缺口作为相同残基数/最短序列长度x100，可确定序列相同性。用缺口罚分时，序列相同性能用无末端缺口罚分(如末端缺口未受罚)确定。或者，确定序列相同性可不考虑缺口作为相同位置数/总比对序列长度x100。[0242]如本文所用，“在对应于……的位置”或者核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开如序列标所示序列的核苷酸或氨基酸位置，指用标准对准算法如gap算法与所公开序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置，以最大化相同性。出于本文目的，u‑pa序列与seqidno:2或5所示人u‑pa蛋白酶结构域的氨基酸序列比对，尤其是seqidno:5的参考人u‑pa。通过比对序列，本领域技术人员能鉴定对应残基，例如用保守和相同的氨基酸残基作为指导。一般，为鉴定对应位置，比对氨基酸序列，从而获得最高等级匹配(参见例如：《计算分子生物学》(computationalmolecularbiology),lesk,a.m.编,纽约牛津大学出版社(oxforduniversitypress),1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(biocomputing:informaticsandgenomeprojects),smith,d.w.编,纽约学术出版社(academicpress),1993；《序列数据的计算机分析，第i部分》(computeranalysisofsequencedata,parti),griffin,a.m.,和griffin,h.g.编,新泽西州胡马纳出版社(humanapress),1994；《分子生物学的序列分析》(sequenceanalysisinmolecularbiology),vonheinje,g.,学术出版社,1987；和《序列分析引物》(sequenceanalysisprimer),gribskov,m.和devereux,j.编,纽约mstockton出版社(mstocktonpress),1991；和carillo等.(1988)siamjappliedmath48:1073)。或者，技术人员能通过胰凝乳蛋白酶编号给残基编号，从而鉴定对应残基。对于密切相关的序列，不需要计算机算法；比对可目测完成。[0243]如本文所用，“全局比对”是将2种序列从开始到结束比对的比对，各序列中的各字母仅一次对准。产生对准，无论序列之间是否有相似性或相同性。例如，基于“全局比对”的50％序列相同性意味着，在各100个核苷酸长度的2种对比序列全序列的比对中，50％残基相同。应理解，甚至当对准序列长度不同时，全局比对还能用于确定序列相同性。序列末端差异考虑用于确定序列相同性，除非选择“末端缺口没有罚分”。一般，全局比对用于在其大部分序列中共有显著相似性的序列。用于进行全局比对的示范性算法包括needleman‑wunsch蒜贩(needleman等.(1970)j.mol.biol.48:443)。进行全局比对的示范性程序公开可得且包括美国国家生物技术信息中心(ncbi)网址(ncbi.nlm.nih.gov/)可得的全局序列比对工具和deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可得的程序。[0244]如本文所用，“局部比对”是比对2条序列的比对，但仅比对有相似性或相同性的这些序列部分。因此，局部比对可确定一种序列的亚区段是否存在于另一序列。如果没有相似性，没有比对返回。局部比对算法包括blast和smith‑waterman算法(adv.appl.math.2:482(1981))。例如，基于“局部比对”的50％序列相同性指，在任意长度的2条所对比的序列全序列的比对中，有100个核苷酸长度相似性或相同性的区域具有在相似或相同区域中相同的50％残基。[0245]出于本文目的，序列相同性能通过标准比对程序确定，使用各供应商确立的默认缺口罚分。gap程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(包含1的值用于相同性和0用于非相同性)和gribskov等.(1986)nucl.acidsres.14:6745的加权比较矩阵，如schwartzanddayhoff编,《蛋白质序列与结构图谱》(atlasofproteinsequenceandstructure),nationalbiomedicalresearchfoundation,第353‑358页(1979)所述；(2)各缺口的罚分3.0和各缺口各符号的额外罚分0.10；和(3)末端缺口没有罚分。无论任意2种核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”的核苷酸序列或者任意2种多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”的氨基酸序列，或列举相同性百分比的其他类似变化，能用基于局部或全局比对的已知计算机算法确定(参见例如wikipedia.org/wiki/sequence_alignment_software,提供几十种已知和公开可得比对数据库及程序的链接)。一般，出于本发明目的，序列相同性用基于全局比对的计算机算法确定，如needleman‑wunsch全局序列比对工具，可获自ncbi/blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？cmd＝web&page_type＝blasthome)；lalign(williampearson实施huang和milleralgorithm(adv.appl.math.(1991)12:337‑357))；和来自xiaoquihuang的程序，可获自deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html。一般，当比较本文的核苷酸序列时，使用末端缺口罚分的比对。当对比的序列基本长度相同时，还能使用局部比对。[0246]如本文所用，术语“相同性”代表测试与参考多肽或多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性示例中，“至少90％相同”指相对于参考多肽或多核苷酸，90％‑100％的相同性百分比。90％或更高的相同性水平指示，假定就示范目的而言，比较100个氨基酸或核苷酸的测试和参考多肽或多核苷酸长度，测试多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中的10)的氨基酸或核苷酸不同于参考多肽。类似比较能在测试与参考多核苷酸之间进行。这种差异能表示为完整氨基酸序列长度上随机分布的点突变，或其能在不同长度的一个或多个位置聚集，多至最大可允许程度，如10/100氨基酸差异(约90％相同性)。差异也可能归因于氨基酸残基缺失或截短。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。根据所对比序列的长度，在高于约85‑90％同源性或相同性的水平，结果能独立于程序和缺口参数组；这种高水平相同性易评价，通常不依赖于软件。[0247]如本文所用，二硫键(也称为s‑s键或二硫桥)是共价单键，衍生自巯基偶联。蛋白中的二硫键在半胱氨酸残基的巯基之间形成，并且稳定多肽结构域之间的相互作用。[0248]如本文所用，“偶联”或“缀合”指经共价或非共价相互作用附着。本文提供的缀合物包含经修饰的u‑pa多肽蛋白酶结构域(称为“spd”，参见例如图4)，所有或部分剩余u‑pa多肽直接连接或经接头连接另一部分，如赋予某一特性的多肽，例如血清半衰期增加(人血清白蛋白hsa)或促进表达或纯化(即sumo,his‑sumo,tsg‑6)或使蛋白靶向受体如结合受体的抗体。多肽能直接连接或经多肽接头连接，一般较短，约4‑20个氨基酸，如ser和gly残基的组合。包含多肽的缀合物一般是融合蛋白。缀合物还包括经修饰的u‑pa多肽，其中氨基酸残基连接部分如peg部分、糖基化部分和其他这类部分。[0249]如本文所用，“引物”指核酸分子，其能在合适条件(例如存在4种不同的三磷酸核苷和聚合剂如dna聚合酶、rna聚合酶或逆转录酶)、合适缓冲液和适当温度下，用作模板导向dna合成的起始点。技术人员应理解某些核酸分子能用作“探针”和“引物”。然而，引物具有3’羟基用于延伸。引物能用于多种方法，包括例如聚合酶链式反应(pcr)、逆转录酶(rt)‑pcr、rnapcr、lcr、多重pcr、锅柄pcr、捕获pcr、表达pcr、3'和5'race、原位pcr、连接介导的pcr和其他扩增操作。[0250]如本文所用，“引物”指含有2种或更多脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，通常大于3种，从其可开始合成引物延伸产物。有益于合成的实验条件包括存在三磷酸核苷和用于聚合及延伸的药剂，如dna聚合酶、合适缓冲液、温度和ph。[0251]如本文所用，“引物对”指包括5'(上游)引物和3'(下游)引物的引物组，前者与待扩增(如通过pcr)序列5'末端杂交，后者与待扩增序列3'末端的互补序列杂交。[0252]如本文所用，“特异性杂交”指核酸分子(如寡核苷酸)通过互补碱基配对与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别相关的参数还包括退火和洗涤温度、缓冲液组成及盐浓度。用于高度严格移除非特异结合核酸分子的示范性洗涤条件是0.1xsspe,0.1％sds,65℃,中等严谨度是0.2xsspe,0.1％sds,50℃。本领域已知等同的严严格条件。技术人员可以容易地调整这些参数以实现核酸分子与适合特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。[0253]如本文所用，基本相同对产品意味着足够充分相似，从而感兴趣特性足够不变，使得基本相同的产品能用于取代该产品。[0254]如本文所用，还应理解术语“基本相同”或“相似”随着上下文变化，如相关领域技术人员所理解。[0255]如本文所用，多核苷酸或核酸分子的野生型形式是基因编码的形式或基因编码的编码序列所编码的形式。通常，野生型基因或其编码的分子不包含改变功能或结构的突变或其他修饰。术语野生型还涵盖物种之间发生等位基因变异的形式。如本文所用，多肽或核酸分子的主要形式指一种分子形式，其是基因所生成的主要形式。例如，不同细胞或组织类型能生成不同形式的多肽，如通过可变剪接和/或可变蛋白加工。在各细胞或组织类型中，不同多肽可以是“主要形式”。[0256]如本文所用，等位基因变体或等位基因变异指占据相同染色体基因座的任意2种或更多替代基因形式。等位基因变异通过突变自然产生，其能导致群内表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码多肽没有变化)或能编码氨基酸序列改变的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于指示基因的等位基因变体所编码蛋白。通常，基因参考形式编码来自物种群或单一参考成员的野生型和/或主要形式的多肽。一般，等位基因变体包括物种之间的变异，与来自同一物种的野生型和/或主要形式有至少80％,90％或更高的氨基酸相同性；相同性程度取决于基因和比较是种间还是种内。一般，种内等位基因变体与野生型和/或主要形式多肽有至少或至少约96％、97％、98％、99％或更高相同性。[0257]如本文所用，“等位基因”在本文中与“等位基因变体”可互换使用，指基因或其部分的替代形式。等位基因占据同源染色体的相同基因座或位置。当受试者有某一基因的2个相同等位基因时，该受试者被称为所述基因或等位基因的纯合子。当受试者有某一基因的2个不同等位基因时，该受试者被称为所述基因的杂合子。特定基因的等位基因可在单一核苷酸或数个核苷酸中彼此不同，且能包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式。[0258]如本文所用，物种变体指不同物种之间的多肽变体，包括不同哺乳动物物种，如小鼠和人。一般，物种变体具有约或70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性。物种之间的对应残基能如下确定：比较和比对序列以最大化匹配核苷酸或残基数目，例如从而序列之间的相同性等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％或等于或大于99％。随后，感兴趣的位置以参考核酸分子中赋予的数字给出。比对能手动或目测实现，尤其是当序列相同性大于80％时。[0259]如本文所用，剪接变体指通过基因组dna初级转录物的差异性加工所生成的变体，其导致多于一种类型的mrna。[0260]如本文所用，修饰涉及多肽氨基酸一级序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和取代。这与多肽自身修饰相反，后者包括翻译后修饰如糖基化、法尼基化、聚乙二醇化，和融合如与其他多肽融合以改变性质，例如血清半衰期，如通过白蛋白化，融合白蛋白例如人血清白蛋白，以及多肽的其他这类修饰。因此，提及氨基酸序列修饰是指插入、缺失、置换/取代，和其组合。多肽修饰指加入多肽的修饰，所述修饰不改变其序列。[0261]出于本文目的，氨基酸取代、缺失和/或插入能在任何u‑pa多肽或其催化活性片段中完成，只要所得蛋白表现出蛋白酶活性或其他活性(或若需要，可进行这些变化以消除活性)。修饰能通过形成保守氨基酸取代以及非保守氨基酸取代来完成。例如，可实现需要地或有额地利改变蛋白性质的氨基酸取代。在一个实施方案中，可完成防止多肽降解的突变。许多蛋白酶在碱性残基如r和k之后切割；为排除这类切割，碱性残基用非碱性残基取代。蛋白酶与抑制剂相互作用可被阻断，而同时保留催化活性，这是通过在抑制剂与蛋白酶相互作用位点实现非保守变化。其他活性也能改变。例如，可改变受体结合，而不改变催化活性。[0262]预期的氨基酸取代包括不消除蛋白裂解活性的保守性取代，如表3所示那些。如本文所述，考虑改变蛋白性质的取代，如移除切割位点和其他这类位点；这种取代一般是非保守性的，但本领域技术人员可以容易地实现。[0263]如本文所用，本领域技术人员已知氨基酸的合适保守性取代且一般能完成，而不改变所得分子的生物活性。本领域技术人员认识到，多肽非必需区中的单一氨基酸取代通常不显著改变生物活性(参见例如watson等.《基因分子生物学》(molecularbiologyofthegene),第4版,1987,本杰明‑卡明斯公司(thebenjamin/cummingspub.co.),p.224)。这类取代能根据下表3所示的那些完成：[0264][0265][0266]也允许其他取代，并能凭经验或根据已知保守性取代确定。[0267]如本文所用，术语启动子指基因的一部分，其所含的dna序列用于结合rna聚合酶和起始转录。启动子序列通常但不总是发现于基因的5’非编码区。[0268]如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白或其生物活性部分基本没有来自从中获取蛋白的组织细胞的细胞材料或其他污染蛋白，或当化学合成时，基本没有化学前体或其他化学物。如果制品显示没有易检测杂质，其能确定为基本游离，如通过本领域技术人员用于评估这类纯度的标准分析方法所测定，例如薄层层析(tlc)、凝胶电泳和高效液相色谱(hplc)，或者确定为足够纯，从而进一步纯化不会明显改变物质的物理和化学性质，如酶和生物活性。本领域技术人员已知纯化化合物的方法，以生成基本化学纯的化合物。然而，基本化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。这些示例中，进一步纯化可能增加化合物特定活性。[0269]术语“基本没有细胞材料”包括蛋白制品，其中蛋白与细胞的细胞组分分离，蛋白从所述细胞中分离或重组生成。在一个实施方案中，术语“基本没有细胞材料”包括蛋白酶蛋白制品，其具有小于约30％(干重)的非蛋白酶蛋白(本文也称为污染蛋白)，一般小于约20％的非蛋白酶蛋白或10％的非蛋白酶蛋白或小于约5％的非蛋白酶蛋白。当蛋白酶蛋白或其活性部分重组生成时，其也基本没有培养基，即培养基呈现小于约或等于20％,10％或5％的蛋白酶蛋白制品体积。[0270]如本文所用，术语“基本没有化学前体或其他化学物”包括蛋白酶蛋白制品，其中蛋白与参与蛋白合成的化学前体或其他化学物分离。该术语包括蛋白酶蛋白制品，其小于约30％(干重)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非蛋白酶化学物或组分。[0271]如本文所用，用重组dna方法通过重组方式生成，是指使用熟知的分子生物学方法以表达克隆dna所编码蛋白。[0272]如本文所用，“表达”指通过多核苷酸转录和翻译来生成多肽的过程。多肽表达水平能用本领域已知任何方式评价，包括例如测定生成自宿主细胞的多肽量的方法。这类方法可包括但不限于定量细胞裂解物中的多肽，通过elisa，凝胶电泳后考马斯亮蓝染色，lowry蛋白测定和bradford蛋白测定。[0273]如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、维持、复制和/或扩增载体的细胞。宿主细胞还能用于表达载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体所含核酸得到复制，从而扩增核酸。[0274]如本文所用，“载体”或“质粒”是可复制核酸，当载体转化入合适宿主细胞时，从该核酸能表达一种或多种异源蛋白。提及载体，包括用于将异源核酸引入细胞以表达或复制其的独立元件。提及载体，也包括可引入多肽编码核酸或其片段的那些载体，一般是通过限制性酶切消化和连接。提及载体，还包括含有蛋白酶编码核酸如经修饰u‑pa的那些载体。载体用于将多肽编码核酸引入宿主细胞以扩增核酸或表达/展示核酸编码的多肽。载体通常维持游离型，但能设计成实现基因或其部分整合入基因组染色体。还考虑作为人工染色体的载体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。本领域技术人员熟知这些载剂的选择和使用。载体也包括“病毒载体”或“病毒性载体”。病毒载体是工程化的病毒，其可操作连接外源基因以转移(作为载剂或穿梭子)外源基因到细胞内。[0275]如本文所用，“表达载体”包括能够表达dna的载体，所述dna可操作连接能够实现这类dna片段表达的调节序列，如启动子区。这种额外区段可包括启动子和终止序列，任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体一般衍生自质粒或病毒dna，或能包含这两者的元件。因此，表达载体指重组dna或rna构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其在引入合适宿主细胞后，引起克隆dna表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，且包括真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及维持游离型的那些或整合入宿主细胞基因组的那些。[0276]如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒性载体”。病毒载体是工程化的病毒，其可操作连接外源基因以转移(作为载剂或穿梭子)外源基因到细胞内。[0277]如本文所用，腺病毒指一组含dna的病毒(其导致人结膜炎和上呼吸道感染)的任一种。如本文所用，裸dna指无组蛋白的dna，其能用于疫苗和基因治疗。裸dna是遗传物质，在称为转化的基因转移期间从一个细胞转移到另一细胞。在转化中，纯化或裸dna由受体细胞摄取，这会给予受体细胞新的特征或表型。[0278]如本文所用，涉及核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作连接”，指核酸区域彼此功能相关。例如，编码前导肽的核酸可操作连接编码多肽的核酸，从而核酸能转录和翻译以表达功能性融合蛋白，其中前导肽实现融合多肽的分泌。一些示例中，编码第一多肽(如前导肽)的核酸可操作连接编码第二多肽的核酸且核酸转录为单一mrna转录物，但mrna转录物的翻译能产生2种表达多肽之一。例如，amber终止密码子能位于编码第一多肽的核酸与编码第二多肽的核酸之间，从而当引入部分amber抑制细胞时，所得单一mrna转录物能翻译生成含第一和第二多肽的融合蛋白，或能翻译生成仅第一多肽。另一示例中，启动子可操作连接编码多肽的核酸，从而启动子调节或介导核酸转录。[0279]如本文所用，“一级序列”指多肽的氨基酸残基序列或核酸分子的核苷酸序列。[0280]如本文所用，蛋白结合序列指能够与其他蛋白或肽序列特异结合的蛋白或肽序列，一般结合一组蛋白或肽序列或者特定蛋白或肽序列。[0281]如本文所用，“标签”或“表位标签”指氨基酸序列，通常加入多肽，如本文提供的u‑pa的n或c末端。纳入融合多肽的标签可促进多肽纯化和/或检测。通常，标签或标签多肽指某一多肽，其具有足够残基以提供抗体识别的表位或能用于检测或纯化，但仍短到足以使其不干扰所连接多肽活性。标签多肽通常足够独特，从而特异性结合其的抗体不与其所连接多肽的表位显著交叉反应。表位带标签的蛋白能进行亲和性纯化，使用针对标签的高特异抗体。[0282]合适的标签多肽一般具有至少5或6个氨基酸残基，通常在约8‑50个氨基酸残基之间，一般9‑30个残基之间。标签能连接一个或多个蛋白且允许检测蛋白或其从样品或混合物中的回收。这种标签熟知，并可以容易地合成和设计。示范性标签多肽包括用于亲和性纯化的那些，包括小泛素样修饰物(sumo)标签、flag标签、his标签、流感病毒血凝素(ha)标签多肽及其抗体12ca5,(field等.(1988)mol.cell.biol.8:2159‑2165)；c‑myc标签及其8f9、3c7、6e10、g4、b7及9e10抗体(参见例如evan等.(1985)molecularandcellularbiology5:3610‑3616)；和单纯疱疹病毒糖蛋白d(gd)标签及其抗体(paborsky等.(1990)proteinengineering3:547‑553)。用于检测表位标签抗体的抗体通常在本文称为二抗。[0283]如本文所用，金属结合序列指能够特异结合金属离子的蛋白或肽序列，一般是一组金属离子或特定金属离子。[0284]如本文所用，术语评价意在包括定量和定性测定，就意义上而言获得绝对值用于样品中所存在蛋白酶或其结构域的活性，以及获得指示活性水平的指数、比例、百分比、视觉的或其他值。评价可以是直接或间接的，实际检测的化学物种当然不需要本身是蛋白裂解产物，但可以例如是其衍生物或一些进一步的物质。例如，检测补体蛋白蛋白裂解产物可通过如sds‑page和考马斯亮蓝蛋白染色。[0285]如本文所用，生物活性指化合物体内活性或者体内施用化合物、组合物或其他混合物后产生的生理反应。因此，生物活性涵盖这类化合物、组合物和混合物的治疗效果及药物活性。生物活性能在设计成测试或使用这些活性的体外系统中观察。因而，出于本文目的，蛋白酶的生物活性是催化多肽的其催化活性。[0286]如本文所用，等同指2条核酸序列时，意味着所讨论的2条种序列编码相同氨基酸序列或等同蛋白。当等同用于指2种蛋白或肽时，意味着2种蛋白或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅有不显著改变蛋白或肽活性或功能的氨基酸取代(例如但不限于保守性变化如上表3所示那些)。当等同指性质时，性质不需要以相同程度存在(如2种肽能显示同一酶活性类型的不同速度)，但活性通常基本相同。互补指2条核苷酸序列时，意味着2条核苷酸序列能够杂交，通常在相对的核苷酸之间小于25％、15％或5％错配。如果有必要，指定互补性百分比。通常，选择2种分子，从而他们会在高度严格条件下杂交。[0287]如本文所用，调节蛋白活性或者基因或核酸表达的药剂可降低或增加或另外改变蛋白活性，或者以某种方式上调或下调或另外改变细胞中的核酸表达。[0288]如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”蛋白酶指某一多肽，其可操作连接另一不同多肽。本文提供的嵌合或融合蛋白可包括一个或多个蛋白酶或其部分如其单链蛋白酶结构域，和用于任意一种或多种转录/翻译控制信号的一个或多个其他多肽，信号序列，定位标签，纯化标签，部分免疫球蛋白g结构域和/或靶向剂。这些嵌合或融合蛋白包括以重组方式作为融合蛋白生成的那些，以化学方式生成的那些如通过化学偶联例如偶联巯基，以及以任何其他方法生成的那些，其中至少一种蛋白酶或其部分直接或间接经接头连接另一多肽。[0289]如本文所用，可操作连接涉及融合蛋白时，指框内互相融合的蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽。非蛋白酶多肽能融合蛋白酶多肽的n或c末端。[0290]如本文所用，靶向剂是任何部分如蛋白或其有效部分，其提供缀合物与细胞表面受体的特异结合，在一些示例中，能内化结合的缀合物或其部分。靶向剂还可促进或有利于例如亲和性分离或纯化缀合物；缀合物附着表面；或检测缀合物或含缀合物的复合物。[0291]如本文所用，“接头”指连接2种多肽(或编码这类多肽的核酸)的氨基酸短序列。“肽接头”指连接2种多肽序列的氨基酸短序列。多肽接头示例是连接合成抗体片段中2条抗体链的接头，如scfv片段。熟知接头且任何已知的接头能用于所提供方法。多肽接头示例是(gly‑ser)n氨基酸序列，一些glu或lys残基分散各处以增加溶解度。本文描述其他示范性接头；任意这些和其他已知接头能与所提供组合物和方法一起使用。[0292]如本文所用，分子衍生物或类似物指衍生自分子的部分或修饰形式的分子。[0293]如本文所用，“疾病或失调”指生物体中的病理状态，导致其的原因或条件包括但不限于感染、获得性病症、基因状况、与环境暴露和人类行为相关的病症以及表征为可鉴定症状的病症。疾病或失调包括临床诊断疾病以及未诊断为临床疾病的生物体正常状态破坏。本文感兴趣的疾病和失调是涉及补体激活的那些，包括由补体激活介导的那些和补体激活在病因学或病理学中发挥作用的那些。本文感兴趣的疾病和失调包括表征为补体激活的那些(如年龄相关的黄斑变性和移植肾功能延迟)。[0294]如本文所用，当视网膜的较小中央部分(称为黄斑)恶化时，发生黄斑变性。有2类amd：干(萎缩性)和湿(新生血管或渗出性)。大部分amd作为干类型开始且在10‑20％个体中，其发展为湿类型。年龄相关的黄斑变性总是双侧的(即在双眼中都发生)，但不必定在双眼中以同样速度发展。[0295]如本文所用，年龄相关的黄斑变性(amd)是导致老年人视觉损伤和失明的炎症性疾病。补体系统的蛋白对该疾病发展重要。amd中的局部和全身炎症通过补体系统替代途径的失调作用来介导。[0296]如本文所用，移植肾功能延迟(dgf)是急性肾损伤(aki)的表现，具有移植过程独有的特性。其在移植手术后出现。移植肾功能延迟(dgf)是常见并发症，通常定义为移植后第一周期间对透析的需求。补体第三成分c3(c3)的内部肾合成通过激发t细胞介导的反应而有助于急性排斥反应。例如，在脑死亡供体中，局部肾c3水平在获取时较高且与移植后14天的肾功能逆相关。[0297]如本文所用，补体介导的疾病或失调是任意失调，其中任何一种或多种补体蛋白在疾病中发挥作用，这归因于有或没有补体蛋白或补体相关蛋白或者激活或灭活补体或补体相关蛋白。在一些实施方案中，补体介导的失调归因于补体蛋白的缺陷。在本文所述的其他实施方案中，补体介导的失调归因于激活或过度激活补体蛋白。补体介导的失调还归因于存在任何一种或多种补体蛋白和/或连续激活补体途径。[0298]如本文所用，“黄斑变性相关失调”指其中视网膜黄斑退化或变得功能失调(如因为黄斑细胞生长减慢、黄斑细胞(如rpe细胞)死亡或重排增加、丧失正常生物学功能或这些事件的组合)和一些病症中的任一种。黄斑变性导致细胞结构和/或正常黄斑胞外基质的完整性丧失和/或黄斑细胞功能丧失。黄斑变性相关疾病示例包括年龄相关的黄斑变性(amd)、地图状萎缩(ga)、北卡罗莱纳州黄斑营养不良症、索斯比氏眼底萎缩、斯特格氏病、图形样营养不良、best病、显性脉络膜小疣和malattialeventinese(放射状脉络膜小疣(radialdrusen))。黄斑变性相关疾病还涵盖在黄斑功能失调/变性之前或之后发生的黄斑外变化。因此，术语“黄斑变性相关失调”还广泛包括改变或破坏黄斑完整性或功能的任何病症(如破坏rpe或布鲁赫膜)。例如，该术语涵盖视网膜脱离、脉络膜视网膜变性、视网膜变性、视网膜光感受器细胞、rpe变性、粘多糖贮积病、视杆视锥(rod‑cone)营养不良、视锥视杆(cone‑rod)营养不良和视锥变性。[0299]本文所述黄斑变性相关失调包括黄斑变性，例如amd黄斑变性。黄斑变性相关失调包括通过抗vegf治疗如抗vegf抗体或激光治疗或植入式望远镜(implantabletelescope)治疗的失调。[0300]如本文所用，“治疗”有疾病或病症的受试者指受试者的症状得到部分或完全缓解，或在治疗后保持稳定。因此，治疗涵盖预防、疗法和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止疾病症状恶化或发展。治疗还涵盖本文所提供经修饰的u‑pa多肽和组合物的任何药物用途。[0301]如本文所用，“防止”或“预防”指方法，其中发展疾病或病症的风险或可能性降低。[0302]如本文所用，“治疗剂”、“治疗方案”、“辐射防护剂”或“化疗剂”指本领域技术人员已知的常规药物和药物疗法，包括疫苗。放疗剂为本领域熟知。[0303]如本文所用，“治疗”指任何方式，其中病症、失调或疾病的症状得到缓解或另外有益改变。治疗还涵盖本文组合物的任何药物用途。[0304]如本文所用，特定疾病或失调通过治疗如施用药物组合物或其他治疗剂“缓解症状”，指任何症状减少，无论永久或暂时，持续或瞬时，这能归因于施用组合物或治疗剂或者与之相关。[0305]如本文所用，“药学有效剂”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂，以及常规治疗剂，包括小分子药物和治疗蛋白。[0306]如本文所用，化合物或组合物用于治疗特定疾病的“有效量”是足以缓解或以某种方式减少疾病相关症状的量。这种量能作为单一剂量施用或根据方案施用，从而其是有效的。所述量能治愈疾病，但通常施用以缓解疾病症状。一般，需要重复施用以实现所需症状缓解。[0307]如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”指药剂、化合物、材料或组合物的量，其所含化合物在施用给受试者后至少足以生成治疗效果。因此，这是防止、治愈、缓解、抑制或部分抑制疾病或失调症状所需的量。[0308]如本文所用，“治疗效果”指治疗受试者引起的效果，其改变通常改善或缓解疾病或病症症状或者治愈疾病或病症。[0309]如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指药剂、化合物、材料或组合物的量，其所含化合物在施用于受试者时产生预期预防效果，如防止疾病或症状或延迟其发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性，或降低病毒感染的发生率。完全的预防效果通过施用一次剂量不必定发生，且仅在施用系列剂量后发生。因此，预防有效量能在一次或多次施用中施用。[0310]如本文所用，“施用非补体蛋白酶”如经修饰u‑pa蛋白酶，指非补体蛋白酶接触其底物的任何方法。施用可体内或离体或体外实现。例如，对于离体施用，从受试者中移出体液如血液并在体外接触经修饰非补体蛋白酶如经修饰u‑pa蛋白酶。对于体内施用，经修饰非补体蛋白酶如经修饰u‑pa蛋白酶能引入体内，如局部、外用、全身和/或其他引入途径。体外施用涵盖方法如细胞培养方法。[0311]如本文所用，“单位剂型”指适合人和动物对象且单独包装的物理离散单元，如本领域已知。[0312]如本文所用，待治疗的“患者”或“受试者”包括人以及人和非人动物。哺乳动物包括：灵长类动物，如人、黑猩猩、大猩猩和猴；家养动物，如狗、马、猫、猪、山羊和牛；和啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠。[0313]如本文所用，“组合”指2个或更多项目之间的任意关联。关联可以是空间的或指出于共同目的使用2个或更多项目。组合可以是2个或更多分开的项目，如2种组合物或2种集合，其混合物如2个或更多项目的单一混合物，或其任意变化。组合元件一般是功能关联或相关。[0314]如本文所用，“组合物”指2种或更多产物或化合物(如药剂、调节剂、调控剂等)的任意混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性或非水性制剂或其任何组合。[0315]如本文所用，稳定剂指为保护抗体或缀合物而加入制剂的化合物，如在保存或使用本文制剂的条件下(例如温度)。因此，纳入的是来自组合物的其他组分的防止蛋白降解的药剂。这类药剂示例是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲液、表面活性剂、抑制剂或底物以及本文所述其他药剂。[0316]如本文所用，“流体(fluid)”指能流动的任何组合物。因而，流体涵盖采用半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗液、乳膏形式的组合物以及其他这类组合物。[0317]如本文所用，“制品”是制备并出售的产品。如本技术通篇所用，该术语意在涵盖治疗剂，其中经修饰的u‑pa多肽或核酸分子包含在相同或不同包装物品中。[0318]如本文所用，“试剂盒”指包装组合，任选地包括使用组合的元件实施方法的试剂和/或其他产品和/或组分，。例如，提供的试剂盒包含经修饰蛋白酶多肽如本文所提供经修饰u‑pa蛋白酶或本文所提供核酸分子和出于某一目的的另一项目，包括但不限于施用、诊断和评价生物活性或特性。试剂盒任选地包括使用说明书。[0319]如本文所用，“细胞提取物”指制备自裂解或受破坏细胞的制品或部分。[0320]如本文所用，“动物”包括任何动物，例如但不限于：灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物如小鼠和大鼠；禽类如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿、绵羊；猪类如猪和其他动物。非人动物排除人作为考虑的动物。本文所提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大部分蛋白酶具有动物来源，包括哺乳动物来源。[0321]如本文所用，“单一剂量”制剂指含直接施用的单剂治疗剂的制剂。单一剂量制剂一般不包含任何防腐剂。[0322]如本文所用，多剂量指含有多剂治疗剂且能直接施用的制剂，以提供数个单剂治疗剂。剂量能在数分钟、小时、周、天或月的进程中施用。多剂制剂可允许剂量调整、剂量合并和/或剂量拆分。由于多剂制剂随着时间使用，其一般包含一种或多种防腐剂以防止微生物生长。[0323]如本文所用，“对照”或“标准品”指与测试样品基本相同的样品，除了其不用测试参数处理，或如果其是血浆样品，可来自不受感兴趣病症影响的健康志愿者。对照还可以是内部对照。例如，对照可以是具有已知性质或活性的样品，如病毒。[0324]如本文所用，单数形式“一种(a、an)”和“所述”包括复数指示物，除非上下文明确另有规定。因此，例如，提及“一种”药剂，包括一种或多种药剂。[0325]如本文所用，术语“或”用于指“和/或”，除非明确表示指仅二选一或如果替代方案是相互排斥的。[0326]如本文所用，范围和量能表示为“约”某一特定值或范围。约也包括精确量。因此，“约5个碱基”意味着“约5个碱基”以及“5个碱基”。[0327]如本文所用，“任选的”或“任选地”指随后所述事件或情况发生或不发生，且该描述包括所述事件或情况发生的示例以及不发生的示例。例如，任选地取代基团意味着基团未被取代或被取代。[0328]如本文所用，除非另有说明，用于任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写是依据其一般用法、公认缩略或iupac‑iub的生物化学命名委员会(参见(1972)biochem.11:1726)。[0329]为了阐明公开内容且不意在限制，详细描述被分成之后的分章节。[0330]b.u‑pa结构和功能[0331]尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa，也称为尿激酶或尿纤溶酶原激活物)是丝氨酸蛋白酶，其催化纤溶酶原水解成纤溶酶。u‑pa在尿、精液和许多癌组织中发现。其参与和纤溶酶原转化成纤溶酶相关的多种生物过程，纤溶酶本身是丝氨酸蛋白酶。纤溶酶在多个正常和病理过程中起作用，包括例如细胞迁移和组织破坏，这是通过其切割多种分子，包括纤维蛋白,纤连蛋白、蛋白聚糖和层粘连蛋白。u‑pa参与伤口愈合、炎症细胞迁移、新血管形成和肿瘤细胞浸润期间的组织重建。u‑pa还切割和激活其他物质，包括但不限于肝细胞生长因子/扩散因子(hgf/sf)、膜型基质金属蛋白酶1的潜在形式(mt‑sp1)、血小板衍生生长因子等。[0332]本文提供经修饰尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽，所述多肽修饰成切割c3中的抑制性序列，从而抑制c3活化成c3a和c3b片段。本文所提供经修饰的u‑pa多肽的活性/特异性使得其切割c3，活性和/或特异性或kcat/km相较未修饰的u‑pa多肽更高，尤其是seqidno:1‑6任一者。就天然生理底物即未修饰的u‑pa多肽的纤溶酶原而言，经修饰的u‑pa多肽可能具有减少的活性或特异性或两者。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽可抑制补体途径的补体激活。相较其他u‑pa底物如纤溶酶原，经修饰的u‑pa多肽还显示对切割c3的选择性增加。因而，本文所提供经修饰的u‑pa多肽不显示对生理天然u‑pa底物的不需要切割活性，从而其不显示不需要的副作用。在一些实施方案中，所述经修饰的u‑pa多肽是蛋白酶结构域或单链形式；这些示例中，游离半胱氨酸(通过胰凝乳蛋白酶编号的残基位置122)用丝氨酸取代，以在蛋白制备后减少或消除聚集。在经修饰的u‑pa多肽是全长或通过切割激活的其他形式的实施方案中，122位处的残基(通过胰凝乳蛋白酶编号)一般不用s取代，从而可形成二硫键以生成2链激活的多肽。[0333]1.丝氨酸蛋白酶[0334]丝氨酸蛋白酶(sp)包括分泌酶和隔离在胞质存储细胞器中的酶，具有多种生理作用，包括凝血、伤口愈合、消化、免疫应答和肿瘤浸润及转移。例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶在消化道中起作用；因子10、因子11、凝血酶和纤溶酶参与凝固几伤口愈合；c1r,c1s和c3转化酶在补体激活中发挥作用。[0335]命名为ii型跨膜丝氨酸蛋白酶的细胞表面蛋白类型是作为膜锚蛋白的蛋白酶，带有胞外结构域。作为细胞表面蛋白，其在胞内信号转导和调节细胞表面蛋白裂解事件中发挥作用。其他丝氨酸蛋白酶是膜结合的并以类似方式运行。其他是分泌型。许多丝氨酸蛋白酶在结合细胞表面受体后发挥其活性，并因而在细胞表面。细胞表面蛋白裂解是产生生物活性蛋白的机制，其调节多种细胞功能。[0336]丝氨酸蛋白酶包括分泌型和跨膜丝氨酸蛋白酶，参与包括肿瘤发展和进展的过程。尽管这些蛋白酶的精确作用尚未充分阐明，丝氨酸蛋白酶和其抑制剂参与控制许多胞内和胞外生理过程，包括癌细胞浸润和转移扩散的降解作用，涉及肿瘤发展的肿瘤新血管形成。蛋白酶参与胞外基质(ecm)的降解和重建，有助于组织重建且对癌浸润和转移是必需的。一些蛋白酶的活性和/或表达显示与肿瘤进展及发展相关。[0337]鉴定了超过20个家族(表示为s1‑s27)的丝氨酸蛋白酶，且其在结构相似性和其他功能证据基础上分成6个簇(sa、sb、sc、se、sf和sg)(rawlingsnd等.(1994)meth.enzymol.244:19‑61)。数个丝氨酸蛋白酶的反应机制类似。胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和羧肽酶c簇具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的共同催化三联体：丝氨酸用作亲核体，天冬氨酸用作亲电体且组氨酸用作碱。催化残基的几何定向在家族之间相似，尽管有不同的蛋白折叠。催化残基的线性排列通常反映簇关系。例如，胰凝乳蛋白酶簇(sa)中的催化三联体是有序的hds，但在枯草杆菌蛋白酶簇(sb)中是有序的dhs且羧肽酶簇(sc)中是sdh。[0338]胰凝乳蛋白酶超家族的丝氨酸蛋白酶示例包括组织型纤溶酶原激活物(tpa)、胰蛋白酶、胰酶样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、尿激酶(或尿型纤溶酶原激活物,u‑pa)、顶体素、活化蛋白c、c1酯酶、组织蛋白酶g、糜酶、包括激肽释放酶和凝血酶在内的凝血级联系统蛋白酶以及因子viia、ixa、xa、xia和xiia(barret,a.j.,收录于:《蛋白酶抑制剂》(proteinaseinhibitors),ed.barrett,a.j.,等,elsevier,amsterdam,第3‑22页(1986)；strassburger,w.等,(1983)febslett.,157:219‑223；dayhoff,m.o.,《蛋白质序列与结构图谱》(atlasofproteinsequenceandstructure),卷5,美国生物医学研究基金会(nationalbiomedicalresearchfoundation),马里兰州银泉市.(1972)；和rosenberg,r.d.等.(1986)hosp.prac.,21:131‑137)。[0339]丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶活性取决于形成其活性位点的氨基酸残基组。残基之一通常是丝氨酸；由此其命名为丝氨酸蛋白酶。例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶共有一个相似结构且其活性丝氨酸残基在所有3个酶中处于所有同一位置(ser195)。尽管相似，但其具有不同底物特异性；其在蛋白消化期间切割不同肽键。例如，胰凝乳蛋白酶优选残基上的芳香族侧链，该残基的羰基碳是待切割的肽键部分。胰蛋白酶优选此位置的带正电lys或arg残基。丝氨酸蛋白酶的底物识别性质显著不同：一些高度特异(即蛋白酶参与凝血和免疫补体系统)；一些仅部分特异(即哺乳动物消化蛋白酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)；和其他如枯草杆菌蛋白酶、细菌蛋白酶是完全非特异的。尽管特异性有这些差异，丝氨酸蛋白酶的催化机制相当保守。[0340]靶蛋白通过丝氨酸蛋白酶的切割机制是基于通过丝氨酸的靶肽键亲核攻击。与天冬氨酸或金属相关的半胱氨酸、苏氨酸或水分子也能发挥此作用。在许多情况中，基团的亲核特性通过存在组氨酸而提高，通过天冬氨酸保持“质子受体状态”。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的匹配的侧链建立了大部分丝氨酸蛋白酶常见的催化三联体。例如，胰凝乳蛋白酶的活性位点残基以及与胰凝乳蛋白酶相同家族成员的丝氨酸蛋白酶例如mtsp‑1，是asp102、his57和ser195。[0341]胰凝乳蛋白酶超家族中所有丝氨酸蛋白酶的催化结构域具有序列同源性和结构同源性。序列同源性包括以下保守性：1)特征性活性位点残基(如胰蛋白酶情况中的ser195,his57和asp102)；2)氧阴离子穴(如胰蛋白酶情况中的gly193,asp194)；3)形成结构中二硫键的半胱氨酸残基(hartley,b.s.,(1974)symp.soc.gen.microbiol.,24:152‑182)。结构同源性包括1)特征为2个希腊钥匙结构的共同折叠(richardson,j.(1981)adv.prot.chem.,34:167‑339)；2)催化残基的共同配置(deposition)；和3)分子核心内结构的详细保护(stroud,r.m.(1974)sci.am.,231:24‑88)。[0342]在丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家族中，底物与酶之间的主干相互作用完全保守，但侧链相互作用变化显著。含有活性位点s1‑s4口袋的氨基酸特性确定了该特定口袋的底物特异性。一个丝氨酸蛋白酶的氨基酸嫁接到同一折叠的另一丝氨酸蛋白酶上，可修饰彼此的特异性。通常，含有s1‑s4口袋的蛋白酶氨基酸在底物4‑5埃内具有侧链。这些氨基酸具有蛋白酶底物的相互作用一般称为“第一壳体”相互作用，因为它们直接接触底物。然而，有最终放置第一壳体氨基酸的“第二壳体”和“第三壳体”相互作用。第一壳体和第二壳体底物结合效果主要由β‑桶状结构域决定。由于这些环不是蛋白核心元件，维持折叠的完整性，同时有新底物特异性的环变体能在进化过程中选择，以在分子水平完成必要的代谢或调节。通常就丝氨酸蛋白酶而言，下列一级序列的氨基酸是特异性的决定因素：195、102、57(催化三联体)；189、190、191、192和226(s1)；57，在58与64之间的环，以及99(s2)；192、217、218(s3)；cys168与cys180、215、以及97‑100(s4)之间的环；和41及151(s2’)，基于胰凝乳蛋白酶编号，其中s1位置的氨基酸影响p1特异性，s2位置的氨基酸影响p2特异性，s3位置的氨基酸影响p3特异性，s4位置的氨基酸影响p4特异性。丝氨酸蛋白酶中的189位是埋于口袋底部、确定s1特异性的残基。u‑pa的结构决定因素列于表4，各指定蛋白酶的蛋白酶结构域与胰凝乳蛋白酶的蛋白酶结构域比对。cys168‑cys182和60环栏标题下面的数字指示氨基酸之间的环以及环中的氨基酸数目。cys191‑cys220栏标题下面的是/否名称指示蛋白酶中是否存在二硫键。这些区域在胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族内可变且本身代表结构决定因素。[0343]2.结构[0344]u‑pacdna克隆自许多哺乳动物物种。示范性u‑pa前体多肽或前尿激酶原多肽包括但不限于人(seqidno:1且由seqidno:7编码)、小鼠(seqidno:52)、大鼠(seqidno:53)、牛(seqidno:54)、猪(seqidno:55)、兔(seqidno:56)、鸡(seqidno:57)、黄狒狒(seqidno:58)、苏门答腊猩猩(seqidno:59)、狗(seqidno:60)、羊(seqidno:61)、狨猴(seqidno:62)、恒河猴(seqidno:63)、北部白颊长臂猿(seqidno:64)和黑猩猩(seqidno:65)u‑pa多肽。mrna转录物通常翻译产生前体蛋白，其在n末端含有20个氨基酸的信号序列。转运到er后，移出信号肽以产生尿激酶原多肽。示范性尿激酶原多肽包括但不限于人(seqidno:3)、小鼠(seqidno:66)、大鼠(seqidno:67)、牛(seqidno:68)、猪(seqidno:69)、兔(seqidno:70)、鸡(seqidno:71)、黄狒狒(seqidno:72)、苏门答腊猩猩(seqidno:73)、狗(seqidno:74)和羊(seqidno:75)u‑pa多肽。例如，人u‑pamrna转录物通常翻译形成431氨基酸前体蛋白(seqidno:1)，其在n末端metargalaleuleualaargleuleuleucysvalleuvalvalseraspserlysgly(seqidno:1的氨基酸残基1‑20)含有20个氨基酸的信号序列。因此，转运到er和去除信号肽后，生成411氨基酸尿激酶原多肽，具有seqidno:3所示氨基酸序列。如下进一步详述，尿激酶原是酶原或前酶，其通过蛋白裂解进一步加工以产生2链成熟的u‑pa多肽。因而，例如，提及成熟u‑pa(seqidno:3)，野生型链激活u‑pa包含第一链(a链)，以及残基1‑158由二硫键连接残基159‑411(b链)，这是经过cys148(c97a胰凝乳蛋白酶编号)与cys279(c122胰凝乳蛋白酶编号)之间的二硫键进行的。由此，在本文所提供经修饰的u‑pa多肽中，当生成蛋白酶结构域时，其包含c122s取代，但当生成采用2链形式的激活形式时，122处的残基(胰凝乳蛋白酶编号)是c，从而其与另一c形成二硫键，一般在激活序列中(参见下面和实施例15的讨论)。[0345]人前体u‑pa具有seqidno:1所示氨基酸序列并由seqidno:7所示的核苷酸序列编码。seqidno:3显示人前u‑pa，也称为成熟u‑pa，缺乏信号序列。存在2种人u‑pa同种型，如通过选择性剪接所生成。人u‑pa的同种型1是上面seqidno:1所述的标准形式。在人u‑pa的同种型2中，seqidno:1的氨基酸1‑29用seqidno:51的氨基酸1‑12取代，所得蛋白含有414个氨基酸(列于seqidno:51)。已知人u‑pa的等位基因变体和其他变体。例如，已知upa变体在seqidno:1所示氨基酸序列中包含氨基酸修饰v15l。另一示例中，已知经修饰的u‑pa多肽在seqidno:1所示的氨基酸序列(对应seqidno:4所示的氨基酸序列)中包含氨基酸修饰c299s(通过胰凝乳蛋白酶编号的c122s)。额外变体包括在seqidno:3所示的成熟u‑pa中含有氨基酸修饰p121l、d130g、c131w、i194m、k211q、g366c和a410v的那些(对应seqidno:1中的氨基酸修饰p141l、d150g、c151w、i214m、k231q、g386c和a430v)。[0346]合成u‑pa多肽并作为单链酶原分子(也称为尿激酶原或单链尿激酶)分泌，其通过多种蛋白酶转化成活性2链u‑pa，包括例如纤溶酶、激肽释放酶、组织蛋白酶b、蛋白裂解酶和神经生长因子‑γ。切割产生双连形式是在人尿激酶原序列的残基158与159(seqidno:3)之间发生(对应seqidno:1中的氨基酸残基178和179)。2条所得链通过cys148与cys279之间的二硫键连接，从而形成2链形式的u‑pa。2链形式的u‑pa也称为高分子量u‑pa(hmw‑u‑pa)。hmw‑u‑pa能进一步加工成低分子量u‑pa(lmw‑u‑pa)，这是通过将a链切割成短链a(a1,seqidno:3的氨基酸136‑157)和氨基末端片段。通过对应cys148和cys279的cys经二硫键连接21‑178和179‑411(seqidno:3)。[0347]尿激酶型纤溶酶原激活物u‑pa是经典的丝氨酸蛋白酶，其包含his‑asp‑ser催化三联体，切割纤溶酶原中的特定arg‑val键以形成纤溶酶。纤溶酶进而可在seqidno:3的lys158‑ile159(通过胰凝乳蛋白酶编号对应于lys15‑ile16)切割u‑pa，形成上述2链形式。人u‑pa的催化三联体包括seqidno:3的氨基酸his204,asp255和ser356(通过胰凝乳蛋白酶编号对应于his57,asp102和ser195)。seqidno:3所示的人u‑pa的残基ser138和ser303是磷酸化的(franco等.(1997)jcellbiol137:779‑791)。人u‑pa包含在seqidno:3的氨基酸残基thr18处的o‑连接糖基化如岩藻糖基化，和seqidno:3的氨基酸残基asn302处的n‑连接糖基化。成熟人u‑pa包含seqidno:3残基c11‑c19、c13‑c31、c33‑c42、c50‑c131、c71‑c113、c102‑c126、c189‑c205、c197‑c268、c293‑c362、c325‑c341和c352‑c380之间的链内二硫键以及seqidno:3残基c148‑c279之间的链间二硫键。[0348]u‑pa成熟形式是411残基蛋白(对应seqidno:1所示的氨基酸序列的氨基酸残基21‑431，所述序列是含有20氨基酸信号肽的前体形式)。u‑pa包含3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域，三环结构域和生长因子结构域。在人u‑pa成熟形式中，氨基酸1‑158代表n末端a链，包括生长因子结构域(氨基酸1‑49)、kringle结构域(氨基酸50‑131)和域间接头区(氨基酸132‑158)。氨基酸159‑411代表c末端丝氨酸蛋白酶结构域或b链。合成u‑pa并作为单链酶原分子分泌，其通过多种蛋白酶转化成活性2链u‑pa，包括例如纤溶酶、激肽释放酶、组织蛋白酶b和神经生长因子‑γ。切割成双连形式是在成熟u‑pa序列残基158与159之间发生(对应seqidno:3中的氨基酸残基178和179)。2条所得链通过二硫键保持在一起，从而形成2链形式的u‑pa。[0349]尿激酶型纤溶酶原激活物包含3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域，kringle结构域和生长因子结构域。在酶原或前酶形式的人u‑pa中，seqidno:3的氨基酸1‑158代表n末端a链(或长链a)，包括表皮生长因子结构域(氨基酸1‑49)、kringle结构域(氨基酸50‑131)和域间接头区(氨基酸132‑158)，且氨基酸159‑411代表催化活性c末端丝氨酸蛋白酶结构域或b链。表皮生长因子结构域负责u‑pa结合细胞表面锚定的u‑pa受体(upar)。在胞外基质中，u‑pa通过结合u‑pa受体而附于细胞膜。lmw‑u‑pa具有裂解活性，但不结合u‑pa受体。丝氨酸蛋白酶结构域包含通过胰凝乳蛋白酶编号的残基37、60、96、110、170和185周围表面暴露的环。激活或切割后，氨基末端插入催化蛋白酶结构域的疏水结合槽，形成疏水相互作用，以及盐桥到asp194的侧面口袋，这在催化生成构象中稳定底物结合口袋和氧阴离子穴。根据胰凝乳蛋白酶编号，asp194参与氢键结合gly142的主链氨基和lys143的主链羰基(blouse等.(2009)jbiolchem284:4647‑4657)。切割后的构象变化涉及激活结构域的4个无序区，包括激活环(残基16‑21)、自溶环(残基142‑152)、氧离子稳定环(残基184‑194)和s1入口框(残基216‑223)，所有编号是根据胰凝乳蛋白酶编号(参见blouse等.(2009)jbiolchem284:4647‑4657；hedstrom(2002)chemrev102:4501‑4524；huber和bode(1978)accchemres11:114‑122；madison等.(1993)science262:419‑421)。[0350]u‑pa的结构决定因素如下表4所示，编号是基于成熟胰凝乳蛋白酶编号。cys168‑cys182和60的环栏标题下面的数字指示2个氨基酸之间的环以及环中的氨基酸数目。cys191‑cys220栏标题下面的“是”名称指示存在二硫键。这些区域在胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族内可变，且本身代表结构决定因素。修饰u‑pa多肽以改变s1‑s4口袋中的任意一个或多个氨基酸，可影响u‑pa多肽对靶底物的特异性或选择性。扩大底物特异性(p1‑p4)揭示了u‑pa对p1arg后的切割有高度特异性，优先p2位的小氨基酸，优先p3位的小极性氨基酸(thr和ser)，不优先p4位(ke等.(1997)j.biol.chem.,272:16603‑16609；harris等.(2000)procnatlacadsciusa,97:7754‑7759)。[0351][0352]3.功能/活性[0353]尿激酶型纤溶酶原激活物是丝氨酸蛋白酶，其催化纤溶酶原水解成纤溶酶。纤溶酶直接作用于胞外基质蛋白降解(andreasen等.(2000)cell.mol.lifesci.57:25‑40)。u‑pa在细胞粘附、迁移和侵袭、组织重建和癌中发挥重要作用(blasi等.(2002)revmolcellbiol3:932；andreasen等.(2000)cell.mol.lifesci.57:25‑40；mondino和blasi(2004)trendsimmunol25:450；ploug(2003)currpharmdes9:1499)。u‑pa的异常表达与类风湿性关节炎、变应性血管炎、着色性干皮病和恶性肿瘤的浸润能力相关。[0354]u‑pa通过结合高亲和性细胞表面受体upar来调节。u‑pa结合upar可增加纤溶酶原激活并提高胞外基质降解和细胞侵袭。upar与u‑pa之间形成的二元复合物与膜相关纤溶酶原相互作用形成高阶激活复合物，其就纤溶酶原激活而言降低km(即对底物大致亲和性的动力学常数)(bass等.(2002)biochem.soc.trans.,30:189‑194)。u‑pa结合upar可保护蛋白酶免受同源抑制剂即pai‑1抑制。这是因为通常存在于血浆的单链u‑pa不易受pai‑1抑制，血浆中的任何活性u‑pa会被pai‑1抑制。受体结合的活性u‑pa就pai‑1抑制而言完全可用，然而，pai‑1不能进入结合的活性分子(bass等.(2002)biochem.soc.trans.,30:189‑194)。由此，u‑pa主要作用于细胞表面且其功能与纤溶酶依赖性细胞外周蛋白裂解的激活相关。[0355]u‑pa还切割肝细胞生长因子/扩散因子(hgf/sf)、膜型基质金属蛋白酶1的潜在形式(mt‑sp1；蛋白裂解酶)、血小板衍生生长因子c(pdgf‑c)、血小板衍生生长因子d(pdgf‑d)、血小板衍生生长因子dd(pdgf‑dd)和其他蛋白(参见例如hurst等.(2012)biochemj441:909‑918；ustach和kim(2005)molcellbiol5:6279‑6288；ehnman等.(2009)oncogene28(4):534‑544)。纤溶酶降解纤维蛋白凝块，切割纤维蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白和血管性血友病因子，蛋白水解补体系统的介质并激活胶原酶。如此，纤溶酶参与血栓溶解或胞外基质降解，连接纤溶酶与血管疾病和癌症。例如，观察到纤溶酶原激活系统的组分在恶性肿瘤中高表达。肝细胞生长因子/扩散因子可调节细胞生长、细胞运动和形态发生，这是通过激活型hgf结合hgf受体c‑met和其刺激有丝分裂发生的能力，细胞运动和基质浸入将其与血管生成、肿瘤发生和组织再生相连接。血小板衍生生长因子可调节细胞生长及分裂，并在血管生成中发挥重要作用，血管生成在失控时，是癌的特征。一旦通过蛋白裂解激活，pdgf结合pdgf受体即酪氨酸激酶，导致磷酸化和涉及癌的一些下游信号通路。由于u‑pa和上述蛋白在血管疾病中的作用，本文所提供u‑pa多肽改变成针对这些蛋白的选择性下降。通过特异性和活性变化，本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示对天然底物的活性降低或无活性或无显著活性，以及相较未修饰的u‑pa，对补体蛋白c3的活性高。因此，采用治疗剂量，本文所提供经修饰的u‑pa多肽特异性抑制补体激活，但对天然u‑pa靶标切割没有或很少副作用。[0356]c.通过靶向c3的补体抑制[0357]相较于不含氨基酸修饰的u‑pa(如野生型人u‑pa(参见seqidno:1或3))或其催化结构域或蛋白酶结构域(参见seqidno:2)或根据胰凝乳蛋白酶编号包含取代c122s的对应未修饰的u‑pa多肽，本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示对补体蛋白c3中抑制性切割序列的特异性和/或活性增加。在残基122有s的取代不改变对c3的特异性或活性，但聚集减少。由于c3参与补体的3个起始途径(参见图1)，通过蛋白裂解抑制来靶向c3可提供用于灭活补体级联的通用和广泛治疗靶标。c3的灭活切割阻断了补体以及替代途径扩增环的末端活性。所有3个途径在c3汇集(参见例如图1)。通过抑制补体激活的能力，这种经修饰的u‑pa多肽能用于治疗补体激活相关的多种疾病、病症和病状，如炎症反应和自身免疫病。补体激活与疾病和病症发展相关，这是通过促进局部炎症和组织破坏，其部分由生成效应分子和膜攻击复合物所导致。在一个示例中，如许多自身免疫病，补体产生组织破坏，因为其在不合适情况下激活，如抗体对于宿主组织。其他情况下，补体能正常激活，如通过败血症，但仍促成疾病发展，如在呼吸窘迫综合征中。病理上，如果控制不当，补体能导致对血管(血管炎)、肾脏基底膜和附着内皮及表皮细胞(肾炎)、关节滑膜(关节炎)和红细胞(溶血)的大量损伤。c3在补体激活中的作用如下进一步详细讨论。[0358]1.补体蛋白c3和其在起始补体中的作用[0359]补体系统包括超过30种可溶和细胞膜结合蛋白，其不仅在抗体介导免疫应答中发挥作用，还在固有免疫应答中运作以识别和杀伤病原体如细菌、病毒感染细胞及寄生虫。补体激活通过3个不同途径在病原体表面上起始：经典途径，替代途径和凝集素途径。这些途径区别在于起始所需的组分不同，但途径最终产生同一组效应分子(如c3转化酶)，其切割补体蛋白c3以激发膜攻击复合物(mac)形成(参见例如图1)。因此，补体蛋白c3是治疗的有吸引力靶标，因为c3调节会引起多种调理素、过敏毒素和mac的调整。此外，天然产生的补体抑制蛋白包括因子h(fh)、cr1、补体受体ig(cr1g)、daf和mcp，其在c3水平抑制。[0360]有三(3)种补体激活途径(参见描述这些途径的图1)。补体途径不同；各自依赖不同分子和机制用于起始。所述途径的相似处在于其汇集产生同一组效应分子，即c3转化酶。在经典和凝集素途径中，c4b2b用作c3转化酶；在替代途径中，c3bbb是c3转化酶(见表5)。c3切割产生了c3b和c3a，前者用作调理素和补体系统的主要效应分子以用于后续补体反应，后者是炎症的肽介质。c5b介导补体激活的“后面”事件，起始一系列反应，最终产生膜攻击复合物(mac)。尽管3种途径生成不同的c3和c5转化酶，但所有途径都生成c3和c5的裂解产物并形成mac。或者，c3能由外来蛋白酶切割和激活，如溶酶体酶和弹性蛋白酶(markiewski和lambris(2007)amjpathology171:715‑727；ricklin和lambris(2007)natbiotechnol25:1265‑1275)。[0361][0362]a.经典途径[0363]c1q是补体经典途径的第一成分。c1q是与蛋白凝集素家族相关的钙依赖性结合蛋白，这归因于总体共有的结构同源性(malhotra等,(1994)clinexpimmunol.97(2):4‑9；holmskov等.(1994)immunoltoday15(2):67‑74)。胶原凝集素通常称为模式识别分子，一般用作调理素以靶向病原体用于免疫细胞的吞噬作用。与胶原凝集素如mbl不同，c1q的羧基末端球状识别结构域不具有凝集素活性，但能用作“带电”模式识别分子，这归因于其球状结构域的表面静电势的显著差异(gaboriaud等.(2003)j.biol.chem.278(47):46974‑46982)。[0364]c1q以2种不同方式起始补体经典途径。首先，经典途径通过c1q与免疫复合物(即抗原‑抗体复合物或者聚集的igg或igm抗体)相互作用来激活，从而连接抗体介导的体液免疫应答与补体激活。当igm或igg的fab部分(可变区)结合抗原时，fc(恒定)区的构象改变，允许c1q结合。c1q必须结合至少2个待活化的fc区。然而，c1q也能够在没有抗体的情况下激活补体，从而在对感染的固有或直接免疫应答中发挥作用。除了通过抗体起始，还通过c1q与非免疫分子如聚阴离子(细菌脂多糖、dna和rna)、某些小多糖、病毒膜、反应蛋白(crp)、血清淀粉样p成分(sap)以及细菌、真菌和病毒膜成分相互作用实现补体激活。[0365]c1q是c1复合物的一部分，其所含单一c1q分子结合2个分子，所述2个分子各具有酶原c1r和c1s。一个以上c1q球状结构域结合靶表面(如聚集的抗体或病原体)，导致(c1r:c1s)2复合物构象变化，引起c1r蛋白酶激活以切割c1s，从而产生活性丝氨酸蛋白酶。活性c1s切割后续补体成分c4和c2以产生c4b及c2b，其共同形成经典途径的c3转化酶。c3转化酶使c3切割成c3b和c3a，前者共价附于病原体表面并用作调理素，后者刺激炎症。一些c3b分子与c4b2b复合物相关联，产生作为经典级联c5转化酶的c4b2b3b。表6概括了参与补体经典途径的蛋白。[0366][0367][0368]b.替代途径[0369]替代途径由外来病原体在没有抗体的情况下起始。由替代途径起始补体是通过c3自发水解成c3b而发生。由于血清和组织蛋白酶活性，少量c3b总存在于体液。宿主自身细胞通常包含高水平膜唾液酸，其如果结合会灭活c3b，但细菌包含较低外部唾液酸水平并因此结合c3b而不灭活其。病原体表面的c3b由蛋白酶酶原因子b识别。因子b由因子d切割。因子d是补体系统的唯一激活蛋白酶，其作为活性酶循环，而不是酶原，但由于因子b是因子d的唯一底物，正常血清中存在低水平活性蛋白酶对宿主一般是安全的。通过因子d切割因子b可产生活性产物bb，其能与c3b关联形成c3bbb，即替代途径的c3转化酶。与经典途径类似，c3转化酶从c3生成更多c3b和c3a。c3b共价附于病原体表面并用作调理素且另外起始替代途径，而c3a刺激炎症。一些c3b连接复合物形成c3bbb3b，即替代途径c5转化酶。c3bbb3b由血浆蛋白备解素或因子p稳定，其结合微生物表面并使转化酶稳定。表7概括了参与补体替代途径的蛋白。[0370][0371]c.凝集素途径[0372]凝集素途径(也称为mbl途径)在通过凝集素蛋白识别和结合病原体相关分子模式(pamp；即碳水化合物部分)后起始。激活补体凝集素途径的凝集素蛋白示例包括甘露糖结合凝集素(mbl)和纤维胶凝蛋白(即l‑纤维胶凝蛋白,m‑纤维胶凝蛋白和h‑纤维胶凝蛋白)。mbl是蛋白凝集素家族成员，从而作为由相同多肽链构成的亚基寡聚物存在，各自含有半胱氨酸富集、胶原样、颈和碳水化合物识别或凝集素结构域。mbl用作模式识别分子以通过其球状凝集素结构域识别碳水化合物部分，尤其是病原体表面的中性糖如甘露糖或n‑乙酰氨基葡萄糖(glcnac)，采用钙依赖性方式。mbl还用作调理素以促进吞噬细胞对细菌、病毒和真菌病原体的吞噬作用。凝集素途径的额外引发剂包括纤维胶凝蛋白，包含l‑纤维胶凝蛋白、m‑纤维胶凝蛋白和h‑纤维胶凝蛋白(参见例如liu等.(2005)jimmunol.175:3150‑3156)。与mbl类似，纤维胶凝蛋白识别碳水化合物部分，例如n‑乙酰氨基葡萄糖和甘露糖结构。[0373]通过mbl或纤维胶凝蛋白激活替代途径与通过c1q激活经典途径类似，其中单一凝集素分子与2个蛋白酶酶原相互作用。在凝集素蛋白的情况中，酶原是mbl相关的丝氨酸蛋白酶masp‑1和masp‑2，其与经典途径的c1r和c1s酶原密切同源。通过凝集素蛋白识别pamp后，例如通过结合病原体表面，masp‑1和masp‑2被激活以切割c4和c2形成mbl级联c3转化酶。随后，c3b连接复合物以形成mbl级联c5转化酶。masp激活不仅参与响应微生物，而且参与涉及暴露中性糖的任何反应，包括但不限于组织损伤，如器官移植中所观察到的。如同替代途径，mbl级联独立于抗体被激活；如同经典途径，mbl级联采用c4和c2形成c3转化酶。表8概括了参与补体凝集素途径的蛋白。[0374][0375]d.补体介导的效应子功能[0376]无论使用哪种起始途径，最终结果是形成补体蛋白的活化片段(如c3a,c4a和c5a过敏毒素以及c5b‑9膜攻击复合物)，其用作效应分子以介导不同效应子功能。细胞识别补体效应分子以起始效应子功能(如趋化和调理作用)可通过各种补体受体介导。补体受体分布于广泛范围的细胞类型，包括红细胞、巨噬细胞、b细胞、中性粒细胞和肥大细胞。补体成分结合受体后，受体起始胞内信号级联，引起细胞反应如刺激细菌的吞噬作用和从细胞分泌炎性分子。例如，补体受体cr1和cr2识别c3b、c4b及其产物，对刺激趋化而言重要。cr3(cd11b/cd18)和cr4(cd11c/cd18)是整合素，在吞噬反应中同样重要，但也在响应ic3b的白细胞粘附和迁移中发挥作用。c5a和c3a受体是g蛋白偶联受体，在c5a和c3a过敏毒素的许多促炎介导功能中起作用。例如，c3a受体c3ar存在于肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞和单核细胞，且直接参与c3a的促炎效果。[0377]因此，通过补体受体，这些补体效应分子片段介导数种功能，包括白细胞趋化、巨噬细胞活化、血管通透性和细胞裂解(frank,m.和fries,“l.补体”(l.complement).收录于paul,w.(编)《基础免疫学》(fundamentalimmunology),雷文出版社(ravenpress),1989)。补体产物的一些效应子功能汇总列于表9。[0378][0379][0380]i.补体介导的裂解：膜攻击复合物[0381]所有3个途径的补体级联终步骤是形成膜攻击复合物(mac)(图1)。c5能由任何c5转化酶切割成c5a和c5b。c5b联合溶液中的c6和c7，c5b67复合物经c7上的疏水位点与病原体脂膜相关联。c8和同样具有疏水位点的数个c9分子加入形成膜攻击复合物，也称为c5b6789或c5b‑9。c5b‑9在膜中形成孔，从中水和溶质能穿过，导致渗透裂解和细胞死亡。如果补体对抗原激活，而没有c5b67能粘附的脂膜，则c5b67复合物可结合附近细胞并起始旁观者溶解。单一mac能裂解红细胞，但有核细胞能内吞mac并修复损伤，除非存在多个mac。革兰氏阴性菌(具有暴露的外膜)和包膜病毒，一般易受补体介导的裂解影响。不太受影响的是革兰氏阳性菌(其质膜由其厚肽聚糖层保护，细菌在其细胞壁周围带有荚膜或粘液层)或病毒没有脂包膜。同样，mac能由在膜插入前结合复合物的蛋白破坏，如链球菌补体抑制剂(sic)和丛生蛋白。通常，mac有助于通过导致裂解来破坏革兰氏阴性菌以及展示外来抗原的人细胞(病毒感染细胞、肿瘤细胞等)，并且还能破坏包膜病毒的包膜。[0382]ii.炎症[0383]炎症是一种过程，其中血管扩张并变得更通透，因而使机体防御细胞和防御化合物能够离开血液及进入组织。补体激活引起数种促炎介质如c3a,c4a和c5a形成。血清或血浆中的完整过敏毒素通过羧肽酶n迅速转化成更稳定、不太具有活性的c3a‑desarg,c4a‑desarg或c5a‑desarg形式。c3a,c4a和c5a以及较小程度上的其desarg衍生物，是有效的生物活性多肽，由于其炎症活性而被称为过敏毒素。过敏毒素结合多个细胞类型上的受体以刺激平滑肌收缩、增加血管通透性和激活肥大细胞以释放炎症介质。c5a是最有效的过敏毒素，主要作用于白血球，尤其是中性粒细胞。c5a刺激白细胞在感染位点附于血管壁，这是通过刺激粘附分子表达增加，从而白细胞能从血管中挤出并进入组织，此过程称为血球渗出。c5a还刺激中性粒细胞生成用于胞外杀伤的活性氧、蛋白水解酶和白细胞三烯。c5a还能通过诱导生成趋化因子、细胞因子和其他促炎介质来进一步间接放大炎症过程。c5a还与肥大细胞相互作用以释放血管扩张剂如组胺，从而血管变得更通透。c3a还与白血球相互作用，主要影响嗜曙红细胞指示c3a在过敏性炎症中的作用。c3a诱导平滑肌收缩、增强血管通透性、导致嗜碱性粒细胞脱粒及释放组胺和其他血管活性物质。c2a能转变成c2激肽，c2激肽通过引起血管扩张来调节血压。[0384]尽管c3b的失活衍生物ic3b在技术上不视作过敏毒素，但其功能是诱导白细胞粘附血管内皮和诱导生成促炎性细胞因子il‑1，这是通过结合其细胞表面整合素受体。通过诱导细胞粘附分子如e‑选择素表达和诱导白介素‑8分泌，c5b‑9还间接刺激白细胞粘附、激活和趋化(bhole等.(2003)critcaremed31(1):97‑104)。c5b‑9还刺激有助于炎症的二级介质释放，例如前列腺素e2、白三烯b4和血栓素。[0385]人补体成分c3和c5转化产生其各过敏毒素产物，可参与某些天然产生的病理状态，包括自身免疫失调如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性肿瘤、心肌梗塞、purtscher’s视网膜病、败血症和成人呼吸窘迫综合征。在某些医源性补体激活相关病症中检测到c3a和c5a循环水平增加，如：心肺旁路手术、肾透析和尼龙纤维白细胞去除术(nylonfiberleukaphoresis)。[0386]iii.趋化[0387]趋化是细胞响应其环境中的化合物而定向迁移的过程。在免疫应答中，多种趋化因子指导细胞如吞噬细胞移动到感染位点。例如，c5a是用于循环中性粒细胞的主要趋化因子，但也能诱导单核细胞趋化。吞噬细胞移向增加浓度的c5a且随后经其cr1受体粘附c3b分子，c3b分子附着于抗原。用嗜碱性粒细胞、嗜曙红细胞、中性粒细胞和单核吞噬细胞观察，c5a的趋化效果在低至10‑10m浓度时有活性。[0388]iv.调理作用[0389]补体的一个重要作用是促进吞噬细胞对病原体的摄取和破坏。这通过称为调理作用的过程发生，其中结合靶细菌的补体成分与吞噬细胞如中性粒细胞或巨噬细胞表面的补体受体相互作用。此示例中，补体效应分子称为调理素。病原体的调理作用是c3b和c4b的主要功能。ic3b也用作调理素。c3a和c5a增加吞噬细胞上c3b受体的表达并提高其代谢活性。[0390]c3b以及较小程度上的c4b，有助于从身体移除有害免疫复合物。c3b和c4b使免疫复合物附于红细胞上的cr1受体。红细胞随后将复合物递送到脾和肝内固定的巨噬细胞以用于破坏。免疫复合物能导致有害的iii型超敏反应。[0391]v.体液免疫应答激活[0392]b细胞激活需要抗原连接b细胞受体(bcr)。然而，显示补体在使b细胞对抗原反应阈值降低多至1000倍中起作用。这通过c3d或c3dg结合b淋巴细胞上的cr2受体发生，c3d或c3dg是从c3分解片段产生的补体产物，其能与bcr共连接。当用c3d调理的抗原颗粒例如免疫复合物经c3d结合cr2受体以及经抗原结合bcr时，共连接发生。当c3d结合抗原时，抗原复合物共连接也能发生，以提高其被抗原呈递细胞如树突细胞摄取，抗原呈递细胞随后能呈递抗原给b细胞以增强抗原反应。cr2缺陷型小鼠展示出b细胞功能缺陷，导致天然抗体水平下降和体液免疫应答受损。[0393]2.c3结构和功能[0394]本文所提供变异u‑pa多肽切割补体蛋白c3或其蛋白裂解片段，从而抑制补体。人补体蛋白c3(uniprot登录号p01024)是1663氨基酸单链前原蛋白，具有seqidno:47所示氨基酸序列。蛋白由位于染色体19的41kb基因编码(seqidno:46所示核苷酸序列)。前原蛋白包含22氨基酸信号肽(seqidno:47的氨基酸1‑22)和四精氨酸序列(seqidno:47的氨基酸678‑681)，其通过弗林蛋白酶样酶去除，导致含β链(seqidno:47的23‑667)和α链(seqidno:47的672‑1663)的成熟2链蛋白形成，其通过氨基酸残基cys559与cys816之间的链间二硫键连接。成熟2链蛋白具有seqidno:77所示氨基酸序列。[0395]在补体级联中，补体蛋白c3通过蛋白裂解进一步加工以形成多个c3蛋白裂解片段。如上所述，所有3种补体起始途径在c3转化酶c4b2b和c3bbb汇合。c3转化酶在seqidno:47残基748与749之间切割c3(参见下表10)，产生过敏毒素c3a(seqidno:47的氨基酸672‑748)和调理素c3b(c3bα链；seqidno:47的氨基酸749‑1663)。c3a参与炎症且c3b形成c5转化酶，最终引起c5a过敏毒素和mac。本文所提供变异u‑pa多肽抑制补体，并且因此，不在此glar切割位点切割。[0396]c3b具有多个补体成分的结合位点，包括c5、备解素(p)、因子h、b和i、补体受体1(cr1)和膜辅因子蛋白(mcp)(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。因子i是血浆蛋白酶，其在辅因子h、cr1和mcp存在下结合可导致c3b失活，而在因子d存在下结合因子b和p可导致c3转化酶扩增及起始mac。因子i在辅因子存在下于seqidno:47的残基1303‑1304,1320‑1321和954‑955之间切割c3b(参见下表10)，产生片段ic3b(seqidno:47的氨基酸749‑1303)和c3f(seqidno:47的氨基酸1304‑1320)。因子i随后切割ic3b，产生c3c(c3cα链片段1；seqidno:47的氨基酸749‑954)和c3dg(seqidno:47的氨基酸955‑1303)。最终结果是c3b永久失活(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。由于因子i灭活c3b，因子i切割位点是由本文所提供变体u‑pa多肽切割的候选。额外c3b蛋白裂解片段包括c3g(seqidno:47的氨基酸955‑1001)、c3d(seqidno:47的氨基酸1002‑1303)和c3cα链片段2(seqidno:47的氨基酸1321‑1663)。补体蛋白c3的切割序列如下表10所示，该表列出p4‑p1残基，切割位点(p1‑p1’位点)的氨基酸残基和蛋白酶负责切割。本文所提供经修饰的u‑pa多肽不在这些位点切割。[0397][0398]a.c3a[0399]c3a(seqidno:47的氨基酸672‑748)是过敏毒素，其参与炎症、嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱粒、血管通透性增强、平滑肌收缩及诱导抑制t细胞。[0400]b.c3b[0401]c3b(seqidno:47的氨基酸749‑1663)在补体级联中具有多种作用。c3b是调理素，其促进吞噬细胞对病原体的摄取和破坏。另外，c3b联合c3转化酶以产生c5转化酶，其激活补体蛋白c5，从而产生c5a过敏毒素和c5b，与c6、c7、c8和c9组合形成膜攻击复合物。此外，如上面章节1b所述，c3b参与补体起始的替代途径。c3b受补体调节蛋白因子i调控，因子i是血浆蛋白酶，使c3b降解成多个片段，包括ic3b、c3c、c3d、c3f和c3dg，从而永久性灭活c3b。[0402]c3b在补体介导效应功能中发挥关键作用，这是通过其结合c3转化酶c4b2b和c3bbb的能力，从而产生c5转化酶c4b2b3b和c3bbb3b。c5转化酶将酶原c5切割成其活性片段，即c5a过敏毒素和c5b。c5a参与趋化和炎症，c5b参与mac形成。[0403]c.c3b抑制剂[0404]c3b具有多个补体成分的结合位点，包括c5,备解素(p)、因子hb和i、补体受体1(cr1)和膜辅因子蛋白(mcp)(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。因子i是血浆蛋白酶，其在辅因子h、cr1和mcp存在下结合可导致c3b失活，而在因子d存在下结合因子b和p可导致c3转化酶扩增及起始mac。因子i在辅因子存在下于seqidno:47的残基1303‑1304,1320‑1321和954‑955之间切割c3b，产生片段ic3b(seqidno:47的氨基酸749‑1303)和c3f(seqidno:47的氨基酸1304‑1320)。尽管c3b的失活衍生物ic3b在技术上不视作过敏毒素，其用于诱导白细胞粘附血管内皮和诱导生成促炎性细胞因子il‑1，这是通过结合其细胞表面整合素受体。蛋白ic3b用作调理素。因子i随后切割ic3b，产生片段c3c(c3cα链片段1；seqidno:47的氨基酸749‑954和c3cα链片段2；seqidno:47的氨基酸1321‑1663)和c3dg(seqidno:47的氨基酸955‑1303)。最终结果是c3b永久失活(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。c3dg能进一步切割产生片段c3g(seqidno:47的氨基酸955‑1001)和c3d(seqidno:47的氨基酸1002‑1303)。[0405]d.切割c3的经修饰的u‑pa多肽[0406]本文提供经修饰和变异尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽。还提供含经修饰的u‑pa多肽的缀合物，如融合蛋白，从而所得其激活形式切割c3。本文所提供经修饰的u‑pa多肽相较于野生型、天然或参考u‑pa多肽，显示活性或特性改变。例如，本文所提供u‑pa多肽包含相较于野生型、天然或参考u‑pa多肽的修饰，所述野生型、天然或参考u‑pa多肽如seqidno:1‑6任一者所示，或与seqidno:1‑6任一者有至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，尤其至少95％序列相同性，例如seqidno:5所示参考u‑pa蛋白酶结构域。本文所提供经修饰的u‑pa多肽包括改变(抑制)补体激活的u‑pa多肽，这是通过实现补体蛋白c3的抑制性切割。本文所提供经修饰的u‑pa多肽包括实现补体蛋白c3抑制性切割的那些。包括实现c3抑制性切割的那些，其活性或特异性kcat/km高于不含修饰(取代、缺失和/或插入)的对应形式或序列如seqidno:1‑6任一者所示的未修饰的u‑pa对应形式。相较于不含氨基酸修饰的对应u‑pa多肽，经修饰的u‑pa多肽还可能对未修饰的u‑pa所切割或识别底物和靶标的特异性和/或选择性降低，包括切割纤溶酶原和/或结合upar。[0407]本文所提供经修饰的u‑pa多肽通过抑制性或灭活切割补体蛋白c3来抑制或灭活补体。本文所提供经修饰的u‑pa多肽抑制或灭活补体，这是通过在切割位点切割补体蛋白c3，导致c3抑制或失活。灭活或抑制切割补体蛋白c3可以在c3的任何序列，只要所得c3切割导致补体失活或激活受抑制。由于本文所提供经修饰的u‑pa多肽抑制补体激活，经修饰的u‑pa多肽不影响c3的酶原形式切割，以产生c3a和c3b活化形式。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽不在seqidno:47的残基748‑749之间切割c3，其会引起c3a和c3b产生。补体蛋白c3的抑制或灭活切割位点可凭经验确定或鉴定。若必要，经修饰的u‑pa多肽能测试其抑制补体的能力，如下面章节e所述和实施例所示范。[0408]本文所提供经修饰的u‑pa多肽催化补体蛋白c3的抑制性或灭活切割。本文所提供经修饰的u‑pa多肽在任何切割序列切割补体蛋白c3，只要所得c3片段失活或无法激活补体介导效应子功能。本文所提供经修饰的u‑pa多肽对天然u‑pa靶标的特异性和/或选择性改变(即降低)，所述靶标包括纤溶酶原和upar。在一个示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割纤溶酶原的特异性降低。另一示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对结合upar的选择性降低。一些示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割纤溶酶原的特异性降低且结合upar的选择性降低。其他示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割补体蛋白c3的特异性增加，而对切割纤溶酶原的特异性减少。其他示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3的选择性增加，而对纤溶酶原和/或upar的选择性降低。[0409]本文所提供和实施例所述经修饰的u‑pa多肽是例如u‑pa的经分离蛋白酶结构域。也考虑其保留蛋白酶活性的较小部分。本文所提供经修饰的u‑pa多肽是u‑pa蛋白酶结构域的突变体，特别是其中蛋白酶结构域内cys残基游离(即不与蛋白的任何其他cys残基形成二硫键)的经修饰的u‑pa多肽用另一氨基酸取代置换，优选保守氨基酸取代或不消除活性的取代，例如用丝氨酸的取代，以及消除糖基化位点的经修饰的u‑pa多肽。也考虑具有保留催化活性的其他氨基酸取代的经修饰的u‑pa多肽(示范性氨基酸取代参见例如表3)。[0410]本文所提供经修饰的u‑pa多肽包含一个或多个氨基酸修饰，从而其以导致补体失活或抑制的方式切割补体蛋白c3。所述修饰可以是单氨基酸修饰，如单一氨基酸取代(置换)、插入或缺失，或多氨基酸修饰，如多个氨基酸取代、插入或缺失。示范性修饰是氨基酸取代，包括单或多氨基酸取代。氨基酸取代可以是保守取代如表3所示，或非保守取代如本文任意所述。本文所提供经修饰的u‑pa多肽相较于不含修饰的u‑pa多肽，可包含至少或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多修饰位置。[0411]本文所述修饰能在任何u‑pa多肽中进行。例如，修饰在以下u‑pa多肽中进行：人u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6的或其所示的氨基酸序列，或其等位基因变体；小鼠u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:52或66的或其所示的氨基酸序列；大鼠u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:53或67的或其所示的氨基酸序列；牛u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:54或68的或其所示的氨基酸序列；猪u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:55或69的或其所示的氨基酸序列；兔u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:56或70的或其所示的氨基酸序列；鸡u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:57或71的或其所示的氨基酸序列；非洲黄狒狒u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:58或72的或其所示的氨基酸序列；苏门答腊猩猩u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:59或73的或其所示的氨基酸序列；狗u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:60或74的或其所示的氨基酸序列；羊u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:61或75的或其所示的氨基酸序列；狨猴u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:62的或其所示的氨基酸序列；恒河猴u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:63的或其所示的氨基酸序列；北部白颊长臂猿u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:64的或其所示的氨基酸序列；和黑猩猩u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:65的或其所示的氨基酸序列；或在序列变体或催化活性片段中进行，其显示与seqidno:1‑6和52‑75任一者至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。[0412]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能在本文所提供u‑pa多肽的任何区域或结构域中修饰，只要经修饰的u‑pa多肽保留其实现补体蛋白c3灭活或抑制性切割的能力。本文所提供经修饰的u‑pa多肽可以是单链或2链多肽、物种变体、等位基因变体、同种型或其催化活性片段，例如其蛋白酶结构域。本文所提供u‑pa多肽可以是全长或截短u‑pa多肽。本文所提供经修饰的u‑pa多肽可以是u‑pa的蛋白酶结构域或u‑pa的蛋白酶结构域修饰形式。还考虑用于本文的是酶原、前体或成熟形式的经修饰的u‑pa多肽，只要u‑pa多肽保留其实现补体蛋白c3抑制性或灭活切割的能力。u‑pa多肽中的修饰可对也包含其他修饰的u‑pa多肽形成，包括多肽一级序列的修饰和非一级序列的修饰。例如，本文所述修饰可以在作为融合多肽或嵌合多肽的u‑pa多肽中。本文所提供经修饰的u‑pa多肽还包括缀合聚合物如peg试剂的多肽。[0413]出于本文目的，提及修饰的位置和氨基酸，包括一个或多个氨基酸取代，在本文中参考seqidno:1‑6任一者所示的u‑pa多肽。于另一u‑pa多肽中制备本文所提供任何修饰是在本领域技术人员水平范围内，这是通过鉴定另一u‑pa多肽的对应氨基酸残基进行的，如seqidno:1‑6任一者所示u‑pa多肽或其显示与seqidno:1‑6任一者所示u‑pa多肽有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的变体。通过比对u‑pa多肽与seqidno:1‑6任一者所示参考u‑pa多肽，能鉴定另一u‑pa多肽的对应位置。出于修饰(如氨基酸取代)目的，对应氨基酸残基可以是任何氨基酸残基，且不需与seqidno:1‑6任一者所示残基相同。通常，通过与例如seqidno:5中残基比对鉴定的对应氨基酸残基是与seqidno:5相同的氨基酸残基，或其保守或半保守氨基酸残基。还应理解本文所提供示范性取代能在u‑pa多肽对应残基处形成，如u‑pa的蛋白酶结构域，只要取代不同于u‑pa多肽的未修饰形式，如u‑pa的蛋白酶结构域。基于此描述和本文他处的描述，生成含一个或多个所述突变的经修饰的u‑pa多肽以及各自测试本文所述性质或活性，在本领域技术人员水平范围内。[0414]本文所提供经修饰的u‑pa多肽通过蛋白裂解介导的抑制或灭活补体蛋白c3来改变补体活性。此外，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割纤溶酶原和/或结合upar的特异性下降。例如，本文所提供经修饰的u‑pa多肽就切割纤溶酶原而言显示小于100％的u‑pa多肽野生型活性，如小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更小的野生型或参考u‑pa多肽的纤溶酶原切割活性，例如不含氨基酸修饰的对应多肽。另一示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽就upar而言显示小于100％的u‑pa多肽野生型结合活性，如小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更小的野生型或参考u‑pa多肽的upar结合活性，例如不含氨基酸修饰的对应多肽。[0415]本文还提供编码任意本文所提供经修饰的u‑pa多肽的核酸分子。一些示例中，编码核酸分子还能修饰成包含异源信号序列以改变(如增加)多肽表达和分泌。本文所提供经修饰的u‑pa多肽和编码核酸分子能通过本领域已知任何方法生成或分离，包括从天然来源分离，分离细胞、组织和生物体中的重组生成蛋白，通过重组方法和包括计算机步骤在内的方法、合成方法和本领域技术人员已知的任何方法。本文所提供经修饰多肽和编码核酸分子可通过本领域技术人员已知的标准重组dna技术生成。可采用本领域已知的任何方法以实现靶蛋白中任意一个或多个氨基酸突变。方法包括标准定点或随机突变编码核酸分子，或固相多肽合成方法。例如，编码u‑pa多肽的核酸分子能进行突变，如随机突变编码核酸、易错pcr、定点突变、重叠pcr、基因重排或其他重组方法。编码多肽的核酸分子随后能引入宿主细胞以异源表达。因而，本文还提供编码本文所提供任意经修饰的u‑pa多肽的核酸分子。一些示例中，合成生成经修饰的u‑pa多肽，如使用固相或溶液相肽合成。核酸分子可在基因治疗载体中提供，如aav或腺病毒载体，以表达体内所编码修饰u‑pa多肽，如眼部或用于全身施用。所编码u‑pa多肽可以是全长多肽或蛋白酶结构域或者有活性或能激活的其他形式。[0416]本文所提供u‑pa多肽修饰成对补体蛋白c3抑制性或灭活切割序列切割的特异性和/或选择性增加。u‑pa多肽能用本领域已知修饰蛋白的任何方法修饰。这种方法包括定点和随机突变。试验如本文所提供和本领域已知用于补体激活生物功能的试验，可用于评价经修饰的u‑pa多肽的生物功能以确定经修饰的u‑pa多肽就切割和灭活而言是否靶向补体蛋白c3。本文提供鉴定u‑pa多肽和经修饰的u‑pa多肽的示范性方法。[0417]1.示范性修饰u‑pa多肽[0418]本文提供的经修饰的u‑pa多肽包含u‑pa多肽中的一个或多个，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个和更多氨基酸修饰，且切割补体蛋白c3，从而补体受抑制或失活。修饰在一级氨基酸序列中，包括取代、缺失和插入氨基酸残基。当处于活性形式时，修饰改变u‑pa多肽的特异性/活性。本文的经修饰的u‑pa多肽选择成识别和切割补体蛋白中的靶位点，尤其是c3以使其失活。它们还能进一步修饰和筛选成对体内底物如纤溶酶原的特异性/活性降低。它们可通过任何适当的蛋白酶筛选方法鉴定。本文的经修饰的u‑pa多肽用美国专利号8,211,428所述筛选方法鉴定，其中修饰蛋白酶的文库与同源或其他抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂(其修饰成包括反应位点环中的靶序列以捕获会切割这种靶标的修饰蛋白酶)反应。[0419]本文所提供经修饰的u‑pa多肽展示出对在灭活的c3位点处补体蛋白c3的活性或特异性kcat/km增加，还可对纤溶酶原的活性或特异性下降和/或展示出对靶位点补体蛋白c3的选择性、特异性和/或活性增加，其中经修饰的u‑pa多肽灭活c3。相较于野生型或有取代c122s(通过胰凝乳蛋白酶编号)的野生型对应形式，经修饰的u‑pa多肽显示对切割和灭活c3的活性增加。具体地，相较于seqidno:5的u‑pa蛋白酶结构域(有c122s的u‑pa蛋白酶结构域)，经修饰的u‑pa多肽的蛋白酶结构域显示c3的灭活切割活性提高。活性提高可以是相较于未修饰的u‑pa的10％、20％、50％、100％、1倍、2倍、3倍、4、5、6、7、8,9、10倍或更多。[0420]经修饰的u‑pa多肽可对天然底物如纤溶酶原的活性降低。例如，经修饰的u‑pa多肽可就纤溶酶原显示野生型或参考u‑pa多肽如seqidno:5所示u‑pa多肽的99％u‑pa活性，以及就切割c3以灭活其而言显示至少0.5倍、1倍、2倍、3倍或更多。例如，本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示小于或小于约99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少的野生型或参考u‑pa多肽的u‑pa活性，所述野生型或参考u‑pa多肽如不含氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的对应多肽，例如seqidno:5所示u‑pa蛋白酶结构域。[0421]例如，能通过例如氨基酸取代或置换修饰的示范性位置包括但不限于对应位置173、178、179、180、181、185、186、187、188、208、209、249、250、252、306、314或353的任何位置，参考seqidno:3所示氨基酸序列(对应位置30、35、36、37、37a、38、39、40、41、60a、60b、97a、97b、99、149、157或192，根据胰凝乳蛋白酶编号)。例如，氨基酸位置可以是在对应苯丙氨酸(f)位置的取代，参考seqidno:3所示氨基酸位置，在一个或多个位置173、r178、r179、h180、r181、v185、t186、y187、v188、d208、y209、t249、l250、h252、y306、m314或q353(对应f30、r35、r36、h37、r37a、v38、t39、y40、v41、d60a、y60b、t97a、l97b、h99、y149、m157和q192，分别根据胰凝乳蛋白酶编号)。[0422]任意上述位置的示范性氨基酸取代如表11所示。提及表11的对应位置，参考seqidno:3所示位置(也参见下面的实施例)。应理解取代能通过比对seqidno:3所示序列而在另一u‑pa多肽的对应位置进行，其中对应位置是匹配的位置。例如，取代能在有seqidno:2所示序列的u‑pa蛋白酶结构域，或在有seqidno:5所示序列的参考u‑pa蛋白酶结构域进行。一些示例中，氨基酸取代可在seqidno:5所示u‑pa多肽或其变体的对应位置，所述变体与其具有至少或至少约75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，尤其是95％或更高序列相同性，只要所得经修饰的u‑pa多肽相较对纤溶酶原的u‑pa活性，显示对补体蛋白c3的特异性改变(即提高)和/或对补体蛋白c3的选择性改变。一个示例中，任何一个或多个取代在seqidno:1‑6任一者中，只要所得经修饰的u‑pa多肽相较对纤溶酶原的u‑pa活性，显示对补体蛋白c3的特异性改变(即提高)和/或对补体蛋白c3的选择性改变。[0423][0424]本文所提供经修饰的u‑pa多肽的氨基酸修饰示例包括但不限于以下取代：在对应173位(根据胰凝乳蛋白酶编号是30)的位置处的酪氨酸(y)；在对应178位(根据胰凝乳蛋白酶编号是35)的位置处的w；在对应178位的位置处的y；在对应178位的位置处的q；在对应179位(根据胰凝乳蛋白酶编号是36)的位置处的h；在对应180位(根据胰凝乳蛋白酶编号是37)的位置处的e；在对应180位的位置处的p；在对应180位的位置处的d；在对应180位的位置处的n；在对应180位的位置处的g；在对应180位的位置处的k；在对应180位的位置处的y；在对应181位(根据胰凝乳蛋白酶编号是37a)的位置处的q；在对应181位的位置处的p；在对应181位的位置处的e；在对应181位的位置处的n；在对应181位的位置处的s；在对应185位(根据胰凝乳蛋白酶编号是38)的位置处的d；。在对应185位的位置处的e；在对应186位的位置处(根据胰凝乳蛋白酶编号是39)的w；在对应186位的位置处的y；在对应187位(根据胰凝乳蛋白酶编号是40)的位置处的h；在对应187位的位置处的f；在对应187位的位置处的q；在对应188位(根据胰凝乳蛋白酶编号是41)的位置处的r；在对应188位的位置处的l；在对应208位的位置处的p；在对应208位(根据胰凝乳蛋白酶编号是60a)的位置处的t；在对应209位(根据胰凝乳蛋白酶编号是60b)的位置处的q；在对应209位的位置处的h；在对应209位的位置处的s；在对应209位的位置处的a；在对应209位的位置处的t；在对应209位的位置处的l；在对应249位(根据胰凝乳蛋白酶编号是97a)的位置处的e；在对应249位的位置处的i；在对应250位(根据胰凝乳蛋白酶编号是97b)的位置处的a；在对应250位的位置处的g；在对应252位(根据胰凝乳蛋白酶编号是99)的位置处的q；在对应306位(根据胰凝乳蛋白酶编号是149)的位置处的k；在对应306位的位置处的r；在对应314位(根据胰凝乳蛋白酶编号是157)的位置处的k；或在对应353位(根据胰凝乳蛋白酶编号是192)的位置处的h；各自参考seqidno:3所示氨基酸位置。在对应279位的位置处的s(根据胰凝乳蛋白酶编号的122s)取代游离cys，从而降低聚集趋势。[0425]含有2个或更多氨基酸修饰的示范性经修饰的u‑pa多肽如下表12所示，其用于切割c3的活性如表14所述。sequenceidno涉及含有所示举取代的示范性u‑pa蛋白酶结构域，其包括c122s处的取代以减少或消除聚集。c122是游离半胱氨酸，其能引起蛋白酶多肽之间的交联。应理解蛋白酶结构域是示范性、全长和前体分子，以及蛋白酶结构域的其他催化活性部分，全长和前体多肽能包括所示举取代，以形成全长的激活修饰u‑pa多肽和其他形式。[0426][0427][0428][0429]2.额外修饰[0430]本文所提供任何经修饰的u‑pa多肽能包含一个或多个额外修饰。额外修饰可包括例如本领域已知的任何氨基酸取代、缺失或插入，通常是相较对纤溶酶原的u‑pa活性会增加对补体蛋白c3的特异性和/或对补体蛋白c3的选择性改变的任意那些。同样，考虑改变任何其他感兴趣活性的修饰。本领域众所周知一级序列的氨基酸修饰是叠加的(参见例如wells(1990)biochem29:8509‑8517)。本文所提供任何经修饰的u‑pa多肽能包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多额外氨基酸修饰以提供其他活性或改变活性。[0431]能纳入本文所提供经修饰的u‑pa多肽的额外修饰示例包括但不限于描述于以下的那些：美国专利号4,997,766；5,126,134；5,129,569；5,275,946；5,571,708；5,580,559；5,648,253；5,728,564；5,759,542；5,811,252；5,891,664；5,932,213；5,980,886；6,248,712；6,423,685；7,070,925；7,074,401；7,807,457；7,811,771；8,211,428；美国专利公开号2002/0106775；2004/0265298；2004/0146938；2009/0010916；2011/0055940；2008/0020416；2006/0142195；国际专利公开号wo1988/008451；wo1989/010401；wo1990/004635；wo1996/013160；wo2002/40503；petersen等.(2001)eurjbiochem268:4430‑4439；skeldal等.(2006)febsj273:5143‑5149；sun等.(1997)jbiolchem272:23818‑23823；blouse等.(2009)jbiolchem284:4647‑4657；nelles等.(1987)jbc262:5682‑5689；crowley等.(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5021‑5025；zeslawska等.(2000)jmolbiol301:465‑475；zeslawska等.(2003)jmolbiol328:109‑118；quax等.(1998)arteriosclerthrombvascbiol18:693‑701；homandberg和wai(1990)thrombinres58:403‑412；zaitsev等.(2010)blood115:5241‑5248；yang等.(1994)biochemistry33:606‑612；davidow等.(1991)proteineng4:923‑928；boutad和castellino(1993)archbiochembiophys303:222‑230；tsujikawa等.(1996)yeast12:541‑553；carriero等.(2002)biolchem383:107‑113；stopelli等.(1985)proc.natl.acad.sci.u.s.a.82:4939‑4943；stoppelli等.(1987)jbiolchem262:4437‑4440；francoetal.(1998)jbiolchem273:27734‑27740；francoetal.(1997)jcellbiol137:779‑791；li等.(1995)jbiolchem270:30282‑30285；botkjaer等.(2009)biochemistry48:9606‑9617；bdeir等.(2003)blood102:3600‑3608；eguchi等.(1990)jbiochem108:72‑79；miyake等.(1988)jbiochem104:643‑647；bergstrom等.(2003)biochem42:5395‑5402；sun和liu(2005)proteins61:870‑877；sun等.(1998)biochemistry37:2935‑2940；anderson等.(2008)biochemj412:447‑457；li等.(1992)biochimbiophysacta1159:37‑43；lijnen等.(1988)eurjbiochem177:575‑582；lijnen等.(1988)eurjbiochem172:185‑188；lijnen等.(1992)eurjbiochem205:701‑709；lijnen等.(1994)eurjbiochem224:567‑574；lijnen等.(1990)jbiolchem265:5232‑5236；yoshimoto等.(1996)biochimbiophysacta1293:83‑89；magdolen等.(1996)eurjbiochem237:743‑751；nienaber等.(2000)jbiolchem275:7239‑7248；gurewich等.(1988)jclininvest1956‑1962；liu等.(1996)biochemistry35:14070‑14076；liu等.(2002)circres90:757‑763；mukhina等.(2000)jbiolchem275:16450‑16458；peng等.(1997)biochemmolbiolint41:887‑894；turkmen等.(1997)electrophoresis18:686‑689；peng等.(1999)biotechnollett21:979‑985；ueshima等.(1994)thrombhaemost71:134‑140；和melnick等.(1990)jbiolchem265:801‑807。本领域所述示范性氨基酸修饰的非限制性示例包括以下任意一种或多种：s9a、c13a、t18a、c19a、v20a、s21a、n22y、n22a、n22q、n22r、k23a、k23h、k23q、k23e、y24a、f25a、s26a、s26f、n27a、n27r、i28a、h29a、h29r、w30a、w30r、w30f、n32s、k35a、g38r、e43a、i44a、d45a、k46a、s47a、s47g、k48a、k48p、t49a、y51a、n54a、l80h、q81r、q82p、t83r、h99y、p105a、d106a、n107a、r108a、r108d、r109a、r110a、g118n、l119r、k120r、k120a、p121l、l122t、l122r、v123y、v123w、q124a、e125a、h129a、d130g、c131w、k135g、k135s、k135y、k135q、k136p、s138e、c148s、c148a、k151e、t152a、r154g、r154p、r154a、p155r、p155l、p155a、p155n、p155s、p155g、p155q、r156p、r156a、r156h、r156s、r156y、r156e、r156g、r156l、f157l、f157t、f157g、f157q、f157d、f157e、k158r、k158e、k158a、k158h、k158s、k158y、k158g、k158w、k158v、k158m、i159r、i159a、i159p、i159g、i160a、i160k、g162r、e163a、f164v、f164a、f164v、i167l、p171l、f173i、f173v、f173l、f173t、f173g、f173m、a175s、y177a、r178a、r179a、h180a、r181a、s184a、t186a、t186e、t186d、y187a、y187h、v188a、s192n、i194m、s195a、h204a、h204q、f206a、d208a、y209a、p210a、k211a、k211q、k212a、e213a、d214a、y215a、i216a、y218a、r221a、s222l、r223g、r223a、l224a、l224p、n225a、s226p、n227a、q229a、e231g、k233e、k233a、f234a、e235k、e235a、e237a、i240v、k243e、k243a、d244a、y245a、d255a、r262a、k264a、e265a、r267a、c268y、c279s、c279a、f289l、g290d、e294g、i295t、g297d、f298a、g299a、g299h、k300a、k300h、k300w、e301d、e301a、e301h、n302a、n302q、n302v、n302l、n302i、n302s、n302t、s303e、s303a、s303e、t304a、t304v、t304m、d305a、y306a、y306g、y306v、y306h、l307a、y308a、p309a、p309s、p309t、p309v、p309g、p309n、p309l、p309d、p309r、p309h、p309f、p309w、e310a、q311a、l312p、l312v、l312m、k313y、k313t、k313a、k313h、t315a、t315i、v316a、v317a、y330h、a343t、d344a、q346a、w347a、k348a、k348e、t349i、d350a、s351a、q353a、g354r、d355a、s356a、g357e、g366c、r378c、r378a、k383a、k385a、r400a、h402a、k404a、e405a、e406ag408a或a410v，根据seqidno:3所示氨基酸序列。额外修饰包括引入糖基化位点的氨基酸取代。[0432]经修饰的u‑pa多肽包括含有化学或翻译后修饰的那些。一些示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽不包含化学或翻译后修饰。化学或翻译后修饰包括但不限于聚乙二醇化、唾液酸化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟化、pas化、hes化、磷酸化、连接多聚化结构域如fc，和本领域已知其他多肽修饰。除了本文提供的任意一种或多种氨基酸修饰，如氨基酸取代、插入、缺失和其组合，本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用本领域已知任何方法缀合或融合任何部分，包括化学和重组方法，提供的所得多肽处于活性形式时，保留实现补体蛋白c3抑制性或灭活切割的能力。[0433]例如，除了本文提供的任意一种或多种氨基酸修饰如氨基酸取代，本文所提供经修饰的u‑pa多肽还能包含其他在或不在多肽一级序列中的修饰，包括但不限于采用以下的修饰：碳水化合物部分、聚乙二醇(peg)部分、硅烷基化部分、来自免疫球蛋白g的fc结构域或者任何其他结构域或部分。例如，[0434]a.免疫原性降低[0435]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能修饰成免疫原性降低。免疫原性降低可如下实现：通过消除来自多肽的抗原表位的序列变化或通过改变翻译后修饰。本领域技术人员熟悉鉴定多肽中抗原表位的方法(参见例如liang等.(2009)bmcbioinformatics,10:302；yang等.(2009)rev.med.virol.,19:77‑96)。一些示例中，能修饰一个或多个氨基酸以移出或改变抗原表位。另一示例中，改变蛋白的糖基化也能影响免疫原性。例如，考虑改变肽的糖基化，只要多肽保留实现补体蛋白c3抑制性或灭活切割的能力。糖基化位点可通过单突变移除。糖基化位点能通过引入标准序列而添加，如通过插入单或多个突变，例如nxs(t)，其中x不是脯氨酸。糖基化位点还可增加血清半衰期。[0436]b.fc结构域[0437]经修饰的u‑pa多肽能连接免疫球蛋白多肽的fc区。通常，这种融合保留至少一个功能活性铰链，免疫球蛋白重链恒定区的ch2和ch3结构域。例如，igg1的全长fc序列包括下面seqidno:45所示序列的氨基酸99‑330。[0438][0439]用于higg1的示范性fc序列如所示seqidno:50：[0440][0441]其包含对应seqidno:45氨基酸100‑110的几乎所有铰链序列；seqidno:45所示ch2和ch3结构域的完整序列。[0442]另一示范性fc多肽如pct申请公开号wo93/10151所示，且是从人igg1抗体(seqidno:50)n末端铰链区延伸到天然c末端fc区的单链多肽。形成连接的精确位点并不关键：熟知具体位点且能选择以优化habp多肽的生物活性、分泌或结合特征。例如，其他示范性fc多肽序列在seqidno:45所示序列的氨基酸c109或p113处开始(参见例如美国公开号2006/0024298)。[0443]除了higg1fc，还能使用其他fc区和其他多聚化结构域。例如，当由fc/fcγr相互作用介导的效应子功能最小化时，考虑与募集补体或效应细胞较弱的igg亚型融合，例如igg2或igg4的fc。另外，fc融合能包含免疫球蛋白序列，其基本由属于任意抗体种类的免疫球蛋白基因编码，包括但不限于igg(包含人子类igg1、igg2、igg3或igg4)、iga(包含人子类iga1和iga2)、igd、ige和igm类抗体。接头能用于共价连接fc与另一多肽以产生fc嵌合体。[0444]还熟知经修饰fc结构域。一些示例中，fc区修饰成显示与fcr的结合改变，以引起效应子功能相比野生型免疫球蛋白重链fc区的效应子功能改变(即更多或更少)。因此，经修饰fc结构域可具有改变的亲和性，包括但不限于对fc受体的亲和性增加或较低或没有。例如，不同igg子类对fcγrs的亲和性不同，igg1和igg3通常对受体的结合显著优于igg2和igg4。不同fcγrs介导不同的效应子功能。fcγr1,fcγriia/c和fcγriiia是免疫复合物引发激活的正调节物，其特征是具有带免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的胞内结构域。然而，fcγriib具有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)并因而是抑制性的。改变fc区对受体的亲和性能调节与fc结构域相关的效应子功能和/或药代动力学性质。经修饰fc结构域为本领域技术人员已知且描述于文献，示范性修饰参见例如美国专利号5,457,035；美国专利公开号us2006/0024298；和国际专利公开号wo2005/063816。[0445]所得嵌合多肽包含fc部分和从中形成的多聚体，易通过蛋白a或蛋白g柱上的亲和层析纯化。[0446]另一示例中，经修饰的u‑pa多肽能连接人血清白蛋白(hsa)，如hsa的残基25‑608，或全长或其部分：[0447][0448]c.缀合聚合物[0449]一些示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽缀合其他聚合物。聚合物能增加多肽大小以降低肾脏清除并因而提高半衰期或修饰蛋白结构以增加半衰期或减少免疫原性。能缀合u‑pa多肽的示范性聚合物包括天然和合成均聚物，如多元醇(即聚oh)、多胺(即聚nh2)和聚羧酸(即聚cooh)以及其他杂聚物，即包含一个或多个不同偶联基团的聚合物，如羟基和胺基。合适聚合分子的示例包括选自以下的聚合分子：聚环氧烷(pao)如聚烷撑二醇(pag)，包括聚乙二醇(peg)、聚乙二醇单甲醚(mpeg)和聚丙二醇，peg‑缩水甘油醚(epox‑peg)、peg‑氧羰基咪唑(cdi‑peg)、支化聚乙二醇(pegs)、聚乙烯醇(pva)、聚羧酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、聚‑d,l‑氨基酸、乙烯马来酸酐共聚物、苯乙烯马来酸酐共聚物、葡聚糖，包括羧甲基‑葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素、壳聚糖水解产物、淀粉如羟乙基‑淀粉和羟丙基‑淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物、瓜尔胶、普鲁兰多糖、菊粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、海藻酸水解产物和生物聚合物。[0450]通常，聚合物是聚环氧烷(pao)如聚氧化乙烯，例如peg，一般是mpeg，其具有一些能够交联的反应基。通常，聚合物是无毒聚合分子如(甲氧基)聚乙二醇(mpeg)，其可用相对简单的化学方法共价缀合u‑pa多肽(如蛋白表面的粘附基团)。[0451]用于附着u‑pa多肽的合适聚合分子包括但不限于：聚乙二醇(peg)和peg衍生物如甲氧基‑聚乙二醇(mpeg)、peg‑缩水甘油醚(epox‑peg)、peg‑氧羰基咪唑(cdi‑peg)、分枝peg和聚氧化乙烯(peo)(参见例如roberts等,advanceddrugdeliveryreview2002,54:459‑476；harris和zalipsky(编.)“聚乙二醇，化学和生物应用(poly(ethyleneglycol),chemistryandbiologicalapplications)”acssymposiumseries680,1997；mehvar等,j.pharm.pharmaceut.sci.,3(1):125‑136,2000；harris和chess(2003)natrevdrugdiscov.2(3):214‑21；和tsubery,jbiol.chem279(37):38118‑24,2004)。聚合分子可具有范围为约3kda‑约60kda的分子量。在一些实施方案中，所述缀合本文所提供经修饰的u‑pa多肽的聚合分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kda的分子量。[0452]经共价粘附(缀合)peg或peg衍生物(即“聚乙二醇化”)来修饰多肽的方法为本领域熟知(参见例如u.s.2006/0104968；u.s.5,672,662；u.s.6,737,505；和u.s.2004/0235734)。聚乙二醇化的技术包括但不限于专门接头和偶联化学(参见例如harris,adv.drugdeliv.rev.54:459‑476,2002)、使多个peg部分附于单缀合位点(如通过使用支化peg；参见例如veronese等,bioorg.med.chem.lett.12:177‑180,2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如chapman等,naturebiotech.17:780‑783,1999)和定向酶促聚乙二醇化(参见例如sato,adv.drugdeliv.rev.,54:487‑504,2002)(还参见例如lu和felix(1994)int.j.peptideproteinres.43:127‑138；lu和felix(1993)peptideres.6:142‑6,1993；felix等.(1995)int.j.peptideres.46:253‑64；benhar等.(1994)j.biol.chem.269:13398‑404；brumeanu等.(1995)jimmunol.154:3088‑95；还参见caliceti等.(2003)adv.drugdeliv.rev.55(10):1261‑77和molineux(2003)pharmacotherapy23(8pt2):3s‑8s)。本领域所述方法和技术能生成蛋白，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个peg或peg衍生物附于单蛋白分子。[0453]本领域描述用于聚乙二醇化的多种试剂。这类试剂包括但不限于：n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化peg、琥珀酰亚胺mpeg、mpeg2‑n‑羟基琥珀酰亚胺、mpegα‑甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丙酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg羧甲基3‑羟丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg‑丙酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg丙醛、同双功能peg丁醛、peg马来酰亚胺、peg酰肼、对硝基苯碳酸酯peg、mpeg‑苯并三唑碳酸酯、丙醛peg、mpeg丁醛、分枝mpeg2丁醛、mpeg乙酰、mpeg哌啶酮、mpeg甲基酮、mpeg“无接头”马来酰亚胺、mpeg乙烯砜、mpeg硫醇、mpeg邻吡啶硫酯、mpeg邻二硫吡啶、fmoc‑peg‑nhs、boc‑peg‑nhs、乙烯砜peg‑nhs、丙烯酸peg‑nhs、荧光素peg‑nhs和生物素peg‑nhs(参见例如monfardini等,bioconjugatechem.6:62‑69,1995；veronese等,j.bioactivecompatiblepolymers12:197‑207,1997；u.s.5,672,662；u.s.5,932,462；u.s.6,495,659；u.s.6,737,505；u.s.4,002,531；u.s.4,179,337；u.s.5,122,614；u.s.5,183,550；u.s.5,324,844；u.s.5,446,090；u.s.5,612,460；u.s.5,643,575；u.s.5,766,581；u.s.5,795,569；u.s.5,808,096；u.s.5,900,461；u.s.5,919,455；u.s.5,985,263；u.s.5,990,237；u.s.6,113,906；u.s.6,214,966；u.s.6,258,351；u.s.6,340,742；u.s.6,413,507；u.s.6,420,339；u.s.6,437,025；u.s.6,448,369；u.s.6,461,802；u.s.6,828,401；u.s.6,858,736；u.s.2001/0021763；u.s.2001/0044526；u.s.2001/0046481；u.s.2002/0052430；u.s.2002/0072573；u.s.2002/0156047；u.s.2003/0114647；u.s.2003/0143596；u.s.2003/0158333；u.s.2003/0220447；u.s.2004/0013637；us2004/0235734；u.s.2005/000360；u.s.2005/0114037；u.s.2005/0171328；u.s.2005/0209416；ep01064951；ep0822199；wo00176640；wo0002017；wo0249673；wo9428024；和wo0187925)。[0454]d.蛋白转导结构域[0455]可连接本文所提供经修饰的u‑pa多肽，如含抗体或其抗原结合片段的融合蛋白，缀合蛋白转导结构域(ptd)，这增加抗体在治疗靶位点的保留，如粘膜位点例如眼睛。可采用任何ptd，只要ptd促进在治疗位点(如粘膜位点)的靶细胞表面结合和/或靶细胞在治疗位点(如粘膜位点例如眼睛)摄取经修饰的u‑pa多肽。[0456]一般，ptd包括短的阳离子肽，其能通过静电粘附细胞膜而结合细胞表面且能通过膜转位被细胞摄取(kabouridis(2003)trendsbiotech21(11)498‑503)。所提供的ptd一般与靶细胞相互作用，这是通过结合糖胺聚糖(gag)例如透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白或硫酸软骨素和其衍生屋。[0457]蛋白转导结构域可以是任何长度。一般，ptd长度范围是5或约5‑100或约100个氨基酸长度。例如，ptd长度范围可以是5或约5‑25或约25个氨基酸长度。一些示例中，ptd是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸长度。[0458]单一ptd或其集合能缀合经修饰的u‑pa多肽。这些有利地用于治疗眼部或眼科疾病，例如糖尿病视网膜病变或黄斑变性，包括amd。例如，多拷贝的相同ptd(如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或更大的多聚体)或不同ptd能缀合经修饰的u‑pa多肽。[0459]数种蛋白和其肽衍生物具备细胞内化性质。本领域已知示范性ptd，包括但不限于下表所示的ptd，包括例如衍生自以下的ptd：人类免疫缺陷病毒1(hiv‑1)tat(seqidno:125‑135；ruben等.(1989)j.virol.63:1‑8),疱疹病毒被膜蛋白vp22(seqidno:140；elliott和o’hare(1997)cell88:223‑233),黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)触角足(antp)蛋白的同源异型蛋白(penetratinptd；seqidno:112；derossi等.(1996)j.biol.chem.271:18188‑18193),protegrin1(pg‑1)抗菌肽synb(例如synb1(seqidno:121),synb3(seqidno:122)和synb4(seqidno:123)；kokryakov等.(1993)febslett.327:231‑236)以及kaposi成纤维细胞生长因子(seqidno:105；lin等,(1995)j.biol.chem.270‑14255‑14258)。[0460]发现其他蛋白和其肽衍生物具备类似的细胞内化性质。衍生自这些蛋白的载体肽显示彼此的序列同源性小，但都是高阳离子和精氨酸或赖氨酸富集。确实，合成的聚精氨酸肽显示以高效率水平内化且能选择用于缀合以提供抗体(futaki等.(2003)j.mol.recognit.16:260‑264；suzuki等.(2001)j.biol.chem.276:5836‑5840)。ptd还能选自一种或多种合成ptd，包括但不限于转运素(seqidno:136；pooga等.(1988)fasebj.12:67–77；pooga等.(2001)fasebj.15:1451–1453),map(seqidno:103；oehlke等.(1998)biochim.biophys.acta.1414:127–139),kala(seqidno:101；wyman等.(1997)biochemistry36:3008–3017)和其他阳离子肽，例如variousβ‑cationicpeptides(akkarawongsa等.(2008)antimicrob.agentsandchemother.52(6):2120‑2129)。其他ptd肽和变异ptd也提供于例如美国专利公开号us2005/0260756,us2006/0178297,us2006/0100134,us2006/0222657,us2007/0161595,us2007/0129305,欧洲专利公开号ep1867661,pct公开号wo2000/062067,wo2003/035892,wo2007/097561,wo2007/053512和本文表13(下面)。本文提供或本领域已知的任何这类ptd能缀合所提供的治疗抗体。[0461][0462][0463]一些示例中，ptd能如下修饰：赖氨酸或精氨酸用另一碱性氨基酸取代，如赖氨酸用精氨酸取代或精氨酸用赖氨酸取代。。[0464]e.用于评价或监测补体介导功能的u‑pa活性的试验[0465]本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示对补体蛋白c3的特异性和/或选择性改变。示范性经修饰的u‑pa多肽特异性切割补体蛋白c3，并因而改变补体激活。此外，本文所提供示范性经修饰的u‑pa多肽对切割天然u‑pa底物如纤溶酶原以及结合upar的特异性和/或选择性改变或降低。[0466]多个体外和体内试验能用于监测或筛选u‑pa多肽切割补体蛋白c3的能力和其对补体激活及补体介导疾病和失调的影响。这类试验为本领域技术人员已知。本领域技术人员能就切割补体蛋白c3测试特定u‑pa多肽和/或测试评估u‑pa对补体介导活性影响相较没有蛋白酶时的任何变化。一些这类试验如本文所示例。[0467]本文提供示范性体外和体内试验用于比较经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3功能的活性。如下所讨论，本领域技术人员已知多种试验，如用于检测补体激活的试验。本文还提供示范性试验以就野生型u‑pa活性如切割纤溶酶原或结合upar而言，测定经修饰的u‑pa多肽活性。还提供确定经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3特异性的试验。示范性试验如下所述。[0468]1.用于评价补体蛋白c3功能的u‑pa活性的方法[0469]相较于对应全长、支架或野生型经修饰u‑pa蛋白酶，经修饰u‑pa蛋白酶能显示对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性改变，从而灭活任意一种或多种补体蛋白，例如c3。经修饰u‑pa蛋白酶保留其蛋白酶活性，但能显示对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加。示范性经修饰u‑pa蛋白酶特异切割任意一种或多种补体蛋白，例如c3，从而改变补体蛋白活性。所有这类经修饰u‑pa蛋白酶是候选治疗剂，其对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加。[0470]经修饰u‑pa蛋白酶在体外和体内试验中显示对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加时，能用于监测或筛选蛋白酶对补体介导功能的影响。本领域技术人员熟知这类试验。本领域技术人员可就切割任意一种或多种补体蛋白例如c3测试经修饰u‑pa蛋白酶，和/或测试经修饰u‑pa蛋白酶对补体介导活性影响相较没有经修饰u‑pa蛋白酶时的任何变化。一些这类试验如本文所示例。[0471]本文提供示范性体外和体内试验以比较经修饰u‑pa蛋白酶对任意一种或多种靶向补体蛋白功能的活性。许多试验可应用于其他蛋白酶和经修饰蛋白酶。如上所讨论，用于补体活性的试验包括但不限于以下试验：检测补体激活的活化产物例如c5b‑9mac复合物，和产生任意一种或多种补体切割产物如c4a,c5a,c3b及c3d。检测补体激活的试验也包括测量补体途径特定成分功能活性的功能试验，例如用于检测激活经典、凝集素或替代途径中任意一种的溶血实验。评价蛋白酶和经修饰蛋白酶对补体蛋白和/或补体介导功能影响的试验包括但不限于：sds分析然后是蛋白质印迹或考马斯亮蓝染色、酶免疫测定和溶血实验。在一个示例中，体外试验能用纯化补体蛋白进行。另一示例中，体内试验能如下进行：就补体功能激活测试物种血清，包括哺乳动物或人种。示范性试验如下所述。[0472]在一个示例中，体外试验能用纯化补体蛋白c3进行，如实施例2‑4所例示。另一示例中，体外试验能在生理相关溶液(即玻璃体液)中实施，如实施例5所例示。另一示例中，体外试验能用肽文库进行以评价切割特异性。另一示例中，可实施试验以评价经修饰的u‑pa多肽的正常功能，即针对正常底物的活性。本领域技术人员已知的多个疾病模型能用于测试本文所提供u‑pa多肽对多种补体介导疾病和失调的功效。[0473]a.蛋白检测[0474]蛋白检测是测量样品中个体补体蛋白的方式。可检测补体蛋白以评价u‑pa多肽对切割补体蛋白c3的影响，或者补体蛋白能作为评价补体激活的方式测量。补体蛋白c3在有或没有u‑pa多肽的情况下处理，能通过任意一种或多种试验分析，包括sds‑page然后是考马斯亮蓝染色或蛋白质印迹、酶免疫测定、免疫组化、流式细胞术、浊度测定、琼脂凝胶扩散或放射免疫扩散。用于蛋白检测的示范性试验如下所述。[0475]i.sds‑page分析[0476]有或没有增加u‑pa多肽浓度情况下的补体蛋白分析可如下进行：在sds‑page上分析蛋白，然后检测这些蛋白。这类示例中，可检测补体蛋白，这是通过染色总蛋白，如考马斯亮蓝染色、银染，或通过本领域技术人员已知的任何其他方法，或者通过蛋白质印迹，使用特异于指定蛋白的多克隆或单克隆抗体。通常，纯化的补体蛋白例如补体蛋白c3能在有或没有u‑pa多肽的情况下孵育。经处理补体蛋白可在sds‑page胶上解析，然后采用检测胶中蛋白的方法，例如考马斯亮蓝染色。经处理蛋白可与其同源全长蛋白作比较，可测定通过蛋白酶切割蛋白所形成的降解产物。[0477]在另一实施方案中，样品例如人血清或血浆，能在有或没有u‑pa多肽的情况下处理，或能在有或没有u‑pa多肽情况下处理动物或人之后收集。经u‑pa处理样品可在sds‑page胶上分析，且可检测特异补体蛋白，例如c3、c5或因子b，这是通过蛋白质印迹，使用针对该蛋白的单克隆或多克隆抗体。切割补体蛋白能与未用u‑pa多肽处理的样品作比较。另外，可刺激样品起始补体激活，例如通过与刺激经典途径激活的igg孵育，或通过刺激替代途径激活的lps。样品可在sds‑page上解析以检测任意一种或多种天然补体蛋白，从而确定相较未用u‑pa多肽处理的蛋白样品，是否存在指定蛋白的切割产物。这类示例中，天然补体蛋白的切割效应分子还能通过蛋白质印迹分析，使用单克隆和多克隆抗体以评价一个或多个补体途径的激活。补体效应分子示例可包括但不限于c3a、c3d、ic3b、bb和c5‑b9。例如，bb样品中的表达减少可能指示u‑pa多肽抑制补体替代途径激活。还能确定效应分子的切割产物以评估增加u‑pa多肽浓度本身对切割补体效应分子的影响。[0478]ii.酶免疫测定[0479]酶免疫测定(eia；也称为酶联免疫吸附试验；elisa)是测量样品中蛋白存在的试验。通常，检测蛋白是间接测量蛋白与抗体结合，抗体本身就化学标记有可检测底物如酶或荧光化合物。通过测量补体激活后产生的补体效应分子是否存在，eia试验能用于检测u‑pa多肽对补体激活的影响。这类示例中，样品例如人血清或血浆，能在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下预处理，随后通过起始分子孵育来活化以诱导补体激活，或者能在动物或人用u‑pa多肽处理后收集。例如，经典途径可通过igg孵育激活，替代途径可通过样品与lps孵育激活。特异于凝聚素途径的补体激活试验需要补体经典途径受抑制，因为凝聚素途径的c4/c2切割活性与补体经典途径共有。抑制经典途径可用高离子强度缓冲液实现，其抑制c1q结合免疫复合物并破坏c1复合物，而高离子强度缓冲液不影响mbl的碳水化合物结合活性。因此，凝聚素途径的激活能通过样品如人血清或血浆与甘露包被表面孵育来诱导，存在1mnacl。[0480]激活后，样品能通过添加pefabloc(罗氏(roche))和edta来淬灭，以尽可能减少途径的持续激活。可通过eia或elisa试验分析样品是否存在补体效应分子。本领域技术人员熟知用于测量补体蛋白的eia和elisa试验。可评估任何补体激活产物。用于测量补体激活的示范性补体激活产物包括ic3b、bb、c5b‑9、c3a、c3a‑desarg和c5a‑desarg。活化的补体途径可根据所测补体激活产物来测定。例如，测量bb切割产物是替代途径的独特标记。[0481]在一些示例中，eia能与检测经切割补体蛋白配对，这是通过sds‑page然后蛋白质印迹分析来分析蛋白酶处理、补体刺激的样品，以鉴定特定补体成分。使用密度测定软件，切割补体产物能与试验中切割的全长补体成分作比较，可测定所有主要降解产物的外观和切割百分比。[0482]iii.放射免疫扩散(rid)[0483]放射免疫扩散(rid)是依赖免疫复合物沉淀的技术，其在灌入时于纳入凝胶的抗体之间形成，且测试样品中存在的抗原引起样品孔周围的循环沉淀素线。沉淀素环的直径与测试样品中存在的抗体(或抗原)浓度成比例。通过比较测试样本沉淀素环的直径与已知标准，可实现特定抗体或抗原浓度的相对不灵敏估计。rid能用于检测样品中补体蛋白的量。例如，样品如人血清或血浆可在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下处理。蛋白酶预处理的样品能加入琼脂糖凝胶孔，所述孔制备成纳入针对任何一种补体蛋白的多克隆或单克隆抗体，所述补体蛋白例如包括但不限于c3、c5、c6、c7、c9或因子b。通过暴露于0.15mnacl而移除未沉淀蛋白后，沉淀蛋白环能通过蛋白染料染色来评价，例如考马斯亮蓝或crowles双染色。[0484]b.溶血实验[0485]功能性溶血实验提供关于补体功能的整体信息。此类试验采用抗体致敏或未致敏绵羊红细胞。溶血实验包括总溶血补体实验(ch50)，其测量经典途径和mac裂解绵羊rbc的能力。其依赖于经典途径成分(c1‑c9)连续激活以裂解绵羊红细胞，所述细胞用最优量的兔抗绵羊红细胞抗体致敏以制备细胞抗原‑抗体复合物。溶血实验还可包括替代途径ch50试验(兔ch50或apch50)，其测量替代途径和mac裂解兔rbc的能力。一个ch50和/或apch50单位定义为裂解测试中50％红细胞所需的血清量或稀释度。通常，为评价补体激活，样品如人血清或血浆可在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下处理，或可在有或没有u‑pa多肽情况下处理动物或人之后收集。蛋白酶处理的样品能随后混合用igg激活或致敏的绵羊红细胞。仅混合绵羊红细胞的水样品能用作总裂解对照以精确评估所分析样品的裂解百分比。向样品加入0.15mnacl可添加到终止裂解反应。通过测量血红蛋白释放，可评估经激活补体途径末端成分诱导的红细胞裂解。测量可通过样品的光密度(od)读数，使用od415nm处的分光光度计。[0486]在一个实施方案中，限制稀释溶血实验能用于测量任一途径特定成分的功能活性。这类试验中，采用的血清来源具有过量的所有补体成分，但缺乏样品所测成分，即培养基或血清来源就特定蛋白而言是补体耗尽的。因此，溶血取决于测试样品中所测成分的存在。这类试验中，纯化的补体蛋白例如任意一种天然补体蛋白，包括但不限于c3，可在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下孵育。然后，蛋白酶处理的纯化补体蛋白能混合补体耗尽的培养基或血浆，igg活化绵羊红细胞和样品溶血可如上所述评估。在另一实施方案中，蛋白裂解能与补体激活相关联，这是通过测定蛋白酶处理样品的溶血活性，接着在sds‑page胶上分析样品，然后用蛋白染色剂染色，例如考马斯亮蓝。可就切割评价蛋白酶处理的纯化补体蛋白，可计算整个试验中切割的全长补体成分百分比。或者，蛋白酶处理的补体蛋白能通过蛋白质印迹分析。[0487]溶血实验的一个替代方案称为脂质体免疫测定(lia)，能用于评价经典途径的激活。lia(美国化学品公司(wacochemicalsusa),弗吉尼亚州里士满)采用二硝基苯基(dnp)包被的脂质体，其含有葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶。当血清混合脂质体和含有抗dnp抗体、葡萄糖‑6‑磷酸及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的底物时，活化的脂质体裂解且酶促比色反应发生，所述反应与总经典补体活性成比例。[0488]c.确定切割位点的方法[0489]补体蛋白c3的切割序列能通过本领域已知任何方法鉴定(参见例如发表的美国公开号us2004/0146938)。在一个示例中，通过孵育补体蛋白c3与本文所提供任意经修饰的u‑pa多肽，确定切割序列。u‑pa多肽孵育后，c3蛋白能通过sds‑page分离且降解产物能通过蛋白染色剂如考马斯亮蓝染色来鉴定。蛋白裂解片段可测序以确定切割序列的特性。鉴定后，基于所需靶底物切割序列设计的荧光肽底物能用于评价活性，如下所述。[0490]2.评价野生型u‑pa活性的方法[0491]本文所提供经修饰的u‑pa多肽对纤溶酶原和upar的特异性改变或降低。可测试u‑pa多肽以确定其就天然底物纤溶酶原而言是否保留催化效率和/或底物特异性。例如，切割纤溶酶原能如下评价：孵育u‑pa多肽与纤溶酶原，检测蛋白切割产物。另一示例中，切割纤溶酶原能如下体外测定：测量肽底物的荧光标记四肽的切割，所述底物例如荧光底物如连接四肽底物的荧光团acc(7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基香豆素)或amc(7‑氨基‑4‑甲基香豆素)。一些示例中，纤溶酶原激活试验用于确定本文所提供经修饰的u‑pa多肽的特异性。在其他示例中，确定本文所提供u‑pa多肽结合u‑pa受体(upar)的能力。[0492]a.切割纤溶酶原[0493]在一个示例中，经修饰的u‑pa多肽能用对应所需切割序列的单独荧光肽底物测定。例如，可切割任意一种或多种所需切割序列的经修饰u‑pa蛋白酶的测定方法包括：(a)使肽荧光样品(包含所需靶切割序列)接触蛋白酶，采用的方式使荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物序列释放，从而生成荧光部分；和(b)观察样品是否发生荧光的可检测变化，可检测变化指示样品中存在酶活性蛋白酶。这种示例中，所需靶切割序列通过本领域已知方法制备到荧光肽内。在一个实施方案中，所述单独肽切割序列能附于荧光标记底物例如acc或amc荧光离去基团，荧光部分的释放能作为蛋白酶对肽切割序列特异性的量度测定。靶切割序列的荧光增加率可用例如荧光分光光度计测量。荧光增加率能随着时间测量。米氏动力学常数可通过标准动力学方法确定。动力学常数kcat、km和kcat/km能如下计算：将底物浓度的倒数相比底物切割速度的倒数作图，并拟合lineweaver‑burk方程(1/速度＝(km/vmax)(1/[s]) 1/vmax；其中vmax＝[et]kcat)。二阶速度常数或特异性常数(kcat/km)是底物如何更好被特定蛋白酶切割的量度。例如，可制备acc‑或amc‑四肽如ac‑cpgr‑amc并与本文所提供经修饰的u‑pa多肽孵育，u‑pa多肽活性能通过测定荧光部分释放来评价。四肽的选择取决于靶标的所需切割序列且能凭经验确定。[0494]在其他实施方案中，也能分析u‑pa多肽以确认其处于活性形式时，切割全长蛋白情况下存在的所需序列。在一个示例中，纯化的靶蛋白即纤溶酶原能在有或没有选定u‑pa多肽的情况下孵育，监测切割事件可通过sds‑page，然后是用于蛋白的考马斯亮蓝染色和采用密度测定的切割产物分析。[0495]b.纤溶酶原激活试验[0496]本领域技术人员已知的任何试验能用于确定u‑pa多肽是否激活纤溶酶原。在一个示例中，纤溶酶原的激活可通过在纤溶酶原和可检测纤溶酶底物存在下孵育多肽来确定，所述底物例如生色底物h‑d‑val‑leu‑lys‑对硝基苯胺(chromogenixs‑2251)或荧光底物h‑d‑val‑leu‑lys‑7‑氨基‑4‑甲基香豆素。水解随后如下监测：在405nm测量吸光度，或用荧光读板仪检测荧光，激发波长为390nm且发射波长为480nm。另一示例中，评价纤溶酶原的激活，同时u‑pa多肽结合upar。这类示例中，u‑pa多肽首先结合细胞如u397细胞表面上的upar，然后加入纤溶酶原和可检测纤溶酶底物，且水解如上所述测量。[0497]c.u‑pa‑upar结合试验[0498]u‑pa多肽与upar的结合可通过本领域技术人员已知的任何试验评估，以检测蛋白‑蛋白结合相互作用，包括但不限于固相结合试验、elisa、表面等离子体共振和facs。在一个示例中，可使用elisa。重组upar固定于微量滴定板上，u‑pa多肽结合通过加入特异性结合u‑pa的试剂来评估，例如u‑pa结合抗体。另一示例中，结合能在基于细胞的试验中测定，使用细胞系例如表达u‑pa受体的u397细胞。u‑pa多肽能用例如生色、荧光或放射性底物标记以实现结合检测。[0499]d.c3切割[0500]经修饰upa多肽的活性能经底物补体蛋白人c3的切割来评估，这是通过测量多个浓度的经修饰upa蛋白酶孵育之后剩余的完整人c3含量。根据此试验，信号在完整人c3存在情况下产生，且随着c3切割而丧失。其他示例中，c3激活试验用于确定本文所提供经修饰upa多肽的特异性。[0501]纯化的c3蛋白可与经修饰的u‑pa多肽孵育，未消化人c3的残留水平能通过本领域技术人员已知的任何评价蛋白浓度的试验定量，例如使用放大发光邻近均相分析(珀金埃尔默(perkinelmer))。c3/upa多肽混合物与α‑小鼠igg包被的受体珠孵育，且孵育后，α‑hc3mab/受体珠混合物用生物素化α‑hc3pab孵育。链霉亲和素包被的供体珠加入混合物，随后测量‘alphascreen’信号(激发＝680nm,发射＝570nm)。此信号对应于剩余c3蛋白浓度。可计算切割50％可用hc3(ec50)所需的upa多肽浓度。[0502]acc‑agr elisa[0503]本文提供评价经修饰的u‑pa多肽的底物特异性的方法。使用发光肽底物例如7‑氨基‑4‑甲基香豆素(amc)发光肽底物或7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基香豆素(acc)发光肽底物，能用于测定经修饰蛋白酶活性，其中荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物中释放，荧光部分的释放能作为蛋白酶对肽切割序列特异性的量度测定。非靶底物切割序列或靶切割序列的增加率能用例如荧光分光光度计测量。荧光增加率能随着时间检测。米氏动力学常数可通过标准动力学方法确定。动力学常数kcat,km和kcat/km能如下计算：将底物浓度的倒数相比底物切割速度的倒数作图，并拟合lineweaver‑burk方程(1/速度＝(km/vmax)(1/[s]) 1/vmax；其中vmax＝[et]kcat)。特异性常数(kcat/km)是底物如何更好被特定蛋白酶切割的量度。[0504]在一个示例中，可测定补体蛋白的任意一种或多种切割序列并用作所需靶切割序列。例如，任意一种或多种c3切割序列。另一示例中，对应野生型蛋白酶底物的序列能用于分析剩余蛋白酶活性。[0505]在一个另外的实施方案中，全长补体蛋白能用作靶底物以相较于蛋白酶全长天然靶底物测定蛋白酶特异性。此外，全长补体蛋白能用于评价底物特异性与全长靶底物蛋白酶切割相比靶底物内所含四氨基酸p1‑p4底物切割序列之间的关联。在一个示例中，全长c3蛋白能用作任意一种或多种蛋白酶的所需切割靶标以评价特异性。此示例中，经修饰蛋白酶切割c3能与另一全长底物切割作比较，或该切割能与c3的荧光四肽切割序列作比较。全长蛋白通过蛋白酶切割的特异性常数可用凝胶密度测量确定，以评价在蛋白酶存在下孵育的全长靶底物带随着时间的密度测量变化。[0506]在一个另外的实施方案中，经修饰的u‑pa多肽的活性能在猕猴血浆或玻璃体液中延长孵育后评价。在一个示例中，剩余蛋白酶活性在80％猕猴玻璃体液中孵育后用荧光底物agr‑acc(7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基‑香豆素)测定。例如，seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽显示在玻璃体和pbs中孵育7天后切割荧光底物agr‑acc的能力相当。另一示例中，seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽在玻璃体液中孵育7天之前和之后切割荧光底物agr‑acc的水平相似。[0507]用肽文库评价特异性[0508]本文提供评价所得经修饰的u‑pa多肽的底物特异性的方法，使用偶联荧光肽的肽文库。经修饰的u‑pa多肽可在任何给定亚位点确认p1‑p4底物特异性，使用偶联荧光底物的肽文库(harris等,(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.97:7754；us2004/0175777；us2004/0146938)。使用一个或多个肽文库允许快速而容易确定蛋白裂解底物。此策略涉及使用肽文库，其中文库内的一个位置保持恒定(即p1位置)，而剩余位置(即p4‑p2和/或p1'和/或p2')由用于制备文库的所有氨基酸组合构成。使用组合荧光肽底物文库例如7‑氨基‑4‑甲基香豆素(amc)荧光肽底物或7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基香豆素(acc)荧光肽底物，能用于测定经修饰蛋白酶活性，其中荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物中释放。本领域技术人员应理解这些方法提供多种替代文库形式。在一个示例中，蛋白酶能用p1‑多样性文库配置。p1‑多样性四肽文库包含acc‑或amc‑荧光四肽，其中p1位置系统性保持恒定，而p2、p3和p4位置包含15个氨基酸中任意一种或多种的等摩尔混合物。确定和考虑与具体酶相关的特定限制或底物序列特异性确定方法在本领域技术人员能力范围内。[0509]本领域技术人员认可存在许多方法制备肽。在一个示范性实施方案中，所述底物库通过将荧光标记底物附于固体支撑物来筛选。在一个示例中，来自底物肽的荧光离去基团如下合成：n‑fmoc香豆素衍生物缩合到酸不稳定性rink接头以提供acc树脂(backes等,(2000)natbiotechnol.18:187)。移出fmoc可生成游离胺。天然、非天然和修饰氨基酸能偶联胺，这能通过偶联额外氨基酸阐明。在一个替代的实施方案中，所述荧光离去基团可以是7‑氨基‑4‑甲基香豆素(amc)(harris等,(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.97:7754)。肽合成完成后，肽‑荧光部分缀合物可从固体支撑物切去，或者，缀合物保持连接(tethered)于固体支撑物。[0510]通常，制备荧光肽或包含荧光肽的材料的方法包括：(a)提供含有荧光部分的第一缀合物，其共价结合固体支撑物；(b)使第一缀合物接触第一受保护氨基酸部分和活化剂，从而在羧基与第一缀合物的胺氮之间形成肽键；(c)脱保护，从而形成具有反应性胺部分的第二缀合物；(d)使第二缀合物接触第二受保护氨基酸和活化剂，从而在羧基与反应性胺部分之间形成肽键；和(e)脱保护，从而形成具有反应性胺部分的第三缀合物。在一个示范性实施方案中，所述方法还包括：(f)使第三缀合物接触第三受保护氨基酸和活化剂，从而在羧基与反应性胺部分之间形成肽键；和(e)脱保护，从而形成具有反应性胺部分的第四缀合物。[0511]对于难以偶联的氨基酸(如ile,val等)，游离、未反应的胺能保持在支撑物上且使后续合成和试验操作复杂化。在dmf中采用乙酸的3‑硝基三唑活性酯的专门加帽步骤可有效酰化剩余苯胺。未纯化底物序列溶液中能存在的所得乙酸加帽的香豆素一般不是蛋白酶底物序列。[0512]固相肽合成是制备本文所提供的多肽的肽骨架的示范性方法，其中序列的c末端氨基酸附于不溶性支撑物，然后依序加入序列中的剩余氨基酸。固相合成的技术描述于narany和merrifield,“固相肽合成”(solid‑phasepeptidesynthesis)；第3‑284页，收录于《肽：分析、合成、生物学》(thepeptides:analysis,synthesis,biology).卷2；《肽合成的特殊方法》(specialmethodsinpeptidesynthesis),a部分,gross和meienhofer编.纽约的学术出版社(academicpress),(1980)；和stewart等,(1984)《固相肽合成》(solidphasepeptidesynthesis),第2版.皮尔斯化学有限公司(piercechem.co.),罗克福德,ill。固相合成最易用市售可得肽合成仪完成，采用fmoc或t‑boc化学。[0513]例如，肽合成能用熟知的fmoc合成化学进行。例如，asp、ser、thr和tyr的侧链用叔丁基保护且cys残基的侧链用s‑三苯甲基和s‑叔丁基硫代保护，lys残基用t‑boc、fmoc和4‑甲基三苯甲基保护。适当保护的氨基酸试剂市售可得，或能用本领域认可的方法制备。使用多保护基团允许选择性去块和偶联荧光团与任何特定所需侧链。因此，例如，t‑boc脱保护用溶于二氯甲烷的tfa完成。fmoc脱保护用例如含20％(v/v)哌啶的dmf或n‑甲基吡咯烷酮完成，4‑甲基三苯甲基脱保护用例如溶于水的1‑5％(v/v)tfa或溶于dcm的1％tfa和5％三异丙基硅烷完成。a‑叔丁基硫代脱保护用例如水性巯基乙醇(10％)完成。移出叔丁基、t‑boc和s‑三苯甲基用例如tfa:苯酚:水:巯基乙烷二硫代(85:5:5:2.5:2.5),或tfa:苯酚:水(95:5:5)完成。[0514]任何特定位置或位置组合处的多样性能用至少2、6、12、20种或更多氨基酸的混合物引入，以扩展肽链。氨基酸的混合物可包括任何有用量的特定氨基酸与任何有用量的一个或多个不同氨基酸的组合。在一个实施方案中，所述混合物是氨基酸的等速混合物(采用适当比例的混合物以允许所有组分的等摩尔反应性)。经修饰蛋白酶例如本文所述经修饰u‑pa蛋白酶，能用对应所需切割序列的单独荧光肽底物测定。可切割任意一种或多种c3切割序列的经修饰蛋白酶的测定方法包括：(a)使肽荧光样品(包含c3切割序列)接触蛋白酶，采用的方式使荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物序列释放，从而生成荧光部分；和(b)观察样品是否发生荧光的可检测变化，可检测变化指示样品中存在酶活性蛋白酶。这种示例中，可制备acc‑或amc‑四肽并与经修饰的蛋白酶孵育，该蛋白酶活性能通过测定荧光部分释放来评价。[0515]测定溶液中的蛋白酶仅需要向荧光蛋白酶指示肽加入一定量的蛋白酶储液并测量吸收谱中激发带的后续荧光增加或减少。溶液和荧光指示剂还能组合并在优化蛋白酶活性的“消化缓冲液”中测定。本领域技术人员熟知适合测定蛋白酶活性的缓冲液。一般，选择缓冲液的ph对应于特定蛋白酶最适ph。例如，特别适合测定弹性蛋白酶活性的缓冲液包含50mm磷酸钠,1mmedta,ph8.9。测量最易在荧光计中完成，该仪器提供“激发”光源用于荧光团且随后检测在特定波长后续发射的光。用缺乏蛋白酶的对照指示溶液比较可提供蛋白酶活性量度。活性水平能如下精确定量：产生用于蛋白酶/指示剂组合的标准曲线，其中测定由已知活性的蛋白酶溶液生成的荧光变化速度。[0516]尽管检测荧光化合物能用荧光计完成，检测也能通过本领域技术人员熟知的多种其他方法实现。因此，例如，当荧光团在可见光波长中发射时，检测可以是简单目测响应光源激发的荧光。检测还可以通过图像分析方式，采用接口到数字转换器或其他图像采集系统的摄像机。检测还可以通过经滤器可视化呈现，如在荧光显微镜下。显微镜能提供由操作者简单目测的信号。或者，信号能记录于胶片或使用图像分析系统。信号还能使用图像分析系统或光度计简单实时定量。[0517]因此，例如，用于样品蛋白酶活性的基础试验涉及在缓冲液(在所测定具体蛋白酶的最适ph)或测试条件(如玻璃体液或血清)中悬浮或溶解样品，向缓冲液加入荧光蛋白酶肽指示剂，用分光荧光计监测所得荧光变化，如示于例如harris等,(1998)jbiolchem273:27364。分光荧光计设置成在荧光团激发波长激发荧光团。荧光蛋白酶指示剂是蛋白酶的底物序列，其由于蛋白酶切割指示剂而改变荧光。[0518]还测定经修饰蛋白酶以确认其在全长蛋白背景下呈现时是否切割所需序列。含有c3切割位点的靶底物蛋白处于c3激活切割或活性位点中。本文描述评价靶蛋白切割的方法和/或为本领域熟知。在一个示例中，纯化的补体蛋白例如c3能在有或没有经修饰蛋白酶情况下孵育，监测切割事件可通过sds‑page，然后进行蛋白的考马斯亮蓝染色和采用密度测定的切割产物分析。还测定靶蛋白活性，例如在溶血实验中，使用本文所述或本领域熟知的方法，以确认其功能是否被切割事件破坏。[0519]3.特异性[0520]靶底物如补体蛋白c3或纤溶酶原通过经修饰的u‑pa多肽切割的特异性常数可用凝胶密度测量确定，以评价在u‑pa多肽存在下孵育的全长靶底物随着时间的密度测量变化。在特定实施方案中，经修饰的u‑pa多肽的特异性比较能用于确定经修饰的u‑pa多肽是否相较野生型u‑pa多肽显示对c3的特异性改变，例如增加。通过切割靶底物相较非靶底物(如u‑pa的天然野生型底物)的特异性常数，可测定u‑pa对靶底物如补体蛋白c3的特异性。经修饰的u‑pa多肽对靶底物c3vs非靶底物如纤溶酶原的特异性常数比例，能用于确定经修饰的u‑pa多肽切割的效率比。比较经修饰的u‑pa多肽与野生型u‑pa多肽的切割效率比，能用于评价对靶底物的特异性倍数变化。相较于野生型u‑pa多肽对靶底物相比非靶底物的特异性，特异性可以是至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍或更多。[0521]u‑pa多肽天然底物的切割动力学分析能与补体蛋白c3中所需靶底物切割分析作比较，以评价经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3的特异性。可评估二阶抑制速度常数(ki)以监测经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3的效率和反应性。出于本文目的，经修饰的u‑pa多肽切割c3，从而补体激活受抑制，如实施例所示，其相比未修饰的u‑pa多肽(或用c122s取代修饰的u‑pa多肽，该取代消除游离半胱氨酸，因而减少聚集)具有显著更高的活性，如至少高5倍的活性。例如，seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽在本文所述试验中切割人c3，ec50为19nm，相比之下seqidno:5的野生型蛋白酶结构域为3380nm。[0522]4.疾病模型[0523]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用于本领域技术人员已知的任何临床相关疾病模型，以确定其对补体介导疾病或失调的影响。示范性试验包括但不限于用于以下的试验：移植，包括用人胰岛细胞的体外试验(tjernberg等.(2008)transplantation85:1193‑1199)和用猪肾的离体试验(fiane等.(1999)xenotransplantation6:52‑65)；生物相容性，包括体外人工表面诱发的炎症(lappegard等.(2008)jbiomedmaterresa87:129‑135；lappegard等.(2005)annthoracsurg79:917‑923；nilsson等.(1998)blood92:1661‑1667；schmidt等.(2003)jbiomedmaterresa66:491‑499)；炎症，包括体外大肠杆菌(e.coli)诱发的炎症(mollnes等.(2002)blood100:1867‑1877)和肝素/鱼精蛋白复合物在狒狒中诱发的炎症(soulika等.(2000)clinimmunol96:212‑221)；兔、猴和啮齿动物中的年龄相关的黄斑变性(chi等.(2010)advexpmedbiol703:127‑135；pennesi等.(2012)mol.aspectsmed.33(4):487‑509；fletcher等.(2014)optm.vis.sci.91(8):878‑886；forest等,(2015)diseasemodelsandmechanisms8:421‑427)；和猪(hanto等,(2010)amjtransplant10(11):2421‑2430)及狗(petrinec等,(1996)surgery61:1331‑1337)中的移植肾功能延迟恢复。[0524]f.生成经修饰的u‑pa多肽编码核酸的方法[0525]本文所示经修饰的u‑pa多肽的多肽能通过本领域用于蛋白纯化和重组蛋白表达的熟知方法获得。多肽还能化学合成。包括截短形式在内的修饰或变体可用标准重组dna方法工程化自野生型多肽。例如，经修饰的u‑pa多肽可从野生型多肽工程化，如通过定点突变。[0526]1.制备或分离编码u‑pa多肽的核酸[0527]多肽能通过本领域已知用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法来克隆或分离。这类方法包括pcr扩增核酸和筛选库，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。例如，当多肽通过重组方式生成时，可使用本领域技术人员已知鉴定编码所需基因的核酸的任何方法。本领域的任何可用方法能用于获得全长或部分(即涵盖完整的编码区)编码u‑pa的cdna或基因组dna克隆，如来自细胞或组织来源。[0528]核酸扩增方法能用于分离编码所需多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链式反应(pcr)方法。这类方法示例包括使用perkin‑elmercetus热循环仪和taq聚合酶(geneamp)。含核酸的材料能用作起始材料，从中可分离所需多肽编码核酸分子。例如，dna和mrna制品、细胞提取物、组织提取物、液体样品(如血液、血清、唾液)以及来自健康和/或疾病对象的样品能用于扩增方法。来源可来自任何真核物种，包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬和其他灵长类动物来源。核酸文库也能用作起始材料来源。引物可设计成扩增所需多肽。例如，引物能基于从中产生所需多肽的表达序列来设计。引物能基于多肽氨基酸序列的反向翻译来设计。若需要，简并引物能用于扩增。与所需序列3’和5’末端序列杂交的寡核苷酸引物能用作引物，以通过来自核酸样品的pcr序列扩增。引物能用于扩增完整的全长u‑pa或其截短序列，如编码本文所提供任何可溶性u‑pa多肽的核酸。通过扩增产生的核酸分子能测序并确认以编码所需多肽。[0529]额外核苷酸序列可连接多肽编码核酸分子，包括含有限制性内切核酸酶位点的接头序列以用于将合成基因克隆入载体的目的，例如蛋白表达载体或载体，其设计用于编码dna序列的核心蛋白扩增。此外，指定功能dna元件的额外核苷酸序列可操作连接多肽编码核酸分子。这类序列示例包括但不限于：设计成促进胞内蛋白表达的启动子序列，和设计成促进蛋白分泌的分泌序列例如异源信号序列。本领域技术人员已知这类序列。额外核苷酸残基序列如指定蛋白结合域的碱基序列也能连接编码酶的核酸分子。这种区域包括但不限于促进或编码蛋白的残基序列，其促进酶摄取到特定靶细胞内，或另外改变合成基因的产物的药物动力学。[0530]例如，可加入标记和/或其他部分以协助多肽的检测或亲和纯化。例如，额外核苷酸残基序列如指定表位标签或其他可检测标记的碱基序列也能连接编码酶的核酸分子。这类序列示例包括编码sumo标签或his标签或flag标签的核酸序列。[0531]鉴定和分离的核酸分子随后能插入适当克隆载体。可使用本领域已知的大量载体‑宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰病毒，但载体系统必须与所用宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或质粒如pcmv4、pbr322或puc质粒衍生物或bluescript载体(stratagene,加利福尼亚州拉荷亚)。例如，通过连接dna片段到有互补粘性末端的克隆载体内，可完成插入克隆载体。插入用topo克隆杂体(英杰公司(invitrogen),加利福尼亚州卡尔斯巴德)实现。[0532]如果互补限制性位点用于裂开克隆载体内存在的dna，dna分子末端能酶促修饰。或者，任何所需位点能通过连接核苷酸序列(接头)到dna末端而生成；这些连接的接头可包含编码限制性内切核酸酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。在一种替代方法中，切割的载体和蛋白基因能通过同聚物加尾修饰。[0533]重组分子可引入宿主细胞，例如通过转化、转染、感染、电穿孔和超声细胞穿孔，从而产生了多拷贝基因序列。在特定实施方案中，宿主细胞用重组dna分子转化能够产生多拷贝基因，所述重组dna分子纳入了经分离蛋白基因、cdna或合成的dna序列。因此，基因可如下大量获得：培养转化子，从转化子中分离重组dna分子，且必要时，从经分离重组dna取回插入基因。[0534]除了重组生成，本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用固相技术通过直接肽合成生成(参见例如stewart等.(1969)《固相肽合成》(solid‑phasepeptidesynthesis),whfreeman公司(whfreemanco.),旧金山；merrifieldj(1963)jamchemsoc.,85:2149‑2154)。体外蛋白合成可用手工技术或自动化实施。自动化合成可用例如appliedbiosystems431a肽合成仪(珀金埃尔默,加利福尼亚州福斯特城)实现，依据厂商提供的说明书。多肽的不同片段能用化学方法单独或联合化学合成。[0535]本文还提供活性或活化或可激活形式的经修饰的u‑pa多肽的表达方法，如2链激活形式和二聚体。如本文所讨论和描述及实施例14‑16所例示，可制备编码经修饰的u‑pa多肽融合蛋白的核酸。编码经修饰u‑pa蛋白酶结构域的核酸连接编码其他序列的核酸，包括但不限于分泌信号例如u‑pa信号序列、iggkapp链信号序列、il‑2信号序列、u‑pa的n末端部分(用于生成全长u‑pa)，激活序列例如u‑pa激活序列或弗林蛋白酶序列，和融合伴侣如白蛋白，以改变u‑pa性质如血清半衰期，和/或序列如his标签和/或sumo以增加表达和/或促进分离。这些核酸分子能在本领域技术人员熟知的合适宿主细胞中表达，以生成经修饰u‑pa和/或融合蛋白。一般，核酸编码信号序列或其他运输序列以分泌或运输至纯化用的基因座。纳入编码激活序列的核酸，能用于生成激活形式的经修饰的u‑pa多肽。[0536]2.产生突变体或修饰核酸和编码多肽[0537]本文所提供的修饰可通过标准重组dna技术形成，如对本领域技术人员常规的那些。可采用本领域已知实现靶蛋白中任意一个或多个氨基酸突变的任何方法。方法包括编码核酸分子的标准定点突变(使用例如试剂盒，如可获自stratagene的quikchange)，或通过固相多肽合成方法。[0538]3.载体和细胞[0539]为重组表达一种或多种所需蛋白如本文所述任何经修饰的u‑pa多肽，含有所有或部分编码蛋白的核苷酸序列的核酸能插入合适表达载体，即包含转录和翻译所插入蛋白编码序列必需的元件的载体。必需的转录和翻译信号还可由酶基因的天然启动子和/或其侧翼区提供。[0540]还提供含有酶编码核酸的载体。也提供含有载体的细胞。所述细胞包括真核和原核细胞，且载体适合其中的用途。一般，所述细胞是能够实现编码蛋白糖基化的细胞。[0541]提供含有载体的真核和原核细胞。这类细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌细胞(archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。细胞用于生成其蛋白，这是通过使上述细胞在细胞表达编码蛋白的条件下生长，并回收表达蛋白。出于本文目的，例如，酶能分泌入培养基。[0542]宿主细胞株可就其调节插入序列表达或以所需方式加工表达蛋白的能力进行选择。这样的多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。翻译后加工能影响多肽的折叠和/或功能。不同宿主细胞例如但不限于cho(dg44、dxb11、cho‑k1)、hela、mcdk、293和wi38，具有用于这类翻译后活性的特定细胞机器和特征机制，且能选择成确保正确修饰和加工所引入蛋白。一般，细胞选择的是能够引入n‑连接糖基化到所表达多肽内的细胞。因此，提供含有载体的真核细胞。真核细胞示例是哺乳动物中国仓鼠卵巢(cho)细胞。例如，缺乏二氢叶酸还原酶的cho细胞(如dg44细胞)用于生成本文所提供多肽。[0543]提供的载体包含编码经修饰的u‑pa多肽的核苷酸序列，偶联天然或异源信号序列以及其多拷贝。能选择载体以表达细胞中的酶蛋白或从而酶蛋白作为分泌蛋白表达。[0544]在一个实施方案中，提供的载体包含核苷酸序列，其编码具有蛋白酶活性的多肽且包含所有或部分蛋白酶结构域，或其多个拷贝。还提供包含核苷酸序列的载体，其编码蛋白酶结构域和额外部分的蛋白酶蛋白，多至且包括全长蛋白酶蛋白，以及其多个拷贝。能选择载体以在细胞中表达支架或经修饰蛋白酶蛋白或其蛋白酶结构域，或从而蛋白酶蛋白作为分泌蛋白表达。当蛋白酶结构域表达时，所述核酸连接编码分泌信号的核酸，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)α‑接合因子信号序列或其部分或天然信号序列。[0545]多种宿主‑载体系统能用于表达蛋白编码序列。这些包括但不限于感染有病毒(如痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)的哺乳动物细胞系统；感染有病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或转化有噬菌体、dna、质粒dna或粘粒dna的细菌。载体表达元件的强度和特异性不同。根据所用宿主‑载体系统，可使用一些适当转录和翻译元件中的任意一种。[0546]本领域技术人员已知的用于将dna片段插入载体的任何方法能用于构建表达载体，所述载体包括含有适当转录/翻译对照信号和嵌合基因和蛋白编码序列。这些方法可包括体外重组dna和合成技术及体内重组(遗传重组)。表达编码蛋白或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列，可由第二核酸序列调节，从而基因或其片段在转化有重组dna分子的宿主中表达。例如，蛋白表达能通过本领域已知的任何启动子/增强子控制。在一个特定实施方案中，所述启动子对所需蛋白的基因而言非天然。可使用的启动子包括但不限于sv40早期启动子(bernoist和chambon,nature290:304‑310(1981)),劳斯肉瘤病毒3’长末端重复所含启动子(yamamoto等.cell22:787‑797(1980)),疱疹胸苷激酶启动子(wagner等,proc.natl.acad.sci.usa78:1441‑1445(1981)),金属硫蛋白基因的调控序列(brinster等,nature296:39‑42(1982))；原核表达载体如β‑内酰胺酶启动子(jay等,(1981)proc.natl.acad.sci.usa78:5543)或tac启动子(deboer等,proc.natl.acad.sci.usa80:21‑25(1983)；还参见“来自重组细菌的有用蛋白(usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”:收录于scientificamerican242:79‑94(1980))；含有胭脂碱合酶启动子的植物表达载体(herrara‑estrella等,nature303:209‑213(1984))或花椰菜花叶病毒35srna启动子(garder等,nucleicacidsres.9:2871(1981)),和光合酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(herrera‑estrella等,nature310:115‑120(1984))；来自酵母和其他真菌的启动子如gal4启动子,醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子碱性磷酸酶启动子以及显示组织特异性且用于转基因动物的下列动物转录控制区:弹性蛋白酶i基因控制区，其在胰腺泡细胞中具有活性(swift等,cell38:639‑646(1984)；ornitz等,coldspringharborsymp.quant.biol.50:399‑409(1986)；macdonald,hepatology7:425‑515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰岛β细胞中具有活性(hanahan等,nature315:115‑122(1985)),免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴样细胞中具有活性(grosschedl等,cell38:647‑658(1984)；adamsetal.,nature318:533‑538(1985)；alexander等,mol.cellbiol.7:1436‑1444(1987)),小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中具有活性(leder等,cell45:485‑495(1986)),白蛋白基因控制区，其在肝中具有活性(pinckert等,genesanddevel.1:268‑276(1987)),甲胎蛋白基因控制区，其在肝中具有活性(krumlauf等,mol.cell.biol.5:1639‑1648(1985)；hammer等,science235:53‑58(1987)),α‑1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中具有活性(kelsey等,genesanddevel.1:161‑171(1987)),β珠蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中具有活性(magram等,nature315:338‑340(1985)；kollias等,cell46:89‑94(1986)),髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑部少突胶质细胞中具有活性(readhead等,cell48:703‑712(1987)),肌球蛋白轻链‑2基因控制区，其在骨骼肌中具有活性(shani,nature314:283‑286(1985)),和促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑中具有活性(mason等,science234:1372‑1378(1986))。[0547]在一个特定实施方案中，使用的载体包含与编码所需蛋白或其结构域、片段、衍生物或同源物的核酸可操作连接的启动子，一个或多个复制起点，和任选存在的一个或多个选择性标记(如抗生素抗性基因)。根据表达系统，有效翻译u‑pa序列还需要特定起始信号。这些信号包括atg起始密码子和相邻序列。在u‑pa的起始密码子和上游序列或其催化活性片段插入适当表达载体时，不需要额外翻译控制信号。在仅插入编码序列或其部分的情况中，必须提供包括atg起始密码子在内的外源转录控制信号。此外，起始密码子必须在正确的读框内以确保完整插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可具有不同来源，可以是天然以及合成的。通过纳入对所用细胞系统合适的增强子，能提高表达效率(scharf等.(1994)resultsproblcelldiffer20:125‑62；bittner等.(1987)methodsinenzymol,153:516‑544)。no:1‑6、8‑44和52‑75任一者所示的蛋白酶结构域或与seqidno:1‑6、8‑44和52‑75任一者所示的序列显示至少65％、70％、75％、80％、84％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。[0556]为了长期、高收率生成重组蛋白，需要稳定表达。例如，能用表达载体转化稳定表达经修饰的u‑pa多肽的细胞系，所述载体包含病毒复制起点或内源表达元件和选择性标记基因。引入载体后，可允许细胞在富集培养基中生长1‑2天，然后转到选择性培养基。选择性标记的目的在于赋予选择抗性，且其存在允许成功表达所引入序列的细胞生长和回收。稳定转化细胞的抗性细胞能用适合细胞类型的组织培养技术增殖。[0557]任意数目的选择系统能用于回收转化细胞系。这些包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(wigler等,(1977)cell11:223‑232)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(lowyi等.(1980)cell,22:817‑23)基因，其可分别用于tk‑或aprt‑细胞。同样，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性能用作选择基础。例如，可使用dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性(wiglerm等.(1980)proc.natl.acad.sci,77:3567‑70)；npt，其赋予对氨基糖苷类新霉素和g‑418的抗性(colbere‑garapinf等.(1981)j.mol.biol.,150:1‑14)；和als或pat，其分别赋予对氯磺隆和草丁膦乙酰转移酶的抗性。描述了其他选择性基因，例如trpb或hisd，前者允许细胞利用吲哚取代色氨酸，后者允许细胞利用histinol取代组氨酸(hartmansc和rcmulligan(1988)proc.natl.acad.sci,85:8047‑8051)。可见的标记物例如但不限于花青素、β‑葡萄糖醛酸酶和其底物gus、荧光素酶和其底物萤光素，也能用于鉴定转化子以及定量特定载体系统引起的瞬时或稳定蛋白表达含量(rhodesca等.(1995)methodsmol.biol.55:121‑131)。[0558]可监测u‑pa多肽的存在和表达。例如，通过在适当条件下就透明质酸酶的酶活性测试条件培养基，可检测功能性多肽。本文提供评价所表达蛋白溶解度和活性的示范性试验。[0559]a.原核细胞[0560]原核生物尤其是大肠杆菌提供生成大量蛋白的系统。大肠杆菌转化是本领域技术人员熟知的一项简单快速技术。大肠杆菌的表达载体能包含诱导型启动子；这类启动子用于诱导高水平蛋白表达和对宿主细胞显示一定毒性的蛋白表达。诱导型启动子示例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、t7和sp6rna启动子以及温控型λpl启动子。[0561]蛋白例如本文所提供的任意蛋白，可在大肠杆菌细胞质环境中表达。细胞质是还原环境且就一些分子而言，这能导致不溶性包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β‑巯基乙醇以及变性剂如胍‑hcl和尿素，能用于使蛋白重新溶解。替代方法是在细菌周质空间中表达蛋白，所述细菌周质空间提供氧化环境和伴侣蛋白样及二硫化物异构酶并且能引起可溶性蛋白生成。通常，前导序列融合待表达蛋白，这指导蛋白到周质。前导序列随后通过周质内的信号肽移除。靶向周质的前导序列示例包括来自果胶裂解酶基因的pelb前导序列和衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。一些情况下，周质表达允许所表达蛋白漏入培养基。蛋白分泌允许从细胞上清中快速简单纯化。非分泌蛋白能通过渗透裂解获自周质。与胞质表达类似，在一些情况下，蛋白可变为不溶性，变性剂和还原剂能用于促进溶解和复性。诱导和生长的温度还可能影响表达水平及溶解度，通常使用25℃‑37℃的温度。一般，细菌生成非糖基化蛋白。因此，如果蛋白功能需要糖基化，糖基化可在从宿主细胞纯化后体外添加。[0562]b.酵母细胞[0563]酵母如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)，是熟知的酵母表达宿主，能用于生成蛋白如本文所述任意蛋白。酵母可用游离型复制载体或通过同源重组经稳定染色体整合来转化。通常，诱导型启动子用于调节基因表达。这类启动子示例包括gal1、gal7和gal5以及金属硫蛋白启动子如cup1、aox1或其他毕赤酵母(pichia)或其他酵母启动子。表达载体通常包括选择性标记如leu2、trp1、his3和ura3，用于选择和维持转化的dna。酵母中表达的蛋白一般可溶。与伴侣蛋白如bip和蛋白质二硫键异构酶共表达能提高表达水平和溶解度。另外，可就分泌指导酵母中表达的蛋白，使用分泌信号肽融合如来自酿酒酵母的酵母接合型α因子分泌信号和与酵母细胞表面蛋白如aga2p交配粘附受体或解腺嘌呤阿氏酵母(arxulaadeninivorans)葡糖糖化酶的融合。可工程化蛋白酶切割位点如用于kex‑2蛋白酶的切割位点，以随着表达多肽离开分泌途径而从该表达多肽去除融合序列。酵母还能够在asn‑x‑ser/thr基序处糖基化。[0564]c.昆虫和昆虫细胞[0565]昆虫细胞尤其是使用杆状病毒表达时，用于表达多肽如u‑pa多肽。昆虫细胞表达高水平蛋白且能够进行高等真核生物所用的大部分翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，这提高真核表达的安全性并减少调控考虑。典型的表达载体使用用于高水平表达的启动子，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(autographacalifornica)核型多角体病毒(acnpv)、家蚕(bombyxmori)核型多角体病毒以及昆虫细胞系如sf9，衍生自草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)、美洲粘虫(pseudaletiaunipuncta)(a7s)和黑脉金斑蝶(danausplexippus)(dpn1)。对于高水平表达，待表达分子的核苷酸序列紧邻病毒多角体蛋白起始密码子下游融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确加工且能用于将表达蛋白分泌入培养基。细胞系美洲粘虫(a7s)和黑脉金斑蝶(dpn1)生成糖基化模式类似哺乳动物细胞系统的蛋白。示范性昆虫细胞是改变成减少免疫原性的那些，包括有“哺乳动物化”杆状病毒表达载体的那些和缺乏酶ft3的那些。[0566]昆虫细胞中的替代表达系统是使用稳定转化的细胞。细胞系如schnieder2(s2)和kc细胞(黑腹果蝇(drosophilamelanogaster))和c7细胞(白纹伊蚊(aedesalbopictus))，能用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子能用于在镉或铜重金属诱导存在情况下诱导高水平表达。表达载体通常用选择性标记如新霉素和潮霉素维持。[0567]d.哺乳动物表达[0568]哺乳动物表达系统能用于表达蛋白，包括u‑pa多肽。表达构建体可转移到哺乳动物细胞，这是通过病毒感染如腺病毒或直接dna转移如脂质体、磷酸钙、deae‑葡聚糖以及物理方式如电穿孔和微注射进行的。用于哺乳动物的表达载体通常包括mrna加帽位点、tata盒、翻译起始序列(kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。还可加入ires元件以允许和另一基因双顺反子表达，如选择性标记。这种载体经常包括为了高水平表达的转录启动子‑增强子，例如sv40启动子‑增强子、人巨细胞病毒(cmv)启动子和劳斯肉瘤病毒(rsv)长末端重复。这些启动子‑增强子在许多细胞类型中具有活性。组织和细胞型启动子及增强子区域也能用于表达。示范性启动子/增强子区包括但不限于来自诸如以下基因的那些：弹性蛋白酶i、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1‑抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺释放激素基因控制。选择性标记能用于选择和维持有表达构建体的细胞。选择性标记基因示例包括但不限于潮霉素b磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(dhfr)和胸苷激酶。例如，表达可在甲氨蝶呤存在下进行以仅选择表达dhfr基因的那些细胞。融合细胞表面信号分子如tcr‑ζ和fcεri‑γ，能指导活性状态的蛋白在细胞表面上表达。[0569]许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示范性细胞系包括但不限于cho、balb/3t3、hela、mt2、小鼠ns0(非分泌性)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、sp2/0、cos、nih3t3、hek293、293s、2b8和hkb细胞。细胞系也可适应无血清培养基，其促进分泌蛋白从细胞培养基中纯化。示例包括cho‑s细胞(加利福尼亚州卡尔斯巴德,cat#11619‑012)和无血清ebna‑1细胞系(pham等,(2003)biotechnol.bioeng.84:332‑42.)。还可获得适应在特殊培养基中生长的细胞系，所述培养基优化用于最大表达。例如，dg44cho细胞适应在化学成分确定、无动物产品的培养基中悬浮培养生长。[0570]e.植物[0571]转基因植物细胞和植物能用于表达蛋白，如本文所述任何蛋白。表达构建体通常转移到植物，使用直接dna转移如微粒轰击和peg介导的转移入原生质体以及农杆菌介导转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译对照元件。表达载体和转化技术通常在双子叶植物宿主如拟南芥(arabidopsis)和烟草与单子叶植物宿主如玉米和稻之间不同(divided)。用于表达的植物启动子示例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、二磷酸核糖羧化酶启动子和泛素及ubq3启动子。选择性标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶，常用于促进选择和维持转化细胞。转化的植物细胞能在培养物中作为细胞、聚集体(愈伤组织)维持，或再生为完整植物。转基因植物细胞还可包藻类，其工程化成生成透明质酸酶多肽。由于植物具有不同于哺乳动物细胞的糖基化模式，可能影响这些宿主中生成的蛋白选择。[0572]5.纯化[0573]用编码经修饰的u‑pa多肽的核酸序列转化的宿主细胞能在适合表达和从细胞培养物回收编码蛋白的条件下培养。重组细胞生成的蛋白一般可分泌，但能根据所用序列和/或载体而胞内包含。如本领域技术人员所理解，含有u‑pa编码核酸的表达载体能用信号序列设计，所述序列促进u‑pa直接分泌通过原核或真核细胞膜。[0574]因此，从宿主细胞纯化多肽的方法取决于所选宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白一般在移出细胞后从培养基中纯化。对于胞内表达，细胞可裂解且蛋白纯化自提取物。当转基因生物如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官能用作起始材料以制备裂解的细胞提取物。另外，生成转基因动物可包括在牛奶或鸡蛋中生成多肽，其能收集且如果必要，蛋白可用本领域标准方法提取并进一步纯化。[0575]蛋白如经修饰的u‑pa多肽能用本领域已知的标准蛋白纯化技术纯化，包括但不限于sds‑page、大小分级和尺寸排阻层析、硫酸铵沉淀和离子交换层析如阴离子交换。亲和纯化技术还能用于提高效率和制品纯度。例如，结合u‑pa蛋白的受体和其他分子能用于亲和纯化。[0576]表达构建体还能工程化成向蛋白添加亲和标签如小泛素样修饰物(sumo)标签、myc表位、gst融合或his6，且分别用sumo或myc抗体、谷胱甘肽树脂和ni‑树脂亲和纯化。这类标签能连接本文他处所述的u‑pa编码核苷酸序列，其能促进可溶性蛋白的纯化。例如，经修饰的u‑pa多肽可表达为重组蛋白，带有一个或多个加入以促进蛋白纯化的额外多肽结构域。这种纯化促进结构域包括但不限于金属螯合肽如允许在固定金属上纯化的组氨酸‑色氨酸模块，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白a结构域和用于flags延伸/亲和纯化系统的结构域(英姆纳克斯公司(immunexcorp.),华盛顿州西雅图)。在纯化结构域与所表达u‑pa多肽之间纳入可切割接头序列如因子xa或肠激酶(加利福利亚州圣地亚哥)可用于促进纯化。一个这种表达载体提供含有u‑pa多肽和肠激酶切割位点的融合蛋白表达。小泛素样修饰物(sumo)标签促进imiac(固定化金属离子亲和层析)上的纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白纯化多肽的方式。[0577]纯化可通过本领域已知任何方法评价，包括凝胶电泳、正交hplc法、染色和分光光度技术。表达和纯化的蛋白能用本领域技术人员已知的任何试验或方法分析，例如章节3所述。这些包括基于蛋白物理和/或功能性质的试验，包括但不限于通过凝胶电泳分析、免疫测定和u‑pa活性试验。[0578]6.额外修饰[0579]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能修饰成提高或改变药代动力学和药理学性质。特定地，经修饰的u‑pa多肽可缀合聚合物如peg部分或葡聚糖或唾液酸化以在血清和包括玻璃体液在内其他体液中降低免疫原性和/或增加半衰期。[0580]a.聚乙二醇化[0581]聚乙二醇(peg)用于生物材料、生物技术和医学，主要是因为peg是生物相容性、无毒、水溶性且通常无致免疫性的聚合物(zhao和harris,acssymposiumseries680:458‑72,1997)。在药物递送领域，peg衍生物广泛用于共价结合(即“聚乙二醇化”)蛋白以减少免疫原性、蛋白裂解和肾清除，从而增加血清半衰期和提高溶解度(zalipsky,adv.drugdel.rev.16:157‑82,1995)。类似地，peg结合低分子量、相对疏水药物以提高溶解度、降低毒性和改变生物分布。通常，聚乙二醇化药物作为溶液注射。[0582]一个相关应用是合成制剂的交联可降解peg网以用于药物递送，因为用于设计可降解、可溶性药物载体的基本相同化学也能用于设计可降解凝胶(sawhney等.,macromolecules26:581‑87,1993)。还已知高分子间复合物可通过混合2种互补聚合物溶液来形成。这类复合物一般通过所涉及聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子‑聚阳离子)和/或氢键(多元酸‑多碱)以及水溶解中聚合物之间的疏水相互作用来稳定(krupers等.,eur.polymj.32:785‑790,1996)。例如，在适当条件下混合聚丙烯酸(paac)和聚氧化乙烯(peo)溶液引起复合物形成，这主要基于氢键结合。这些复合物在生理条件下解离被用于递送游离药物(即非聚乙二醇化)。互补聚合物的复合物形成自均聚物和共聚物。[0583]用于聚乙二醇化的许多试剂被称为peg部分(聚乙二醇化)治疗蛋白。这类试剂包括但不限于多肽与以下的反应：n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化peg、琥珀酰亚胺mpeg、mpeg2‑n‑羟基琥珀酰亚胺、mpegα‑甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丙酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg羧甲基3‑羟丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg‑丙酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg丙醛、同双功能peg丁醛、peg马来酰亚胺、peg酰肼、对硝基苯‑碳酸酯peg、mpeg‑苯并三唑碳酸酯、丙醛peg、mpeg丁醛、支化mpeg2丁醛、mpeg乙酰、mpeg哌啶酮、mpeg甲基酮、mpeg“无接头”马来酰亚胺、mpeg乙烯砜、mpeg硫醇、mpeg邻吡啶硫酯、mpeg邻二硫吡啶、fmoc‑peg‑nhs、boc‑peg‑nhs、乙烯砜peg‑nhs、丙烯酸peg‑nhs、荧光素peg‑nhs和生物素peg‑nhs(参见例如monfardini等,bioconjugatechem.6:62‑69,1995；veronese等,j.bioactivecompatiblepolymers12:197‑207,1997；u.s.5,672,662；u.s.5,932,462；u.s.6,495,659；u.s.6,737,505；u.s.4,002,531；u.s.4,179,337；u.s.5,122,614；u.s.5,324,844；u.s.5,446,090；u.s.5,612,460；u.s.5,643,575；u.s.5,766,581；u.s.5,795,569；u.s.5,808,096；u.s.5,900,461；u.s.5,919,455；u.s.5,985,263；u.s.5,990,237；u.s.6,113,906；u.s.6,214,966；u.s.6,258,351；u.s.6,340,742；u.s.6,413,507；u.s.6,420,339；u.s.6,437,025；u.s.6,448,369；u.s.6,461,802；u.s.6,828,401；u.s.6,858,736；u.s.2001/0021763；u.s.2001/0044526；u.s.2001/0046481；u.s.2002/0052430；u.s.2002/0072573；u.s.2002/0156047；u.s.2003/0114647；u.s.2003/0143596；u.s.2003/0158333；u.s.2003/0220447；u.s.2004/0013637；us2004/0235734；wo0500360；u.s.2005/0114037；u.s.2005/0171328；u.s.2005/0209416；ep01064951；ep0822199；wo00176640；wo0002017；wo0249673；wo9428024；和wo0187925)。[0584]在一个示例中，聚乙二醇的分子量范围为约3kda‑约50kda，通常约5kda‑约30kda。peg共价结合药物(称为“聚乙二醇化”)可通过已知化学合成技术完成。例如，通过使nhs‑活化peg与蛋白在适当反应条件下反应，可完成蛋白的聚乙二醇化。[0585]尽管就聚乙二醇化描述了许多反应，那些最普遍适应在温和反应条件下赋予方向性且不必需广泛的下游加工以移出有毒催化剂或副产物。例如，单甲氧基peg(mpeg)仅具有一个反应性末端羟基，因而其应用限制了所得peg‑蛋白产品混合物的一些异质性。实现有效蛋白聚乙二醇化需要在与末端甲氧基相反的聚合物末端羟基的激活，旨在使衍生的peg更易受亲核攻击。攻击亲核剂通常是赖氨酰残基的ε‑氨基，但如果局部条件有利，其他胺也能反应(例如组氨酸的n末端α‑胺或环胺)。更定向附着在含有单赖氨酸或半胱氨酸的蛋白中可行。后一种残基能通过用于硫醇特异修饰的peg‑马来酰亚胺靶向。或者，peg酰肼可与高碘酸盐氧化的透明质酸降解酶反应并在nacnbh3存在下还原。更特定地，聚乙二醇化cmp糖可与透明质酸降解酶在适当糖基转移酶存在下反应。一种技术是“聚乙二醇化”技术，其中一些聚合分子偶联讨论中的多肽。使用此技术时，免疫系统在识别多肽表面负责抗体形成的表位方面有困难，从而减少免疫应答。对于直接引入人体循环系统以产生特定生理效应的多肽(即药物)，典型的潜在免疫应答是igg和/或igm反应，而经呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)可能导致ige反应(即过敏反应)。解释免疫应答减少的理论之一是聚合分子遮蔽多肽表面上负责免疫应答引起抗体形成的表位。另一理论或至少部分因素是缀合物越重，获得的免疫应答越少。[0586]通常，为制备本文提供的聚乙二醇化经修饰的u‑pa多肽，peg部分经共价结合与多肽缀合。可制备用于聚乙二醇化的经修饰的u‑pa多肽而不进行c122s取代；c122反而能用作缀合peg部分和/或形成所需二硫键的位点，如用于2链活化形式或二聚体。[0587]用于聚乙二醇化的技术包括但不限于专门的接头和偶联化学(参见例如harris,adv.drugdeliv.rev.54:459‑476,2002)、多个peg部分附于单一缀合位点(如通过使用支化peg；参见例如veronese等,bioorg.med.chem.lett.12:177‑180,2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如chapman等,naturebiotech.17:780‑783,1999)和定点酶促聚乙二醇化(参见例如sato,adv.drugdeliv.rev.,54:487‑504,2002)。本领域所述方法和技术可生成有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个peg或peg衍生物的蛋白，所述peg或peg衍生物附于单一蛋白分子(参见例如美国专利公开号2006/0104968)。[0588]b.融合蛋白和其他缀合物[0589]本文提供u‑pa与本文所提供经修饰的u‑pa多肽的缀合物。这类缀合物示例是实施例14‑16例示的融合蛋白。如本文所述，一些缀合物通过切割所包括的激活多肽而活化时，形成2链活化的u‑pa多肽；其他如含有fc结构域的那些，能经fc结构域连接形成2链。其他包含序列，如促进表达和分离/纯化的sumo和his‑sumo。实施例14和15以及图1‑4，描绘和叙述所得缀合物。为用作药物，经修饰的u‑pa多肽一般以活化形式提供，如2链活化形式。应理解下列讨论描述能包括信号序列的融合多肽和在所生成产物中不出现的其他调控序列。特定地，融合多肽可包括激活序列，其中在切割后，所得多肽是2链激活多肽。其是多肽活化形式，其一般是施用于对象的药物产品。[0590]i.示范性融合蛋白和其他蛋白缀合物[0591]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能融合其他多肽和其部分以及融合多个部分以赋予所需性质，如血清半衰期增加和/或免疫原性降低和/或其他性质。这些包括例如融合白蛋白，融合靶部分如抗体和其抗原结合片段，融合免疫球蛋白，fc融合，修饰糖基化模式、法尼基化和其他这类修饰(关于改善治疗蛋白药代动力学性质的多种融合蛋白的综述，参见strohl(2015)biodrugs29:215‑239)。用于改变治疗药理性质的任何这类形式能施用于本文所提供经修饰的u‑pa多肽。一般，修饰是多肽或其部分时，经修饰u‑pa作为融合蛋白生成。对于非多肽修饰如聚乙二醇化，修饰在分离蛋白上实现。经修饰的u‑pa多肽包括在残基122(通过胰凝乳蛋白酶编号)具有cys的那些，以提供翻译后或纯化后修饰的位点。经修饰的u‑pa多肽包括作为全长和其催化活性部分的那些，如蛋白酶结构域，或者成熟多肽或活化的2链多肽。[0592]还提供融合蛋白，包含本文所提供经修饰的u‑pa多肽和一种或多种其他多肽。提供药物组合物，包含配置用于经适当途径施用的这类融合蛋白。融合蛋白如下形成：以任何顺序连接经修饰的u‑pa多肽与另一多肽，如抗体或其片段、生长因子、受体、配体和出于促进蛋白酶纯化目的的其他这类药剂，通过引导u‑pa多肽到靶细胞或组织而改变经修饰的u‑pa多肽的药效学性质，和/或增加u‑pa多肽的表达或分泌。在u‑pa多肽融合蛋白内，u‑pa多肽可以是u‑pa多肽的全部或其催化活性部分或者u‑pa多肽化活性部分以及非全长u‑pa的另一u‑pa部分。本文所提供融合蛋白几乎全部保留其对补体蛋白c3的特异性和/或选择性。一般，u‑pa融合多肽相较于非融合u‑pa多肽保留至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％底物特异性和/或选择性，包括相较非融合u‑pa多肽的96％、97％、98％、99％或更高底物特异性。[0593]ii.产生构建体[0594]u‑pa融合蛋白可通过标准重组技术生成。例如，编码不同多肽序列的dna片段能根据常规技术框内连接在一起，如通过采用钝端或交错端末端用于连接，限制性酶切以提供合适末端，酌情填补粘性末端，碱性磷酸酶处理以防止不需要的连接，和酶促连接。在另一实施方案中，所述融合基因能通过常规技术合成，包括自动化dna合成仪。或者，基因片段的pcr扩增可用在2个连续基因片段之间产生互补突出的锚引物完成，所述连续基因片段随后能退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见例如ausubel等.(编)《精编分子生物学实验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology),约翰威利父子公司(johnwiley&sons),1992)。许多编码融合部分(如his标签、sumo多肽或gst多肽)的表达载体市售可得。编码u‑pa的核酸能克隆入这类表达载体，从而融合部分框内连接u‑pa多肽。[0595]示范性表达载体包括任何哺乳动物表达载体，例如pcmv。对于细菌表达，这类载体包括pbr322、puc、pskf、pet23d以及融合载体如mbp、gst和lacz。其他真核载体例如含有来自真核病毒的调控元件的任意载体能用作真核表达载体。这些包括例如sv40载体、乳头瘤病毒载体和衍生自eb病毒的载体。示范性真核载体包括pmsg、pav009/a 、pmt010/a 、pmamneo‑5、杆状病毒pdsce，以及允许在以下启动子指导下表达蛋白的任何其他载体：cmv启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多面体启动子或显示有效用于真核生物表达的其他启动子。[0596]iii.信号序列[0597]u‑pa融合蛋白可包含信号肽(sp或信号序列或定位信号或前导肽)以指导蛋白酶运输。信号肽是在初生蛋白n末端发现的序列基序，其靶向蛋白以跨内质网膜转运到其细胞内特定目的地，或如果蛋白待分泌则转运到细胞外。因此，sp选择和修饰sp会影响蛋白靶向(zhang等.(2005)jgenemed7:354‑365)。为了更有效活性开发了优化的sp。开发计算机模型和算法以预测sp效率及定义sp共有序列(burdukiewicz等.(2018)intjmolsci19(12):3709；peason等.(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444‑2448)。[0598]已知多种蛋白具有sp，包括但不限于：受体(核、4跨膜、g蛋白偶联和酪氨酸激酶)、细胞因子(趋化因子)、激素(生长和分化因子)、神经肽和血管介质、蛋白激酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、核苷酸环化酶、基质分子(粘附、钙粘素、胞外基质分子、整合素和选择素)、g蛋白、离子通道(钙、氯、钾和钠)、蛋白酶、转运子/泵(氨基酸、蛋白、糖、金属和维生素；钙、磷酸、钾和钠)以及调控蛋白。在一些示例中，初始信号肽优化用于蛋白在就生产选定的所需宿主细胞中的分泌。u‑pa多肽如本文所提供经修饰u‑pa蛋白酶结构域能直接或间接融合非u‑pa信号肽以用于u‑pa靶向。[0599]信号肽可以是抗体的信号肽，如抗体重链和抗体轻链的信号肽。抗体同种型可包括但不限于igg、igm、igd、iga和ige。因此，重链可包括γ、μ、δ、α和ε重链，轻链可包括κ或λ轻链。本文所示u‑pa融合蛋白能用抗体信号肽制备，如人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列，例如seqidno:999所示信号序列。[0600]其他示范性信号肽衍生自人白介素‑2(il‑2)，广泛用于研究和蛋白生成(bamford等(1998)jimmunol160:4418；komada等(1999)biolpharmbull22:846)。开发了碱性和疏水性增加的经修饰il‑2sp，使得融合蛋白分泌上升多至3.5倍(zhang等(2005)j.genemed.7:354)。本文的u‑pa融合蛋白可用例如il‑2信号肽制备，如人il2信号肽(hil2sp)，例如seqidno:1000所示信号序列。[0601]本文所示示范性u‑pa融合蛋白可包含信号肽以指导蛋白酶转运。例如，seqidno:1004、1005、1010、1011、1014‑1018、1036和1040所示u‑pa融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)。另一示例中，seqidno:1006‑1009、1012、1013、1034和1035所示u‑pa融合多肽包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)。[0602]iii.示范性融合蛋白和肽接头[0603]经修饰的u‑pa多肽与另一多肽的连接能直接或间接经接头实现。在一个示例中，连接可以是化学连接，如通过异双功能剂或硫醇连接或其他这类连接。u‑pa多肽与另一多肽的融合可以融合到经修饰的u‑pa多肽，如经修饰u‑pa蛋白酶结构域的n或c末端。例如，能用于有本文所提供u‑pa多肽的融合蛋白的多肽非限制性示例包括来自免疫球蛋白g的fc结构域、血清白蛋白(即人血清白蛋白)、结合iim型胶原的scfv(c2scfv)、透明质酸结合域(habd)、gst(谷胱甘肽s‑转移酶)多肽、his标签(即hhhhhh)、小泛素样修饰物(sumo)标签、流感病毒血凝素(ha)标签多肽和其抗体12ca5和/或异源信号序列(如来自凝血酶或小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)或人白介素‑2(hil2))。融合蛋白可包含额外成分，如协助细胞摄取蛋白的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(mbp)(参见国际pct申请公开号wo01/32711)。[0604]肽接头能纳入u‑pa融合蛋白。在一个示例中，肽接头能融合第一多肽c末端和第二多肽n末端。此结构可重复多次，从而至少一个且任选地2、3、4个或更多多肽经肽接头在其各自末端彼此连接。例如，融合蛋白能包括序列x‑y‑z，其中x是野生型或经修饰u‑pa催化结构域，y是肽接头，z是所有或部分融合伴侣(如hsa、fc、habd或c2scfv)。一些示例中，x是全部的经修饰u‑pa，包括u‑pa的n末端和u‑pa的蛋白酶结构域。其他示例中，x是部分的经修饰u‑pa，包括u‑pa蛋白酶结构域直接上游的12个氨基酸以及u‑pa蛋白酶结构域。另一示例中，多肽可包括序列a‑x‑y‑z，其中“a”是另一融合伴侣，如多肽例如sumo或his‑sumo，其促进表达和/或分离所得多肽。[0605]肽接头一般包括gly、ser和其组合，或ala和脯氨酸。接头一般包含2到多至20或25个残基。肽接头示例包括但不限于：‑‑gly‑gly‑‑、gsg、ags(seqidno:1003)、ggggs(seqidno:1001)、ggssgg(seqidno:1002)、ssssg(seqidno:1024)、gkssgsgsesks(seqidno:1025)、ggstsgsgkssegkg(seqidno:1026)、gstsgsgksssegsgstkg(seqidno:1027)、gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1028)、egkssgsgseskef(seqidno:1029)、或alaalaproala或(alaalaproala)n(seqidno:1030)，其中n是1‑6，如1、2、3、4、5或6。[0606]连接部分描述于例如huston等(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:5879‑5883,whitlow等(1993)proteinengineering6:989‑995,和newton等,(1996)biochemistry35:545‑553。其他合适肽接头包括美国专利号4,751,180或4,935,233所述那些中的任意一种。编码所需肽接头的多核苷酸能插入其间，且与编码包括u‑pa蛋白酶结构域在内所有或部分u‑pa的多核苷酸在同一读框内，使用任何适当的常规技术。在一个示例中，融合蛋白包含u‑pa多肽如u‑pa蛋白酶结构域，和融合伴侣如hsa、fc、habd或c2scfv，其通过肽接头分开。[0607]示范性u‑pa融合多肽包括在u‑pa蛋白酶结构域c末端的接头，其连接u‑pa蛋白酶结构域与融合伴侣c末端如hsa或fc。u‑pa接头和u‑pa‑接头‑hsa分子任选地包含表位标签和/或用于表达及分泌的信号。示范性u‑pa‑接头‑fc融合蛋白如seqidno:1018所示，包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、his‑sumo(seqidno:990)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)、接头(seqidno:1002)和人igg1重链的fc片段(seqidno:992)。[0608]其他示例中，示范性u‑pa融合蛋白是u‑pa‑接头‑hsa融合多肽，如seqidno:1015‑1017所示融合蛋白。例如，seqidno:1015所示的融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa的n末端结构域(seqidno:1042)、野生型u‑pa激活序列(seqidno:997)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)、接头(seqidno:1002)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1016所示的融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa激活序列中的弗林蛋白酶激活位点(seqidno:996)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)、接头(seqidno:1002)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1017所示融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、his‑sumo(seqidno:990)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)、接头(seqidno:1002)和hsa(seqidno:991)。[0609]其他示例中，接头在u‑pa蛋白酶结构域n末端并连接蛋白酶结构域与n末端融合伴侣。例如，融合蛋白可包含连接u‑pa的n末端fc。示范性fc‑接头‑u‑pa融合多肽如所seqidno:1004所示，其包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、人igg1重链的fc片段f(seqidno:992)、接头(seqidno:1003)、野生型u‑pa激活序列(seqidno:997)和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)。[0610]iv.融合伴侣[0611]融合蛋白是已知用于改善肽或生物药物药代动力学的修饰，例如含有以下的融合蛋白：融合fc，融合人血清白蛋白(hsa)，融合单链片段可变(scfv)抗体例如结合ii型胶原的scfv(c2scfv)，融合habd、以及融合其他多肽。这些还包括缀合线性或支链单甲氧基聚乙二醇(peg)，引起分子量和流体力学半径增加以及肾的肾小球过滤速度下降。改善药代动力学参数的另一方法包括修饰糖基化模式，导致清除率降低和半衰期延伸。[0612]示范性u‑pa融合多肽包括将融合伴侣(即hsa、habd、c2scfv或fc)n末端置于u‑pa蛋白酶结构域或其c末端置于u‑pa蛋白酶结构域。示范性u‑pa融合蛋白如seqidno:1004所示，其中融合伴侣在u‑pa蛋白酶结构域的n末端。示范性u‑pa融合蛋白如seqidno:1006‑1018所示，其中融合伴侣在u‑pa蛋白酶结构域的c末端。[0613](a)fc结构域[0614]一些u‑pa融合蛋白示例包括免疫球蛋白多肽重链，最常是重链恒定结构域。用于人igg亚型的重链恒定区示范性序列如seqidno:45(igg1)、seqidno:1020(igg2)、seqidno:1021(igg3)和seqidno:1022(igg4)所示。例如，对于seqidno:45所示示范性重链恒定区，ch1结构域对应于氨基酸1‑98，铰链区对应于氨基酸99‑110，ch2结构域对应于氨基酸111‑223，ch3结构域对应于氨基酸224‑330。[0615]在一个示例中，u‑pa融合蛋白可包括免疫球蛋白多肽的fc区，如人免疫球蛋白。通常，这种融合保留至少功能活性铰链，免疫球蛋白重链恒定区的ch2和ch3结构域。例如，igg1的全长fc序列包括seqidno:45所示序列的氨基酸105‑330。用于higg1的示范性fc序列如seqidno:992和1023所示，包含对应于seqidno:45氨基酸100‑110的几乎所有铰链序列，和如seqidno:45所示用于ch2和ch3结构域的完整序列。另一示范性fc多肽如pct申请wo93/10151所示，且是单链多肽，从n末端铰链区延伸到人igg1抗体fc区的天然c末端(seqidno:50)。形成连接的精确位点不关键：熟知特定位点且能选择以优化u‑pa多肽的生物活性或稳定性。例如，其他示范性fc多肽序列在seqidno:45所示序列的氨基酸c109或p113处开始(参见例如美国公开号2006/0024298)。[0616]除了higg1fc，其他fc区也能纳入本文所提供u‑pa融合蛋白。例如，当由fc/fcγr介导的效应子功能最小化时，考虑融合igg同种型，其募集补体或效应细胞较弱，例如igg2或igg4的fc。另外，fc融合能包含免疫球蛋白序列，其基本由属于任意抗体种类的免疫球蛋白基因编码，包括但不限于抗体的igg(包括人亚类igg1、igg2、igg3或igg4)、iga(包括人亚类iga1和iga2)、igd、ige和igm种类。此外，接头能用于共价连接fc与另一多肽以产生fc嵌合体。[0617]本文也考虑经修饰的fc结构域用于有u‑pa融合多肽的嵌合体。一些示例中，fc区修饰成显示与fcr的结合改变，从而引起效应子功能相比野生型免疫球蛋白重链fc区的效应子功能改变(即更多或更少)。因此，经修饰的fc结构域可具有改变的亲和性，包括但不限于对fc受体的亲和性增加或较低或没有。例如，不同igg亚类对fcγr的亲和性不同，igg1和igg3通常与受体的结合显著优于igg2和igg4。不同fcγr介导不同效应子功能。fcγr1、fcγriia/c和fcγriiia是免疫复合物引发激活的正调节物，其特征是具有含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的免疫胞内结构域。然而，fcγriib具有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)并因而是抑制性的。一些示例中，可修饰本文所提供u‑pa多肽‑fc融合蛋白以增强结合补体蛋白c1q。此外，fc能修饰成改变其结合fcrn，从而改善u‑pa‑fc融合多肽的药代动力学。因此，改变fc区对受体的亲和性能调节与fc结构域相关的效应子功能和/或药代动力学性质。经修饰fc结构域为本领域技术人员已知且描述于文献，示范性修饰参见例如美国专利号5,457,035；美国专利公开号us2006/0024298；和国际专利公开号wo2005/063816。[0618]在一些示例中，形成u‑pa多肽多聚体。通常，多肽多聚体是2个嵌合蛋白的二聚体，其通过直接或间接连接2个相同或不同u‑pa多肽如u‑pa蛋白酶结构域与fc多肽而产生。一些示例中，编码u‑pa‑fc融合蛋白的基因融合物插入适当表达载体。所得u‑pa‑fc融合蛋白可在转化有重组表达载体的宿主细胞内表达，允许像抗体分子一样组装，其中链间二硫键在fc部分之间形成以产生二价u‑pa多肽。[0619]含有fc区的u‑pa融合多肽也能工程化成包括带金属螯合物或其他表位的标签。带标签的结构域可用于通过金属‑螯合物层析快速纯化，和/或通过抗体以允许检测蛋白质印迹、免疫沉淀或生物试验中的抗体消耗/阻断。[0620]示范性u‑pa‑fc融合多肽包括u‑pa蛋白酶结构域和fc的融合。示范性u‑pa‑fc融合蛋白如seqidno:1004、1006、1010、1011、1012和1018所示。u‑pa‑fc分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，示范性u‑pa‑fc融合多肽如seqidno:1004、1010和1011所示，包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、人igg1重链的fc片段(seqidno:992)和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21或987)，位于fc的n末端(seqidno:1004)或c末端(seqidnos:1010和1011)。另一示例中，seqidno:1006和1012所示示范性u‑pa‑fc融合多肽包含u‑pa蛋白酶结构域n末端的人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:5或21)和人igg1重链的fc片段(seqidno:992)。[0621](b)血清白蛋白[0622]u‑pa融合蛋白能用白蛋白作为融合伴侣产生，以增加半衰期、稳定性、生物利用度、分布和/或改善u‑pa的药代动力学。许多连接人血清白蛋白(hsa)的产品被批准用作治疗剂，包括用作癌症治疗剂和用于2型糖尿病治疗(alqahtani等.(2019)biomedandpharmacotherapy113:108750；roscoe等,(2018)mol.pharmaceutics151:15046‑5047；strohl,w.r.(2015)biodrugs4:215‑239)。一些示例中，缺乏信号序列和激活序列的成熟hsa蛋白与感兴趣蛋白融合。在u‑pa融合蛋白的一些示例中，血清白蛋白如人血清白蛋白(hsa)缀合u‑pa，如u‑pa蛋白酶结构域。示范性hsa如seqidno:991所示。[0623]u‑pa‑hsa融合多肽包括融合u‑pa蛋白酶结构域和hsa。示范性u‑pa‑hsa融合蛋白如seqidno:1007和1013‑1017所示。u‑pa‑hsa分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，示范性u‑pa‑hsa融合多肽如seqidno:1014‑1017所示，包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987或21或)和c末端hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1013所示示范性u‑pa‑hsa融合多肽包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:5)和c末端hsa(seqidno:991)。[0624](c)结合ii型胶原的scfv(c2scfv)[0625]重组抗体片段采用单链片段可变(scfv)抗体形式例如结合ii型胶原的scfv(c2scfv)，能用作与u‑pa的融合伴侣。生成自噬菌体展示的scfv抗体可融合标记物，或者活性或治疗蛋白(ahmad等(2012)clindevimmunol2012:980250)。融合scfv能用于增加缀合蛋白的收率和活性(martin等,(2006)bmcbiotech6:46)。[0626]单链片段可变抗体包括由肽接头或二硫键连接的重(vh)和轻(vl)链可变区(glockshuber等(1990)biochemistry29(6):1362–1367)。肽接头在多肽链折叠中发挥关键作用。常用接头包括用于灵活性的gly和ser残基或提高溶解度的glu和lys(whitlow等(1993)proteinengineering6(8):989–995)。[0627]scfv能融合蛋白以特异性递送到抗原呈递细胞(ahmad等(2012)clindevimmunol2012:980250)。例如，可产生scfv以靶向ii型胶原，如用作研究药剂，和作为治疗分子到表达人ii型胶原位点的递送剂。例如，scfv是分离的单克隆抗体或其结合人ii型胶原的片段，包括vh区和vl区，其中c2scfv所含氨基酸序列具有seqidno:993所示序列。[0628]示范性u‑pa‑c2scfv融合多肽包括融合u‑pa蛋白酶结构域和c2scfv。示范性u‑pa‑c2scfv融合蛋白如seqidno:1008所示。u‑pa‑c2scfv分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，seqidno:1008所示的示范性u‑pa‑c2scfv融合多肽包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和c末端c2scfv(seqidno:993)。[0629](d)透明质酸结合域(habd)[0630]在一些示例中，u‑pa融合蛋白包含habd融合伴侣，如肿瘤坏死因子刺激基因6(tsg‑6)，例如seqidno:994所示的tsg‑6(对应于人tsg‑6的氨基酸32‑134；ncbino:np_009046.2)。u‑pa融合蛋白可用habd如tsg‑6产生，作为融合伴侣以增加半衰期、稳定性、生物利用度、分布和/或改善u‑pa的药代动力学。[0631]肿瘤坏死因子刺激基因6(tsg‑6、肿瘤坏死因子α‑诱导蛋白6、tnfaip6；ncbino:np_009046.2)是～35kda分泌型糖蛋白，由单一n末端连接模块和c末端cub结构域构成。tsg‑6的表达通过炎症介质在许多细胞类型中诱导，包括细胞因子和生长因子。通过其据报道含有大致氨基酸35‑132的连接模块，tsg‑6是多形核白细胞游走的有效抑制剂。tsg‑6与丝氨酸蛋白酶抑制剂即间α抑制剂(iαi)形成稳定复合物并加强iαi的抗纤溶酶活性。tsg‑6还对富含ha的细胞周围包被和胞外基质的形成及重塑重要。[0632]示范性u‑pa‑habd融合多肽包括融合u‑pa蛋白酶结构域和habd。示范性u‑pa‑habd融合蛋白如seqidno:1009所示。u‑pa‑habd分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，示范性u‑pa‑habd融合多肽如seqidno:1009所示，包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和c末端habd(seqidno:994)。[0633]v.激活位点[0634]示范性u‑pa融合蛋白包含用于u‑pa激活的位点。例如，u‑pa融合蛋白包括野生型u‑pa序列用于自动激活；包含弗林蛋白酶序列用于在蛋白表达期间激活；或在分泌信号切割后激活，都产生活化的u‑pa蛋白酶。[0635](a)弗林蛋白酶[0636]弗林蛋白酶蛋白参与分泌途径内失活前体蛋白在单一、成对或多碱性共同位点的内切蛋白水解成熟加工(nakayama(1997)biochem.j.327:625‑635；seidah和chretien,currentopinionsinbiotechnology(1997)8:602‑607)。新合成的前体蛋白从内质网运到高尔基体区室后，前肽在两步式加工事件中于弗林蛋白酶切割基序处自催化去除(leduc等(1992)j.biol.chem267:14304‑14308；anderson等(1997)embo1508‑1518)。弗林蛋白酶需要r‑x‑x‑r位点用于切割，最优加工出现在r‑x‑k/r‑r基序(molloy等(1992)j.biolchem267:16396‑16402)。示范性u‑pa激活序列如seqidno:995和996所示，包含弗林蛋白酶rrkr切割位点。[0637]u‑pa融合蛋白可包括位于u‑pa蛋白酶结构域的n末端的弗林蛋白酶激活位点，从而u‑pa蛋白在表达期间活化。表达期间的u‑pa激活如通过在u‑pa激活序列纳入弗林蛋白酶激活位点，意在去除对下游加工期间激活步骤的需求。[0638]产生u‑pa融合多肽，包括弗林蛋白酶激活位点和u‑pa蛋白酶结构域。示范性弗林蛋白酶‑u‑pa蛋白如seqidno:1010、1014和1016所示。弗林蛋白酶激活的u‑pa分子任选地包含融合伴侣和或用于表达及分泌的信号。例如，seqidno:1014和1016所示示范性u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa激活序列中的弗林蛋白酶激活位点(seqidno:995或996)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21或987)和hsa(seqidno:991)。seqidno:1014所示的u‑pa融合蛋白还包括u‑pa的n末端(如seqidno:1或seqidno:1042的氨基酸21‑178所示)，位于弗林蛋白酶‑u‑pa蛋白酶结构域的n末端，其带有seqidno:987所示的u‑pa蛋白酶结构域。另一示例中，seqidno:1010所示的u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa激活序列中的弗林蛋白酶激活位点(seqidno:995)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和fc(seqidno:992)。[0639](b)u‑pa[0640]u‑pa酶原激活通过u‑pa催化结构域n末端的单肽键切割发生，起始蛋白构象变化。本文产生的u‑pa构建体可包含12氨基酸u‑pa激活序列(seqidno:997)或其修饰形式(seqidno:998)，或者可含有包括激活序列在内的u‑pan末端延伸部分，从而u‑pa包括全长成熟多肽，如seqidno:3所示多肽。其他示例中，u‑pa包括n末端，如seqidno:1或seqidno:1042的氨基酸21‑178所示u‑pa的n末端区，和12氨基酸u‑pa激活序列(seqidno:997)或u‑pa激活序列修饰形式(seqidno:998)。[0641]制备含有本文所提供经修饰的u‑pa多肽的融合蛋白。产生u‑pa融合多肽，包括野生型或经修饰u‑pa激活位点和u‑pa蛋白酶结构域。示范性u‑pa蛋白如seqidno:1004、1005、1011和1015所示，包含用于激活的野生型u‑pa激活位点。融合肽任选地包含融合伴侣和/或用于表达和/或分泌的信号。例如，seqidno:1004所示示范性u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、fc(seqidno:992)、u‑pa激活序列(seqidno:995)和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)。另一示例中，seqidno:1005所示u‑pa融合蛋白包含全长成熟u‑pa序列(seqidno:3，带有seqidno:987所示经修饰蛋白酶结构域)和n末端人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)。另一示例中，seqidno:1011所示u‑pa融合蛋白包含n末端人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、全长成熟u‑pa序列(seqidno:3，带有seqidno:987所示的经修饰蛋白酶结构域)和fc(seqidno:992)。另一示例中，seqidno:1015所示u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、包括u‑pa激活序列在内的u‑pan末端(如seqidno:1的氨基酸21‑178所示)和hsa(seqidno:991)。经修饰的u‑pa多肽如seqidno:1006、1007、1009和1010的那些，在表达后证明有u‑pa蛋白酶活性。有弗林蛋白酶激活序列的经修饰u‑pa显示最高活性，所述序列位于在c末端有igfc融合的u‑pa的n末端。[0642]vi.纯化标签[0643]示范性u‑pa融合蛋白包含用于纯化u‑pa或u‑pa融合蛋白的标签。用于纯化u‑pa融合蛋白的示范性标签如上面章节f所示。示范性u‑pa融合蛋白能包含用于纯化的sumo或his序列。[0644](a)his标签[0645]u‑pa融合蛋白可包括his标签如seqidno:989所示的6xhis，和u‑pa蛋白酶结构域。[0646]产生u‑pa融合多肽，包括his纯化标签和u‑pa蛋白酶结构域。示范性his‑u‑pa融合蛋白如seqidno:1017和1018所示。带his标签的u‑pa分子任选地包含融合伴侣和/或用于表达及分泌的信号。例如，seqidno:1017所示的示范性his‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1018所示的示范性his标签‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和fc(seqidno:992)。[0647](b)sumo[0648]u‑pa融合蛋白可包括his标签和/或能纳入用于在包涵体中积聚的sumo序列。例如，seqidno:990所示his‑sumo序列和u‑pa蛋白酶结构域能连接全长经修饰的u‑pa多肽或其催化活性部分，如蛋白酶结构域或经修饰的u‑pa多肽的更大部分。产生u‑pa融合多肽，包括his‑sumo标签和u‑pa蛋白酶结构域。示范性his‑sumo‑u‑pa蛋白如seqidno:1017和1018所示。带his‑sumo标签的u‑pa分子任选地包含融合伴侣和/或用于表达及分泌的信号。例如，seqidno:1017所示的示范性his‑sumo‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1018所示示范性his‑sumo‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和fc(seqidno:992)。[0649]7.核酸分子[0650]本文提供编码u‑pa多肽的核酸分子。核酸分子包括任意所编码u‑pa多肽或其催化活性部分的等位基因变体或剪接变体。在一个实施方案中，本文所提供核酸分子与任意核酸编码的u‑pa多肽或其催化活性部分有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列相同性。在另一实施方案中，核酸分子可包括有任意u‑pa多肽或其催化活性部分简并密码子序列的那些，如本文提供的那些。[0651]提供核酸分子或含有核酸分子催化活性部分的融合蛋白，其可操作连接启动子，如用于哺乳动物细胞表达的诱导型启动子。这类启动子包括但不限于cmv和sv40启动子；腺病毒启动子，如响应hpve7癌蛋白的e2基因启动子；pv启动子，如响应pve2蛋白的pbvp89启动子；和由hiv或pv或致癌基因激活的其他启动子。[0652]本文所提供u‑pa蛋白酶也能在基因转移载体中递送给细胞。转移载体还能编码额外治疗剂以治疗疾病或失调，如类风湿性关节炎或心血管疾病或amd或dgf，为了所述疾病或失调施用所述蛋白酶。通过向对象施用核酸，编码蛋白酶的转移载体能全身使用。例如，转移载体可以是病毒载体，例如腺病毒载体。编码蛋白酶的载体还能纳入干细胞且这类干细胞施用于对象，如通过在治疗位点移植或嫁接干细胞。例如，间充质干细胞(msc)可工程化成表达蛋白酶且这类msc在移植位点植入以用于治疗。[0653]g.组合物、制剂和剂量[0654]能以任何常规方式配制包含经修饰的u‑pa多肽、经修饰u‑pa融合蛋白或编码核酸分子的药物组合物，这是通过混合选定量的多肽与一个或多个生理上可接受载体或赋形剂进行的。在大部分实施方案中，经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白在组合物中采用活化形式来施用。因此，例如，多肽是2链活化形式，或当融合蛋白包含多聚化结构域时，该蛋白可以是多聚体如二聚体。[0655]选择载体或赋形剂在管理专业人员技术范围内且可取决于若干参数。这些包括例如施用模式(即全身、口头、经鼻、肺部、局部、外用或任何其他模式)和所治疗疾病。本文所提供药物组合物能配制用于单剂(直接)施用或稀释或其他修饰。制剂中的化合物浓度在施用后可有效递送，其含量就预期治疗而言有效。通常，组合物配制用于单剂施用。为配制组合物，一定重量分数的化合物或其混合物以有效浓度溶解、悬浮、分散或另外混合于选定载剂，从而所治疗病症得到缓解或改善。适合本文所提供化合物施用的药物载体或载剂包括本领域技术人员已知适合特定施用模式的任意这类载体。[0656]1.经修饰的u‑pa多肽的施用[0657]出于本章节目的，经修饰的u‑pa多肽指含有修饰的u‑pa多肽，如经修饰蛋白酶结构域，且包括缀合物如融合蛋白。多肽能配制为组合物中唯一的药物活性成分或联合其他活性成分。多肽可靶向用于递送，如通过缀合靶向剂例如抗体。脂质体悬液包括组织靶向脂质体，也适合作为药学上可接受载体。这些能根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，脂质体制剂能如美国专利号4,522,811所述制备。脂质体递送可包括缓释制剂，包括药物基质如胶原凝胶和修饰有纤连蛋白的脂质体(参见例如weiner等(1985)jpharmsci.74(9):922‑5)。[0658]将活性化合物纳入药学上可接受载体，其量足以产生治疗有益效果，而对所治疗对象没有不需要的副作用。治疗有效浓度可凭经验确定，这是通过在已知的体外和体内系统中测试，如本文所提供的试验。[0659]本文所提供u‑pa多肽(即活性化合物)能体外、离体或体内施用，这是通过使混合物如体液或其他组织样本接触本文所提供u‑pa多肽进行的，包括本文所提供任意经修饰的u‑pa多肽。例如，当离体施用化合物时，来自对象的体液如玻璃体或组织样本可接触管或滤器上包被的u‑pa多肽，例如旁路机中的管或滤器。当体内施用时，活性化合物能通过任何适当途径施用，例如口服、经鼻、肺部、胃肠外、静脉内、皮内、玻璃体内、视网膜内、视网膜下、眼周、皮下或外用，采用液体、半液体或固体形式，且以适合各施用途径的方式配制。确定剂量在医生技术范围内，且可视特定疾病、施用途径和对象而定。示范性剂量包括例如0.1‑1mg。[0660]经修饰的u‑pa多肽和生理上可接受盐及溶剂能配制用于经吸入施用(通过口或鼻)、口服、肺部、胃肠外或直肠施用。对于吸入施用，经修饰的u‑pa多肽可以来自压缩包或雾化器的喷雾剂呈现形式递送，使用合适推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体。在压力气雾剂的情况中，剂量单位能通过提供阀确定以递送计量数量。例如，明胶的胶囊和弹筒用于吸入器或吹药器，能配制成含有治疗化合物和适当粉末基如乳糖或淀粉的粉末混合物。[0661]对于肺的肺部施用，经修饰的u‑pa多肽可以喷雾剂呈现形式递送，来自雾化器、turbo雾化器或微处理器控制的定量口服吸入器，使用合适推进剂。一般，气雾剂的粒径较小，如范围为0.5‑5微米。在配制用于肺部施用的药物组合物情况中，通常不使用洗涤剂表面活性剂。肺部药物递送是有希望的非侵入性全身施用方法。肺代表一种有吸引力的药物递送途径，主要归因于用于吸附的高表面积、薄肺泡上皮、广泛血管化、没有肝的首关代谢和相对低代谢活性。[0662]对于口服施用，药物组合物可采用例如片剂、药丸、液体悬液或胶囊形式，其通过常规方式用药学上可接受赋形剂制备，如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙甲纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂能用本领域熟知的方法包被。用于口服施用的液体制剂采用例如溶液、糖浆剂或悬液的形式，或其能呈现为干产品，以在使用前用水或其他合适载剂构建。这类液体制品可通过常规方式用药学上可接受添加剂制备，如悬浮剂(例如山梨糖醇浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性载剂(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如羟苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制品在适当时还能包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。[0663]用于口服施用的制品能配制用于活性化合物的控释。对于颊部施用，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。[0664]经修饰的u‑pa多肽能配制为持久(depot)制剂。这类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌肉内注射施用。因此，例如，治疗化合物能用适当聚合或疏水材料(例如，作为溶于可接受油的乳液)或离子交换树脂配制，或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐。[0665]经修饰的u‑pa多肽能配制用于经注射胃肠外施用(如通过团注(bolusinjection)或连续输注)。注射用制剂可采用单位剂型(如在安瓶或多剂量容器中)呈现，添加有防腐剂。组合物可采用形式如溶于油或水性载剂的悬液、溶液或乳液，且能包含制剂如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，活性成分能采用粉末‑冻干形式，以在使用前用合适载剂如无菌无热原水构建。[0666]经修饰的u‑pa多肽能配制用于眼或眼科递送。眼的药物递送可以是例如外用、口服或全身和/或注射。例如，经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物可外用施用，如采用滴眼剂形式。另一示例中，经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物能通过眼周和/或玻璃体内或视网膜内或视网膜下施用，例如通过眼周或视网膜内或玻璃体内注射。[0667]经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物或编码经修饰的u‑pa多肽的核酸能配制用于全身施用以治疗dgf。另一示例中，经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物或编码经修饰的u‑pa多肽的核酸直接输注或注入肾或者移植肾相邻或周围的组织或器官。经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物可在同种异体移植时间前或伴随慢性方式连续施用的移植时间前施用，和/或可在诸如发作确实发生等事件中的排斥反应期间施用。[0668]药物组合物能配制用于局部或外用应用，如外用应用于皮肤(经皮)和粘膜，例如在眼中，采用凝胶、乳膏和洗剂(lotion)形式，且应用于眼睛或者脑池内或椎管内应用。这类溶液尤其是预期用于眼部应用的那些，可配制为0.01％‑10％等渗溶液和约ph5‑7，采用适当盐。化合物可配制为外用的气雾剂，如经吸入(参见例如美国专利号4,044,126,4,414,209和4,364,923，所述专利描述递送类固醇的气雾剂，该类固醇对治疗炎症疾病尤其是哮喘有用)。[0669]药物组合物中的活性化合物浓度取决于活性化合物的吸附、失活和排出率，给药方案，施用量以及本领域技术人员已知的其他因素。如本文进一步所述，剂量可凭经验确定，使用经修饰的u‑pa多肽相较未修饰和/或野生型u‑pa多肽的性质及活性(如切割一个或多个补体蛋白)对比。[0670]若需要，组合物可以在包装、试剂盒或分配器装置中呈现，其能包括含有活性成分的一个或多个单位剂型。在一些示例中，组合物可包被在装置上，如试管或滤器，例如在旁路机中。例如，包装包含金属或塑料薄膜，如泡罩包装。包装或分配器装置可随附施用说明书。含有活性剂的组合物能包装为含有包装材料和本文所提供药剂的制品，以及指示药剂所用疾病的标签。[0671]还提供含编码u‑pa多肽的核酸分子的组合物，包括表达载体。在一些实施方案中，所述编码u‑pa多肽的核酸分子与其编码表达载体的组合物适用于基因治疗。核酸能体内施用而不是递送蛋白，如全身或通过其他途径或离体如通过移出细胞，包括淋巴细胞，在其中引入核酸，并再引入宿主或相容受体。[0672]2.施用编码经修饰u‑pa多肽的核酸(基因治疗)[0673]经修饰的u‑pa多肽能通过表达核酸分子而递送给细胞和组织。经修饰的u‑pa多肽可以以编码经修饰的u‑pa多肽的核酸分子施用，包括离体技术和直接体内表达。核酸能通过本领域技术人员已知的任何方法递送给细胞和组织。分离的核酸能纳入载体以进一步操作。通过表达编码核酸分子来施用u‑pa多肽的方法包括施用重组载体。载体能设计成维持游离型，如通过纳入复制起点，或能设计成整合入细胞中的染色体。[0674]u‑pa多肽还可用于离体基因表达治疗，使用载体。本领域技术人员已知合适的基因治疗载体和递送方法。例如，细胞能工程化成表达经修饰的u‑pa多肽，如通过将u‑pa多肽编码核酸整合入基因组位置，可操作连接调控序列或从而其放置成在基因组位置可操作连接调控序列。这类细胞随后能局部或全身施用给对象，如需要治疗的患者。用于体内或离体基因治疗的示范性载体包括病毒载体和非病毒载体如脂质体或人工染色体。[0675]可采用病毒载体，包括例如腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒如慢病毒、ebv、sv40、巨细胞病毒载体、痘苗病毒载体，和其他设计用于基因治疗的载体。载体可以是保持游离型的那些或能整合入所治疗对象染色体的那些。经修饰的u‑pa多肽可在病毒载体中编码，如aav，其施用给需要治疗的对象。[0676]适合基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒和上述其他病毒。例如，腺病毒表达技术为本领域熟知，腺病毒生成和施用方法也熟知。可获得腺病毒血清型，例如来自美国菌种保藏中心(马里兰州罗克维尔市)。腺病毒可离体使用，例如细胞分离自需要治疗且转导有表达经修饰的u‑pa多肽的腺病毒载体的患者。适当的培养阶段后，转导细胞局部和/或全身施用给对象。或者，表达u‑pa多肽的腺病毒颗粒被分离和在药学上可接受载体中配制以递送治疗有效量，从而防止、治疗或缓解对象的疾病或病症。在一个实施方案中，所述待治疗疾病由补体激活导致。通常，腺病毒颗粒递送的剂量范围为1颗粒‑1014颗粒/千克对象体重，一般为106或108颗粒‑1012颗粒/千克对象体重。[0677]核酸分子能引入人工染色体和其他非病毒载体。人工染色体如aces(参见lindenbaum等.nucleicacidsres.(2004)32(21):e172)能工程化成编码和表达u‑pa多肽。简言之，哺乳动物人工染色体(mac)提供以自主复制、非整合模式向细胞引入大负载遗传信息的方式。mac中独特的基于哺乳动物卫星dna的人工染色体表达系统(aces)能在不同物种细胞系中从头可重复产生，且易从宿主细胞染色体中纯化。纯化的哺乳动物ace随后可再引入多种受体细胞系，在该处其在没有选择压力的情况下维持较长时间，使用ace系统。采用此方法，在lmtk(‑)和cho细胞中实现1或2个基因靶标的特定加载。[0678]引入经修饰的u‑pa多肽编码核酸的另一方法是酵母中的两步式基因取代技术，开始是用克隆于酵母人工染色体(yac)的完整腺病毒基因组(ad2；ketner等.(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:6186‑6190)和含腺病毒序列的质粒以靶向特定yac克隆中的区域，用于感兴趣基因的表达盒以及正和负选择性标记。对yac特别感兴趣，因为其允许纳入较大基因。此方法能用于构建基于腺病毒的载体，其携带编码任意上述经修饰的u‑pa多肽的核酸以基因转移到哺乳动物细胞或整体动物。[0679]核酸可封装于载剂如脂质体，或引入细胞如细菌细胞，尤其是减毒细菌，或者引入病毒载体。例如，当采用脂质体时，与内吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白能用于靶向和/或促进摄取，如衣壳蛋白或其亲特定细胞类型的片段，用于循环中经历内化的蛋白的抗体，和靶向胞内定位及提高胞内半衰期的蛋白。[0680]在一些实施方案中，需要提供核酸来源，带有靶向细胞的药剂，如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，或靶细胞上受体的配体。本文提供的多核苷酸和表达载体可通过任何适当方法形成。进一步提供含有上述核酸分子的核酸载体。还提供含有上述核酸分子的核酸载体和含有这些载体的细胞。[0681]对于离体和体内方法，将经修饰的u‑pa多肽编码核酸分子引入来自适当供体或待治疗对象的细胞。可出于治疗目的引入核酸的细胞包括例如适合待治疗疾病或病症的任何所需、可获得的细胞类型，包括但不限于表皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞如t淋巴细胞、b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干或祖细胞，包括造血干或祖细胞，例如获自骨髓、脐带血、外周血、胎肝和其其他来源的干细胞。[0682]对于离体治疗，移出来自与待治疗对象相容供体的细胞或来自待治疗对象的细胞，向这些分离细胞引入核酸且修饰细胞施用于对象。治疗包括直接施用，例如在多孔膜内封装，其植入患者(参见例如美国专利号4,892,538和5,283,187)。适合核酸体外转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体和阳离子脂质(如dotma、dope和dc‑chol)电穿孔、微注射、细胞融合、deae‑葡聚糖和磷酸钙沉淀方法。dna递送方法能用于体内表达u‑pa多肽。这类方法包括脂质体递送核酸和裸dna递送，包括局部和全身递送例如使用电穿孔、超声和磷酸钙递送。其他技术包括微注射、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移和球状质体融合。[0683]体内表达经修饰的u‑pa多肽可与额外分子表达相连。例如，u‑pa多肽表达可与细胞毒性产物的表达相连，如在工程病毒中或在细胞毒性病毒中表达。这类病毒能靶向特定细胞类型，其是治疗效果的靶标。表达的u‑pa多肽能用于增强病毒的细胞毒性。[0684]体内表达u‑pa多肽可包括操作性连接u‑pa多肽编码核酸分子与特定调控序列如细胞特异或组织特异性启动子。u‑pa多肽也能表达自载体，其在靶细胞类型和/或组织中特异性感染和/或复制。诱导型启动子能用于选择性调节u‑pa多肽表达。[0685]作为裸核酸或在载体、人工染色体、脂质体和其他载剂中的核酸分子，能通过全身施用、外用、局部和其他施用途径施用于对象。当全身性和体内时，核酸分子或含有核酸分子的载剂能靶向细胞。[0686]施用还可以是直接的，如通过载体或细胞施用，其通常靶向细胞或组织。例如，肿瘤细胞和增殖细胞可以是用于体内表达u‑pa多肽的靶细胞。用于体内表达u‑pa多肽的细胞还包括与患者自体同源的细胞。这类细胞可从患者取出，引入用于表达u‑pa多肽的核酸，然后通过注射或移植施用于患者。[0687]施用以治疗amd和其他眼疾病[0688]可施用编码经修饰的u‑pa多肽的核酸以治疗病因学涉及补体激活的疾病或病症，其中抑制其能缓解疾病或病症症状或另外治疗疾病或病症。核酸如载体例如病毒载体设计用于递送本文所述经修饰的u‑pa多肽编码核酸，可根据疾病或病症通过任何合适途径或不同途径的组合施用对象。实现核酸递送可通过直接递送到眼睛(如眼部递送、视网膜下注射、玻璃体内(ivt)注射、视网膜内注射或外用(例如滴眼剂)递送)或全身途径递送，如动脉内、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内和其他施用途径。[0689]本领域技术人员可选择与施用对象和病毒相容的任何施用模式，且还可能导致病毒到达和进入靶细胞类型或组织，如眼睛，例如视网膜色素上皮(rpe)细胞和/或感光细胞。施用途径能由本领域技术人员根据任意多种因素选择，包括疾病性质、靶细胞或组织特性(如细胞类型)和待施用的特定病毒。可选择在靶向感兴趣细胞或组织的地方施用，如眼睛，例如视网膜色素上皮(rpe)细胞和/或感光细胞或视网膜下腔。[0690]例如，经修饰的u‑pa多肽编码核酸如病毒表达载体能递送给靶细胞，其以疾病为特征，如眼疾病例如amd。例如，含有病毒的组合物可通过视网膜下注射递送，如视网膜下注入视网膜色素上皮(rpe)、感光细胞或其他眼细胞(如视网膜神经节细胞)。在一些示例中，视网膜下施用病毒如含有本文所述核酸的任意病毒，需要熟练的医生实施玻璃体切除术(即其中在视网膜内形成针孔(视网膜造孔术)并注射液体，如含有病毒的液体，例如本文所述任何病毒)。视网膜下注射能经角膜途径实现，通过瞳孔且随后穿过晶状体、玻璃体和视网膜。其他示例中，视网膜下注射可如下进行：将针或任何其他施用装置穿过巩膜，进入平坦部或色边缘区，通过中部或后部玻璃体并到达视网膜另一侧，到视网膜下腔内。其他示例中，视网膜下注射可如下进行：将针或任何其他施用装置穿过巩膜，通过眼脉络膜和布鲁赫膜，防止视网膜递送到rpe。视网膜下施用的其他合适途径可由熟练的技术人员或医生或外科医生确定。一些示例中，水泡形成标志着施用成功。[0691]在其他示例中，组合物包含经修饰的u‑pa多肽编码核酸以在眼中表达，可通过玻璃体内注入眼部细胞递送，如施用以靶向玻璃体细胞和内层视网膜细胞。在一些示例中，玻璃体内注射如下进行：将针或任何其他施用装置穿过平坦部，通过中部或后部玻璃体并到达视网膜另一侧。玻璃体内注射后，可递送含有病毒的组合物以感染神经节细胞。其他示例中，通过玻璃体内注射递送的含病毒组合物靶向内核层细胞。递送功效取决于病毒滴度和血清型。在一些示例中，治疗包括直接玻璃体内注射，联合玻璃体内植入式装置(即生物溶蚀性和非生物溶蚀性植入式装置)以增加眼睛后部的所施用药剂浓度(hwang等(2012)jkoreanmedsci27:1580‑85)。[0692]在其他示例中，含有经修饰的u‑pa多肽编码核酸的组合物通过睑静脉注射入靶眼部细胞。其他示例中，病毒离体施用(如应用于切除的rpe脉络或胎儿视网膜细胞或视网膜细胞)以移植到眼睛，例如作为视网膜移植物。其他示例中，本领域技术人员如熟练的医生可选择含有本文所述核酸的任何病毒的合适施用途径。若需要，施用途径能组合。[0693]在一个示例中，病毒在靶细胞如疾病细胞存在的位点局部施用，即眼睛或视网膜。外用施用常用于眼前节的眼疾病(patel等.worldjpharmacol(2013)2:47‑64)。[0694]在一个示例中，玻璃体内递送的病毒能在细针(27‑30g)内通过玻璃体内的平坦部施用。技术人员会确定针轴离多远插入眼睛(如插入深度)、施用速度(如应用于柱塞的压力)、斜面的取向角以及轴与平坦部之间的角度。[0695]h.治疗应用和治疗方法[0696]本文所提供经修饰的u‑pa多肽靶向补体蛋白c3且允许调节补体介导的疾病和失调。治疗蛋白酶如本文所提供经修饰的u‑pa多肽相比传统治疗方法具有许多潜在优势。其中主要是以催化方式灭活疾病靶标(即一个到许多化学计量)。因此，蛋白酶能在显著低于靶浓度的浓度下维持有效调控。另外的差异化优势包括(1)不可逆灭活；(2)低给药剂量；(3)给药频率减少(4)小分子尺寸；(5)靶向翻译后修饰的能力；(6)中和高靶标浓度的能力；和(7)靶向远离活性位点的能力。作为治疗剂，蛋白酶必须仍显示下列特征：(1)达到分子靶标(胞外)和(2)对于疾病状态关键的靶标具有足够严格的特异性。本文所提供的经修饰的u‑pa多肽能用于治疗补体介导疾病和失调。[0697]技术人员应理解补体系统在疾病过程中的作用并知道多种这类疾病。提供关于示范性疾病和补体蛋白c3在其病因学及病理学中作用的简要讨论。本文所提供经修饰的u‑pa多肽和核酸分子能用于治疗涉及补体途径激活的任何病症，尤其是炎性病症，包括急性炎症病症如败血性休克和慢性炎症病症如类风湿性关节炎(ra)。急性和炎性病症可表现为免疫介导疾病，例如自身免疫病或由免疫复合物介导的炎症所导致的组织损伤。补体介导的炎性病症也可表现为具有炎症成分的神经退行性或心血管疾病。此章节提供本文所提供经修饰的u‑pa多肽的示范性应用和施用方法。所述这些治疗是示范性的且不限制本文所提供经修饰的u‑pa多肽的应用。这类方法包括但不限于治疗下面所述和列举的生理及医学状况的方法。这类方法包括但不限于治疗年龄相关的黄斑变性(amd)、地图状萎缩(ga)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、移植肾功能延迟(dgf)、败血症、类风湿性关节炎(ra)、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、红斑狼疮、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、呼吸窘迫综合征、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、多脏器功能衰竭、阿尔茨海默氏病(ad)、由事件或处理导致的缺血再灌注损伤，如心肌梗塞(mi)、中风、心肺转流(cpb)或冠状动脉旁路搭桥、血管成形术或血液透析，慢性阻塞性肺病(copd)、特发性肺纤维化(ipf)和/或格林‑巴利综合征的方法。[0698]用本文所提供经修饰的u‑pa多肽治疗疾病和病症可通过任何适当途径使用本文所述合适制剂实现，包括但不限于皮下注射、口服、玻璃体内、视网膜内、视网膜下、眼周和经皮施用。若必要，特定剂量和持续时间及治疗操作可凭经验确定或推测。例如，野生型u‑pa多肽的示范剂量能用作起始点以确定合适剂量。相较于野生型u‑pa多肽具有更高特异性和/选择性的经修饰的u‑pa多肽可在减少的剂量或频率有效。剂量水平能基于多种因素确定，如个体体重、总体健康、年龄、所用特定化合物的活性、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病严重度和过程、患者疾病倾向和治疗医生的判断。可联合载体材料以生成单一剂型的活性成分量会根据所治疗宿主和特定施用模式而变化。[0699]患者病症改善后，若必要，可施用化合物或组合物的维持剂量；施用剂量、剂型或频率或其组合可改良。一些情况下，对象在任何疾病症状复发后可能需要长期间歇疗法。[0700]1.补体激活介导的疾病[0701]补体级联是一把双刃剑，通过促进吞噬作用和炎症来引起针对细菌以及病毒侵入的保护。相反，甚至当补体正常运作时，其可能通过促进局部炎症而促成疾病发展和组织损伤。因此，病理学效果由负责补体保护作用的相同介质介导。例如，过敏性和趋化肽c5a通过募集和激活嗜中性粒细胞来驱动炎症，c3a能导致其他吞噬细胞的病理性激活，膜攻击复合物能杀死或损伤细胞。在一个示例中，如许多自身免疫病中，补体产生组织损伤，因为其在不恰当情况下活化，如通过针对宿主组织的抗体活化。其他情况下，补体能正常激活，如通过败血症，但仍促成疾病发展，如在呼吸窘迫综合征中。如果不适当控制，补体能在病理上导致对血管(血管炎)、肾脏基底膜以及附着的内皮细胞和上皮细胞(肾炎)、关节滑膜(关节炎)和红细胞(溶血)的重大损害。[0702]补体在若干疾病的免疫发病机理中起作用，包括自身免疫病如类风湿性关节炎(参见例如wang等(1995)proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:8955‑8959；moxley等(1987)arthritis&rheumatism30:1097‑1104)、红斑狼疮(wang等(1996)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:8563‑8568；andbuyon等(1992)arthritisrheum.35:1028‑1037)和急性肾小球性肾炎(couser等(1995)jamsocnephrol.5:1888‑1894)。涉及补体系统激活的其他病状包括败血症(参见例如stove等(1996)clindiaglabimmunol3:175‑183；hack等(1989)am.j.med.86:20‑26)、呼吸窘迫综合征((参见例如zilow等(1990)clin.exp.immunol.79:151‑157；和stevens等(1986)j.clin.invest.77:1812‑1816)、多脏器功能衰竭((参见例如hecke等(1997)shock7:74；和heideman等(1984)j.trauma24:1038‑1043)、缺血再灌注损伤如在心血管疾病如中风或心肌梗塞中发生(austenwg等(2003)intjimmunopatholpharm16(1):1‑8)、年龄相关的黄斑变性(bradley等.eye25:683‑693(2011)；gemenetzi等.eye30:1‑14(2016))和移植肾功能延迟(danobeitia等.[摘要].amjtransplant.2013；13(suppl5)；yu等(2016)amjtransplant16(9):2589‑2597；castallano等(2010)amjpathol176(4):1648‑1659)。一些补体介导疾病的范例如下所述。[0703]a.类风湿性关节炎[0704]类风湿性关节炎(ra)是慢性炎症性疾病。其是自身免疫病，其中免疫系统攻击正常组织成分，就如同它们是入侵的病原体。与类风湿性关节炎相关的炎症主要攻击关节内部。血管、心脏和肺内衬的膜还可能发炎。ra表征为在发炎滑膜和确立的疾病淋巴滤泡及生发中心内存在活化的b细胞和浆细胞。这引起高水平的局部免疫球蛋白生成和包括igg及igm类风湿因子在内的免疫复合物沉积，这在滑膜中且与关节软骨相关联，其能用作补体级联的起始剂。在发炎的类风湿性关节中发现补体成分如c3a、c5a和c5b‑9水平提高。这些补体成分能加剧ra相关炎症，这是通过诱导多种促炎活性如血管通透性、白细胞趋化的改变以及多个细胞类型的激活和裂解。[0705]b.败血症[0706]败血症是由严重感染如细菌感染导致的疾病，引起全身性炎症应答。细菌细胞壁成分脂多糖通常与败血症相关，尽管其他细菌、病毒和真菌感染能刺激败血症状。如果身体的天然免疫系统无法抵御入侵的微生物，从而例如免疫应答的促炎结果对宿主组织有害，则经常发生败血性休克。败血症早期表征为过度补体激活，引起补体过敏毒素如c3a、c4a和c5a生成增加，其作用于增加血管通透性，刺激从中性粒细胞生成超氧化物并刺激组胺释放。c5a的作用能有助于对细菌感染的高效免疫应答，但若保持不受调控，c5a也能有严重破坏性。在大肠杆菌诱导的炎症模型中，阻断c5a可通过限制c5a介导的中性粒细胞激活来改善败血症动物的结果，所述激活能导致中性粒细胞介导的组织损伤。[0707]对细菌感染的固有免疫应答的持续损伤通常导致慢性败血症或败血性休克，其可能威胁生命。在败血症后期，中性粒细胞的“休眠”活性促成疾病持续，其与早期出现的极度活跃相反。后期中，中性粒细胞的主要功能下降，包括趋化性、呼吸爆发活力和细菌杀伤能力。补体且尤其是c5a，也在败血症后期发挥作用。败血症期间的c5a过度生成与血中性粒细胞“失活”相关联，此过程与中性粒细胞上c5a诱导的其自身受体c5ar下调相关(guo等(2003)fasebj13:1889)。中性粒细胞上的c5ar水平下降与血中性粒细胞结合c5a的能力减弱、趋化反应受损、过氧化物生成损失和细菌活性受损相关联。然而，c5ar水平能在败血症后期开始“恢复”且与有益疾病结果示例相关。[0708]c.多发性硬化[0709]多发性硬化(ms)和其动物模型实验性变应性脑脊髓炎(eae)是中枢神经系统(cns)的炎性脱髓鞘病。在ms中，神经组织炎症导致髓磷脂损失，髓磷脂是脂肪物质，用作脑和脊髓中神经纤维的一种保护绝缘套。此脱髓鞘留下沿着神经细胞覆盖物的多区域瘢痕组织(硬化)，这破坏神经实施电脉冲进出大脑的能力，生成多种ms症状。ms由活化的淋巴细胞、巨噬细胞/小神经胶质细胞和补体系统介导。补体激活可通过其双重作用促进这些疾病的发病机理：活化末端复合物c5b‑9促进脱髓鞘的能力和亚溶解型c5b‑9保护少突胶质细胞(olg)免于细胞凋亡的能力。[0710]d.阿尔茨海默氏病[0711]阿尔茨海默氏病(ad)表征为脑内的缠结(异常配对的蛋白tau螺旋丝，其通常结合微管)和斑块(胞外沉积，主要由β淀粉样蛋白构成)。尽管ad的精确病因不完全清楚，ad脑受影响区域的慢性神经炎症表明促炎介质能发挥作用。ad脑内的缠结和斑块沉积有活化的补体片段，例如c4d和c3d。同样，ad脑内的营养不良性神经突可就mac进行免疫组化染色，指示ad中这些神经突的自催化攻击和伴随的神经突损失。ad的补体激活通过聚集的淀粉样β蛋白所诱导的抗体独立机制发生。此外，补体级联能由正五聚蛋白、c反应蛋白(crp)和淀粉样蛋白p(ap)激活，其在ad中都上调(mcgeer等,(2002)trendsmolmed8:519)。ad的补体激活标志为补体介质增加，通过补体调控蛋白如cd59的补偿性上调，未充分控制所述激活。因此，补体激活的促炎结果加剧ad发展且可能促成神经突破坏。[0712]e.缺血再灌注损伤[0713]缺血再灌注损伤是缺血事件和血流后续恢复之后持续的损伤，由对缺氧损害的炎症应答引起。缺血再灌注损伤在心脏手术操作期间，例如开心手术或血管成形术后，可以是急性的，或者随着充血性心力衰竭或闭塞性心血管疾病，可以是慢性的。能导致缺血再灌注损伤的损伤示例包括心肌梗塞(mi)和中风。炎症应答的起始可能由随着再灌注发生的组织氧水平增加以及伴随的代谢物积聚引起，所述代谢物可产生免疫刺激的氧自由基。缺血再灌注损伤与多个事件相关，包括心肌梗塞、脑缺血事件、肠缺血的严重度，和许多方面的血管外科、心外科、创伤和移植。损伤表现为固有免疫系统的炎症事件，尤其是补体系统的激活，响应作为非自身的新改变组织。如此，缺血再灌注损伤表征为血管通透性增加导致的组织水肿和多形核白细胞流入导致的急性炎性细胞浸润。[0714]补体系统的激活在缺血再灌注损伤的炎症事件中发挥作用。缺血损伤导致细胞膜改变，影响外部表面的脂质、碳水化合物或蛋白，从而这些暴露的表位改变并能用作新抗原(修饰的自身抗原)。循环igm识别和结合新抗原以在受损细胞表面上形成免疫复合物。形成的抗原‑抗体复合物是补体经典途径的经典激活物，尽管所有途径可能都在某种程度上参与损伤的加剧作用。补体经典途径参与缺血再灌注损伤由c3或c4基因缺陷型小鼠证明，其在损伤的后肢和动物模型中展示出针对局部损伤的等同保护(austen等(2003)intjimmunopathpharm16:1)。相反，在缺血损伤的肾模型中，c3、c5和c6缺陷型小鼠受到保护，而c4缺陷型小鼠没有，表明替代补体途径的重要性(guo等(2005)annrevimmunol23:821)。补体激活后诱导的介质在局部损伤位点针对细胞膜起始炎症应答。[0715]补体在缺血再灌注损伤中的主要效应机制是中性粒细胞通过补体成分例如c5a流入发炎组织和激活。中性粒细胞激活引起局部受损器官中的活性氧生成增加和溶酶体酶释放，这最终导致细胞凋亡、坏死和器官功能损失。产生末端mac即c5b‑9也促成缺血再灌注损伤中的局部组织损伤。[0716]f.眼失调[0717]正常眼中，补体系统在低水平连续激活；膜结合和可溶性眼内补体调控蛋白严格调节此自发补体激活。低水平补体激活提供保护抵御病原体，而不导致对自身组织的任何损害和视力丧失。补体系统和补体调控蛋白控制自身免疫性葡萄膜炎中的眼内炎症并在角膜炎症、年龄相关的黄斑变性和糖尿病视网膜病变发展中起重要作用。补体系统在糖尿病视网膜病变以及糖尿病神经病变和糖尿病心血管病变的发病机理中具有重要作用(参见例如ghosh等(2015)endocrrev36:272–288)。自发补体激活能导致感染后的角膜组织损害。补体抑制是多种眼疾病治疗中的相关治疗靶标(参见例如purushottam等(2007)molimmunol.44:3901–3908)。[0718]年龄相关的黄斑变性(amd)[0719]年龄相关的黄斑变性是描述多种疾病的临床术语，所述疾病表征为中心视力的逐步丧失。amd是许多工业国家中老年个体视力丧失的主要原因(jager等(2008)nengljmed358:2606‑2617)。发生视力丧失归因于黄斑进行性变性，黄斑是眼后部区域，包括高密度视锥细胞，其专门用于高灵敏度中心视力。[0720]amd能表现为干(非新生血管)amd和/或湿amd。干amd是更常见(85‑90％病例)和温和形式的amd，且表征为黄斑中或下面的小、圆形、黄白病变(脉络膜小疣)。晚期干amd或地图状萎缩导致由pre感光细胞损失引起的视网膜变薄、黄斑退化和最终的失明。尽管更稀少，与湿amd相关的视力丧失一般比干amd更剧烈。湿amd包括形成致病性血管，称为脉络膜新生血管(cnv)，其中异常血管在视网膜色素上皮(rpe)层下方发展。cnv通过布鲁赫膜断裂或其破坏从下面脉络入侵视网膜能导致amd中的视力丧失，布鲁赫膜是脉络与视网膜色素上皮(rpe)之间的胞外基质(例如，归因于视网膜下出血和/或瘢痕)。[0721]amd的早期临床特点包括布鲁赫膜变厚和出现脉络膜小疣(gass,j.d.(1972)trans.am.ophthalmol.soc.70:409‑36)，其是由聚集蛋白组成的胞外脂蛋白沉积(即白蛋白、载脂蛋白e(apoe))、补体途径成分(如补体因子h(cfh),c1q,c3,c5,c5b,c6,c7,c8,c9和玻连蛋白(hageman等.,(2001)prog.retin.eye.res29:95‑112；hageman等(2005)proc.nat.acad.sci.102:7227‑7232；mullins等(2000)fasebh14:835‑846；anderson等,(2010)pro.retin.eyeres.29:95‑112))、免疫球蛋白和/或β淀粉样蛋白(crabb等,(2002)procnatlacadsci99:14682‑14687；johnson等,(2002)99:11830‑11835))以及位于rpe与布鲁赫膜之间的脂质和细胞组分。[0722]amd中的炎症由替代补体途径失调介导。补体成分c3和c5是amd患者中脉络膜小疣的主成分(mullins等,(2000)fasebj14,835‑46；johnson等,(2000)expeyeres70,441‑9；anderson等,(2002)amjophthalmol134,411‑31；和leitner等,(2001)expeyeres73,887‑96)。假设脉络膜小疣的生物发生涉及能引发补体激活和mac形成的慢性炎症过程，其可裂解rpe细胞或破坏rpe细胞的生理性自体稳衡，导致amd的炎症特征(johnson等(2001)expeyeres73,887‑896)。在amd患者血液中还检测到补体蛋白(如c3d)((scholl等,(2008)plosone3:e2593)，指示amd诱导炎症可能是全身性的。有遗传证据证明补体在干amd发病机理中的作用(klein等.science308(5720):385‑389(2005)；yates等,nejm357:553‑561(2007))，坎普他汀(和坎普他汀衍生物apl‑1及apl‑2)和c3的小肽抑制剂pot‑4(potentiapharmaceuticals)可减缓amd中的地图状萎缩发展(ricklin等(2008)adv.exp.med.biol.632:273‑292)，表明c3(即c3抑制)可以是amd治疗的可行靶标。[0723]g.器官移植和移植肾功能延迟(dgf)[0724]补体在缺血再灌注损伤的发病机理发挥作用。肾再灌注损伤的机制取决于c5a和c5b‑9的生成，两者都对肾小管有直接毒性，促进急性肾小管坏死和细胞凋亡，并导致缺血后急性肾功能衰竭和组织纤维化。进而，产生这些末端途径成分取决于肾内合成c3和对补体激活必要的其他补体成分可用性。供体器官的c3表达水平强烈取决于冷缺血时间(elham等(2010)curropinorgantransplant.15:486–491)。[0725]实体移植器官排斥受初始炎症应答和后续适应性同种免疫应答影响，两者都受多个补体成分影响。补体蛋白在缺血再灌注过程的移植后器官损伤和调节适应性免疫应答激活中发挥重要作用。抑制补体或调节补体蛋白分子功能可减少移植器官损伤并增加器官寿命(参见例如elham等(2010)curropinorgantransplant.15:486–491)。为治疗干预靶向补体成分可在器官回收、转移和移植后的时间减少器官损伤。示例性的这样的器官是肾。可施用本文所提供经修饰的u‑pa多肽以缓解和/或治疗移植后的器官损伤。[0726]移植肾功能延迟(dgf)如肾功能延迟恢复是一个肾移植患者子集中出现的病症，其中移植器官在移植后无法立即正常运作。其他可能的移植包括但不限于心、肺、血管组织、眼、角膜、晶状体、皮肤、骨髓、肌肉、结缔组织、胃肠组织、神经组织、骨、干细胞、胰岛、软骨、肝细胞和造血细胞。肾dgf表征为肾移植的急性坏死且临床定义为移植后不久的透析需求。移植过程期间的急性肾损伤经常表现为dgf。dgf的潜在病理学是来自供体衍生因素(如供体年龄和缺血持续时间)和受体因素(如再灌注损伤、免疫应答和免疫抑制剂药物治疗)的贡献的复合体。[0727]补体级联成分和补体激活起到作为移植排斥和缺血再灌注损伤介质的关键作用，所述损伤导致dgf。动物研究确立了补体在缺血再灌注损伤中的关键作用。例如，针对c5的人源化单克隆抗体依库丽单抗可阻断补体激活且显示在一个高风险肾移植患者子集中防止移植肾功能延迟(参见例如《水平扫描研究和情报中心简报》(horizonscanningresearchandintelligencecentrebrief),2016年9月；johnson等(2015)curropinorgantransplant20(6):643‑651；yu等(2016)amjtransplant16(9):2589‑2597)。粒状c4d沉积与人肾移植受体的dgf相关(等(2014)transplint27(3):312‑321)。c3生成增加与肾移植排斥相关(pratt等(2002)natmed8(6):582‑587；damman等(2011)nephroldialtransplant26(7):2345‑2354)。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用作治疗剂以防止或缓解或消除移植排斥和dgf。[0728]2.治疗应用[0729]a.免疫介导的炎症疾病[0730]本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于治疗炎症性疾病。可用蛋白酶治疗的炎症性疾病包括急性和慢性炎症性疾病。示范性炎症性疾病包括中枢神经系统疾病(cns)、自身免疫病、气道高反应性病症如哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病和免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤。[0731]实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)能用作多发性硬化(ms)模型(piddlesden等,(1994)jimmunol152:5477)。eae可在许多遗传易感物种中通过用髓磷脂和髓磷脂组分如髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)免疫来诱导。例如mog诱导的eae概括了人ms的基本特征，包括慢性、复发临床病程、炎症的病理组织学三联体(pathohistologicaltriadofinflammation)、反应性胶质化和形成汇合的大脱髓鞘斑块。经修饰的u‑pa多肽可在eae动物模型中评价。施用经修饰的u‑pa多肽，如通过每日腹腔注射，监测相较对照动物的症状过程和进展。可加剧疾病的炎性补体成分水平能如下测量：在溶血实验中测定血清补体活性和测定补体成分例如c1、c3和c9的沉积。[0732]补体激活调节疾病中的炎症，如类风湿性关节炎(ra)(wang等,(1995)proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:8955)。经修饰的u‑pa多肽能用于治疗ra。例如，u‑pa多肽能局部或全身注射。经修饰的u‑pa多肽能每日或每周给药。聚乙二醇化u‑pa多肽可用于诱导免疫原性。在一个示例中，ii型胶原诱导性关节炎(cia)能在作为自身免疫炎性关节疾病模型的小鼠中诱发，其在组织学上类似表征为炎性滑膜炎、血管翳形成以及软骨和骨侵蚀的ra。为诱导cia，牛ii型胶原(b‑cii)在弗氏完全佐剂存在情况下能于尾基部皮内注射。21天后，小鼠能用相同操作再免疫。为检测u‑pa多肽效果，b‑cii初始攻击后3周，u‑pa多肽或对照能每周腹腔施用2次，持续3周。小鼠在初始免疫后7周杀死以用于组织学分析。为评价u‑pa多肽对已建立疾病的治疗效果，u‑pa多肽能在一个或多个后肢发生临床关节炎后每日施用，持续共10天。初始受影响关节的肿胀程度可通过测量爪厚度用卡尺监测。2种模型中，血清能取自小鼠以用于溶血实验和测量激活的补体标记物例如c5a及c5b‑9。另一示例中，可获得灵长类动物模型用于ra治疗。可在u‑pa多肽治疗对象和对照中监测触痛及肿胀关节的反应以评估u‑pa多肽治疗。[0733]经修饰的u‑pa多肽能用于治疗免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤。ic介导的损伤由针对组织中ic沉积的局部炎症应答导致。随后的炎症应答特征为水肿、中性粒细胞增多、出血和最终的组织坏死。ic介导的组织损伤可在体内阿瑟氏(rpa)反应中研究。简言之，rpa反应中，过量抗体(例如兔igg抗鸡卵清蛋白)注入动物例如大鼠或豚鼠的皮肤，所述动物之前静脉输注对应抗原(即鸡卵清蛋白)(szalai等.,(2000)jimmunol164:463)。rpa反应开始前不久，u‑pa多肽或丸剂对照能通过静脉内注射经右股静脉与对应抗原同时施用。或者，u‑pa多肽能在rpa反应最初一小时中施用，在抗原注射后立即开始且就在抗体皮肤注射之前。u‑pa多肽对产生补体依赖性ic介导的组织损伤的影响可在rpa开始后多个时间如下评价：通过收集血液以确定血清溶血活性，和通过收获受感染皮肤区域以定量病变大小。[0734]治疗性u‑pa多肽如本文所述那些，能用于治疗败血症和导致致命休克的严重败血症。补体介导的致命休克的模型能用于测试u‑pa多肽作为治疗剂的效果。在一个这类示例中，大鼠能用痕量脂多糖(lps)致敏，然后施用针对补体膜抑制剂的单克隆抗体(抗crry)(mizuno等,(2002)intarchallergyimmunol127:55‑62)。可在致命休克开始过程中如lps致敏前、lps致敏后或施用抗crry后施用u‑pa多肽或对照，可评估大鼠从致命休克的恢复。[0735]b.神经退行性疾病[0736]补体激活加剧了阿尔茨海默氏病(ad)发展且促进ad脑的神经突损失。本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于ad。模拟一些ad神经病理和行为特征的小鼠模型能用于评价u‑pa多肽的治疗效果。转基因小鼠模型示例包括在积极启动子控制下向小鼠引入人淀粉样前体蛋白(app)或早老素1(ps1)蛋白，所述蛋白带有生成疾病的突变。这些小鼠发展出ad特征，包括β‑淀粉样蛋白斑块和营养不良性神经突的增加。用于app和ps1突变蛋白的双重转基因小鼠发展出更大数目的纤维状β‑淀粉样蛋白斑块并显示与斑块相关的活化神经胶质和补体因子。u‑pa多肽能通过例如每日腹腔或静脉内注射施用，并监测相较于对照动物症状的过程和发展。[0737]c.心血管疾病[0738]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用于治疗心血管疾病。u‑pa多肽能用于治疗心血管疾病，包括缺血再灌注损伤，由中风、心肌梗塞、心肺转流术、冠状动脉旁路搭桥术、血管成形术或血液透析引起。u‑pa多肽还能用于治疗与心肺转流术相关的炎症应答，其可能促成组织损伤。一般，u‑pa多肽可在诱导补体介导缺血再灌注损伤的治疗或事件之前、同时或之后施用。在一个示例中，u‑pa多肽可在通过补体介导、缺血损伤诱导事件的对象治疗前施用给对象，所述事件例如冠状动脉旁路搭桥术或血管成形术。[0739]u‑pa多肽对缺血再灌注损伤治疗的效果可在损伤的动物模型中评估。一个这类模型中，在心包前形成切口的兔子内诱导心肌缺血，这是通过在左前降支(lad)冠状动脉周围从其起点开始5‑8mm放置3‑0丝线并收紧结扎线，从而血管完全闭塞(buerke等,(2001)jimmunol167:5375)。u‑pa多肽例如经修饰的u‑pa多肽或对照载剂如盐水，能在冠状动脉闭塞后55分钟(即再灌注前5分钟)以增加剂量大剂量(asabolus)静脉内施用。5分钟后(即缺血共60分钟后)，lad结扎线能解开且心肌缺血可再灌注3小时。再灌注阶段结束时，收紧lad周围的结扎线。u‑pa多肽对缺血损伤的效果能如下分析：评价对心肌坏死的影响、血浆肌酸激酶水平和中性粒细胞激活标志物，例如髓过氧物酶活性和超氧自由基释放。[0740]在经分离小鼠心脏用含6％人血浆的krebs‑henseleit缓冲液灌注后维持的补体介导心肌损伤的另一模型中，经修饰的u‑pa多肽治疗能用于限制对心脏的组织损害。这类示例中，用于灌注心脏的缓冲液可补充有不同剂量的经修饰的u‑pa多肽。可就人c3和c5b‑9的沉积、冠状动脉灌注压、舒张末压和心率测定灌注的心脏。[0741]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能在心肺转流术(cpb)或冠状动脉旁路搭桥术之前或之后用作治疗剂以抑制炎症免疫应答，所述炎症免疫应答通常在旁路后发生且可能促进组织损伤。体外旁路回路中全血的体外再循环能用于刺激血小板和白血球变化以及cpb诱导的补体激活(rinder等(1995)j.clin.invest.96:1564)。这种模型中，u‑pa多肽或对照缓冲液能以不同剂量加入已含有来自健康供体血液和猪肝素的转移包，且就在血液加入体外回路之前。血样可在再循环后5、15、30、45、60、75和90分钟获取并测定用于补体研究，例如溶血实验和/或补体激活试验以测量c5a、c3a和/或sc5b‑9。加入体外回路前取出的血液处理前样品能用作对照。可实施血液样品的流式细胞术以确定血液中循环白血球(即中性粒细胞)上的粘附分子水平，例如cd11b和p选择素水平。[0742]d.年龄相关的黄斑变性(amd)[0743]本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于测试年龄相关的黄斑变性(amd)。可用蛋白酶治疗的年龄相关的黄斑变性(amd)包括湿amd、干amd和地图状萎缩。[0744]可获得模拟许多人疾病特征的多个amd动物模型(pennesi等(2012)mol.aspectsmed.33(4):487‑509))。补体途径基因的突变显示增加或减少amd易感性(edwards等(2005)science308(5720):421‑424；hageman等(2005)proc.nat.acad.sci102(20):7227‑7232；klein等(2005)science308(5720):385‑389)。例如，在通常与c3b相互作用的补体因子h(cfh)中，单一核苷酸多态性y402h防止c3b结合因子b，导致抑制c3形成。y402h与人中amd风险上升相关，先前在43‑59％amd患者中鉴定突变(haines等(2005)science308(5720):419‑421；thakkinstian等(2006)hum.mol.genet.15(18):2784‑2790；zareparsi等(2005)am.j.hum.genet.77(1):149‑153)。[0745]没有形成cfh能力的转基因小鼠发展出amd特征，包括视网膜异常、视力下降和补体沉积(coffey等(2007)proc.nat.acad.sci.104:16651‑16656)。补体蛋白因子b(montes等(2009)proc.nat.acad.sci.106(11):4366‑4371)、c2(gold等(2006)nat.genet.38(4):458‑462)和c3(maller等(2007)nat.genet.39(10):1200‑1201；yates等(2007)newengl.j.med.357(6):553‑561)的突变与发展amd的风险增加或减少相关，这是基于其对多个补体蛋白表达和/或活性的影响(reynolds等(2009)invest.ophthalmol.vis.sci.50(12):5818–5827)。[0746]经修饰的u‑pa蛋白酶如本文所提供经修饰的u‑pa蛋白酶能用作治疗剂，其中u‑pa蛋白酶用于切割补体蛋白c3的活性如底物特异性或选择性改变。施用本文所提供经修饰的u‑pa蛋白酶，例如通过每月两次玻璃体内或视网膜下或视网膜内注射，监测症状相较于对照动物或对象的过程和发展。可加剧疾病的补体成分水平也能如下测量：在溶血实验中测定血清补体活性和测定补体成分例如c1、c3和c9的沉积。[0747]补体激活在年龄相关的黄斑变性(amd)的疾病发展中发挥作用(参见例如bradley等,(2011)eye25:683‑693；gemenetzi等(2016)30:1‑14)。经修饰的u‑pa多肽能用于治疗amd。例如，u‑pa多肽或含有u‑pa多肽如本文所述经修饰的u‑pa多肽的药物组合物，能玻璃体内或视网膜内或视网膜下或眼周注射。经修饰的u‑pa多肽可每日或每周或更低频率给药，例如每月或更低频率，如每月两次。对于amd，每月给药经修饰的u‑pa多肽是可能的，所述多肽未进一步“修饰”用于眼部延长持续时间(如融合蛋白、聚乙二醇化等)(也考虑每月两次给药)。适当“修饰”后，每3个月(或更低频率)是可行的。经修饰的u‑pa多肽能改良，如通过聚乙二醇化以降低潜在免疫原性和/或增加血清半衰期。对于amd，使用每月给药或每月两次给药的经修饰的u‑pa多肽，所述多肽未进一步修饰用于眼部延长持续时间(如融合蛋白、聚乙二醇化等)。若通过聚乙二醇化修饰，给药能每3个月或更长时间完成。[0748]e.器官移植[0749]移植肾功能延迟(dgf)[0750]本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于治疗移植肾功能延迟(dgf)，包括例如作为肾移植受体中缺血再灌注损伤结果的dgf。u‑pa多肽也能用于治疗器官移植相关的炎症应答，其可能促进组织损伤。一般，u‑pa多肽可在诱导补体介导缺血再灌注损伤的治疗或事件之前、同时或之后施用。在一个示例中，u‑pa多肽可在通过补体介导、缺血损伤诱导事件的对象治疗前施用于对象，所述事件例如肾移植或肾同种异体移植。u‑pa多肽对治疗移植肾功能延迟例如缺血再灌注损伤所引起移植肾功能延迟的效果，可在模拟人肾同种异体移植或移植物所展示特征的损伤动物模型中评估。[0751]存在导致dgf的早期移植功能障碍的早期生物标志物可指示对治疗的需求，包括用于肾小管上皮细胞损伤的生物标志物。鉴定了dgf的生物标志物(即血清肌酸)(malyszko等(2015)naturescientificreports5:11684；wanga等(2015)plosone10(9):e0136276)。早期检测dgf的生物标志物和治疗干预例如用经修饰的u‑pa多肽的治疗处理，可改善临床结果。[0752]补体激活调节失调中的疾病发展，如器官移植例如肾移植后的移植肾功能延迟(yu等(2016)amjoftransplantation16(9):2589‑2597)。经修饰的u‑pa多肽能用于治疗dgf。例如，可施用u‑pa多肽用于全身递送或能直接注入移植物或周围组织。经修饰的u‑pa多肽可在移植之前、期间或之后施用。经修饰的u‑pa多肽可每日或每周或更低频率给药，例如每月或更低频率，如每月两次。一些情况下，施用单一全身剂量的经修饰的u‑pa多肽。也考虑在数小时中多次输注经修饰的u‑pa多肽。[0753]经修饰的u‑pa多肽能长期递送，若需要，例如经修饰的u‑pa多肽如本文所述经修饰的u‑pa多肽能每日或以另一方案递送，从而在同种异体移植受体中维持有效量。经修饰的u‑pa多肽能用于在受体中延长同种异体移植物存活，尤其是同种异体移植物的长期存活。聚乙二醇化u‑pa多肽能用于减少免疫原性。[0754]3.联合疗法[0755]本文所提供经修饰的u‑pa多肽可与其他现有药物和治疗剂联用以治疗疾病及病症。这种治疗可结合其他抗炎药物和/或治疗剂实施。抗炎药物和用于联合疗法的药剂示例包括非甾体抗炎药(nsaid)，包含水杨酸盐，如阿司匹林，传统nsaid如布洛芬、萘普生、酮洛芬、纳布美通、吡罗昔康、双氯芬酸或吲哚美辛，和cox‑2选择性抑制剂如塞来昔布(以商标销售)或rotecoxin(以商标销售)。用于联合疗法的其他化合物包括抗代谢物如甲氨蝶呤和来氟米特，皮质类固醇或其他类固醇如可的松、地塞米松或强的松，镇痛药如对乙酰氨基酚，氨基水杨酸盐如氨水杨酸以及细胞毒性剂如硫唑嘌呤(以商标销售)、环磷酰胺(以商标销售)和环孢霉素a。能用于联合疗法的额外药剂包括生物反应调节剂。生物反应调节剂可包括促炎性细胞因子抑制剂，包括tnf‑α抑制剂，如依那西普(以商标销售)、英夫利昔(以商标销售)或adalimumad(以商标销售)以及il‑1抑制剂如阿那白滞素(以商标销售)。生物反应调节剂还可包括抗炎细胞因子如il‑10、b细胞靶向剂如抗cd20抗体(以商标销售)、靶向t抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂，激酶抑制剂如丝裂原活化蛋白(map)激酶、c‑junn末端激酶(jnk)的抑制剂或核因子(nf)κb(nfκb)以及过氧化物酶体增殖激活受体‑γ(ppar‑γ)配体。能用于联合疗法的额外药剂包括免疫抑制剂。免疫抑制剂可包括他克莫司或fk‑506；霉酚酸；神经钙调蛋白抑制剂(cni)；csa；西罗莫司或已知抑制免疫系统的其他药剂。[0756]本文所提供经修饰的u‑pa多肽还可与药剂联用，施用所述药剂以治疗心血管疾病和/或在治疗心血管疾病过程中施用，例如本文所述有助于与补体介导缺血再灌注损伤相关的炎性病症的那些。例如，所提供u‑pa多肽能联合抗凝剂施用。示范性抗凝剂示例包括但不限于肝素、华法林、醋硝香豆醇、苯茚二酮、edta、柠檬酸盐,草酸盐和直接凝血酶抑制剂如阿加曲班、重组水蛭素、比伐卢定和希美加群。[0757]本文所提供经修饰的u‑pa多肽还可与施用以治疗dgf的药剂联用。例如，本文所提供u‑pa多肽能联合免疫抑制剂施用。这类组合用于延长受体中的同种异体移植物存活，尤其是同种异体移植物的长期存活。在优选实施方案中，配制和制备所述组合，从而其适合长期施用于同种异体移植物的受体，例如，采用稳定制剂。在某些实施方案中，配制和制备所述组合，从而其适合向同种异体移植物的受体同步施用经修饰的u‑pa多肽与免疫抑制药物。在某些实施方案中，配制和制备所述组合，从而其适合向同种异体移植物的受体依序(任一顺序)施用经修饰的u‑pa多肽与免疫抑制药物。[0758]本文所提供经修饰的u‑pa多肽还可与施用以治疗黄斑变性的其他药剂联用。例如，经修饰的u‑pa多肽能用以下任意一种或多种一起施用：兰尼单抗(以商标lucentistm销售)；贝伐单抗(以商标avastintm销售)；哌加他尼钠(以商标macugentm销售)；阿柏西普(以商标eyleatm销售)；和维替泊芬(以商标visudynetm销售)。本文所提供u‑pa多肽还可与植入式望远镜、激光疗法或激光凝固、手术和/或光动力治疗联用，单独或联合治疗性维替泊芬，以治疗黄斑变性。[0759]额外药剂如其他补体抑制剂能用作抗炎药，与本文所述经修饰的u‑pa多肽形成联合疗法。这类其他补体抑制剂示例包括眼镜蛇蛇毒因子(cvf)，聚阴离子分子如肝素、硫酸葡聚糖、聚乙烯硫酸、聚赖氨酸或苏拉明，天然分子如k‑76cooh、迷迭香酸或中草药麻黄提取物，合成分子如甲磺酸萘莫司他(fut‑175)，c1s的合成抑制剂(c1s‑inh‑248)或针对c1s和fd的抑制剂(bcx‑1470)，肽抑制剂如坎普他汀，补体的抗体抑制剂如抗‑c5(n19‑8)\人源化抗‑c5(h5g1.1)、抗‑c6或抗‑c8抗体和可溶形式的膜补体调节剂如可溶性cr1(scr1)、可溶性daf(sdaf)、可溶性mcp(smcf)或可溶性cd59(scd59)(morgan等,(2003)molimmunol.40:159)。[0760]含有本文所述u‑pa多肽的药物组合物能用于治疗任意一种或多种由补体激活介导的炎症性疾病或病症。还提供u‑pa多肽与另一疗法或化合物的组合，以治疗炎症性疾病或病症。u‑pa多肽和抗炎剂能包装为单独组合物，以共同或依序或间歇施用。或者，其可提供为施用用的单一组合物或作为单一组合物施用的2种组合物。所述组合能包装为试剂盒，任选地带有额外试剂、使用说明书、小瓶和其他容器、注射器以及使用经修饰的u‑pa多肽的其他项目。实施例[0761]仅出于阐述目的纳入下列实施例，而不意在限制本发明范围。[0762]实施例1.克隆和表达经修饰的u‑pa多肽以及筛选在qhar/as位点切割c3的经修饰的u‑pa多肽[0763]a.克隆u‑pa[0764]将编码人u‑pa多肽(uniprotp00749；如seqidno:1所示)中的氨基酸179‑431(根据根据胰凝乳蛋白酶编号带有c122s突变)(如seqidno:5所示)的核酸克隆入pe‑sumo‑amp表达载体，小泛素样修饰物(sumo)标签的c末端。构建体包括信号肽(氨基酸1‑20)和蛋白酶结构域(氨基酸179‑431)。[0765]b.产生经修饰的u‑pa多肽[0766]通过quikchange定点突变(stratagene)根据厂商说明产生经修饰的u‑pa多肽，特定设计的寡核苷酸用作引物以将设计的突变纳入新合成的dna。设置pcr反应，含有作为模板的野生型u‑padna和设计成含有所需突变的寡核苷酸引物。pcr后，各反应产物用dpni消化以去除dam甲基化的亲代dna链。然后，dna转化入大肠杆菌xl‑1blue超感受态细胞(stratagene)并接种于含50μg/ml羧苄青霉素的选择性琼脂。质粒dna分离自选定克隆，测序以确认预期突变在u‑pa编码dna内选定位置纳入而没有任何额外不需要的突变。[0767]c.制备u‑pa多肽[0768]1.转化[0769]将编码野生型和各变体u‑pa多肽的dna克隆入pe‑sumo‑amp表达载体，该载体c末端对着小泛素样修饰物(sumo)标签和前结构域，如上面章节a所详述，所得构建体转化入bl21gold(de3)大肠杆菌细胞(安捷伦科技(agilenttechnologies),产品目录号:230132)。约50μl化学感受态bl21gold(de3)细胞用0.5μl合适质粒dna(通常含有1pg–50ng总dna)转化。细胞和dna在冰上孵育30分钟，细胞随后在42℃热激45秒，冰上再孵育2分钟。450μl室温terrific肉汤(tb)培养基(vwrinternational,产品目录号100219‑866)加入混合物，细胞在tb培养基中孵育1小时，240rpm,37℃振荡。20μl的此转化混合物在2xyt培养基 100μg/ml羧苄青霉素板上铺开并37℃孵育过夜，所述板来自天惠华(teknova，产品目录号:y4420)。[0770]2.表达u‑pa多肽[0771]含有所需u‑pa多肽编码dna的细胞(通常获自单一“确认”菌落，来自上述转化过程)在约50ml培养基中生长，所述培养基通过组合50μl羧苄青霉素,0.3ml20％乳糖溶液,5ml磷酸盐缓冲液和45ml基础terrific肉汤(tb)培养基(天惠华,产品目录号l0350)制备。细胞和生长培养基在inforsmultitron摇床中37℃,400rpm旋转。生长18‑22小时后，细菌如下沉淀：在50mlfalcon离心管中在具有fiberlitef13‑14x50cs离心转子的beckmansorvalrc6plus离心机(赛默飞世尔(thermo‑fisher))中4℃，7,000rpm离心10分钟。离心后，倒出上清。[0772]来自50ml培养物的细胞沉淀重悬于10ml细胞裂解缓冲液a(50mmtris,ph8.0,50mmnacl,2mmedta,0.1mg/ml溶菌酶)。通过在37℃,240rpm振荡1小时，细胞团块重悬于缓冲液a。所得混合物在7,000rpm离心15分钟，倒出上清。所得沉淀重悬于含20μlbenzonasetm(密理博西格玛(milliporesigma))的10ml提取试剂(默克密理博(merckmillipore),nc9591474)。通过在37℃,240rpm涡旋和振荡1小时，使细胞重悬。振荡后，剩余不溶性材料通过在4℃,10,000rpm离心15分钟沉淀，倒出上清。通过在10ml洗涤缓冲液a[50mmtris(ph8.0),300mmnacl和1％tritonx‑100]中用powergen500均质器(飞世尔科技(fisherscientific),14‑261‑04p)均质化，重悬所得沉淀。含有重悬u‑pa多肽包涵体(ib)的此混合物在4℃,10,000rpm离心15分钟，弃去上清。新的沉淀重悬于10ml洗涤缓冲液b(50mmtris(ph8.0))，重复均质化直至沉淀分散均匀。所得混合物再次在4℃,10,000rpm离心15分钟，倒出上清，允许沉淀空气干燥10‑15分钟。此u‑pa多肽包涵体(ib)沉淀能在‑20℃保存或立即用于下述打开和再折叠。[0773]3.打开upa[0774]不溶性sumo‑u‑pa多肽融合蛋白包涵体在5ml打开缓冲液[6mguhcl,50mmtrisph8,(天惠华,产品目录号:g0380)]中溶解和变性。在再折叠过程当天加入新制备的dtt到10mm终浓度。此ib溶液在37℃,240rpm搅拌至少1小时(通常2小时)，或直至包涵体充分溶解。充分溶解的ib溶液澄清，但能显示褐色色彩。[0775]4.再折叠u‑pa[0776]5ml上述打开的u‑pa多肽溶液分成2.5ml的2个等分样品，各等分样品加入200ml再折叠缓冲液[1.5m精氨酸,50mmtrisph8.0,150mmnacl,5mmgsh(还原型l‑谷胱甘肽,西novexbis‑tris凝胶的各“泳道”，在1xmes运行缓冲液中于200v运行40分钟。通过考马斯亮蓝染色凝胶然后脱色，“呈现”蛋白。含有在约25kda迁移的单一带的部分用液氮速冻并‑80℃保存，直至使用。单独u‑pa多肽样品的品质通过活性试验和质谱进一步评估。[0786]d.选择和鉴定切割c3以使其灭活的经修饰的u‑pa多肽[0787]经修饰的u‑pa多肽如下鉴定：针对经修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(pai‑1)筛选经修饰的u‑pa多肽文库，如美国专利号8,211,428详述(还参见发表的美国申请公开号us‑2014‑0242062‑a1)。抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或其片段用于筛选，在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与蛋白酶之间能够形成共价酰基酶中间物。一般，所用的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白在体内正常靶向蛋白酶。在试验中，通过取代其反应位点环(rsl)以包括靶序列(即c3中的活性位点)的经修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可捕获修饰蛋白酶，该蛋白酶会切割靶位点形成稳定复合物。随后分离/鉴定捕获的经修饰的蛋白酶。对于u‑pa，pai‑1,pai‑2,pai‑3尤其是pai‑1(是其抑制剂)，是同源丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白pai‑1如下修饰：用qharashlg(c3的残基737‑745,seqidno:47，其是人c3的活性位点)取代如下所示的残基。选择所有经修饰的u‑pa多肽，使得它们在c3的活性位点内切割。特别地，它们在r与a之间切割。[0788]qhar↓ashl[0789]atiii"饵"(如下)带有插入序列qharashlg(对应c3的灭活切割位点(seqidno:47的残基737‑745)):[0790][0791]上面经修饰pai‑1中的突变如下:[0792]rcllrrqharashl341350突变v1c11突变n150h150150突变k154t154154突变q319l319319突变a340l340340突变v341r341341突变i342r342342突变v343q343343突变s344h344344突变m347a347347突变a348s348348突变p349h349349突变e350l350350突变m354i354354[0793]下面实施例2的表14列出突变，并为含有突变的经修饰的u‑pa多肽的示范性蛋白酶结构域提供seqid。编号是胰凝乳蛋白酶编号。产生经修饰的u‑pa多肽并选择成灭活c3，带有所示突变。尽管seqid涉及蛋白酶结构域，应理解突变能纳入前体、全长和成熟经修饰的u‑pa多肽。纳入c122s取代或其他用于s的保守取代以减少聚集；虽然有利，这是任选存在的。对于用于基因治疗或聚乙二醇化的经修饰u‑pa，c122s取代不纳入经修饰u‑pa或编码核酸。c122s能用作缀合聚乙二醇化部分或其他修饰的位点。体内表达时，聚集一般不是问题。同样，对于活性形式是由二硫键连接的两条链，残基122处的游离cys一般不修饰成ser，从而其可用于形成二硫键。[0794]实施例2.体外切割补体蛋白c3[0795]经修饰的u‑pa多肽用于灭活切割c3的活性如下测定：底物补体蛋白人c3与各种浓度的各修饰蛋白酶37℃孵育1小时后，测量完整人c3的量。根据此试验，信号在完整人c3存在下产生，并随着c3切割而丧失。[0796]在含有50mmtris,ph8.0,50mmnacl和0.01％tween‑20的缓冲液中，2μm血浆纯化的人c3(complementtechnologies；德克萨斯州泰勒)与经修饰的u‑pa多肽(0–250nm)37℃孵育1小时。通过加入egr‑cmk(haematologictechnologies,egrck‑01)到10μm终浓度，来淬灭经修饰的u‑pa多肽的活性，允许hc3/经修饰的u‑pa多肽混合物在环境温度维持30分钟。[0797]未消化的人c3的残留水平用放大发光邻近均相分析筛选(amplifiedluminescentproximityhomogeneousassayscreen)(以商标销售；珀金埃尔默)定量。在50mmtris,ph8.0,50mmnacl,0.01％tween‑20和0.2％bsa中，100μg/ml(珀金埃尔默#6760606)α‑小鼠igg包被的受体珠与5nm小鼠α‑hc3amab(艾博抗(abcam)#ab11872‑50)孵育，以形成受体珠混合物。受体珠混合物避光并置于旋转摇床30–60分钟。hc3/经修饰的u‑pa多肽反应混合物(如上制备)在50mmtris,ph8.0,50mmnacl,0.01％tween‑20,0.2％bsa中稀释1600倍，4μl等分样品置于384孔optiplate(珀金埃尔默#6007299)的重复孔中。8μlα‑hc3mab/受体珠混合物用8μl25nm生物素化山羊α‑hc3pab(用来自赛默科技(thermoscientific)#21327的ez‑link磺基‑nhs‑lc‑生物素试剂盒制备，来自complementtechnologies#a213的未生物素化形式)孵育。板随之避光并在环境温度孵育30分钟。此时间之后，向各孔加入4μl100μg/ml链霉亲和素包被供体珠(珀金埃尔默#6760606)并孵育60分钟，避光。接着用envision2104多标记读板仪(珀金埃尔默)测量alphascreen信号(激发＝680nm,发射＝570nm)。此信号(对应剩余hc3([hc3])浓度)根据浓度([alterase])作图，数据拟合下面的四参数方程以确定试验中切割50％可用hc3所需的经修饰的u‑pa多肽浓度(浓度)(ec50)，hill斜率(hill)以及最大(max)和最小(min)信号。[0798][0799]独立测量含有突变r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r(参见seqidno:21)的u‑pa变体切割hc3共13次，使用9个不同分组(lot)的蛋白酶。此经修饰的u‑pa多肽的平均ec50值测定为19nm(n＝13,sd＝2.2)；在结果报告于下表14的实验中，其为24.5nm。[0800]表14列出约600个经修饰的u‑pa多肽，其包括带有突变的蛋白酶结构域。结果示于下表14。大部分所测试经修饰的u‑pa多肽切割人补体蛋白c3比含有c122s取代的野生型蛋白酶结构域显著更有效(即ed50更低)；许多的ed50低于100nm。多肽包括c122s取代以防止例如蛋白酶结构域表达后聚集。在一些实施方案中，所述经修饰的u‑pa多肽是全长，其活化形成2链激活的多肽。对于这类实施方案，经修饰u‑pa蛋白酶结构域不包括c122s取代(根据成熟编号是279)；半胱氨酸形成二硫键(根据成熟编号在148c与279c之间，参考seqidno:3)。[0801]所测试u‑pa变体包括效力小于野生型u‑pa的那些，尤其是在一小时试验期间没有观察到hc3切割(即下表14中标示为na)的那些变体。其他低活性变体在试验期间切割小于25％hc3，并因而未赋值ed50。基于这些结果，技术人员能选择增加c3切割活性的突变。[0802]表14[0803][0804][0805][0806][0807][0808][0809][0810][0811][0812][0813][0814][0815][0816][0817][0818][0819][0820][0821][0822][0823][0824][0825][0826][0827][0828][0829][0830][0831][0832][0833][0834]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0835]实施例3.u‑pa变体在食蟹猴血浆中的抗c3活性[0836]一些经修饰的u‑pa多肽的离体抗c3活性在购买的食蟹猴血浆(biochemed)中测量。经修饰的u‑pa多肽切割c3的半数有效剂量(ed50)用elisa计算。简言之，示范性经修饰的u‑pa多肽连续稀释1:1.5倍，从1000nm到39.0nm(9点稀释)。hc3标准在含1％bsa的1xpbst(磷酸盐缓冲盐水tween‑20)中连续稀释1:1.5倍，从450到39(7点稀释)。1xpbst配方包括：[0837]1.在800ml蒸馏h2o中溶解下列物质[0838]о8gnacl[0839]о0.2gkcl[0840]о1.44gna2hpo4[0841]о0.24gkh2po4[0842]о2mltween‑20[0843]2.调整ph到7.2[0844]3.用额外蒸馏h2o调整体积到1l[0845]4.高压灭菌消毒.[0846]80％食蟹猴玻璃体血浆(获自biochemed)(在含50mmtris,ph8.0,50mmnacl和0.01％tween‑20的缓冲液中)和c3稀释液与终浓度0.1μm的经修饰的u‑pa多肽37℃孵育10分钟。80％血浆消化物在含1％bsa的1xpbst中稀释1:15,625，使用biomek液体处理系统(贝克曼库尔特(beckmancoulter))。平底eia板(伯乐(bio‑rad))包被有2.0μg/ml的纯化a213抗体(抗c4；quidel特色产品)，用50μl/孔样品或标准物孵育，用抗hc3a抗体(ab11872；艾博抗)在含1％bsa的1xpbst中检测。孔进一步用在含1％bsa的1xpbst中1:30,000稀释的hrp缀合山羊抗小鼠‑hrp抗体(杰克逊免疫研究公司(jacksonimmunoresearch)；产品目录号:115‑035‑003)包被，用westernbrightecl(化学发光)hrp底物显色以检测。[0847]ed50定义为生成50％c3损失的蛋白酶浓度。结果显示c3损失(即切割)增加，存在带有seqidno:8‑14和16‑20所示序列的经修饰的u‑pa多肽。u‑pa多肽蛋白酶结构域具有seqidno:8所示的序列，以高于其他数倍的ed50切割。结果示于下表15。[0848][0849][0850]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0851]实施例4.经修饰的u‑pa多肽在食蟹猴玻璃体液中的抗c3活性[0852]经修饰的u‑pa多肽的活性通过切割底物补体蛋白人c3来评估。2μm纯化的人c3(complementtechnologies；德克萨斯州泰勒)用经修饰的u‑pa多肽(0–250nm)在购买的猴玻璃体液(biochemed)中37℃孵育1小时。通过加入尿激酶抑制剂glu‑gly‑arg氯甲酮(egr‑cmk；haematologictechnologies,egrck‑01)到10μm终浓度，来淬灭经修饰的u‑pa多肽的活性，允许hc3/经修饰的u‑pa多肽混合物在环境温度维持30分钟。[0853]未消化的人c3的残留水平用elisa定量。所有经修饰的u‑pa多肽以相比含seqidno:5所示c122s取代的参考u‑pa多肽更高的转换数(每小时)切割补体蛋白c3，包括含有取代r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r、y40q/v41l/l97ba/c122s和y40q/v41l/l97ba/c122s以及y40q/v41r/l97ba/c122s的那些。结果示于下表16。[0854][0855][0856]*含有取代的蛋白酶结构域的seqid[0857]实施例5.经修饰的u‑pa多肽在食蟹猴玻璃体液中的离体稳定性[0858]在购买的食蟹猴玻璃体液或磷酸盐缓冲盐水(pbs)对照中评价经修饰的u‑pa多肽的离体稳定性。在玻璃体液中显示稳定性的经修饰的u‑pa多肽能用于治疗amd。[0859]80％食蟹猴玻璃体液(获自biochemed；产品目录号bc7615‑v1,bc60815‑v1,bc33115‑v6)(在含50mmtris,ph8.0,50mmnacl和0.01％tween‑20的缓冲液中)或pbs对照与终浓度0.1μm的经修饰的u‑pa多肽孵育。这些混合物37℃孵育7天，剩余蛋白酶活性用溶于50mmtris,ph8.0,50mmnacl,0.01％tween‑20的100μm荧光底物agr‑acc(7‑氨基‑4‑氨基甲酰甲基‑香豆素)测定(试验结果在激发波长＝380nm和发射波长＝460nm评价)。结果显示序列如seqidno:21‑33所示的经修饰的u‑pa多肽在食蟹猴血浆和pbs中展示出相当的活性。结果如下表17所示。[0860][0861][0862]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0863]在购买的食蟹猴玻璃体液中孵育7和28天后，评价下表18内抗c3u‑pa变体的离体稳定性。结果显示数个变体甚至在28天孵育后维持显著活性。结果如下表18所示。[0864][0865]*含有取代的蛋白酶结构域的seqid[0866]实施例6.人血浆中的离体药效学试验[0867]经修饰的u‑pa多肽(蛋白酶结构域)用80％人血浆孵育，然后加入红细胞以在补体活性溶血实验中评价补体蛋白c3的切割。在人血浆存在下进行功能分析，测试抗c3蛋白酶在药物相关环境下的活性，并且例如检测其是否对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或人血液中存在的其他蛋白酶抑制剂灭活敏感。一般，本文所提供的经修饰的u‑pa多肽在人血浆存在下不受抑制。这对治疗疾病和失调及病症如dgf非常重要，其中施用的经修饰的u‑pa多肽暴露于人血浆，如静脉内施用时。这对应用如通过玻璃体内或视网膜内或视网膜下注射治疗amd不太重要或不重要，其中经修饰的u‑pa多肽不暴露于人血浆。[0868]测量ed50值，这是实现50％补体活性抑制的蛋白酶浓度。野生型u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:5,带有c122s)和多个示范性经修饰u‑pa蛋白酶结构域连续稀释，从3μm到0.11μm(9点连续稀释1:2)以测量ed50。野生型u‑pa(seqidno:5)蛋白酶结构域和经修饰u‑pa蛋白酶结构域用0.2ml管中80％血浆的终浓度预孵育，这是通过组合4μl稀释蛋白酶溶液和16μl人血浆(柠檬酸钠作为抗凝剂；创新研究公司(innovativeresearch,inc.))进行的。这引起蛋白酶进一步稀释以产生0.6μm‑0.0022μm蛋白酶终浓度用于ec50操作。无蛋白酶对照(18μl血浆和2μlpbst)和背景对照(仅20μlpbst)也纳入试验。反应在37℃孵育1小时。反应混合物进一步稀释到20％血浆，加入70μlpbst。[0869]敏化的绵羊红细胞(diamdex,佛罗里达州迈阿密)如下浓缩到10x：使3.0ml等分样品成团，移出2.7ml缓冲液并在剩余0.3ml缓冲液中重悬细胞沉淀。浓缩的致敏红细胞以每孔12μl体积加入聚丙烯96孔板。6μl或60μl的预孵育蛋白酶/血浆混合物加入红细胞以分别产生1％血浆或10％血浆终浓度，终体积为120μl(添加pbst至终体积)。溶液室温振荡孵育45分钟。细胞在2000rpm旋转减慢5分钟以使未破裂细胞成团，移出100μl上清并置于澄清的96孔微量滴定板。[0870]通过在415nm读取光密度(od)，监测血红蛋白自裂解红细胞释放。溶血部分如下计算：从所有孔中减去背景对照，然后将实验样品除以无蛋白酶对照(阳性对照)，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。通过在四参数逻辑曲线拟合(softmaxpro软件,分子仪器公司(moleculardevices),加利福尼亚州)中对溶血部分相比蛋白酶浓度作图，测量蛋白酶的溶血ed50(nm)。[0871]结果示于下表19，其列出80％人血浆中，带有c122s突变的seqidno:5所示的野生型u‑pa与经修饰的u‑pa多肽对溶血的ed50(nm)。如表19所示，80％人血浆中野生型u‑pa的ed50高于6μm；而示范性经修饰u‑pa蛋白酶结构域多肽抑制补体的能力显著增加，如ed50更低所指示(例如在173nm‑1.028μm之间)。[0872][0873][0874]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0875]实施例7.使用间接显色试验的纤溶酶原激活动力学分析[0876]进行间接显色试验以测定野生型和经修饰的u‑pa多肽的活性，后者作为纯化蛋白制品生成(参见madison等(1989)nature,339:721‑724；madison等(1990)jbiol.chem.,265:21423‑21426)。此试验中，游离对硝基苯胺释放自显色底物spectrozymepl(h‑d‑正亮氨酰六氢酪氨酰‑赖氨酸‑对硝基苯胺二乙酸盐,美国诊断公司(americandiagnostics,inc.))，这是通过u‑pa对纤溶酶原作用所产生的纤溶酶作用。游离对硝基苯胺的释放采用分光光度法在od405nm测量。[0877]对于试验，100μl反应混合物在含有50mmtris‑hcl(ph7.5),0.1mnacl,1.0mmedta和0.01％(v/v)tween80的缓冲液中合并，所述混合物包含0.25‑1ng待测试u‑pa酶,0.62mmspectrozymepl和0.2μmlys‑纤溶酶原(美国诊断公司)。反应在96孔平底微量滴定板(costar,inc.)中37℃孵育，在moleculardevicesthermomax中每30秒读取405nm处的光密度(od405)，持续1小时。计算动力学常数kcat、km和kcat/km(特异性常数)(参见例如madison,e.l(1989)nature339:721‑724)。[0878]结果示于下表20。结果显示经修饰的u‑pa多肽对底物纤溶酶原的酶活性显著下降。相较于未修饰的u‑pa，本文所提供的全部经修饰的u‑pa多肽对纤溶酶原的活性和特异性降低；对c3的特异性和活性以及抑制补体激活都增加许多倍。[0879][0880]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0881]实施例8.抗c3u‑pa变体在食蟹猴玻璃体液中的体内抗c3活性和稳定性[0882]评价seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽的体内活性和稳定性，其是含有取代r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r的蛋白酶结构域。玻璃体液中的稳定性和切割c3的能力是指示治疗amd候选物的参数。[0883]12只初始食蟹猴分入单一治疗组。研究动物的一个眼睛通过玻璃体内施用单剂125μg经修饰的u‑pa多肽。施用分离的蛋白酶结构域，其序列如seqidno:21所示，分子量约为25kda。右眼接受试验样品且左眼注射载剂对照。在下列每个时间点杀死4只动物：给药后24小时，第2天和第6天。玻璃体液样品收集自右眼和左眼，在经修饰的u‑pa多肽或载剂对照治疗后分析经修饰的u‑pa多肽稳定性和c3水平；c3和经修饰的u‑pa多肽浓度通过上面详述的elisa测定。[0884]玻璃体液样品中存在的经修饰的u‑pa多肽浓度通过elisa测定，所述样品获自给药后24小时，第2天和第6天。随后，通过加入egr‑cmk(haematologictechnologies,egrck‑01)到10μm终浓度，来淬灭经修饰的u‑pa多肽的活性，允许hc3/经修饰的u‑pa多肽混合物在环境温度维持30分钟。[0885]seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽的半衰期测定为约2天，这应该对应于人系统中的约5天(deng等.mabs3(1):61‑66(2011))。通过elisa从经修饰的u‑pa多肽的观察最高水平计算经修饰的u‑pa多肽(seqidno:21)的体内回收(即经修饰的u‑pa多肽的峰值水平除以经修饰的u‑pa多肽剂量)。100％体内回收的理论预测值是2.5μm。所测经修饰u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的体内回收计算为约80％的预测值，或约2.0μm，所述蛋白酶结构域含有取代：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r。[0886]玻璃体液中的c3水平通过elisa评估，如实施例3详述。载剂注射阴性对照眼睛中的c3水平范围是0.4nm‑50nm(2个来自载剂注射眼睛的样品彼此显著差异达到10，可能归因于玻璃体的血液污染)。u‑pa施用前的c3基线水平约为2.2nm。1天和7天后，变体治疗的眼睛中的c3无法检测。28天后，序列如seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽所治疗的眼睛中的c3浓度为2.2nm，这等同于治疗前水平。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽是治疗amd的候选物。[0887]实施例9.u‑pa中的示范性突变和确认切割位点[0888]表22(下面)列出u‑pa多肽中的示范性位置和突变，所述多肽包括全长、前体和蛋白酶结构域及其催化活性部分。[0889][0890][0891]取代在任何形式的u‑pa中，包括蛋白酶结构域(seqidno：2或5)；全长(seqidno：1或4)和成熟形式(seqidno：3或6)。取代能组合，包括如本文所例示的，包括多至15‑18个或更多取代。[0892]数据显示带有这些突变的经修饰的u‑pa多肽在多个物种中切割和灭活c3，如人和食蟹猴。人c3切割可在残基740与741之间(seqidno：47)，此切割使c3灭活：[0893]qharꢀ↓ashlꢀꢀꢀꢀꢀꢀ737‑744[0894]p4p3p1↓p1′ꢀp4′.[0895]如上和本公开内容通篇所证明，经修饰的u‑pa多肽切割并灭活c3。选择经修饰的u‑pa多肽用于此区域切割，通过测试其进行确认。例如，c3与含有取代r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r的经修饰u‑pa蛋白酶结构域(seqidno：21)或具有取代y40q/v41l/l97ba/c122s的经修饰u‑pa蛋白酶结构域(seqidno：40)孵育，酶与底物之比为1∶10或1∶50，持续共1小时。在0、5、10、20、40和60分钟从这些反应中取出样品，通过加入tfa和干冰速冻，在各样品中立即终止切割反应。进一步分析这些样品前，半胱氨酸侧链还原和烷基化，赖氨酸侧链的ε‑氨基通过o‑甲基异脲处理阻断，肽氨基末端随之标记有nhs‑ss‑生物素。捕获所得生物素化c3肽并用胰蛋白酶和gluc蛋白酶进一步消化。此第二蛋白酶消化后，肽产物再一次进行亲和性捕获。生物素接着通过还原从捕获肽去除，肽混合物通过lc‑ms/ms分析。在0分钟后的各时间点，观察到mw8289的片段，指示c3中qhar位点的精氨酸切割。这些反应中没有观察到额外的c3切割位点。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽在qhar切割。[0896]qharꢀ↓ashlꢀꢀꢀꢀꢀꢀ737‑744[0897]p4p3p2p1↓p1′ꢀp4′.[0898]实施例10.食蟹猴玻璃体液中的u‑pa毒性[0899]经修饰的u‑pa多肽的安全性和耐受性在食蟹猴中体内评估。3只初始食蟹猴各分入三个治疗组。研究动物每个眼睛通过玻璃体内施用12.5μg、37.5μg或125μg的各修饰u‑pa多肽。右眼接受测试多肽且左眼注射载剂对照。临床观察动物(即摄食量)并实施眼科检查。眼科检查包括裂隙灯活组织镜检查和间接检眼镜观察，然后是给药前(t＝0)和给药后第2、8及15天的眼底彩色照相或光学相干断层成像(oct)。所有观察持续多至4周或直至分辨。[0900]就所有动物评估未观察到的损害作用水平(noael)。对于施用序列如seqidno:42所示的经修饰的u‑pa多肽的动物，noael是≥37.5μg。对于施用序列如seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽的动物，没有记录到有害作用；因此，就施用序列如seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽的动物而言，noael是≥125μg(等同于人中的≥375μg/眼)。[0901]实施例11[0902]进行计算以在野生型u‑pa、野生型u‑pa(seqidno:5)蛋白酶结构域的c122s变体和示范性u‑pa变体蛋白酶结构域中鉴定候选免疫原性热点，从而确认示范性变体的突变不引入任何免疫原性热点。还进行计算以比较感兴趣的变体并对比蛋白组的热点总体谱(profile)。[0903]方法概述[0904]t细胞对外来蛋白反应中的重要步骤是结合和呈递构成肽(衍生自外来蛋白的切割)，呈递到任何具有hla复合物的宿主，所述复合物在抗原呈递细胞中表达。鉴定衍生自蛋白、预测结合已知hla的肽，能用于指示引发t细胞反应的序列中的可能热点。考虑具有已知免疫原性特性的蛋白变体时，比较所预测hla‑结合剂的谱可能有助于鉴定变化是否引入任何新的免疫原性热点。[0905]所述谱能用公开可得的数据库产生。例如，公开可得的结合预测服务(netmhcii2.2服务器)，丹麦技术大学，用于预测与hla的结合。netmhcii2.3服务器预测肽与hla‑dr、hla‑dq、hla‑dp和小鼠mhcii类等位基因的结合，使用人工神经元网路。可就25个hla‑dr等位基因、20hla‑dq、9hla‑dp和7个小鼠h2ii类等位基因获得预测。预测值以nmic50值给出，并作为一组1,000,000个随机天然肽的％‑排名。[0906]所述服务用于预测示范性变体(seqidno:40和seqidno:21)、野生型蛋白酶结构域(seqidno:2)和带有c122s的野生型蛋白酶结构域(seqidno:5)，针对一组14个hla‑dr变体(参见下表b)根据肽主要序列，15个连续氨基酸的所有可能肽的结合亲和性。对于各肽/hla对，netmhcii服务器提供预测的结合亲和性，以及分类为紧密结合剂(kd≤500)、弱结合剂kd≤50nm)或非结合剂(kd>500nm)。对于含有n个氨基酸的蛋白序列，这引起总共t＝(n‑14)x14可能肽—hla结合对。[0907]使用来自netmhcii服务器的结合预测，结果用于鉴定这些蛋白序列中的可能热点，这是基于鉴定若干候选结合对的区域。这些变化与对应蛋白序列中的已知变化作比较。[0908]对于各蛋白，总体结合分数基于所预测紧密结合肽—hla对(tb)数目、所预测弱结合肽—hla对(wb)数目和考虑的肽—hla对总数(t)：[0909]分数＝(tb 0.5*wb)/t[0910]表b‑纳入作为可能结合剂的hla‑dr分子[0911]hla‑drb1*1101[0912]hla‑drb1*0101[0913]hla‑drb1*0301[0914]hla‑drb1*0401[0915]hla‑drb1*0404[0916]hla‑drb1*0405[0917]hla‑drb1*0701[0918]hla‑drb1*0802[0919]hla‑drb1*0901[0920]hla‑drb1*1302[0921]hla‑drb1*1501[0922]hla‑drb3*0101[0923]hla‑drb4*0101[0924]hla‑drb5*0101[0925]当使用8个hla亚组时，此分数显示与epivax公司(罗得岛州普罗维登斯)产生的计算机免疫原性预测具有良好相同性，后者使用免疫信息学和体外技术以预测免疫原性。使用该8个hla亚组。对一组标准蛋白进行相同计算以提供针对其比较u‑pa变体的对比组。[0926]突变对所预测hla结合谱的影响[0927]对各‑hla复合物就用于任何变体u‑pa蛋白酶结构域的给定序列位置次数作图，kd截短为50nm和500nm。每列的比例固定，但列之间不同并与野生型多肽作比较以评价突变是否改变免疫原性谱。多肽之间没有观察到显著差异。[0928]聚集免疫原性分数[0929]为计算各序列的聚集免疫原性分数，8个hla组(表c)中各结合阈值处的肽—hla结合对总数先前通过epivax(罗得岛州普罗维登斯)验证，以提供与所公开计算机免疫原性分数的良好相同性。epivax是使用免疫信息学和体外技术以预测免疫原性的公司。这些值随后用于计算总分，如上面方法总结中所述。[0930]表c‑用于总体免疫原性分数的hla‑dr亚组[0931]hla‑drb1*0101[0932]hla‑drb1*0301[0933]hla‑drb1*0401[0934]hla‑drb1*0701[0935]hla‑drb1*0802[0936]hla‑drb1*1101[0937]hla‑drb1*1302[0938]hla‑drb1*1501[0939]8个hla亚组的肽—hla结合对数目和upa总分如下所示：[0940][0941]结果表明变体的免疫原性不会不同于野生型多肽。比较蛋白组的相同分析结果如下所示：[0942][0943][0944]实施例12.通过wt‑和变体u‑pa多肽的纤溶酶原激活[0945]通过本文所提供u‑pa多肽的wt‑和抗c3变体激活glu‑纤溶酶原的催化效率如下所述测试。来自这些实验的数据证明，抗c3u‑pa变体蛋白显示针对野生型u‑pa生理相关底物纤溶酶原的活性显著降低。联合来自实施例7的数据，这些数据证明抗c3u‑pa多肽不仅显示针对“新”底物c3的活性显著更高，而且针对wtu‑pa正常生理底物的活性显著降低。[0946]因此，相较于wt‑u‑pa，引入本技术所述抗c3变体的突变大幅改变抗c3变体多肽的底物特异性。[0947]通过wt‑和抗c3变体u‑pa多肽的纤溶酶原激活[0948]1)用单时间点反应分析(37c持续30分钟)[0949]a)反应条件[0950]测量野生型u‑pa/c122s(seqidno:5)以及抗c3u‑pa多肽变体的纤溶酶原激活活性，所述变体包含突变y40q/v41l/l97ba/c122s(seqidno:40)和r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r(seqidno:21)。反应混合物中的蛋白酶浓度是25nm(wt‑u＝pa)或250nm(抗c3u‑pa变体)且底物(即glu‑纤溶酶原)浓度是2.5um。反应体积是20ul且反应在37℃进行30分钟。各反应如下终止：加入2ul1mdtt和7ul4x样品缓冲液，加热至80℃，持续45s。终止的反应混合物加载到4–12％bis‑tris凝胶各孔中，在xtmes缓冲液内200v运行45分钟，随后用simplybluesafestain染色。[0951]b)测量反应产物(即纤溶酶)[0952]染色的sds凝胶分析表明wtu‑pa切割反应中存在的所有纤溶酶原，在30分钟孵育期间将其转化成2链、活性纤溶酶。相反，u‑pa变体y40q/v41l/l97ba/c122s(seqid40)在此反应中的活性大大低于wt‑u‑pa，而在此反应中没有观察到通过u‑pa变体r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r的纤溶酶原激活。[0953]2)通过抗c3u‑pa多肽的glu‑纤溶酶原激活动力学[0954]通过wt‑或抗c3upa变体多肽的glu‑纤溶酶原激活动力学分析如下所述实施。激活反应在含有0.1％bsa的i＝0.16mhepes/nacl/edta缓冲液中37℃进行。u‑pa多肽以1nm(wt)或10nm(变体)的浓度存在。二级速度常数(kcat/km)衍生自显色底物s‑2251(h‑d‑val‑leu‑lys‑pna·2hcl)的水解初始反应速度(通过反应产物纤溶酶)相比glu‑纤溶酶原(即u‑pa底物)浓度(0–4μm)的拟合线性关系。还参见表24。[0955][0956]c4s突变不在蛋白酶结构域内[0957]15个变体之间的比较显示下面所附表24的结果，标记有“通过抗c3u‑pa变体的glu‑纤溶酶原激活”。[0958]对于表24：[0959]glu‑纤溶酶原通过c122supa或选定的upa变体在1nm或10nm蛋白酶的蛋白酶浓度激活。[0960]反应在含有0.1％bsa的i＝0.16mhepes/nacl/edta缓冲液中37℃完成。[0961]二级速度常数(kcat/km)衍生自显色底物s‑2251(h‑d‑val‑leu‑lys‑pna·2hcl)的水解初始反应速度vs.glu‑纤溶酶原浓度(0–4μm)的拟合线性关系。[0962]实施例13.示范性u‑pa蛋白酶结构域突变体在食蟹猴玻璃体液中切割补体蛋白c3[0963]示范性突变体如下表23所示，涉及seqidno:5所示的wtu‑pa蛋白酶结构域。带阴影的单元格指示相较于seqidno:5所示的参考u‑pa多肽，经修饰的u‑pa多肽在此残基突变。无阴影的单元格表明经修饰的u‑pa多肽包含与seqidno:5所示的参考u‑pa多肽相同的氨基酸。经修饰的u‑pa多肽的活性通过切割底物补体蛋白c3测定，如实施例2所详述和呈现，且表示为u‑pa治疗后的残留c3水平(nm)。通过经修饰的u‑pa多肽切割c3在购买的食蟹猴玻璃体液或磷酸盐缓冲盐水(pbs)对照中进行，如实施例3所详述。下表23所示的结果显示，相较于序列如seqidno:5所示的参考u‑pa蛋白酶结构域，经修饰的u‑pa多肽表现出针对c3的活性更高。玻璃体液和pbs中的活性％显示7天后剩余活性的百分比。经修饰的u‑pa多肽相较seqidno:5的参考野生型蛋白酶结构域相对稳定，其中一些显示比其他更高的稳定性。治疗候选物包括下表中的那些，具有较高c3切割活性和更高的稳定性，尤其是在玻璃体液中。[0964][0965]*含有取代的蛋白酶结构域的seqid[0966]其中，这些数据和其他数据显示：[0967]r35q：此突变使固有抗c3活性(即缓冲液中)增加约2.7倍和在80％人血浆存在下增加约4.3倍[0968]h37y：此突变使缓冲液中和存在80％人血浆的情况下，抗c3活性增加约2.4‑2.5倍[0969]r37ae：此突变使固有抗c3活性减少约3.2倍；然而，存在80％人血浆时，其对抗c3活性没有影响[0970]v38e：此突变改善缓冲液和玻璃体液中的蛋白稳定性，使80％人血浆中的抗c3活性提高～1.5倍[0971]t39y：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆中的抗c3活性增加约7.5‑8.5倍[0972]v41r：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆中的抗c3活性增加约25‑27倍[0973]d60ap：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆中的抗c3活性增加约1.2‑1.6倍[0974]y60bq：此突变使固有抗c3活性减少约1.7倍并使玻璃体中的蛋白稳定性在37℃孵育7天后下降～1.4倍；但存在80％人血浆时，其使抗c3活性增加约1.1倍[0975]t97ai：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆存在下的抗c3活性增加约1.2‑1.3倍[0976]l97ba：此突变使缓冲液和80％人血浆中的抗c3活性增加约6.4‑8.2倍[0977]h99q：此突变使缓冲液和80％人血浆中的抗c3活性增加约2.9‑4.8倍[0978]y149r：此突变使缓冲液和80％人血浆中的抗c3活性减少约1.6‑2.1倍[0979]就较低突变负荷经修饰的u‑pa多肽中的取代获得类似结果，所述多肽包含：i41d/c122s/g151n/q192t(参见例如序列如seqidno：40所示的经修饰的u‑pa多肽，以及含有这些取代的全长和前体及成熟形式)。[0980]数据表明本文所提供经修饰的u‑pa多肽在多个物种中切割和灭活c3。例如，切割人c以灭活其，可以在残基740与741之间(seqidno：47)：[0981]qhar↓ashlꢀꢀꢀꢀꢀꢀ737‑744[0982]p4p3p1↓p1′ꢀp4′.[0983]实施例14.u‑pa‑人血清白蛋白(hsa)融合蛋白的克隆、表达和制备[0984]a.克隆u‑pa‑hsa融合多肽[0985]产生表达u‑pa‑hsa融合蛋白的构建体(seqidno：1015)。u‑pa‑接头‑hsa片段组装自合成寡核苷酸和/或pcr产物，并克隆入pcdna3.4‑topo载体(英杰(invitrogen)；产品目录号a14697)以在人巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子/增强子或专有表达载体(lakepharma)控制下表达。分泌信号序列(seqidno：999(metdtlllwvlllwvpgstg))克隆到u‑pan末端结构域(seqidno：3的氨基酸1‑158)和示范性经修饰u‑pa蛋白酶结构域(如seqidno：987所示)上游，并经接头(seqidno：1002(ggssgg))连接人血清白蛋白(hsa；seqidno：991)的编码区：[0986][0987]构建体包括信号肽(氨基酸1‑20)，u‑pan末端结构域，seqidno：21的经修饰蛋白酶结构域，除了122位的c(如seqidno：987所示)，gs接头(ggssgg，seqidno：1002)，然后是hsa编码区。完整构建体序列如seqidno:1015所示，是：[0988][0989]b.制备u‑pa‑hsa融合多肽[0990]1.u‑pa‑hsa融合多肽的转化和表达[0991]编码经修饰u‑pa‑hsa融合多肽的dna克隆入pcdna3_4表达载体(赛默飞世尔)或专有载体(lakepharma)，其c末端对着分泌信号序列，如章节a所详述。经修饰的u‑pa‑hsa融合蛋白随后以1l表达培养基体积在赛默飞世尔的hekexpi293或expicho表达细胞或lakepharma的专有tunachotm细胞系中表达6天。[0992]2.u‑pa‑hsa融合多肽的亲和纯化[0993]经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白的酶原形式用以captureselecttmhumanalbuminaffinitymatrixsystem销售的系统(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)；产品目录号19129701l或19127005)根据厂商说明纯化。通过向柱加入约10mlcaptureselecttm亲和基质树脂(赛默飞世尔)，对柱进行预备。允许存储溶液流过柱后，加入10个柱体积(cv)的pbs(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmkh2po4,ph7.4)以洗涤树脂。其次，将含有u‑pa‑hsa融合蛋白的表达收获物应用于柱，随后用5‑10cv的pbs洗涤。结合的u‑pa‑hsa融合蛋白用10cv的洗脱缓冲液(20mmtris,2mmgcl2,ph7.0)洗脱。柱稍后用10cv的甘氨酸(0.2m,ph3.0)脱离并用10％tris‑hcl(1.5m,ph7.4)中和，pbs中再平衡。收集流通和洗脱步骤的样品，在还原和非还原sdspage凝胶上分析以评估样品纯度。u‑pa‑hsa融合蛋白在pbs中4℃透析16小时。[0994]3.经修饰的u‑pa‑hsa融合多肽的纤溶酶激活[0995]纤溶酶选择性切割野生型u‑pa和具有野生型u‑pa激活序列的其他u‑pa融合多肽中的单键，以激活u‑pa‑hsa酶原并形成2链u‑pa‑hsa融合蛋白，经二硫键连接c末端活性蛋白酶结构域，其经二硫键系于n末端u‑pa结构域。对于这些实验，所用构建体具有seqidno:1015所示序列，其包含seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽，除了根据胰凝乳蛋白酶编号的c122s，是c122c以提供游离半胱氨酸，不纳入信号序列(seqidno:1015的残基1‑20)。激活后，所得产物具有2条链(参考seqidno:1015)：具有残基21‑178的a链和具有残基179‑1022的b链，u‑pa(残基179‑431)、接头(残基432‑437)和hsa(残基438‑1022)。a链和b链通过c168与c299之间的二硫键连接(对应根据胰凝乳蛋白酶编号的c122)。[0996]hsa结构域通过ggssgg接头保持缀合蛋白酶结构域c末端。激活遵循下列程序：通过用1xpbs洗涤树脂3次，制备纤溶酶‑琼脂糖树脂浆体(molecularinnovations；产品目录号hpl‑1)。然后，将200μl树脂悬浮液(在1xpbs中)/毫克u‑pa融合多肽加入含有透析u‑pa‑hsa融合多肽的pbs溶液。通过在室温温和振荡蛋白/树脂溶液3小时，完成u‑pa多肽酶原的“激活”。经修饰的u‑pa‑hsa多肽酶原其后完全转化成对应的活性经修饰u‑pa‑hsa蛋白酶。[0997]根据厂商说明，活性经修饰u‑pa‑hsa多肽用0.2μm旋转滤器(2.0ml容量)从纤溶酶树脂回收，离心以从纤溶酶树脂中回收活化的经修饰u‑pa‑hsa。为使回收最大化，可预想额外过滤技术(比照(asopposedto)旋转沉降树脂和用移液管提取回收上清)。其他低蛋白结合过滤装置也能用于进一步过滤树脂。活化的u‑pa‑hsa融合蛋白在4℃或冷冻下等分保存。确认完整激活步骤可通过sds‑page在还原条件下呈现，以分开n末端结构域与蛋白酶结构域hsa融合缀合物。[0998]4.抑制活化的经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白[0999]对于一些实验，需要使用催化失活形式的u‑pa‑hsa融合多肽(如seqidno:1015的残基21‑1022所示，如上所讨论；参见例如seqidno:1019)。为产生命名为抑制的经修饰u‑pa‑hsa(u‑pa‑hsai)的蛋白，活化的经修饰u‑pa‑hsa(u‑pa‑hsaa)与不可逆活性位点抑制剂glu‑gly‑arg‑氯甲酮(egr‑cmk)孵育，以防止经修饰的u‑pa‑hsa多肽的任何自催化或体内实验中的灭活/切割(参见例如实施例15和16)。为制备u‑pa‑hsai，冻干的egr‑cmk(molecularinnovations；产品目录号ggack)在10mmhcl中复水到100mm。浓缩的egr‑cmk以储料浓度加入活化的经修饰u‑pa‑hsa样品(u‑pa‑hsaa)以达到1xpbs中1mmegr‑cmk抑制剂的终抑制剂浓度，允许混合物rt孵育1小时。[1000]为评价u‑pa‑hsaa是否充分抑制，在稳定性实验中比较经修饰u‑pa‑hsai的降解与经修饰u‑pa‑hsaa。简言之，经修饰的u‑pa‑hsai和经修饰的u‑pa‑hsaa在37℃孵育0小时、1天或7天。在还原和非还原条件下，通过还原和非还原sds‑page凝胶电泳来目测监测经修饰u‑pa‑hsai和u‑pa‑hsaa降解。通过考马斯或其他类似市售可得染色剂来呈现条带。结果证明用抑制剂预孵育可稳定多肽，因为相较于在37℃孵育1天或7天后观察到的经修饰u‑pa‑hsaa降解，在多至7天的任何时间点没有观察到任何经修饰u‑pa‑hsai的降解产物。[1001]5.在激活后纯化u‑pa‑hsaa和u‑pa‑hsai多肽[1002]在终纯化轮期间，活性和抑制的经修饰u‑pa‑hsa多肽分离自高和低分子量杂质，使用尺寸排阻层析。纯化排除高分子量种类，其作为u‑pa‑hsa主峰前的单独峰洗脱。高分子量种类未进一步分析，然而，能代表在所述过程的表达或激活步骤中形成的聚集物或多聚体。认为第二、低分子量种类游离于表达期间产生的白蛋白或者激活也被消除。[1003]纯化如下推进：～300μl经修饰u‑pa‑hsai(0.8mg)样品或～400μl经修饰u‑pa‑hsaa(0.8mg)样品加载到尺寸排阻层析柱(hiprep16/60sephacryls‑200hr；通用电气医疗集团,产品目录号ge17‑1166‑01)，在pbs,ph7.0中，流速为0.5ml/min。蛋白一般根据厂商用于树脂的说明(通用电气医疗集团)纯化，主峰含有保留的经修饰u‑pa‑hsai或u‑pa‑hsaa。[1004]制品的品质和分离的程度通过还原及非还原sds‑page凝胶电泳进一步评估。经修饰u‑pa‑hsai或u‑pa‑hsaa多肽样品的洗脱部分加载到12孔非还原sds‑page凝胶各“泳道”，在40v运行，直至带充分可辨别，多个尺寸的蛋白种类通过银染色呈现以提高相比标准考马斯染色的灵敏度。收集含有在75kda预期分子量迁移的单带的部分，以约2mg/ml终浓度进行液氮速冻，‑80℃保存，直至使用。终浓度通过280nm吸收确定，使用nanodrop分光光度计。蛋白尺寸和表达稍后通过考马斯染色及sds‑page确认。单独u‑pa‑hsa多肽样品的品质通过活性试验和质谱进一步评估。[1005]实施例15.玻璃体内注射后的经修饰u‑pa蛋白酶结构域和经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白药代动力学评估[1006]评价经修饰的u‑pa‑hsa融合多肽的药代动力学和明显眼部毒性。融合蛋白包含经修饰的u‑pa多肽蛋白酶结构域(seqidno:987,其是seqidno:21,除了c122s是c122c)，如上面实施例14所述。融合蛋白具有seqidno:1019所示的序列，其是seqidno:1015的残基21‑1022。如实施例14所述，经修饰u‑pa的蛋白酶结构域如seqidno:987所示。活化和抑制的经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白(seqidno:1015)的药代动力学概况在荷兰黑带兔(dutchbeltedrabbit)中体内评价，并与仅如seqidno:21所示经修饰u‑pa蛋白酶结构域的药代动力学概况作比较。3个治疗组的每个分配8只兔子(组1:经修饰的u‑pa‑hsaa；组2:经修饰的u‑pa‑hsai；组3:经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21))。研究动物每只眼睛通过玻璃体内注射(ivt)施用50μl的2.1mg/ml经修饰的u‑pa‑hsai和u‑pa‑hsaa或1.15mg/ml经修饰的u‑pa(seqidno:21)。对于含经修饰的蛋白酶的经修饰的u‑pa治疗组，右眼接受经修饰的u‑pa多肽且左眼注射pbs作为载剂对照(pbs)。下表概括了组和条件以及进行的评估：[1007][1008]*os和od分别指右和左眼[1009]1.经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa融合蛋白的眼部耐受性[1010]在给药阶段期间和安乐死之前，进行临床和眼部观察并记录体重。在给药后1、3、7和14天(组1和2)或1、3和7天(组3)对2只眼睛都进行眼部检查，眼睛刺激用德雷策标度打分。德雷策打分系统(draize等、(1944)jpharmexperther82(3)377‑90)评价角膜、虹膜和结膜中的眼睛刺激，提供以0‑2或0‑4量表打分刺激的标准。“0”分指示角膜、虹膜和结膜正常。在所有时间点，使用德雷策标准，所有动物的眼睛刺激打分为0，除了1只兔子有2个“1”分，指示“红”，其中“血管明确高于正常注射”和“球结膜水肿”具有结膜“高于正常的肿胀”。在第1天玻璃体内施用u‑pa‑hsai后数小时内，就组2(u‑pa‑hsai)的1只兔子观察到这些“1”分。最重要的是，在玻璃体内施用经修饰u‑pa和经修饰u‑pa‑hsa活化融合蛋白后，没有观察到毒性。[1011]2.经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa融合蛋白的药代动力学[1012]为确定经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa多肽浓度(nm)及药代动力学参数，在1、3、7和14天摘除双眼后收集眼组织及液体的终端样品，每个时间点使用2只动物。安乐死后，收集各兔子的双眼并切开以收集眼组织及液体(眼房水(ah)、玻璃体液(vh)、视网膜和脉络膜)，从而评价u‑pa和u‑pa‑hsa表达及活性。收集后，称重量的兔玻璃体液、视网膜和眼脉络膜在含2.8mm陶瓷珠的耐冲击微管(usascientific)中均质化。对于vh、视网膜和脉络膜组织，向各管加入磷酸盐缓冲盐水/毫克组织的恒定等分样品。视网膜和脉络膜样品9:1稀释(稀释液体积:组织体积)且vh样品4:1稀释(稀释液体积:vh体积)，使用磷酸盐缓冲盐水。样品在0‑10℃,5500rpm匀化，持续3×30秒循环，各循环之间有20秒停顿，直至彻底匀质化。[1013]vh中经修饰u‑pa和经修饰u‑pa‑hsa多肽的浓度(由elisa测定)(nm)及活性(nm)，分别用elisa和活性试验确定。对于浓度测定，抗u‑pa夹心elisa如下完成：捕获抗体pa1‑36166(英杰)在elisa板上4℃包被过夜或rt2小时，浓度为100mm碳酸盐缓冲液,ph9.5中的1.0ug/ml。板随后用pbst(含有tween的1xpbs)洗3x，然后用含1％bsa的pbs‑tween在4℃阻断过夜或rt2小时。50μl的各样品在rt振荡孵育30分钟，然后pbs洗3x，用检测抗体pa1‑36015(英杰，0.25ug/ml，持续30分钟)孵育。孔再次洗涤且随之用1:30,000稀释的hrp缀合抗山羊抗体(rockland)孵育39分钟，伴有rt振荡。用pbst洗6x后，结合的经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa多肽通过1步式tmb(34028,赛默(thermo))检测呈现，用2n硫酸淬灭，然后读取450nm吸光度。[1014]然后通过活性定量vh中经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa多肽，使用基于淬灭‑荧光肽底物(fret)水解的试验并针对已知活性浓度的经修饰的u‑pa多肽的标准曲线校准。此试验采用基于人补体3(c3)切割序列的fret肽底物。肽序列是rqhar/ashl，其中“/”指示切割位点。肽的n末端侧标记有dabcyl荧光团，c末端侧标记有edans荧光团。肽切割可分开edans/dabcylfret对以产生荧光信号，其在多孔荧光酶标仪中测量。[1015]试验如下进行：测试样品通常在试验缓冲液(100mmtris,50mmnacl,0.01％tween‑80,ph7.4)中稀释到最低所需稀释度1:20。稀释的样品进一步1:2稀释，采用96孔板的80μmfret底物。稀释的测试样品与底物组合后，立即在荧光读板仪中评估fret底物水解后的荧光信号，每30秒测量，持续2小时。fret肽底物的酶促水解产生了edans荧光产物。将荧光强度的产生速率插入edans标准曲线以产生edans产物产生速率。特定活性可以2种方式计算。首先，产物产生速率乘以稀释因数以产生体积特定活性，单位为每ml样品每分钟反应的nmol产物(nmol/min/ml)。体积特定活性指示样品中活性酶总量。第二，特定活性如下计算：体积特定活性除以样品酶浓度以产生酶特定活性，单位为每mg酶每分钟反应的nmol产物(nmol/min/mg)。为测试确定未知样品(如体内pk样品)的表观蛋白酶浓度，样品的体积特定活性(nmol/min/ml)除以对照经修饰的u‑pa或经修饰的u‑pa‑hsa多肽的酶特定活性(nmol/min/mg)，以产生样品的表观蛋白酶浓度(mg/ml)。[1016]下表提供各眼和动物的数据。每只动物就各眼获得的浓度进行平均。然后，各动物的药物浓度在各时间点平均以补偿动物间变化。计算各时间点的均值并示于下表。所得数据随后接受下列分析方法：首先，lee等开发的半参数分段稳健回归方法(参见lee等,(1990)j.labclin.med.115:745‑748；和lee等(1997)“使用稳健回归技术以获得改进的凝血因子半衰期估。第十六届国际血栓与止血大会(theuseofrobustregressiontechniquestoobtainimprovedcoagulationfactorhalf‑lifeestimates.xvithcongressoftheinternationalsocietyforthrombosisandhemostasis),”意大利佛罗伦萨)用于计算半衰期。其是区室化模型。数据用程序demitasse评估，其经验证并用于fda提交。为分析时间曲线下面积(auc)和其他pk参数，使用基于梯形法则的非区室化模型。计算pk参数并示于下表。[1017]表[1018]idno:1000))；(2)野生型u‑pa激活序列(seqidno:997或998),弗林蛋白酶激活序列(seqidno:995,996或1041),或没有激活序列；(3)经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987或21)或野生型u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:2或5)；(4)接头(seqidno:1002或1003)；和(5)融合伴侣(即igg1fc(seqidno:992)；人血清白蛋白(hsa)(seqidno:991)；结合胶原蛋白iim的cfv(c2scfv)(seqidno:993)；或透明质酸结合域(habd)(seqidno:994))。c末端融合蛋白示例如seqidno:1006‑1010、1012、1013、1016和1040所示(参见例如图3a和3b)。[1031]也产生含有u‑pan末端区的c末端融合蛋白。构建体包含(从n末端到c末端)：(1)分泌信号(小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)；seqidno:999)；(2)野生型u‑pan末端区(seqidno:1的氨基酸21‑178或seqidno:1042)；(3)u‑pa激活序列(seqidno:997或998)或弗林蛋白酶激活序列(seqidno:995,996或1041)；(4)经修饰u‑pa催化结构域(seqidno:987或seqidno:5,除了根据胰凝乳蛋白酶编号的c122,或seqidno:21)；(5)接头(seqidno:1002或1003)；和(6)融合伴侣(即igg1fc(seqidno:992)；人血清白蛋白(hsa)(seqidno:991))。c末端融合蛋白示例如seqidno:1011,1014,1015和1036所示(参见例如图3c)。还参见seqidno:1010，其包含弗林蛋白酶激活序列取代u‑pa。[1032]还产生含有n末端sumo和c末端融合伴侣的融合蛋白。构建体包含(从n末端到c末端)：(1)分泌信号(小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)(seqidno:999))；(2)his接头和sumo序列(seqidno:990)；(3)经修饰u‑pa催化结构域(seqidno:987)；(4)接头(seqidno:1002)；和(5)融合伴侣(即igg1fc(seqidno:992)；或人血清白蛋白(hsa)(seqidno:991))。c末端融合蛋白示例如seqidno:1016和1017所示。[1033]产生未与融合伴侣融合的全长u‑pa蛋白作为对照(参见例如图2b)。构建体包含(从n末端到c末端)：(1)分泌信号(小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)(seqidno:999))；(2)u‑pa的n末端结构域(seqidno:1040；seqidno:1的氨基酸21‑166)；(3)u‑pa激活序列(seqidno:997)；和(4)经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)。全长u‑pa蛋白示例如seqidno:1005所示。以下是产生的构建体概括：[1034][1035][1036]对照蛋白具有seqidno:1005所示的序列。对照蛋白包含u‑pan末端(seqidno:3的氨基酸1‑158)、野生型u‑pa激活序列和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)且没有融合伴侣。seqidno:1004所示的融合蛋白包括在n末端的融合伴侣(fc)。seqidno:1006‑1009所示的融合蛋白具有c末端的不同融合伴侣且没有位于经修饰u‑pa蛋白酶结构域n末端的激活序列。seqidno:1010和1011所示的融合蛋白包含c末端的fc且彼此差异性激活：seqidno:1010所示融合蛋白包含弗林蛋白酶激活序列；seqidno:1011所示的融合蛋白包含u‑pa的n末端区和野生型u‑pa激活序列。seqidno:1012和1013所示的融合蛋白分别与seqidno:1006和1007所示的融合蛋白相同，但具有野生型u‑pa蛋白酶结构域取代经修饰的u‑pa蛋白酶结构域。[1037]seqidno:1014‑1016所示的融合蛋白包含c末端的hsa且彼此差异性激活：seqidno:1014所示的融合蛋白包含弗林蛋白酶激活序列；seqidno:1015所示的融合蛋白包含野生型u‑pa激活序列用于激活；seqidno:1016所示的融合蛋白包含弗林蛋白酶结构域用于激活。seqidno:1017和1018所示的融合蛋白分别包含n末端的sumo作为激活结构域，和c末端的hsa或igg‑fc。向seqidno:1010、1014和1016所示的融合蛋白加入弗林蛋白酶激活位点，从而蛋白能在表达期间活化，因而消除对下游加工期间激活步骤的需求。[1038]2.构建体产生[1039](a)制备u‑pa构建体[1040]构建体组装自合成寡核苷酸和/或pcr产物并克隆入pcdna3.4‑topo载体(英杰；产品目录号a14697)，以在人巨细胞病毒(cmv)立早启动子/增强子控制下表达。[1041](b)制备sumo‑u‑pa构建体[1042]为表达含有sumo标签的融合蛋白(如seqidno:1017和1018所示)，带有c122s的经修饰的u‑pa多肽编码dna(如seqidno:21所示)克隆入密码子优化的pe5表达载体(赛默科技；序列如seqidno:988所示)。pe5质粒包含位于sumo序列c末端的多克隆位点以克隆融合伴侣(hsa或fc)和经修饰的u‑pa蛋白酶结构域。最终的融合蛋白是(1)融合伴侣(hsa或fc)；(2)有c122s的经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)；其有(3)n末端6xhis纯化标签；和(4)sumo。[1043]b.制备u‑pa融合多肽[1044]u‑pa融合蛋白的预期分子量如下所示：[1045][1046][1047]1.u‑pa融合蛋白的转化、表达、折叠和再折叠[1048]序列如seqidno:1004‑1013所示的融合蛋白如上面实施例14所详述进行转化和表达。[1049]2.u‑pa‑sumo(小泛素样修饰物)融合蛋白的转化、表达、折叠和再折叠[1050]序列如seqidno:1017和1018所示的融合蛋白如下所详述制备。[1051]克隆用于大肠杆菌表达的sumo‑经修饰u‑pa融合多肽[1052]感受态bl21gold(de3)大肠杆菌细胞用表达载体(seqidno:988)中的u‑pa融合蛋白转化，其由赛默科技制备，使用标准热激方法。质粒dna重悬于50μlmq水以获得100ng/ml储液。质粒dna和感受态bl21goldde3细胞在冰上解冻。将0.5μldna加入无菌微量离心管的50μl细胞，冰上孵育30分钟。细胞/dna混合物通过在42℃放置45秒来热激。细胞/dna混合物移回到冰，冰上孵育2分钟。向细胞/dna混合物加入450μl预热(37℃)soc培养基，所得soc/细胞/dna混合物在37℃振荡孵育。soc(2‑200μl)中的细胞在lb‑羧苄青霉素板上接种并涂布，所述板37℃孵育过夜。从培养箱中取出具有细菌菌落的板，石蜡膜密封并4℃保存。各转化菌落的甘油储液通过标准方法制备并‑70℃保存。[1053]c.评价融合蛋白在哺乳动物细胞培养物中的蛋白表达[1054]来自expi293细胞培养物上清(参见实施例14)的蛋白浓度通过elisa评估且通过蛋白质印迹定性评估。蛋白质印迹后的蛋白表达在1‑5量表上打分，其中1代表最高表达而5代表没有表达。[1055]就各构建体测试6个样品。结果如下表所示。结果显示，通过elisa和蛋白质印迹，seqidno:1004、1007‑1009和1013所示的融合蛋白表达不良。seqidno:1005、1010和1011所示的蛋白具有最高表达，如定性蛋白质印迹和elisa所评价。[1056][1057]r平方＝0.9993；检测极限＝0.109ng/ml；定量限＝1.375ng/ml[1058][1059]d.融合蛋白激活策略[1060]多种策略用于u‑pa激活。seqidno:1004‑1005、1011和1015所示的蛋白通过纤溶酶活化，如上面实施例14所详述。seqidno:1010、1014和1016所示的蛋白预期通过表达期间的胞内弗林蛋白酶活化。seqidno:1006‑1008所示的蛋白预期在表达期间自激活。seqidno:1017和1018所示的蛋白通过sumo蛋白酶处理激活。为激活sumo‑u‑pa构建体，通常加入10单位sumo蛋白酶/1mg蛋白，允许4℃孵育过夜。histrap镍螯合柱上进一步纯化会有效移出带his标签的sumo部分。[1061][1062]e.测量酶活性[1063]含有u‑pa融合蛋白的expi293hek上清在40μm人c3fret肽上的体积特定活性如实施例15所述评价。计算插入的、稀释调整的初始速度(nmedans/min/μl样品)。seqidno:1004、1005、1008和1011‑1013所示的融合蛋白未显示活性。seqidno:1006、1007、1009和1010所示的融合蛋白证明u‑pa蛋白酶活性。带有u‑pa的n末端的弗林蛋白酶激活序列和c末端的igfc融合的经修饰的u‑pa(如seqidno:1010所示)，显示最高活性。结果如下表所示。[1064][1065]f.亲和性纯化[1066]seqidno:1010和1011所示的融合蛋白具有最高表达，如蛋白质印迹和elisa所评价。seqidno:1010和1011所示的弗林蛋白酶‑变体u‑pa‑fc和全长upa‑fc融合蛋白分别进行蛋白a亲和纯化，使用厂商推荐条件(通用电气医疗集团)。[1067]g.高表达融合蛋白的纯化和活性评价[1068]亲和纯化后，蛋白浓度通过280nm吸光度和u‑paelisa评价(参见实施例15)，而纯度通过sds‑page凝胶电泳和分析型尺寸排阻层析(sec)评估，如上面实施例14所述。2种融合蛋白都表达。通过凝胶电泳和染色以及通过分析型尺寸排阻层析(sec)评价时，认为序列如seqidno:1010所示的融合蛋白(u‑pa弗林蛋白酶w/ocys)纯度不佳。通过凝胶电泳，认为seqidno:1011所示融合蛋白(全长wtupaw/cys)的纯度良好。结果如下表所示：[1069][1070]在人c3fret肽试验中评价亲和纯化后的u‑pa酶活性，如上面实施例15所述。结果示于下表:[1071][1072]亲和纯化后的u‑pa酶活性在人c3fret肽试验中评价，如上面实施例15所述。酶活性在纤溶酶激活后评价，如上面实施例14所述。结果如下表所示：[1073][1074]h.描述具有切割c3的经修饰的u‑pa多肽的融合蛋白[1075]具有u‑pa多肽的融合蛋白如下所述。下列讨论提供示范性序列。[1076]1.催化结构域[1077]催化结构域(蛋白酶结构域)可以是本文所提供经修饰的u‑pa多肽的任意蛋白酶结构域(参见实施例2，表14，其提供含本文和实施例所述多个修饰的蛋白酶结构域的ed50)，尤其是ed50小于100nm的任意那些，如实施例2所述，或小于50nm、30nm或10nm的那些。经修饰upa蛋白酶结构域示例如seqidno:21所示，除了当使用其激活生成2链多肽时，残基122(通过胰凝乳蛋白酶编号)是c，而非seqidno:21中的s。对经修饰upa多肽蛋白酶结构域加标签：[1078]seqidno:987:iiggefttienqpwfaaiyqryeggseyyrcggslispcwvisathcfipqpkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadiaaqhndiallkirskegrcaqpsrtiqticlpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdrlypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal；[1079]seqidno:21经修饰upa多肽蛋白酶结构域，含有c122s突变:iiggefttienqpwfaaiyqryeggseyyrcggslispcwvisathcfipqpkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadiaaqhndiallkirskegrcaqpsrtiqtislpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdrlypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmtltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal[1080]相较于天然upa多肽蛋白酶结构域seqidno:2含有氨基酸取代:iiggefttienqpwfaaiyrrhrggsvtyvcggsl[i/m]spcwvisathcfidypkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadtlahhndiallkirskegrcaqpsrtiqticlpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdylypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmtltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal；[1081]或相较于蛋白酶结构域，其中残基122(通过胰凝乳蛋白酶编号)处的c是s，如seqidno:5所示:[1082]iiggefttienqpwfaaiyrrhrggsvtyvcggslispcwvisathcfidypkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadtlahhndiallkirskegrcaqpsrtiqtislpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdylypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmtltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal.[1083]如本文所示，经修饰的u‑pa多肽相较于天然u‑pa，显示蛋白裂解活性和生化性质改变。u‑pa多肽修饰成对切割c3的活性增加，如本文所述，且切割其天然底物的活性下降。no:997(qcgqktlrprfk)或seqidno:998(qsgqktlrprfk))或弗林蛋白酶切割序列(seqidno:995、996、1041或1044(如qcgqktlrrrkr、或qsgqktlrrrkr、或qsgktlrrkr或qsgqktlrrkr)。二硫键能在激活序列内的半胱氨酸与u‑pa催化结构域内的半胱氨酸(通过胰凝乳蛋白酶编号的c122)之间维持。切割激活位点后，活化分子保留在n末端片段激活或全部n末端结构域之间的共价连接。[1093]5.接头[1094]为连接u‑pa多肽与其他多肽序列，使用氨基酸的短、灵活序列(接头)。接头示例包括但不限于ggssgg或ggggs或ags(如seqidno:1001‑1003和1024‑1030所示那些)，以及详细描述中讨论的那些。这些重复序列连接的较长链接也纳入，从而接头具有序列(ggssgg)n 1，其中n是0或1‑20的整数。其他接头如序列表和详细描述所示。[1095]6.其他u‑pa修饰[1096]可加入其他肽序列如6xhissumo(如seqidnos:990和1031‑1033(dghhhhhhgslqdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdsl(t/r)flydgi(e/r)iqadq(t/a)pedldmedndiieahreqigg)所示那些)以促进u‑pa多肽的表达、分泌或纯化。对于改变或天然u‑pa多肽的额外化学和翻译后修饰能包括但不限于缀合聚合物，如聚乙二醇化、pas化和唾液酸化以改变u‑pa多肽的药效学性质。[1097]7.有n末端融合的示范性经修饰的u‑pa多肽[1098][1099][1100]*seqidno:21的u‑pa蛋白酶结构域(有和没有c122s取代)[1101]图2列出有n末端融合的u‑pa多肽示意图，如seqidno:1004和1005所示的n末端融合多肽。[1102]8.有c末端融合的示范性经修饰的u‑pa多肽[1103][1104][1105][1106][1107][1108][1109][1110][1111][1112][1113][1114][1115][1116][1117][1118][1119][1120]图3列出有c末端融合的u‑pa多肽示意图，如seqidno:1006‑1018和1036所示c末端融合多肽。[1121]i.用于评价u‑pa量和补体途径活性的试验[1122]在pcdna3_4载体转染后生成u‑pa多肽融合，所述载体在expi293tm细胞的哺乳动物表达系统中编码改变的和天然u‑pa多肽融合。在expi293tm细胞中正确表达的u‑pa多肽用hitrap蛋白ahp或captureselecttm人白蛋白亲和基质纯化，并加工用于生物分析试验如u‑paelisa以检测upa效加价或c3fret蛋白裂解试验以检测u‑pa多肽催化活性。结果如下表所示：[1123][1124][1125]1.u‑paelisa水平[1126]酶联免疫吸附测定(elisa)用于检测u‑pa多肽的存在(参见例如实施例15)。通常，检测u‑pa是u‑pa与捕获抗体(1.0ug/ml的pa1‑36166,英杰)结合的间接量度。捕获的u‑pa多肽随后用检测抗体(0.25ug/ml的pa1‑36015)检出，其由hrp缀合抗山羊抗体(rockland,605‑403‑b69)识别。hrp酶在加入tmb底物后引发比色反应。使用u‑paelisa法，鉴定了4个以高upa效价水平表达的u‑pa多肽(seqidno:1005、1010、1011、1012、1015)，2个中等效价的u‑pa多肽(seqidno:1006和1013)，和不表达的seqidno:1004、1007‑1009所示u‑pa多肽。[1127]2.酶活性(人c3fret肽)[1128]体外测量upa多肽对人c3的蛋白裂解活性，使用genscript(批号94045990005/pe6379)生产的人c3fret肽rhqarashledans/dabcyl(参见例如实施例15)。肽的n末端侧标记有dabcyl荧光团，c末端侧标记有edans荧光团。切割肽可分开edans/dabcylfret对以产生荧光信号，其在多孔读板仪中测量。将荧光强度的产生率针对edans标准曲线插值以产生edans产物产生率。产物产生率乘以稀释因子以产生体积特定活性，单位为每ml样品每分钟反应的nmol产物(nmol/min/ml)。体积特定活性指示样品中活性酶总量。第二特定活性如下计算：体积特定活性除以样品酶浓度以产生酶特定活性，单位为每mg酶每分钟反应的nmol产物(nmol/min/mg)。酶特定活性指示upa多肽在样品中的固有活性，无论浓度如何。使用人c3fret活性试验，seqidno:1010所示的upa多肽显示有活性。[1129]***[1130]本领域技术人员清楚了解一些修饰，预期本发明仅受所附权利要求范围限制。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：5.提供经修饰的u‑pa多肽，其切割补体蛋白，从而抑制补体激活。通过此抑制，经修饰的u‑pa多肽能用于治疗补体介导的或补体激活在其中发挥作用的疾病和病症。这些疾病和病症包括但不限于眼科适应症(包括黄斑变性如年龄相关的黄斑变性(amd)和stargardt病)、移植肾功能延迟(dgf)、缺血和再灌注失调(包括心肌梗塞和中风)、败血症、自身免疫病、炎症性疾病以及有炎性成分的疾病(包括阿尔茨海默氏病和其他神经退行性疾病)。6.发明背景7.补体(c)系统是免疫系统的一部分并在消除入侵病原体和起始炎症反应中发挥作用。人和其他哺乳动物的补体系统涉及超过30个可溶性和膜结合蛋白，所述蛋白参与引起补体激活的有序的一系列反应。血液补体系统具有大量与广谱宿主防御机制(包括抗微生物和抗病毒作用)相关的功能。衍生自c组分激活的产物包括非自我识别分子c3b、c4b和c5b，以及影响多种细胞免疫反应的过敏毒素c3a、c4a和c5a。这些过敏毒素充当促炎剂。8.补体系统由一系列酶和非酶蛋白及受体构成。补体激活通过三种主要模式之一发生，所述模式称为“经典”途径、“替代”途径和“凝集素”途径(参见图1)。补体通常由这3条途径之一激活或引发，其如图1所示在c3活化处汇集。在称为内源性途径的第四补体激活机制中，与凝血和纤溶级联相关的丝氨酸蛋白酶直接通过切割c3或c5来激活补体系统，不依赖经典、替代和凝集素途径。9.这些途径能通过起始补体激活的过程区分。经典途径由抗体‑抗原复合物或聚集形式的免疫球蛋白起始；替代途径由微生物和细胞表面的结构识别起始；凝集素途径是抗体依赖性途径，其通过甘露糖结合凝集素(mbl，也命名为甘露糖结合蛋白)与碳水化合物如细菌或病毒表面展示的那些相结合来起始。级联激活导致产生参与蛋白质水解或细胞裂解的复合物以及参与调理作用、过敏反应和趋化性的肽。10.补体级联是动物免疫应答的重要组分，是不可逆级联。许多蛋白辅助因子调节该过程。不恰当的调节，通常是不恰当激活，该过程，可能是参与不恰当炎症或免疫应答的多种失调的一方面或可能在其中出现，如在急性和慢性炎性疾病以及涉及不恰当免疫应答的其他病症中观察到的那些。这些疾病和失调包括自身免疫病如类风湿性关节炎和狼疮、心脏失调和其他炎性疾病如败血症和缺血再灌注损伤。11.由于补体途径参与多种疾病和病症，补体途径的组分是治疗性干预的靶标，尤其是用于抑制通路。这类治疗示例包括合成和天然小分子治疗剂、抗体抑制剂及重组可溶形式的膜补体调节剂。制备这类治疗剂的策略有限制。小分子的体内半衰期短且需要连续输注以维持补体抑制，从而限制其作用，尤其是在慢性病中。治疗性抗体可导致受试者的免疫应答并因而可能在治疗中，特别是设计成调节免疫应答的治疗中导致并发症。因此，需要治疗剂用于治疗补体介导疾病和补体激活在其中发挥作用的疾病。这些疾病包括急性和慢性炎性疾病。因此，本文的目的中，一个目的是提供这类治疗剂以靶向补体级联激活并提供治疗疾病的治疗剂和方法。12.发明概述13.提供经修饰尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽，其包括在蛋白酶结构域中的氨基酸插入、缺失和/或取代，导致对补体蛋白c3的切割活性相较于野生型u‑pa蛋白酶结构域(其中蛋白酶结构域可包括用ser取代游离cys以减少/消除聚集)增加。所述经修饰的u‑pa多肽包括蛋白酶结构域，如全长活化蛋白酶、其酶原形式以及含有经修饰的u‑pa多肽和赋予药学特性或活性的融合伴侣的融合蛋白。所述经修饰的u‑pa多肽和含有所述经修饰u‑pa的融合蛋白处于活性形式时，抑制补体激活。特别是，这些多肽和融合蛋白切割c3，从而c3活性被抑制或消除。14.本文提供的修饰(包括氨基酸缺失、取代和插入)在蛋白酶结构域内。经修饰的u‑pa多肽包括或者是蛋白酶结构域。经修饰的u‑pa多肽还可包括翻译后修饰和一级氨基酸序列以外的其他修饰，如缀合或连接其他多肽和改变性质的部分，所述性质如血清半衰期及耐受内源性蛋白酶。这类修饰包括但不限于连接白蛋白、连接多聚化结构域和聚乙二醇化。因此，经修饰的u‑pa多肽能通过聚乙二醇化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化和本领域已知其他多肽修饰来修饰。在多种修饰中包括在酶原中用丝氨酸或丙氨酸取代游离半胱氨酸，如根据胰凝乳蛋白酶编号的c122，以减少聚集，尤其是体外表达后的聚集。此取代是任选存在的，且不必需包括在待聚乙二醇化或体内表达的多肽中。15.经修饰的u‑pa多肽通过切割灭活补体蛋白c3。经修饰的u‑pa多肽切割c3以抑制补体激活，其在一个位点如活性位点切割c3，灭活或抑制c3活性，从而抑制补体激活。本文提供的经修饰的u‑pa多肽选择并设计成在qharashlg内切割，具体是其中p1‑p1'为ra(qhar↓ashl；参见seqidno:47残基737‑744，其中切割在残基740‑741之间)。因此，这些经修饰的u‑pa多肽能用作治疗剂以治疗失调、疾病和/或病症，其中补体激活发挥作用，从而其抑制能治疗失调、疾病和/或病症。经修饰的u‑pa多肽相较于野生型u‑pa或相较于仅具有通过胰凝乳蛋白酶编号对应c122s取代的那些，也可对天然底物如纤溶酶原活性下降。16.经修饰的u‑pa多肽所用于的疾病和病症是任意c3介导或补体介导或参与的疾病和病症。这些包括眼科失调如年龄相关的黄斑变性(amd)和糖尿病视网膜病变及器官排斥如移植肾功能延迟(dgf)以及能通过抑制补体激活治疗的其他疾病、失调和病症。amd通过施用到玻璃体液来治疗，如通过玻璃体腔注射或者视网膜内或视网膜下注射，而dgf通过静脉内或其他全身施用来治疗。经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白可进一步修饰，如通过聚乙二醇化，以提高或改善或赋予所需的药学性质，包括增加的半衰期和/或减少的免疫原性。其他疾病和病症包括例如类风湿性关节炎(ra)、眼疾病、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、阿尔茨海默氏病(ad)、缺血再灌注损伤、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)和补体3肾小球病(c3g)。17.未修饰的u‑pa多肽包括前体形式、成熟形式、催化结构域和其催化活性形式以及融合蛋白，如实施例14‑16所述的那些。未修饰的u‑pa多肽示例是序列如seqidno:1‑6所示的那些。未修饰的u‑pa多肽包括催化结构域中的游离半胱氨酸(通过胰凝乳蛋白酶编号对应于c122)被另一氨基酸如s或a，尤其是s取代，其不改变催化活性，但减少多肽聚集。应理解所有经修饰的u‑pa多肽能在通过胰凝乳蛋白酶编号对应于c122的残基处包括取代，一般是s。18.本文提供的经修饰尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽是含有选自对应于r35q、h37y、v41r、v41l、y40q、d60ap、l97ba、t97ai和h99q的取代的一个或多个氨基酸修饰，以及因此的保守氨基酸修饰的那些，其中经修饰的u‑pa多肽相较未修饰活性形式的u‑pa多肽，对补体蛋白的活性/特异性增加，其中：氨基酸修饰选自取代、插入和缺失；对应残基能通过与u‑pa天然形式比对来确定；经修饰的u‑pa多肽切割补体蛋白以相较不含氨基酸修饰的未修饰的u‑pa多肽抑制或减少补体激活；残基通过胰凝乳蛋白酶编号来标示；未修饰的u‑pa多肽包括seqidno:1‑6任一者(野生型人全长u‑pa、野生型蛋白酶(催化)结构域u‑pa、野生型成熟u‑pa、带有对应c122s取代的全长u‑pa、带有对应c122s取代的蛋白酶结构域u‑pa和带有对应c122s取代的成熟u‑pa)所示的序列和其含氨基酸取代的催化活性片段。保守修饰选自r35y、w、f或n；h37r、q、e、w或f、v41k、d60as、t97ad、l或v、l97bg或s和h99n，通过胰凝乳蛋白酶编号。19.具体地，这些经修饰的尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽是含有一个或多个氨基酸修饰的那些，所述修饰选自对应以下的取代：r35q、h37y、v41r、v41l、y40q、d60ap、l97ba、t97ai和h99q。20.经修饰的u‑pa多肽切割纤溶酶原中的底物序列的活性和/或特异性降低。多肽对其特异性/活性增加的补体蛋白是c3；切割使c3失活。切割位点的示例在c3活性位点内。经修饰的u‑pa多肽是对c3切割活性增加的那些，所述活性比seqidno:5(有c122s取代的蛋白酶结构域)的未修饰的u‑pa多肽高至少3倍。21.经修饰的u‑pa多肽包括含有取代h37y如取代h37y/v38e的那些。经修饰的u‑pa多肽包括含有取代r35y/h37k或r35q/h37k的那些，如包含取代r35y/h37k/v38e或r35q/h37k/v38e的那些。22.还提供经修饰的u‑pa多肽，包括上述那些，其也含有取代l97ba和/或r35q，和/或h99q，和/或d60ap，和/或t97ai。23.经修饰的u‑pa多肽还能包括对应t39y、t39w、t39f如t39y的氨基酸取代，或选自t39m或t39l的保守取代。其他经修饰的u‑pa多肽包括或进一步包括氨基酸取代r35q/h37y和/或v38e/v41r/y149r。24.其他经修饰的u‑pa多肽是包含修饰v41r的那些，如包含修饰v38e/v41r的经修饰的u‑pa多肽，包括在位置r35、h37和v38的一个或多个进一步包含取代的那些。这些包括其中v38处的取代是e的经修饰的u‑pa多肽，例如包含r35y/h37s/v38e/v41r、h37y/v38e，以及有助于c3切割和/或稳定性(例如体液中)的其他残基组合的经修饰的u‑pa多肽。25.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽是体外测试中对c3灭活切割的ed50小于100nm或50nm或30nm或25nm的经修饰的u‑pa多肽。其示例是表14所示ed50是100nm或更少的那些，或表14所示ed50小于50nm的那些，或表14所示ed50小于30nm的那些，或表14所示ed50小于25nm的的那些。评估ed50的试验示例包括底物补体蛋白人c3与多种浓度的各修饰蛋白酶在37℃孵育1小时，以测定ed50。特别地，经修饰的u‑pa多肽是以ed50为50nm或更少切割c3的任意多肽。26.未修饰的u‑pa多肽可由seqidno:1‑6任一者所示的氨基酸序列组成，或能包括额外的修饰，包含额外的插入和缺失。本文任意取代、插入或缺失能纳入未修饰的u‑pa多肽，如蛋白酶结构域，尤其是seqidno:5的蛋白酶结构域。经修饰的u‑pa多肽可与seqidno:1‑6任一者多肽或其催化活性部分有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。相较于seqidno:1‑6任一者的未修饰的u‑pa多肽或其催化活性部分，经修饰的u‑pa多肽能包含1或多至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸取代、插入或缺失。27.由此，提供含有修饰v41r或h37y或l97ba或r35q或h99q或d60ap或t97ai或其组合的经修饰的u‑pa多肽。任意经修饰的u‑pa多肽还能含有对应于t39y、t39w、t39f的氨基酸取代或者其选自t39m或t39l的保守取代。特别地，经修饰的u‑pa多肽还能含有氨基酸取代t39y，如组合t39y/v41r，和多至12或13个额外修饰以及任选存在的c122s。任意经修饰的u‑pa多肽还能包含氨基酸取代v38e，且可进一步含有氨基酸修饰r35q、y60bq和/或y149r的一个或多个。任意经修饰的u‑pa多肽还能含有氨基酸修饰r37ae或r37as。因此，本文提供的经修饰的u‑pa多肽可含有取代r35q/h37y/t39y/v41r或r35q/h37y/t39y/v41r/c122s。任意经修饰的u‑pa多肽可包含对应于h99q的取代。28.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽是含有氨基酸修饰r35q/h37y/t39y/v41r/l97ba/h99q/c122s或r35q/h37y/t39y/v41r/l97ba/h99q或t39y/v41r/y60bq/l97ba/h99q或t39y/v41r/y60bq/l97ba/h99q/c122s或t39y/v41r/d60ap/l97ba/h99q/c122s或t39y/v41r/d60ap/l97ba/h99q/c122s的那些。本文所提供的经修饰的u‑pa多肽也是含有对应于y40q/v41l/l97ba/c122s或y40q/v41r/l97ba/c122s或y40q/v41l/l97ba或y40q/v41r/l97ba或r37as/v41r/l97bg/h99q或r37as/v41r/l97bg/h99q/c122s或t39y/v41l/l97ba/h99q/c122s或t39y/v41r/l97ba/h99q/c122s的氨基酸修饰的那些。29.经修饰的u‑pa多肽包括含有以下修饰的那些：30.r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r。31.提供含氨基酸修饰的经修饰的u‑pa多肽，包括具有以下修饰的多肽：32.h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/l97ba/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/h99q/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/c122s/y149r；或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60aa/y60bp/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35l/h37d/r37as/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35m/h37g/r37ad/v38e/t39w/v41r/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37g/r37ap/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60be/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35a/h37g/r37ae/v38e/t39f/v41r/d60ae/y60bp/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37s/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bs/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37t/r37ap/v38e/t39y/v41r/d60ae/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37g/r37ae/v38e/t39h/v41r/d60ap/y60ba/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35w/h37d/r37as/v38e/t39y/v41r/d60ae/y60bs/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37g/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60b/t97a1/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35w/h37p/r37an/v3ge/t39y/v41r/d60ap/y60bl/d97t/t97ae/l97bg/a98s/h99l/c22s或r35w/h37p/r37an/v38e/t39y/v41k/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y151l/q192a或r35y/h37v/r37aw/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60be/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y151l/q192t或r35w/h37p/r37an/v38e/t39y/v41k/d60ap/y60bd/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y151l/q192t或33.各自在c122没有取代。这些经修饰的u‑pa多肽的示例是含有以下修饰的那些：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r。34.这些多肽的示例是序列如seqidno：8‑44和987如21和39‑44任一者所示的那些，以及前体和全长经修饰的u‑pa多肽，其含有序列如seqidno：8‑44所示的多肽和其催化活性部分。还应理解在本文所提供的任意经修饰的u‑pa多肽中，通过胰凝乳蛋白酶编号的残基122处cys能用ser取代，或能保持cys。保留cys用于其中含有经修饰u‑pa蛋白酶结构域的多肽包括融合蛋白旨在用作2条链的形式的实施方案，其中游离c122与多肽内的另一游离cys形成二硫键，或cys被修饰，如通过聚乙二醇化。在本文所述全部实施方案中，位置122可以是cys或ser。技术人员能根据预期用途选择适当残基35.未修饰的u‑pa多肽包含seqidno：1‑6任一者的蛋白酶结构域，或其催化活性部分，仅包括或含有seqidno：2或seqidno：5的蛋白酶结构域。36.经修饰的u‑pa多肽可含有额外的修饰，包括翻译后修饰，引入或移除糖基化位点的修饰，修饰如连接或缀合聚合物例如peg以增加血清半衰期和/或降低免疫原性或两者都有。特别地，本文所述和提供的任意及所有经修饰的u‑pa多肽能够聚乙二醇化。还提供含有本文所提供经的修饰的u‑pa多肽融合蛋白，如融合fc结构域，或特异于靶细胞或抗原的靶向剂。37.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白是pbs或体液如房水或血清中孵育7天后稳定性超过50％或80％的那些。经修饰的u‑pa多肽也是处于活性形式时，对纤溶酶活性相较于对应形式的未修饰的u‑pa多肽下降至少100倍的那些。38.本文所提供的经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白包括体外测试中对c3灭活切割的ed50小于100nm或50nm或30nm或25nm或15nm或10nm的那些，如本文实施例中所例示的任一个。这些包括多肽，其含有或者是表14所示的蛋白酶结构域，表14列出许多经修饰的u‑pa多肽蛋白酶结构域的突变串(string)和ed50，所述结构域表现出如实施例2所述评估的ed50。ed50为100nm或更少、小于50nm、小于30nm、小于25nm、小于15nm、小于10nm的经修饰的u‑pa多肽和融合多肽能如本文所述用作蛋白酶结构域，或采用较长u‑pa形式和/或在融合蛋白中。39.提供缀合蛋白，包括融合蛋白，其含有与非蛋白酶多肽或其部分融合的经修饰的u‑pa多肽或任意经修饰的u‑pa多肽的催化活性部分。提供非蛋白酶多肽，例如包括多聚化结构域如fc结构域、增加血清稳定性的多肽如白蛋白或蛋白转导域(ptd)的那些。40.如上所讨论，所有修饰能在序列如seqidno:1‑6任一者所示的未修饰多肽和其催化活性部分中。所述多肽包括其中未修饰多肽具有seqidno:5所示的序列(有c122s取代的蛋白酶结构域)的那些多肽。41.还提供融合蛋白，其含有本文所提供的经修饰的u‑pa多肽以及额外的多肽如血清白蛋白、多聚化结构域、信号序列和其他运输序列及标签以促进表达和分离。融合蛋白还可包括激活序列以活化u‑pa部分。活性形式的融合蛋白在表达、去除信号序列和任何其他加工及运输信号后生成，以产生切割c3的活性融合蛋白。活性形式的融合蛋白包括2链激活形式以及二聚体，如纳入多聚化结构域产生的那些。42.融合蛋白是含有经修饰的u‑pa多肽或经修饰的u‑pa多肽催化活性部分的那些，如表14中的那些，所述多肽融合非蛋白酶多肽或其部分。融合蛋白也可包括激活序列，以及在加工前包括信号序列和其他运输信号。非蛋白酶多肽包括但不限于本领域技术人员已知的赋予所需药学活性或特性、多聚化结构域如fc、蛋白转导域(ptd)、透明质酸结合域(habd)、靶向特定抗原的抗体的任一种。融合蛋白还可包括激活序列，如天然u‑pa激活序列或弗林蛋白酶激活序列。弗林蛋白酶激活序列示例是，是或包括qsgqktlrrrkr(seqidno:996)或qcgqktlrrrkr(seqidno:995)或qsgqktlrrkr(seqidno:1044)或与其有至少98％的序列相同性的弗林蛋白酶激活位点的那些。43.例如，包含本文所述或提供的任意经修饰的u‑pa多肽的融合蛋白在加工或激活前也包括信号序列和经修饰的u‑pa多肽或其催化活性部分。为了融合蛋白分泌编码的信号序列包括例如来自il‑2、u‑pa或iggκ的信号序列。44.融合蛋白能包括融合伴侣，如多聚化结构域，或增加血清半衰期的多肽，或赋予另一所需药学特性或活性的多肽。这些的示例是白蛋白或fc结构域或单链抗体或抗体的其他抗原结合片段或透明质酸结合域(habd)。示范性融合伴侣包括但不限于肿瘤坏死因子刺激基因‑6(tsg‑6)、has、iggfc、抗体或其抗原结合片段如抗ii型胶原抗体scfv片段或抗vegfr抗体或其片段。45.融合蛋白还可包括激活序列，从而含有u‑pa的所得的融合蛋白处于活性形式，如2链形式。激活序列能包含或修饰成包含半胱氨酸，其能与经修饰的u‑pa多肽中的游离cys如c122形成二硫键，从而在激活后，所得的激活的多肽包括2条链。示范性激活序列是u‑pa激活序列和弗林蛋白酶激活序列以及其修饰形式，如序列如seqidno:995‑998,1041和1044任一者所示或序列与其有至少98％或99％序列相同性的激活序列。46.示范性融合蛋白包含激活序列、经修饰的u‑pa多肽和hsa，如包含任意seqidno:1014、1015、1016、1019和1040所示氨基酸序列或其具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列相同性(且含有u‑pa部分的序列中的修饰)的修饰形式。为用于治疗方法，融合蛋白一般不含有信号序列。为用于基因治疗方法，核酸能编码信号序列。47.提供这类融合蛋白，如含有seqidno:1004‑1019和1034‑1040任一者所示的氨基酸序列的那些或具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列相同性(且包含u‑pa部分序列中的修饰)的任意融合蛋白。融合蛋白的示例是具有seqidno:1015或1019所示的氨基酸序列的那些。特别地，信号序列在使用前或体内表达后或体外生成时去除。这些包括处于含有a链和b链的2链激活形式的那些。例如，融合蛋白，其中b链在经修饰的u‑pa多肽的残基iigg处起始并在融合蛋白c末端终止，如含有经修饰的u‑pa多肽和hsa的那些，含有seqidno:1005、1011、1014、1015和1036任一者所示的氨基酸序列，但缺乏信号序列的那些。处于激活形式的融合蛋白示例是含有残基21‑178的a链和残基179‑到蛋白c末端的b链，残基168‑299之间有二硫键的融合蛋白。应理解，这些还包括具有至少95％、96％、97％、98％、99％序列相同性(且含有u‑pa部分的序列中的修饰)的融合蛋白。例如，提供含有a链和b链的融合蛋白，其中a链由seqidno:1015的残基21‑178组成，b链由残基179‑1022组成；a和b链经seqidno:1015的c168与c299之间二硫键连接。48.本文提供的其他融合蛋白包含多聚化结构域，从而在加工后，其形成多聚体，如通过互补多聚化结构域，例如fc结构域相互作用形成的二聚体。49.还提供组合，其可作为试剂盒包装，其含有第一组合物和第二组合物，所述第一组合物含有一或多种经修饰的u‑pa多肽，包括(如在所有实施方案中)融合蛋白，尤其处于非激活形式的那些，所述第二组合物含有用于治疗补体介导疾病或失调的一或多种第二药剂(agent)。例如，所述一或多种第二药剂可以是抗炎剂或抗凝血剂。这类药剂的示例是抗炎剂，选自以下的任意一种或多种：非甾体类抗炎药(nsaid)、抗代谢物、皮质类固醇、镇痛剂、细胞毒性剂、促炎性细胞因子抑制剂、抗炎性细胞因子、b细胞靶向剂、靶向t抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂、激酶抑制剂、ppar‑γ配体、补体抑制剂、肝素、华法林、苊香豆醇、苯茚二酮、edta、柠檬酸盐、草酸盐、阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定和希美加群。50.提供核酸分子，其编码本文所提供的任何经修饰的u‑pa多肽及融合蛋白。还提供含有这类核酸分子且编码经修饰的u‑pa多肽的载体。载体包括原核载体和真核载体，包括哺乳动物和昆虫载体如杆状病毒载体，酵母载体如毕赤酵母属(pichia)和酵母属(saccharomyces)，以及病毒载体如单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体、aav载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。载体可以是用于生成经修饰的u‑pa多肽的表达载体和/或用于基因治疗的载体，如腺病毒载体和aav载体，尤其是有感兴趣组织例如肝或眼趋向性的那些。51.提供生成经修饰的u‑pa多肽的方法，通过使细胞在载体表达的条件下生长，和任选地分离或回收所表达的经修饰的u‑pa多肽进行，所述细胞包含编码经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白的载体或核酸。52.还提供含有所述核酸分子或载体的经分离细胞和细胞培养物。细胞可以是非人细胞或人细胞培养物，但不包括发育成人的任何受精卵或细胞。细胞包括哺乳动物细胞和细菌细胞，包括但不限于细菌细胞如大肠杆菌(e.coli)、cho、balb/3t3、hela、mt2、小鼠ns0、bhk、昆虫细胞、酵母细胞以及常规用于多肽重组表达的其他细胞。生成经修饰的u‑pa多肽的方法包括使细胞在一定条件下生长，其中所编码的修饰u‑pa多肽得到表达，且任选地分离或纯化经修饰的u‑pa多肽。一般，经修饰的u‑pa多肽和其缀合物如融合蛋白，在使蛋白糖基化的细胞中生成。分离的经修饰的u‑pa多肽能进一步修饰，如通过聚乙二醇化。53.还提供含有所述经修饰的u‑pa多肽及融合蛋白和/或核酸和/或载体的药物组合物。提供所述药物组合物、核酸或经修饰的u‑pa多肽在抑制补体激活中的应用，从而治疗补体激活介导的疾病或失调或者其中补体激活在疾病或失调的病因学中起作用或是所述疾病或失调的病因学的基础的疾病或失调。特别地，提供所述核酸分子和/或载体在基因治疗中的应用，以治疗由补体激活介导的或涉及补体激活的这类疾病、失调和病症，其中抑制补体激活可实现治疗或缓解疾病或病症。还提供通过施用所述载体或施用核酸分子治疗由补体激活介导的或涉及补体激活的疾病或病症的方法。特别地，所述疾病、失调和病症是其中灭活c3以抑制或减少补体激活可实现治疗的那些。54.补体介导或者补体激活在病因学中发挥作用或是病因学基础的疾病、失调或病症，包括但不限于炎症性疾病、败血症、类风湿性关节炎(ra)、眼疾病或眼科疾病、心血管失调、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、阿尔茨海默氏病(ad)、缺血再灌注损伤、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、补体3肾小球病(c3g)和移植器官排斥，尤其是延迟性移植器官排斥。具体的疾病和失调包括眼失调或眼科失调，如黄斑变性或糖尿病视网膜病变或移植器官引起的炎症。所述疾病、失调和病症包括年龄相关的黄斑变性(amd)和移植肾功能延迟(dgf)。55.提供抑制补体激活的方法。所述方法如下进行：使经修饰的u‑pa多肽接触补体蛋白c3，其中补体蛋白c3被切割，从而补体激活减少或受抑制。接触能体外，但一般是体内，通过给需要补体失活或减少的对象施用经修饰的u‑pa多肽进行。施用可以是全身性的，如胃肠外，包括静脉内，或是局部，如通过接触受影响的组织如眼。施用于眼包括通过滴剂，通过连接经修饰的u‑pa多肽与蛋白转导结构域，或通过玻璃体注射、视网膜内或视网膜下注射或其他这类方法。对于疾病和病症如dgf，施用能通过静脉内施用实现。其他方法包括皮下和经皮施用。56.所述方法和应用包括治疗任何疾病、失调或病症，其中抑制补体激活会引起与补体介导疾病或失调相关的炎性症状减少，所述疾病或失调选自炎症性疾病、神经退行性疾病、眼科疾病和心血管障碍。这些包括但不限于炎症性疾病、病症和失调、败血症、类风湿性关节炎(ra)、眼失调、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、非典型溶血性尿毒综合征(ahus)、补体3肾小球病(c3g)、阿尔茨海默氏病(ad)、眼科失调如amd和糖尿病视网膜病变以及缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤可涉及选自以下的事件或治疗或由其引起：心肌梗塞(mi)、中风、血管成形术、冠状动脉旁路搭桥术、心肺转流术(cpb)和血液透析或治疗对象。用经修饰的u‑pa多肽治疗在对象治疗前完成。治疗包括器官移植。疾病、失调或病症包括眼科病症或是眼疾病或是移植器官引起的排斥或炎症，如糖尿病视网膜病变或黄斑变性。特别地，提供年龄相关的黄斑变性(amd)的治疗方法，以及移植肾功能延迟(dgf)的治疗方法。治疗能静脉内或皮下或局部实现，如通过注射经修饰的u‑pa多肽到眼内。包括玻璃体内或视网膜内、视网膜下注射或连接经修饰的u‑pa多肽与蛋白转导结构域以促进转导到玻璃体液内。经修饰的u‑pa多肽能连接或缀合某些部分，所述部分实现多肽靶向特定器官或组织，或增加血清半衰期或降低免疫原性，如聚乙二醇化和/或连接fc结构域或抗体或其抗原结合部分。57.由此，提供方法以治疗有补体介导失调或病症或者补体激活在这类失调或病症中发挥作用的对象，这是通过施用本文所提供经修饰的u‑pa多肽。本文还提供经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白的这类应用。经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白可实现治疗或能用于这些治疗，因为其切割补体蛋白c3，从而抑制或减少补体激活。抑制补体激活会导致与补体介导失调、疾病或病症相关的炎性症状减少，其涉及炎症反应，导致与补体介导疾病、病症或失调相关的炎性症状减少，其选自炎症性疾病、神经退行性疾病和心血管障碍。这些包括眼科疾病，如糖尿病视网膜病变和黄斑变性，以及延迟器官排斥如dgf。58.本文提供用于所述应用和方法的剂量以及单次剂量制剂。单次剂量能由熟练的医师凭经验确定，包括例如局部施用的单次剂量范围为0.1mg‑1mg，全身性如静脉内施用的范围为0.1mg‑10、15、20、30mg或更多。具体剂量取决于特定失调或疾病或病症，所治疗的对象，疾病、失调或病症的阶段，施用途径，方案和其他这类参数。剂量能每天，每2、3、4、5、6或7天，至少每周二次(bi‑weekly)，至少每2周、3周、4周或更长间隔重复。具体方案和剂量取决于例如所治疗的失调、施用模式和对象的具体情况如体重。其确定在熟练的医师的技术范围内。59.还提供方法、应用和组合以及经修饰的u‑pa多肽和融合蛋白，其中经修饰的u‑pa多肽包含修饰v41r或v41l，尤其是v41r，如v41i或r和v38e，以及含有h37y/v38e的那些。这类经修饰的u‑pa多肽示例是含有修饰y40q/v41r/l97ba或y40q/v41l/l97ba或r37as/v41r/l97bg/h99q，或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r的经修饰的u‑pa多肽。所述修饰在任何未修饰的u‑pa多肽中，包括seqidno:1‑6任一者所示的那些，和其包括对应v41的残基的催化活性部分。这类经修饰的u‑pa多肽示例包括seqidno:21或987或seqidno:40‑44任一者所示的氨基酸残基序列，或seqidno:40‑44任一者所示的氨基酸残基序列而在通过胰凝乳蛋白酶编号的c122没有修饰，和其催化活性部分，以及其修饰形式如聚乙二醇化形式，融合蛋白和其修饰形式。60.还提供治疗失调如dgf的方法，通过静脉内施用本文所述和提供的经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白(处于激活形式)进行，所述经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白包括包含seqidno:21和40‑44任一者所示的氨基酸残基序列，及其修饰形式如聚乙二醇化形式的经修饰的u‑pa多肽。单次剂量能由熟练的医师凭经验确定，包括范围为0.1mg‑1mg的单次剂量。剂量取决于对象、疾病或失调如dgf的严重度或阶段。治疗可重复多次，如一天2、3或4次，一天一次，每1天、2天、3天、4天、5天、6天、每周、每月两次(bi‑monthly)或每月重复。所述经修饰的u‑pa多肽可以是包含取代/插入的多肽，根据胰凝乳蛋白酶编号为r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r；以及根据成熟编号为r20q/h22y/r23e/v27e/t28y/v30r/d50p/y51q/t91i/l92a/h94q/c121s/y148r。其示例是含有seqidno:21所示蛋白酶结构域或其催化活性部分或者全长或前体形式(含有蛋白酶结构域)的经修饰的u‑pa多肽，和其修饰形式如聚乙二醇化形式及融合蛋白。施用可通过任何适当方法实现，包括静脉内、皮下、经皮、局部、肌肉内、口服和其他全身性施用途径。一般，本文所提供的经修饰的u‑pa多肽的施用形式是激活形式，其通常(取决于蛋白的组分(参见例如实施例15))是2链形式。61.本文以上和以下所述的方法包括通过将在本文中提供的经修饰的u‑pa多肽及其修饰形式如聚乙二醇化形式和融合蛋白，例如含有蛋白转导结构域的那些施用到眼治疗眼科失调或眼失调的方法。涉及补体激活的眼科失调、疾病或病症包括糖尿病视网膜病变和黄斑变性，如amd。剂量如上所述，且包括0.1mg‑1mg的单次剂量。经修饰的u‑pa多肽包括含有以下取代的那些：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r、y40q/v41l/l97ba/c122s或y40q/v41r/l97ba/c122s或y40q/v41l/l97ba或y40q/v41r/l97ba，和含有seqidno:21和40‑44任一者所示的氨基酸残基序列，和其催化活性部分以及其修饰形式的那些。治疗可重复多次，如一天一次。提供经修饰的u‑pa多肽和其修饰形式用于治疗amd或dgf的应用。经修饰的u‑pa多肽包括本文所述任意多肽，包括含有以下取代的那些：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r或r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/y149r或y40q/v41l/l97ba/c122s或y40q/v41r/l97ba/c122s或y40q/v41l/l97ba或y40q/v41r/l97ba，以及其修饰形式(其是如本文所述的聚乙二醇化或融合蛋白)。62.附图简要说明63.图1概述了经典、凝集素和替代补体途径以及末端补体复合物、膜攻击复合物(mac)的激活。该图描述超过30种参与补体级联的蛋白中的许多，其在级联内的作用，以及适用时，其在补体途径中的汇合点。例如，这3个途径在c3转化酶产生后汇集，该酶切割c3以形成c5转化酶，产生mac复合物。该图还描述许多补体切割产物的产生。64.图2a‑2b是n末端u‑pa融合蛋白的示意图。图2a是n末端u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域n末端的融合伴侣(即fc)。示范性n末端融合蛋白如seqidno:1004所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、fc(融合伴侣)、ags(接头)、u‑pa激活序列和经修饰的u‑pa催化结构域。图2b是不含融合伴侣的n末端野生型蛋白的示意图。示范性n末端野生型蛋白如seqidno:1005所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端、u‑pa激活序列和经修饰的u‑pa催化结构域。65.图3a‑3c是c末端u‑pa融合蛋白的示意图。图3a是c末端u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域c末端的融合伴侣，其中融合蛋白没有u‑pa催化结构域n末端的激活序列。示范性c末端融合蛋白如seqidno:1006所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1007所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(人血清白蛋白，作为融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1008所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和结合胶原蛋白ii的scfv(c2scfv)(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1009所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和habd(透明质酸结合域)(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1012所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、野生型u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1013所示，其含有人il2信号序列(hil2sp)、野生型u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。图3b是c末端u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域c末端的融合伴侣(即fc或hsa)。示范性c末端融合蛋白如seqidno:1010所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、弗林蛋白酶激活位点、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1016所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、弗林蛋白酶激活序列、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。图3c是u‑pa融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa催化结构域c末端的融合伴侣(即fc或hsa)以及u‑pa催化结构域n末端的融合伴侣(即野生型u‑pa的n末端)。示范性融合蛋白如seqidno:1011所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端结构域、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和fc(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1014所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端区、弗林蛋白酶激活位点、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。另一示范性c末端融合蛋白如seqidno:1015所示，其含有人免疫球蛋白轻链(κ)信号序列、u‑pa的n末端区、弗林蛋白酶激活位点、u‑pa激活序列、经修饰的u‑pa催化结构域、接头和hsa(融合伴侣)。66.图4a‑4h是融合蛋白的激活形式的示意图，其中spd指丝氨酸蛋白酶结构域(本文所提供经修饰u‑pa多肽蛋白酶结构域；u‑pa的n末端一般指u‑pa残基1‑178或其任何修饰形式)。图4a是seqidno:1010的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)c末端的fc结构域和弗林蛋白酶激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。图4b是seqidno:1011的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的fc结构域和所述蛋白n末端的u‑pa的n末端以及u‑pa激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。图4c是seqidno:1036所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的fc结构域和融合蛋白n末端的u‑pa的n末端以及弗林蛋白酶激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。图4d是seqidno:1014所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的hsa和融合蛋白n末端的u‑pa的n末端以及弗林蛋白酶激活序列。图4e是seqidno:1015所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)的c末端的hsa和融合蛋白n末端的u‑pa的n末端以及u‑pa激活序列。图4f是seqidno:1016所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的c末端的hsa和蛋白酶结构域n末端的弗林蛋白酶激活序列。图4f是seqidno:1017所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的c末端的hsa和蛋白酶结构域n末端的sumo激活序列。图4h是seqidno:1018所示的融合蛋白的示意图，所述融合蛋白含有u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的c末端的fc结构域和蛋白酶结构域n末端的u‑pa的n末端以及sumo激活序列，其中fc结构域之间的二硫键形成二聚体。67.发明详述68.概要69.a.定义70.b.u‑pa结构和功能71.1.丝氨酸蛋白酶72.2.结构73.3.功能/活性。74.c.通过靶向c3来抑制补体75.1.补体蛋白c3和其在起始补体中的作用76.a.经典途径77.b.替代途径78.c.凝集素途径79.d.补体介导的效应子功能80.i.补体介导的裂解：膜攻击复合物81.ii.炎症82.iii.趋化83.iv.调理作用84.v.激活体液免疫应答85.2.c3结构和功能86.a.c3a87.b.c3b88.c.c3b抑制剂89.d.切割c3的经修饰的u‑pa多肽90.1.示范性经修饰的u‑pa多肽91.2.额外修饰92.a.减少免疫原性93.b.fc结构域94.c.缀合聚合物95.d.蛋白转导结构域96.e.评价或监测u‑pa对补体介导的功能的活性的试验1.评价u‑pa对补体蛋白c3功能的活性的方法97.a.蛋白检测98.i.sds‑page分析99.ii.酶免疫试验100.iii.放射免疫扩散(rid)101.b.溶血试验102.c.确定切割位点的方法103.2.评价野生型u‑pa活性的方法104.a.切割纤溶酶原105.b.纤溶酶原活化试验106.c.u‑pa‑upar结合试验107.d.c3切割108.acc‑agr elisa109.用肽文库评价特异性110.3.特异性111.4.疾病模型112.f.编码其经修饰的u‑pa多肽的核酸生成方法113.1.分离或制备编码u‑pa多肽的核酸114.2.产生突变或修饰核酸及编码的多肽115.3.载体和细胞116.4.表达117.a.原核细胞118.b.酵母细胞119.c.昆虫和昆虫细胞120.d.哺乳动物表达121.e.植物122.5.纯化123.6.额外修饰124.a.聚乙二醇化125.b.融合蛋白和其它缀合物126.7.核酸分子127.g.组合物、制剂和剂量128.1.施用经修饰的u‑pa多肽129.2.施用编码经修饰的u‑pa多肽的核酸(基因治疗)。130.h.治疗应用和治疗方法131.1.补体激活介导的疾病132.a.类风湿性关节炎133.b.败血症134.c.多发性硬化135.d.阿尔茨海默氏病136.e.缺血再灌注损伤137.f.眼失调138.年龄相关的黄斑变性(amd)139.g.器官移植与移植肾功能延迟恢复(dgf)140.2.治疗应用141.a.免疫介导的炎症性疾病142.b.神经退行性疾病143.c.心血管疾病144.d.年龄相关的黄斑变性(amd)145.e.器官移植146.移植肾功能延迟恢复(dgf)147.3.联合疗法148.i.实施例149.a.定义150.除非另有定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解相同的意义。除非另有说明，本文完整公开内容引用的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、genbank序列、网址和其他发表的材料通过引用全文纳入。在本文术语有多种定义的情况下，以该章节的为准。涉及url或其他这类标识符或地址时，应理解这些标识符能改变且互联网上的特定信息可以来来去去，但已知等价信息并易获得，如通过搜索互联网和/或合适数据库。提及其证明了这类信息的可用性和公共传播性。151.如本文所用，切割指通过蛋白酶使肽键断裂。蛋白酶的切割位点基序涉及切割键n‑末端和c‑末端的残基(蛋白酶的切割位点定义为...p3‑p2‑p1‑p1'‑p2'‑p3'...，且切割在p1与p1'残基之间发生，则分别是无'的一侧和有'的一侧(unprimedandprimedsides))。在人中，通过c3转化酶切割在c3的残基r与s之间发生(参见seqidno:47的残基746‑751，在人c3的残基748与749之间切割)：152.p3ꢀꢀp2ꢀꢀp1ꢀꢀꢀp1'p2'p3'153.leualaarg↓serasnleu154.通常，生化途径中的底物切割是激活切割或抑制切割。激活切割指从失活形式切割多肽到活性形式。这包括例如切割酶原到活性酶。激活切割也是其中蛋白切割成一种或多种自身具有活性的蛋白的切割。例如，补体系统是蛋白裂解事件的不可逆级联，其终端导致多个效应分子形成，其刺激炎症、促进抗原吞噬作用和直接裂解一些细胞。因此，通过c3转化酶切割成c3a和c3b是激活切割。相反，本文提供的经修饰的u‑pa多肽实现c3的抑制切割，如通过在活性位点切割。155.如本文所用，抑制切割或灭活切割是将蛋白切割成一个或多个无功能的降解产物。抑制切割导致蛋白活性减少或降低。通常，蛋白活性降低会降低该蛋白参与的途径或过程。在一个示例中，任意一种或多种补体蛋白的切割(其是抑制切割)会导致补体经典、凝集素或替代功能途径的任意一种或多种的伴随降低或抑制。为了成为抑制性，切割使活性相较于蛋白天然形式下降至少或至少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。抑制切割所需的蛋白切割百分比在蛋白之间可变，但能通过分析蛋白活性来确定。156.如本文所用，“补体激活”指激活补体途径，例如补体激活指任意一种或多种补体途径的功能或活性被蛋白酶增加，或补体途径中的任意蛋白活性增加。补体激活能导致补体介导的细胞裂解或能导致细胞或组织破坏。宿主组织的不恰当补体激活在许多自身免疫疾病和炎症性疾病病理学中起重要作用，并且还引起许多与生物不相容性相关的疾病状态或与之相关联。应理解激活可指现有活性增加以及诱导新活性。补体激活可体外或体内发生。可测定并如本文所述的补体示范性功能包括溶血试验，测量任意一种或多种补体效应分子的试验，如通过sdspage然后进行蛋白质印迹或考马斯亮蓝染色或elisa。在一些实施方案中，相较于没有蛋白酶时的补体活性，补体激活被蛋白酶如本文所述蛋白酶抑制40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％或更多。157.如本文所用，“抑制补体激活”或“补体灭活”指任意一种或多种补体途径的补体介导的功能或活性被蛋白酶降低或减少，或途径中的任意蛋白活性降低或减少。补体功能或活性能体外或体内发生。可测定并如本文所述的补体示范性功能包括溶血试验，测量任意一种或多种补体效应分子的试验，如通过sdspage然后进行蛋白质印迹或考马斯亮蓝染色或elisa。蛋白酶能使补体激活抑制1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在其他实施方案中，相较于没有蛋白酶时的补体活性，补体激活被蛋白酶抑制40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％或更多。158.如本文所用，“补体蛋白”或“补体组分”是补体系统的蛋白，其在宿主防御感染和炎症过程中发挥作用。补体蛋白包括在经典途径、替代途径和凝集素途径中发挥作用的那些。补体蛋白包括参与补体途径的蛋白酶。159.如本文所用，补体蛋白包括任意“切割产物”(也称为“片段”)，其在补体级联激活后形成。补体蛋白还包括失活或改变形式的补体蛋白，如ic3b和c3a‑desarg。因此，补体蛋白包括但不限于：c1q、c1r、c1s、c2、c3、c3a、c3b、c3c、c3dg、c3g、c3d、c3f、ic3、c3a‑desarg、c4、c4a、c4b、ic4、c4a‑desarg、c5、c5a、c5a‑des‑arg、c6、c7、c8、c9、masp‑1、masp‑2、mbl、因子b、因子d、因子h、因子i、cr1、cr2、cr3、cr4、备解素、c1inh、c4bp、mcp、daf、cd59(mirl)、凝聚素和hrf以及任意补体蛋白的等位基因和物种变体。160.如本文所用，“天然”形式的补体蛋白在没有补体激活情况下分离自生物如脊椎动物，且没有被人在实验室中有意修改。天然补体蛋白示例包括c1q、c1r、c1s、c2、c3、c4、因子b、因子d、备解素、c5、c6、c7、c6和c9。161.一般，“天然补体蛋白”是失活的且在激活后获取活性。激活可能需要激活切割、成熟切割和/或与其他蛋白形成复合物。一个例外是天然形式具有酶活性的因子i和因子d。在一些示例中，天然补体蛋白的激活在蛋白切割后发生。例如，补体酶原如c3是蛋白酶，其自身通过蛋白酶切割活化，从而通过c3转化酶c4b2b切割c3可产生活性片段c3a和c3b。在另一示例中，切割失活天然补体蛋白导致蛋白结构稳定性变化，引起蛋白激活。例如，c3包含内部硫酯键，其在天然蛋白中稳定，但在蛋白切割导致构象变化后可能变成高反应性和活性。因此，c3切割产物具有生物活性。c3激活也能在没有切割情况下自发产生。天然c3中硫酯键的自发转换是补体替代途径的起始事件。另一示例中，天然补体蛋白的激活在复合调控分子释放后发生，该分子抑制另外活性天然补体的活性。例如，c1inh结合c1s和c1r并使之失活，除非其与c1q复合。162.如本文所用，“成熟切割”是通用术语，指酶原激活所需的任何切割。这包括导致构象变化的切割，其引起活性(即激活切割)。还包括其中关键结合位点暴露或位阻暴露或者抑制性区段被去除或移动的切割。163.如本文所用，“改变形式”的补体蛋白指以非天然形式存在的补体蛋白，该形式由其分子结构的修饰引起。例如，硫酯与水的c3反应能在没有转化酶切割的情况下发生，产生c3的水解失活形式，称为ic3。另一示例中，包括c3a、c5a和c4a在内的过敏毒素可通过羧肽酶n来脱精氨酸(desarginated)，变成更稳定、不太活跃的形式。164.如本文所用，补体蛋白的“片段”或“切割产物”是补体蛋白的区域或区段，其包含天然补体蛋白的多肽序列的部分。补体蛋白片段通常在补体级联激活后产生。一般，片段产生自天然补体蛋白的蛋白裂解切割。例如，补体蛋白c3通过c3转化酶酶促切割，产生2个片段：c3a，构成c3的n末端部分；和c3b，构成c末端部分且含有丝氨酸蛋白酶位点。补体蛋白片段还产生自另一补体蛋白片段的蛋白裂解切割。例如，c3b(产生自c3切割的片段)由因子i切割产生片段ic3b和c3f。一般，补体蛋白的切割产物是生物活性产物且作为补体系统的切割效应分子发挥作用。因此，补体蛋白片段或部分包括补体蛋白切割产物，以及所述蛋白的部分，其保留或显示至少一种补体蛋白活性。165.如本文所用，“切割效应分子”或“切割效应蛋白”指产生自补体系统激发酶级联的活性切割产物。补体激活引起的切割效应分子、片段或切割产物能有助于任意一种或多种补体介导的功能或活性，其包括调理作用、过敏性反应、细胞裂解和炎症。切割或效应分子示例包括但不限于c3a、c3b、c4a、c4b、c5a、c5b‑9和bb。补体系统的切割效应分子通过参与级联表现出活性，包括刺激炎症、促进抗原吞噬作用和直接裂解一些细胞。补体切割产物促进或参与补体途径激活。166.如本文所用，“过敏毒素”是切割效应蛋白，其激发肥大细胞或嗜碱粒细胞脱粒或物质从其释放，所述肥大细胞或嗜碱粒细胞参与炎症反应，尤其是作为抵御寄生虫的部分防御。如果脱粒过强，其能导致过敏反应。过敏毒素包括例如c3a、c4a和c5a。过敏毒素还间接介导平滑肌细胞痉挛(如支气管痉挛)，增加毛细血管渗透性以及趋化性。167.如本文所用，“趋化性”指受体介导的白血球向趋化因子移动，通常沿着其浓度增加的方向，如过敏毒素浓度增加的方向。168.如本文所用，“调理作用”指病原体或其他颗粒表面的改变，从而其能被吞噬细胞摄取。结合或改变病原体表面的蛋白被称为调理素。抗体和补体蛋白使胞外细菌易受调理，以用于吞噬细胞如中性粒细胞和巨噬细胞的摄取和破坏。169.如本文所用，“细胞裂解”指细胞通过破坏其壁或膜来裂开。红细胞溶血是细胞裂解的量度。170.如本文所用，“补体蛋白c3”或“c3”指补体系统的补体蛋白c3，在宿主防御感染和炎症过程中发挥作用。人补体蛋白c3是seqidno:47所示的1663氨基酸单链前原蛋白或酶原，其包含22氨基酸信号肽(seqidno:47的氨基酸1‑22)和四精氨酸序列(seqidno:47的氨基酸678‑671)，所述四精氨酸序列通过弗林蛋白酶样酶去除，产生成熟的2链蛋白，该蛋白含有通过残基c559与c816之间二硫键连接的β链(seqidno:47的氨基酸23‑667)和α链(seqidno:47的氨基酸672‑1663)。补体蛋白c3由seqidno:47氨基酸748与749之间的c3转化酶(c4b2b或c3bbb)通过蛋白裂解进一步激活，产生过敏毒素c3a和调理素c3b。171.如本文所用，“酶原”指通过蛋白裂解激活的蛋白，包括成熟切割如激活切割，和/或与其他蛋白和/或辅因子形成络合物。酶原是蛋白的失活前体。这类前体一般大于活性形式，尽管不必需更大。对于u‑pa或补体蛋白c3，酶原通过特异性切割转化成活性酶，包括催化和自催化切割，或是通过结合激活辅因子，其产生活性酶。因此，酶原是无酶活性的蛋白，其通过活化剂作用转换成蛋白水解酶。切割能自催化实现。一些补体蛋白是酶原；它们失活，但在感染后的补体系统起始之后被切割和激活。酶原一般无活性，能通过催化或自催化切割前区域(proregion)从酶原转化为成熟活性多肽。172.如本文所用，“前区域”、“前导肽”或“前序列”指被切割以产生成熟蛋白的蛋白区域或区段。这可包括功能是通过掩蔽催化组件(machinery)并因而防止形成催化中间物(即通过空间上封闭底物结合位点)抑制酶活性的区段。前区域是位于成熟生物活性多肽氨基末端的氨基酸序列，且能少至几个氨基酸或可以是多域结构。173.如本文所用，“激活序列”指酶原中的氨基酸序列，其是激活切割或成熟切割以形成活性蛋白酶所需的位点。激活序列切割可自催化或通过激活伴侣来催化。激活切割是成熟切割的一种类型，其中发生活性所需的构象变化。这是经典激活途径，例如对于丝氨酸蛋白酶，其中切割产生新的n末端，该末端与催化组件的保守区如催化残基相互作用，以诱导活性所需的构象变化。激活能引起多链形式蛋白酶生成。在一些情况中，单链形式蛋白酶可显示蛋白裂解活性。174.如本文所用，“结构域”指分子如蛋白或编码核酸的部分，其在结构和/或功能上不同于分子的其他部分并且可鉴别。示范性多肽结构域是多肽的部分，其能在的多肽内形成由一个或多个结构基序构成的独立折叠的结构(如通过环区域连接的α螺旋和/或β链的组合)和/或通过特定功能活性识别，如酶活性、二聚化或底物结合。多肽可具有一个或多个，通常多于一个不同结构域。例如，多肽可具有一个或多个结构域和一个或多个功能域。单一多肽结构域能基于结构和功能区分。结构域可涵盖氨基酸的连续线性序列。或者，结构域可涵盖多个非连续氨基酸部分，它们沿着多肽的氨基酸线性序列是非连续的。通常，多肽含有多个结构域。例如，丝氨酸蛋白酶能基于蛋白酶结构域序列表征。本领域技术人员熟悉多肽结构域且能通过与其他这类结构域的结构和/或功能同源性对其进行鉴定。对于本文的示例，提供定义，但应理解通过名称识别特定结构域完全在本领域技术范围内。需要时，合适的软件能用于鉴定结构域。175.如本文所用，多肽的“结构区域”是含有至少一个结构域的多肽区域。176.如本文所用，“蛋白酶结构域”是蛋白酶的催化活性部分。提及蛋白酶的蛋白酶结构域，包括单链、2链和多链形式的任意这些蛋白。蛋白的蛋白酶结构域含有蛋白就其蛋白裂解活性而言所需的所有必要特性，例如其催化中心。177.如本文所用，蛋白酶如u‑pa多肽的“催化活性部分”或“催化活性结构域”指蛋白酶结构域，或保留蛋白酶活性的其任何片段或部分。例如，u‑pa多肽的催化活性部分可以是u‑pa蛋白酶结构域，包括分离的单链形式蛋白酶结构域或激活的2链形式。显著的是，至少在体外，单链形式蛋白酶和催化结构域或其蛋白裂解活性部分(一般是c末端截短)显示蛋白酶活性。178.如本文所用，“编码蛋白酶结构域或蛋白酶催化活性部分的核酸”指仅编码所示举单链蛋白酶结构域或其活性部分的核酸，而没有蛋白酶的其他连续部分作为连续序列。179.如本文所用，基本由蛋白酶结构域组成的叙述意味着，仅多肽的部分是蛋白酶结构域或其催化活性部分。多肽可任选地或通常包括额外的非蛋白酶衍生的氨基酸序列。180.如本文所用，“蛋白酶活性位点”指发生底物催化的底物结合位点。活性位点的结构和化学性质允许底物识别和结合以及底物中切割键的后续水解和切割。蛋白酶活性位点含有有助于肽切割催化机制的氨基酸，如氨基酸glnhisalaargalaserhisleu(c3活性位点；seqidno:47的残基737‑744)以及有助于底物序列识别的氨基酸，如有助于延伸的底物结合特异性的氨基酸。例如，c3活性位点中的切割能抑制其活性，如：181.qhar↓ashl(seqidno:47的残基737‑744)182.p4p3p2p1↓p1'p2'p3'p4'.183.如本文所用，“底物识别位点”或“切割序列”指由蛋白酶活性位点识别的序列，其通过蛋白酶切割。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列是6个残基长度以匹配许多蛋白酶的延伸底物特异性，但根据蛋白酶可以更长或更短。一般，例如对于丝氨酸蛋白酶，切割序列由底物中的p1‑p4和p1’‑p4’氨基酸构成，其中切割在p1位置后发生。通常，丝氨酸蛋白酶的切割序列是6个残基长度以匹配许多蛋白酶的延伸的底物特异性，但根据蛋白酶可以更长或更短。184.如本文所用，“靶底物”指由蛋白酶切割的底物。通常，靶底物在其底物识别位点通过蛋白酶特异性切割。最低限度地，靶底物包括构成切割序列的氨基酸。任选地，靶底物包括含切割序列和任何其他氨基酸的肽。全长蛋白、等位基因变体、同种型或其含有蛋白酶所识别的切割序列的任意部分，是该蛋白酶的靶底物。例如，出于预期补体失活的本文目的，靶底物是补体蛋白c3，或其含有u‑pa多肽所识别的切割序列的任何部分或片段。这种靶底物可以是纯化蛋白，或能存在于混合物，如体外混合物或体内混合物。混合物可包括例如血液或血清，或其他组织液体。另外，靶底物包括肽或蛋白，含有不影响蛋白酶切割底物的额外部分。例如，靶底物可包括化学连接荧光部分的四氨基酸肽或全长蛋白。蛋白酶能修饰成显示对靶底物更高的底物特异性。185.如本文所用，“u‑pa”或“upa”或“u‑pa多肽”指任何u‑pa多肽，包括但不限于重组生成的多肽、合成生成的多肽和提取或分离自细胞或组织的u‑pa多肽，包括但不限于肝和血。就u‑pa而言可互换使用的替代名称包括尿激酶以及尿纤溶酶原激活物和尿激酶纤溶酶原激活物和尿型纤溶酶原激活物和尿激酶型纤溶酶原激活物。u‑pa包括来自不同物种的相关多肽，包括但不限于人和非人来源。人u‑pa包括u‑pa、等位基因变体、同种型、来自核酸的合成分子、分离自人组织及细胞的蛋白以及其修饰形式。示范性未修饰人u‑pa多肽包括但不限于未修饰和野生型天然成熟u‑pa多肽(seqidno:3)、包括前肽和/或信号肽的未修饰和野生型前体u‑pa多肽(如seqidno:1所示u‑pa多肽)及蛋白酶结构域(如seqidno:2所示的u‑pa蛋白酶结构域)。本领域技术人员会认识到，成熟u‑pa多肽(seqidno:3)的参考位置相较于前体u‑pa多肽(seqidno:1，其是含有信号肽序列的u‑pa多肽)差异20个氨基酸残基。因此，seqidno:3的第一个氨基酸残基“对应于”seqidno:1的第21个氨基酸残基。[0186]“u‑pa”涵盖激活或2链形式的u‑pa多肽，其包含通过残基148c与279c(对应于seqidno:3所示成熟u‑pa多肽)之间二硫键连接的n末端a链(seqidno:3的氨基酸1‑158)和c末端b链(seqidno:3的氨基酸159‑411)。2链形式或高分子量(hmw)u‑pa形成自成熟u‑pa多肽(如seqidno:3所示)，这是通过在氨基酸残基lys158之后、残基ile159之前的蛋白裂解。例如，蛋白裂解能通过纤溶酶、激肽释放酶、组织蛋白酶b、蛋白裂解酶和神经生长因子‑γ完成。本文提供的u‑pa多肽能进一步修饰，如化学修饰或翻译后修饰。这类修饰包括但不限于糖基化、聚乙二醇化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化以及本领域已知的其他多肽修饰。[0187]u‑pa包括来自任何物种的u‑pa，包括人和非人物种。非人来源的u‑pa多肽包括但不限于鼠、犬、野兔、禽类、牛、羊、猪和其他灵长类u‑pa多肽。示范性非人来源的u‑pa多肽包括例如小鼠(小家鼠(musmusculus)，seqidno:52)、大鼠(大家鼠(rattusnorvegicus)，seqidno:53)、牛(家牛(bostaurus)，seqidno:54)、猪(野猪(susscrofa)，seqidno:55)、兔(家兔(oryctolaguscuniculus)，seqidno:56)、鸡(原鸡(gallusgallus)，seqidno:57)、黄狒狒(草原狒狒(papiocynocephalus)，seqidno:58)、苏门答腊猩猩(苏门答腊猩猩(pongoabelii)，seqidno:59)、狗(狼(canislupus)，seqidno:60)、绵羊(家绵羊(ovisaries)，seqidno:61)、狨猴(普通狨(callithrixjacchus)，seqidno:62)、恒河猴(猕猴(macacamulatta)，seqidno:63)、北部白颊长臂猿(北白颊长臂猿(nomascusleucogenys)，seqidno:64)和黑猩猩(黑猩猩(pantroglodytes)，seqidno:65)。[0188]提及u‑pa多肽，还包括单链或2链形式的前体多肽和成熟u‑pa多肽、其具有活性的截短形式、经分离蛋白酶结构域，包括等位基因变体和物种变体、通过剪接变体编码的变体以及其他变体，包含与seqidno:1所示的前体多肽或其成熟形式(seqidno:3)或其蛋白酶结构域(seqidno:2)有至少或至少约40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。u‑pa多肽包括但不限于组织特异性同种型和其等位基因变体，通过翻译核酸制备的合成分子，通过化学合成产生的蛋白如包括经重组方法连接较短多肽的合成，分离自人和非人组织及细胞的蛋白，嵌合u‑pa多肽和其修饰形式。u‑pa多肽还包括u‑pa多肽片段或部分，其有足够长度或包括保留至少一种全长成熟多肽活性(若需要，在激活后)的合适区域。在一个示例中，u‑pa的部分是蛋白酶结构域，例如seqidno:2所示的蛋白酶结构域，其对应于seqidno:1所示的u‑pa序列的氨基酸179‑431。u‑pa多肽还包括含有化学或翻译后修饰的那些以及不含化学或翻译后修饰的那些。这类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟化、磷酸化、hes化(通过药物分子偶联生物可降解羟乙基淀粉(hes)来延长半衰期)、pas化(用由小l‑氨基酸pro、ala和/或ser构成的天然无序的生物合成聚合物经基因融合或化学偶联缀合药物活性化合物如蛋白、肽和低分子量药物)和本领域已知的其他多肽修饰。[0189]如本文所用，“u‑pa蛋白酶”或“u‑pa蛋白酶结构域”指任何u‑pa多肽，包括但不限于重组生成的多肽、合成生成的多肽和提取或分离自细胞或组织的u‑pa多肽，包括但不限于肝和血。u‑pa蛋白酶包括来自不同物种的相关多肽，包括但不限于人和非人来源的动物。人u‑pa蛋白酶或u‑pa蛋白酶结构域包括u‑pa、等位基因变体、同种型、来自核酸的合成分子、分离自人组织及细胞的蛋白以及其修饰形式。示范性参考人u‑pa蛋白酶结构域包括但不限于未修饰和野生型u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:2)和替代的蛋白酶结构域(如seqidno:5所示的u‑pa蛋白酶结构域)。本领域技术人员会认识到，u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:2)的参考位置相较于成熟u‑pa多肽(seqidno:1，其是含有全长wt序列的u‑pa多肽)差异178个氨基酸残基。因此，seqidno:2的第一个氨基酸残基“对应于”seqidno:1的第179个氨基酸残基。[0190]如本文所用，“修饰”涉及多肽的氨基酸序列或核酸分子中的核苷酸序列的修饰，且分别包括氨基酸或核苷酸的缺失、插入和取代。修饰多肽的方法对本领域技术人员而言是常规的，如采用重组dna方法。在多肽氨基酸序列修饰与多肽修饰之间有区别。前者指氨基酸的插入、缺失和取代或置换；后者指多肽修饰，如翻译后修饰、聚乙二醇化和其他这类蛋白修饰以改变性质和/或活性。[0191]如本文所用，“置换”或“取代”指天然、靶标、野生型或其他核酸或多肽序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸被替代的核苷酸或氨基酸取代，而没有改变分子长度(如残基数所述)。因此，分子中的一个或多个置换不改变分子的氨基酸残基或核苷酸数目。相较于特定多肽的氨基酸取代可以沿着多肽序列长度的氨基酸残基数的形式表示。例如，在氨基酸序列第35个位置处有精氨酸(arg；r)被谷氨酰胺(gln；q)置换/取代的氨基酸修饰的修饰多肽，可以r35q、arg35gln或35q表示。简单地，r35能用于指示经修饰第35个位置处的氨基酸是精氨酸。[0192]如本文所用，“经修饰的u‑pa”或“经修饰的u‑pa多肽”指相较于未修饰形式显示活性改变的u‑pa蛋白酶，如底物特异性改变。这种蛋白酶包括相较于野生型u‑pa的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个修饰(即氨基酸变化)，从而u‑pa蛋白酶就切割补体蛋白c3而言的活性如底物特异性或选择性改变。经修饰的u‑pa可以是全长u‑pa蛋白酶，或可以是全长蛋白酶的部分，如u‑pa的蛋白酶结构域，只要经修饰的u‑pa蛋白酶在区域中包含改变蛋白酶活性或底物特异性的修饰且蛋白酶具有蛋白裂解活性。经修饰的u‑pa蛋白酶或经修饰的u‑pa蛋白酶结构域还可在区域中包括不影响蛋白酶底物特异性的其他修饰。因而，经修饰的u‑pa多肽通常具有与野生型u‑pa多肽对应氨基酸序列60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。经修饰的全长u‑pa多肽或者经修饰的u‑pa多肽的催化活性部分或其蛋白酶结构域可包括作为融合蛋白的多肽，只要融合蛋白具有靶特异性。[0193]如本文所用，胰凝乳蛋白酶编号指seqidno:76的成熟胰凝乳蛋白酶多肽的氨基酸编号。另一蛋白酶的蛋白酶结构域例如u‑pa蛋白酶结构域能与胰凝乳蛋白酶进行比对。这种示例中，对应于胰凝乳蛋白酶氨基酸的u‑pa多肽氨基酸根据胰凝乳蛋白酶氨基酸编号给出。对应位置可通过这样的比对如下确定：由本领域技术人员用手工比对或采用许多可获得的比对程序(如blastp)。对应位置还能基于结构比对，例如用计算机模拟比对蛋白结构。列举多肽的氨基酸对应于公开序列的氨基酸，涉及用标准比对算法如gap算法将多肽与公开序列比对后鉴定的氨基酸，以最大化相同性或同源性(其中匹配保守氨基酸)。表1中提供了seqidno:3所示的u‑pa多肽氨基酸位置159‑411对应的胰凝乳蛋白酶的编号。相对于seqidno:3所示的序列的氨基酸位置采用常规字体，这些位置处的氨基酸残基采用粗体，对应的胰凝乳蛋白酶编号采用斜体。例如，u‑pa的丝氨酸蛋白酶结构域(seqidno:2)与成熟胰凝乳蛋白酶比对后，u‑pa中159位的异亮氨酸(i)以i16的胰凝乳蛋白酶编号给出。后续氨基酸相应编号。在一个示例中，成熟u‑pa(seqidno:3)的氨基酸位置173处的苯丙氨酸(f)根据胰凝乳蛋白酶编号对应氨基酸位置f30。如果残基存在于蛋白酶但不存在于胰凝乳蛋白酶时，氨基酸残基以字母符号给出。例如，胰凝乳蛋白酶中残基是具有基于胰凝乳蛋白酶编号的氨基酸60环的一部分，但相较于胰凝乳蛋白酶在u‑pa序列中是插入的，所述残基称为例如d60a、y60b或p60c。这些残基相对于seqidno:3所示成熟u‑pa序列编号分别对应d208、y209和p210。[0194]表1.u‑pa的胰凝乳蛋白酶编号[0195][0196][0197]如本文所用，kcat测量酶的催化活性；kcat单位是秒‑1。kcat的倒数是酶分子“周转(turnover)”一个底物分子所需的时间；kcat测量每秒周转的底物分子数/酶分子。kcat有时称为周转数。在酶学中，kcat(也称为周转数)是每秒底物分子的化学转化最大数，这是单一催化位点就给定酶实施的。当所有酶催化位点用底物饱和时，这是反应最大速度(vmax)。[0198]如本文所用，靶底物的特异性指相较于称为非靶底物的另一底物，蛋白酶偏好切割靶底物。特异性反映于特异性常数(kcat/km)，其是蛋白酶对其底物亲和性及酶效率的量度。kcat/km是酶效率的量度；大数值kcat(迅速周转)或小数值km(底物高亲和性)使得kcat/km大。[0199]如本文所用，切割的特异性常数是(kcat/km)，其中km是米氏常数(一半vmax处的[s])且kcat是vmax/[et]，et是最终的酶浓度。参数kcat、km和kcat/km可如下计算：绘制底物浓度倒数vs底物切割速度倒数的图，拟合到lineweaver‑burk方程(1/速度＝(km/vmax)(1/[s]) 1/vmax；其中vmax＝[et]kcat)。存在多种底物浓度下，确定切割随着时间增加的速度的任何方法能用于计算特异性常数。例如，底物连接荧光部分，其在蛋白酶切割后释放。通过确定不同酶浓度下的切割速度，能测定特定酶的kcat。特异性常数能用于确定蛋白酶对一种靶底物相比于另一底物的优先性。[0200]如本文所用，底物特异性指蛋白酶对靶底物相比于另一底物的优先性。底物特异性能作为特异性常数比例测量。[0201]如本文所用，底物特异性比例是特异性常数比例且能用于比较2种或更多蛋白酶的特异性或者蛋白酶对2个或更多底物的特异性。例如，蛋白酶对于竞争底物的底物特异性或竞争性蛋白酶对于一种底物的底物特异性能通过比较kcat/km来对比。例如，蛋白酶对靶底物的特异性常数是2x106m‑1sec‑1，对非靶底物是2x104m‑1sec‑1，对靶底物的特异性更高。使用上述特异性常数，蛋白酶对靶底物的底物特异性比例是100。[0202]如本文所用，对靶底物的优先性或底物特异性能以底物特异性比例表示。反映优先性的该比例具体值是所讨论的底物和蛋白酶函数。大于1的底物特异性比例表明对靶底物的优先性，小于1的底物特异性表明对非靶底物的优先性。一般，至少为或约为1的比例反映对于待考虑为候选治疗剂的蛋白酶的足够的差异。[0203]如本文所用，改变的特异性指经修饰蛋白酶相较起始野生型蛋白酶的底物特异性变化。一般，特异性变化反映相较蛋白酶的野生型底物(本文称为非靶底物)，经修饰的蛋白酶对靶底物的优先性变化。通常，本文提供的经修饰的u‑pa蛋白酶显示对补体蛋白c3的底物特异性相较于野生型u‑pa蛋白酶的底物特异性增加。例如，对靶底物相比于非靶底物的底物特异性比例为100的经修饰蛋白酶，相较于底物特异性比例为10的支架蛋白酶表现出10倍增加的特异性。另一示例中，底物特异性比例为1的经修饰的蛋白酶相较于0.1的比例，表现出底物特异性增加10倍。为显示特异性相较于骨架蛋白酶上升，经修饰的蛋白酶对任意一种或多种补体蛋白的底物特异性提高1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更大。[0204]如本文所用，“选择性”指蛋白酶从竞争底物混合物中选择和切割靶底物的能力时，能与特异性互换使用。例如，蛋白酶对靶底物相较任何其他一个或多个靶底物的选择性可通过比较蛋白酶切割靶底物的特异性常数来确定。例如，若蛋白酶对靶底物的切割特异性常数为2x106m‑1sec‑1且对任何其他一个或多个靶底物为2x104m‑1sec‑1，蛋白酶对靶底物更具有选择性。[0205]如本文所用，多肽如蛋白酶的“活性”或“功能活性”指多肽显示的任何活性。这种活性能凭经验确定。示范性活性包括但不限于与生物分子相互作用的能力，例如经底物‑结合、dna结合或二聚化，酶活性例如激酶活性或蛋白裂解活性。对于蛋白酶(包括蛋白酶片段)，活性包括但不限于特异性结合特定底物的能力，底物‑结合的亲和性和/或特异性(如高或低亲和性和/或特异性)，效应功能如促进底物(如蛋白，即c3)抑制、中和、切割或清除的能力，以及体内活性如促进蛋白切割或清除的能力。活性能体外或体内评价，使用公认的试验如elisa、流式细胞术、表面等离子体共振或测量缔合或解离速率(on‑oroff‑rate)的等价试验、免疫组化及免疫荧光组织学和显微镜检查、基于细胞的试验和结合试验。例如，对于蛋白酶如经修饰的u‑pa蛋白酶，可通过体外和/或体内测量底物蛋白切割、周转、剩余活性、稳定性和/或水平来评价活性。这种表明多肽显示活性的体外试验结果可能与体内多肽活性相关，其中体内活性能称为治疗活性或生物活性。经修饰的多肽的活性可以是未修饰多肽活性的任意水平的百分比，包括但不限于相较于未修饰多肽1％或约1％的活性，2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的活性。确定经修饰的(或变体)蛋白酶功能或活性的试验为本领域熟知。[0206]功能活性包括但不限于生物活性、催化或酶活性、抗原性(结合抗多肽抗体或与多肽竞争结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、特异性结合多肽受体或配体的能力。[0207]如本文所用，涉及补体蛋白的功能活性指补体介导的功能，包括但不限于过敏性、调理作用、趋化性或细胞裂解。测试补体活性的试验示例包括红细胞溶血以及检测补体效应分子，如通过elisa或sds‑page。[0208]如本文所用，催化活性或切割活性指体外蛋白裂解试验中评价的蛋白酶活性，所述试验检测选定底物的蛋白裂解。通过评价蛋白酶催化效率，可测量切割活性。[0209]如本文所用，针对靶底物的活性指切割活性和/或功能活性，或反映蛋白酶在靶底物上或对其活性的其他量度。蛋白酶对补体蛋白靶底物的功能活性能如下测量：在补体试验如红细胞溶血或者本领域技术人员已知或本文所提供其他这类试验中评估ic50，以评价补体活性。通过评价蛋白酶催化效率，可测量切割活性。出于本文目的，相较没有蛋白酶时，如果蛋白酶显示对靶靶底物的更高蛋白裂解或切割和/或调节(即激活或抑制)补体蛋白功能活性，则活性增加。[0210]如本文所用，涉及经修饰的u‑pa多肽的“活性增加”指，在相同条件下测试时，经修饰的u‑pa多肽相较于不含氨基酸取代的未修饰的u‑pa多肽，显示活性更高。例如，经修饰的u‑pa多肽表现出至少或至少约110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多的未修饰参考u‑pa多肽活性。[0211]如本文所用，术语“相同”用于指抗体结合亲和性时，意味着ec50、缔合常数(ka)或解离常数(kd)在参考抗体的1‑100倍或1‑10倍范围内(亲和性比参考抗体高1‑100倍或亲和性低1‑100倍，或这些范围内的任何数值或范围或值)。[0212]如本文所用，“结合活性”指分子如多肽的特征，涉及其是否或如何结合一个或多个结合伴侣。结合活性包括与结合伴侣结合的能力，与结合伴侣结合的亲和性(如高亲和性)，与结合伴侣的键强度和/或与结合伴侣结合的特异性。[0213]如本文所用，ec50也称为表观kd，是在固定量底物上观察到50％最大活性的蛋白酶浓度(如nm)(例如，切割50％可用的hc3所需的经修饰的u‑pa多肽的浓度)。通常，ec50值确定自s形剂量反应曲线，其中ec50是拐点处的浓度。蛋白酶对其底物的高亲和性与低ec50值相关，低亲和性则对应高ec50值。亲和性常数可通过用于蛋白酶反应的标准动力学方法确定，例如免疫测定如elisa，然后进行曲线拟合分析。[0214]如本文所用，“亲和性常数”指缔合常数(ka)，用于测量蛋白酶与底物之间的亲和性或分子结合强度。亲和性常数越高，蛋白酶对底物的亲和性越高。亲和性常数以摩尔浓度倒数(即m‑1)单位表示，且能计算自缔合及解离反应的速度常数，如用于蛋白酶‑底物反应的标准动力学方法所测(例如免疫测定、表面等离子体共振或本领域已知的其他动力学相互作用分析)。蛋白酶的结合亲和性还可以解离常数或kd表示。解离常数是缔合常数的倒数，kd＝1/ka。因此，亲和性常数还能由kd表示。亲和性常数可通过用于蛋白酶反应的标准动力学方法确定，例如免疫测定、表面等离子体共振(spr)(rich和myszka(2000)curr.opin.biotechnol11:54；englebienne(1998)analyst.123:1599)、等温滴定量热法(itc)或本领域已知的其他动力学相互作用分析(参见例如paul编,fundamentalimmunology,第2版,纽约的raven出版社(ravenpress),第332‑336页(1989))。已知用于实时检测和监测结合速度的仪器及方法并且市售可得(例如，biacore2000,biacoreab,瑞典乌普萨拉和通用电气医疗集团生命科学部门(gehealthcarelifesciences)；malmqvist(2000)biochem.soc.trans.27:335)[0215]熟知用于计算亲和性的方法，如确定ec50值的方法或确定缔合/解离常数的方法，包括本文示例的那些。例如，关于ec50，高结合亲和性指特异性结合靶蛋白的蛋白酶，ec50小于约10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、1ng/ml或更小。高结合亲和性也可通过平衡解离常数为10‑6m或更低来鉴定，如10‑7m、10‑8m、10‑10m、10‑11m或10‑12m或更低。在平衡缔合常数(ka)方面，高结合亲和性一般与ka值相关，ka值大于或等于约106m‑1、大于或等于约107m‑1、大于或等于约108m‑1、或大于或等于约109m‑1、1010m‑1、1011m‑1或1012m‑1。亲和性能凭经验估计或亲和性能相对确定，例如通过比较2个或更多抗体对特定抗原的亲和性，如，通过成对计算所测试抗体的亲和性比例。例如，这种亲和性易用常规技术测定，如elisa；平衡透析；表面等离子体共振；用放射性标记靶抗原的放射免疫分析；或技术人员已知的另一方法。可分析亲和性数据，例如通过scatchard等,annn.y.acad.sci.,51:660(1949)的方法或曲线拟合分析，例如采用4参数逻辑非线性回归模型，用方程y＝((a‑d)/(1 ((x/c)^b))) d，其中a是最小渐近线，b是斜率因数，c是拐点(ec50)，而d是最大渐近线。[0216]如本文所用，“ed50”是蛋白酶(如经修饰的u‑pa)的剂量(如mg/kg或nm)，其在50％的总群体(如样品中存在的c3总量)中生成指定结果(如切割补体蛋白c3)。[0217]如本文所用，术语“表面等离子体共振”指光学现象，允许通过检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度变化来分析实时相互作用，例如使用biacore系统(通用电气医疗集团生命科学部门)。[0218]如本文所用，人蛋白由存在于人基因组的核酸分子如dna编码，包括所有等位基因变体和其保守变化。如果修饰是基于人蛋白的野生型或突出序列，则蛋白变体或修饰是人蛋白。[0219]如本文所用，天然产生的α‑氨基酸残基是自然界中发现的这20个α‑氨基酸残基，其通过特异识别带电trna分子与其在人中的同源mrna密码子来纳入蛋白。[0220]如本文所用，非天然产生的氨基酸指非基因编码的氨基酸。[0221]如本文所用，“核酸”指至少2个相关的核苷酸或核苷酸衍生物，包括脱氧核糖核苷酸(dna)和核糖核苷酸(rna)及其类似物，它们通常经磷酸二酯键连接在一起。术语“核酸”还包括核酸如肽核酸(pna)、硫代磷酸dna的类似物，以及其他这种类似物和其衍生物或组合。核酸还包括dna和rna衍生物，含有例如核苷酸类似物或磷酸二酯键以外的“主干”键，例如磷酸三酯键、氨基磷酸酯键、硫代磷酸键、硫酯键或肽键(肽核酸)。术语还包括rna或dna的等价物、衍生物、变体和类似物，所述rna或dna制备自核苷酸类似物、单链(有义或反义)和双链核酸。脱氧核糖核苷酸包括脱氧腺苷,脱氧胞苷,脱氧鸟苷和脱氧胸苷。对于rna，尿嘧啶碱基是尿苷。核酸可以是单链或双链的。当涉及探针或引物(其任选地是如用可检测标记如荧光或放射性标记来标记的)时，考虑单链分子。这类分子通常具有一定长度，从而其靶标在统计上独特或有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)以用于探针识别(probing)或引物识别(priming)文库。一般，探针或引物包含至少14、16或30个连续核苷酸，序列与感兴趣基因互补或相同。探针和引物长度可以是10、20、30、50、100或更多个核苷酸。[0222]如本文所用，“经分离的核酸分子”与所述核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分开。“经分离”的核酸分子如cdna分子能在通过重组技术生成时几乎没有其他细胞材料或培养基，或在化学合成时几乎没有化学前体或其他化学物。本文提供的示范性经分离的核酸分子包括编码所提供的u‑pa蛋白酶的经分离的核酸分子。[0223]如本文所用，“合成”涉及例如合成核酸分子或合成基因或合成肽时，指通过重组方法和/或化学合成方法生成的核酸分子或多肽分子。[0224]如本文所用，“多肽”指2个或更多共价连接的氨基酸。术语“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用。[0225]如本文所用，“肽”指长度为2‑约40个氨基酸的多肽。[0226]如本文所用，在本文所提供多种氨基酸序列中出现的氨基酸根据其已知、三字母或一字母缩写鉴定(表2)。多个核酸片段中出现的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名法指定。[0227]如本文所用，“氨基酸”是含有氨基和羧酸基的有机化合物。多肽包含2个或更多氨基酸。出于本文目的，氨基酸包括20个天然存在的氨基酸(表2)、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即α‑碳具有侧链的氨基酸)。如本文所用，在本文所呈现多个多肽氨基酸序列中出现的氨基酸根据其熟知、三字母或一字母缩写鉴定(表2)。在多个核酸分子和片段中出现的核苷酸用本领域常规使用的标准单字母命名法指定。[0228]如本文所用，“氨基酸残基”指多肽在其肽键化学消化(水解)后形成的氨基酸。本文所述氨基酸残基推定为采用“l”异构形式。如此命名的“d”异构形式中的残基能取代任何l‑氨基酸残基，只要多肽保留所需功能性质。nh2指多肽氨基末端存在的游离氨基。cooh指多肽羧基末端存在的游离羧基。与j.biol.chem.,243:3557‑3559(1968)所述的标准多肽命名一致且如37c.f.r.§§1.821‑1.822所采用，氨基酸残基的缩写如表2所示：[0229]表2–对应表[0230][0231][0232]本文通过公式所示的全部氨基酸残基序列具有氨基末端到羧基末端常规方向的从左向右定向。短语“氨基酸残基”包括对应表(表2)所示氨基酸、修饰、非天然和不常见的氨基酸。此外，氨基酸残基序列开始或结束处的破折号指示肽键，结合一个或多个氨基酸残基的进一步序列或者氨基末端基团如nh2或羧基末端基团如cooh。[0233]如本文所用，“天然存在的氨基酸”指多肽中存在的20个l‑氨基酸。如本文所用，天然产生的α‑氨基酸残基是自然界中发现的这20个α‑氨基酸残基，其通过用人的mrna密码子特异识别携带其的trna分子纳入蛋白，所述密码子与所述trna是同源(cognate)的。[0234]如本文所用，“非天然氨基酸”指结构与天然氨基酸类似，但经结构上修饰以模拟天然氨基酸结构和反应性的有机化合物。因此，非天然产生的氨基酸包括例如20个天然产生氨基酸以外的氨基酸或氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的d‑立体异构体。本领域技术人员已知示范性非天然氨基酸，包括但不限于对乙酰苯丙氨酸、对叠氮苯丙氨酸、2‑氨基己二酸(aad)、3‑氨基己二酸(baad)、β‑丙氨酸/β–氨基‑丙酸(bala)、2‑氨基丁酸(abu)、4‑氨基丁酸/哌啶酸(4abu)、6‑氨基己酸(acp)、2‑氨基庚酸(ahe)、2‑氨基异丁酸(aib)、3‑氨基异丁酸(baib)、2‑氨基庚二酸(apm)、2,4‑二氨基丁酸(dbu)、锁链素(des)、2,2'‑二氨基庚二酸(dpm)、2,3‑二氨基丙酸(dpr),n‑乙基甘氨酸(etgly)、n‑乙基天冬酰胺(etasn)、羟赖氨酸(hyl)、别羟赖氨酸(ahyl)、3‑羟脯氨酸(3hyp)、4‑羟脯氨酸(4hyp)、异锁链素(ide)、别异亮氨酸(aile)、n‑甲基甘氨酸、肌氨酸(megly)、n‑甲基异亮氨酸(meile)、6‑n‑甲基赖氨酸(melys)、n‑甲基缬氨酸(meval)、正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)和鸟氨酸(orn)。示范性非天然氨基酸如本文所述且为本领域技术人员已知。[0235]如本文所用，等动力混合物是其中氨基酸摩尔比根据其报告的反应速度调整(参见例如ostresh等.(1994)biopolymers34:1681)的混合物。[0236]如本文所用，dna构建体是单链或双链、线性或环状dna分子，其包含以自然界未发现形式组合及并列的dna区段。dna构建体作为人为操作的结果存在，包括所操纵分子的克隆和其他拷贝。[0237]如本文所用，dna区段是具有指定属性的较大dna分子部分。例如，编码指定多肽的dna区段是较大dna分子部分，如质粒或质粒片段，其从5’到3’方向阅读时，编码指定多肽的氨基酸序列。[0238]如本文所用，术语直系同源物指获自一个物种的多肽或蛋白，其是来自不同物种的多肽或蛋白的功能对应物。直系同源物之间的序列差异是物种形成的结果。[0239]如本文所用，术语多核苷酸指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单或双链聚合物，从5’到3’末端阅读。多核苷酸包括rna和dna，且能分离自天然来源，体外合成，或制备自天然和合成分子的组合。多核苷酸分子的长度在本文中以核苷酸(缩写“nt”)或碱基对(缩写“bp”)给出。上下文允许时，术语核苷酸用于单和双链分子。当术语应用于双链分子时，其用于指示总长度且应理解为等同于术语碱基对。本领域技术人员应理解双链多核苷酸的2条链可能长度略有差异，其末端能交错；因而双链多核苷酸分子内的所有核苷酸无法配对。这种未配对末端一般不超过20个核苷酸长度。[0240]如本文所用，序列比对指使用同源性以匹配核苷酸或氨基酸的2种或更多序列。通常，以50％或更高相同性相关的2条或更多序列是匹配的。一组匹配的序列指在相应位置匹配的2条或更多序列，且能包括衍生自rna的匹配序列，如与基因组dna序列匹配的est和其他cdna。相关或变异多肽或核酸分子能通过本领域技术人员已知的任何方法比对。这类方法通常使匹配最大化，且包括方法如使用手动比对和采用多种可用的比对程序(例如blastp)以及本领域技术人员已知的其他方法。通过比对多肽或核酸序列，本领域技术人员能鉴定类似部分或位置，使用保守和相同氨基酸残基作为指导。此外，本领域技术人员还能采用保守氨基酸或核苷酸残基作为指导以发现人与非人序列之间的对应氨基酸或核苷酸残基。对应位置还能基于结构比对，例如用计算机模拟比对蛋白结构。其他示例中，可鉴定对应区域。本领域技术人员还能采用保守氨基酸残基作为指导以发现人与非人序列之间的对应氨基酸残基。[0241]如本文所用，“序列相同性”指在测试与参考多肽或多核苷酸比较中相同或相似的氨基酸或核苷酸碱基数目。序列相同性能能通过核酸或蛋白序列比对确定，以鉴定相似或一致的区域。出于本文目的，序列相同性一般通过比对确定，以鉴定相同残基。比对可以是局部或全部。匹配、错配和缺口能在对比序列之间鉴定。缺口是比对序列残基之间插入的无效氨基酸或核苷酸，从而比对相同或相似特性。一般，可以有内部和末端缺口。通过考虑缺口作为相同残基数/最短序列长度x100，可确定序列相同性。用缺口罚分时，序列相同性能用无末端缺口罚分(如末端缺口未受罚)确定。或者，确定序列相同性可不考虑缺口作为相同位置数/总比对序列长度x100。[0242]如本文所用，“在对应于……的位置”或者核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开如序列标所示序列的核苷酸或氨基酸位置，指用标准对准算法如gap算法与所公开序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置，以最大化相同性。出于本文目的，u‑pa序列与seqidno:2或5所示人u‑pa蛋白酶结构域的氨基酸序列比对，尤其是seqidno:5的参考人u‑pa。通过比对序列，本领域技术人员能鉴定对应残基，例如用保守和相同的氨基酸残基作为指导。一般，为鉴定对应位置，比对氨基酸序列，从而获得最高等级匹配(参见例如：《计算分子生物学》(computationalmolecularbiology),lesk,a.m.编,纽约牛津大学出版社(oxforduniversitypress),1988；《生物计算：信息学和基因组计划》(biocomputing:informaticsandgenomeprojects),smith,d.w.编,纽约学术出版社(academicpress),1993；《序列数据的计算机分析，第i部分》(computeranalysisofsequencedata,parti),griffin,a.m.,和griffin,h.g.编,新泽西州胡马纳出版社(humanapress),1994；《分子生物学的序列分析》(sequenceanalysisinmolecularbiology),vonheinje,g.,学术出版社,1987；和《序列分析引物》(sequenceanalysisprimer),gribskov,m.和devereux,j.编,纽约mstockton出版社(mstocktonpress),1991；和carillo等.(1988)siamjappliedmath48:1073)。或者，技术人员能通过胰凝乳蛋白酶编号给残基编号，从而鉴定对应残基。对于密切相关的序列，不需要计算机算法；比对可目测完成。[0243]如本文所用，“全局比对”是将2种序列从开始到结束比对的比对，各序列中的各字母仅一次对准。产生对准，无论序列之间是否有相似性或相同性。例如，基于“全局比对”的50％序列相同性意味着，在各100个核苷酸长度的2种对比序列全序列的比对中，50％残基相同。应理解，甚至当对准序列长度不同时，全局比对还能用于确定序列相同性。序列末端差异考虑用于确定序列相同性，除非选择“末端缺口没有罚分”。一般，全局比对用于在其大部分序列中共有显著相似性的序列。用于进行全局比对的示范性算法包括needleman‑wunsch蒜贩(needleman等.(1970)j.mol.biol.48:443)。进行全局比对的示范性程序公开可得且包括美国国家生物技术信息中心(ncbi)网址(ncbi.nlm.nih.gov/)可得的全局序列比对工具和deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可得的程序。[0244]如本文所用，“局部比对”是比对2条序列的比对，但仅比对有相似性或相同性的这些序列部分。因此，局部比对可确定一种序列的亚区段是否存在于另一序列。如果没有相似性，没有比对返回。局部比对算法包括blast和smith‑waterman算法(adv.appl.math.2:482(1981))。例如，基于“局部比对”的50％序列相同性指，在任意长度的2条所对比的序列全序列的比对中，有100个核苷酸长度相似性或相同性的区域具有在相似或相同区域中相同的50％残基。[0245]出于本文目的，序列相同性能通过标准比对程序确定，使用各供应商确立的默认缺口罚分。gap程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(包含1的值用于相同性和0用于非相同性)和gribskov等.(1986)nucl.acidsres.14:6745的加权比较矩阵，如schwartzanddayhoff编,《蛋白质序列与结构图谱》(atlasofproteinsequenceandstructure),nationalbiomedicalresearchfoundation,第353‑358页(1979)所述；(2)各缺口的罚分3.0和各缺口各符号的额外罚分0.10；和(3)末端缺口没有罚分。无论任意2种核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”的核苷酸序列或者任意2种多肽具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％“相同”的氨基酸序列，或列举相同性百分比的其他类似变化，能用基于局部或全局比对的已知计算机算法确定(参见例如wikipedia.org/wiki/sequence_alignment_software,提供几十种已知和公开可得比对数据库及程序的链接)。一般，出于本发明目的，序列相同性用基于全局比对的计算机算法确定，如needleman‑wunsch全局序列比对工具，可获自ncbi/blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？cmd＝web&page_type＝blasthome)；lalign(williampearson实施huang和milleralgorithm(adv.appl.math.(1991)12:337‑357))；和来自xiaoquihuang的程序，可获自deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html。一般，当比较本文的核苷酸序列时，使用末端缺口罚分的比对。当对比的序列基本长度相同时，还能使用局部比对。[0246]如本文所用，术语“相同性”代表测试与参考多肽或多核苷酸之间的比较或比对。在一个非限制性示例中，“至少90％相同”指相对于参考多肽或多核苷酸，90％‑100％的相同性百分比。90％或更高的相同性水平指示，假定就示范目的而言，比较100个氨基酸或核苷酸的测试和参考多肽或多核苷酸长度，测试多肽或多核苷酸中不超过10％(即100中的10)的氨基酸或核苷酸不同于参考多肽。类似比较能在测试与参考多核苷酸之间进行。这种差异能表示为完整氨基酸序列长度上随机分布的点突变，或其能在不同长度的一个或多个位置聚集，多至最大可允许程度，如10/100氨基酸差异(约90％相同性)。差异也可能归因于氨基酸残基缺失或截短。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。根据所对比序列的长度，在高于约85‑90％同源性或相同性的水平，结果能独立于程序和缺口参数组；这种高水平相同性易评价，通常不依赖于软件。[0247]如本文所用，二硫键(也称为s‑s键或二硫桥)是共价单键，衍生自巯基偶联。蛋白中的二硫键在半胱氨酸残基的巯基之间形成，并且稳定多肽结构域之间的相互作用。[0248]如本文所用，“偶联”或“缀合”指经共价或非共价相互作用附着。本文提供的缀合物包含经修饰的u‑pa多肽蛋白酶结构域(称为“spd”，参见例如图4)，所有或部分剩余u‑pa多肽直接连接或经接头连接另一部分，如赋予某一特性的多肽，例如血清半衰期增加(人血清白蛋白hsa)或促进表达或纯化(即sumo,his‑sumo,tsg‑6)或使蛋白靶向受体如结合受体的抗体。多肽能直接连接或经多肽接头连接，一般较短，约4‑20个氨基酸，如ser和gly残基的组合。包含多肽的缀合物一般是融合蛋白。缀合物还包括经修饰的u‑pa多肽，其中氨基酸残基连接部分如peg部分、糖基化部分和其他这类部分。[0249]如本文所用，“引物”指核酸分子，其能在合适条件(例如存在4种不同的三磷酸核苷和聚合剂如dna聚合酶、rna聚合酶或逆转录酶)、合适缓冲液和适当温度下，用作模板导向dna合成的起始点。技术人员应理解某些核酸分子能用作“探针”和“引物”。然而，引物具有3’羟基用于延伸。引物能用于多种方法，包括例如聚合酶链式反应(pcr)、逆转录酶(rt)‑pcr、rnapcr、lcr、多重pcr、锅柄pcr、捕获pcr、表达pcr、3'和5'race、原位pcr、连接介导的pcr和其他扩增操作。[0250]如本文所用，“引物”指含有2种或更多脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，通常大于3种，从其可开始合成引物延伸产物。有益于合成的实验条件包括存在三磷酸核苷和用于聚合及延伸的药剂，如dna聚合酶、合适缓冲液、温度和ph。[0251]如本文所用，“引物对”指包括5'(上游)引物和3'(下游)引物的引物组，前者与待扩增(如通过pcr)序列5'末端杂交，后者与待扩增序列3'末端的互补序列杂交。[0252]如本文所用，“特异性杂交”指核酸分子(如寡核苷酸)通过互补碱基配对与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟悉影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。与体外杂交特别相关的参数还包括退火和洗涤温度、缓冲液组成及盐浓度。用于高度严格移除非特异结合核酸分子的示范性洗涤条件是0.1xsspe,0.1％sds,65℃,中等严谨度是0.2xsspe,0.1％sds,50℃。本领域已知等同的严严格条件。技术人员可以容易地调整这些参数以实现核酸分子与适合特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。[0253]如本文所用，基本相同对产品意味着足够充分相似，从而感兴趣特性足够不变，使得基本相同的产品能用于取代该产品。[0254]如本文所用，还应理解术语“基本相同”或“相似”随着上下文变化，如相关领域技术人员所理解。[0255]如本文所用，多核苷酸或核酸分子的野生型形式是基因编码的形式或基因编码的编码序列所编码的形式。通常，野生型基因或其编码的分子不包含改变功能或结构的突变或其他修饰。术语野生型还涵盖物种之间发生等位基因变异的形式。如本文所用，多肽或核酸分子的主要形式指一种分子形式，其是基因所生成的主要形式。例如，不同细胞或组织类型能生成不同形式的多肽，如通过可变剪接和/或可变蛋白加工。在各细胞或组织类型中，不同多肽可以是“主要形式”。[0256]如本文所用，等位基因变体或等位基因变异指占据相同染色体基因座的任意2种或更多替代基因形式。等位基因变异通过突变自然产生，其能导致群内表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码多肽没有变化)或能编码氨基酸序列改变的多肽。术语“等位基因变体”在本文也用于指示基因的等位基因变体所编码蛋白。通常，基因参考形式编码来自物种群或单一参考成员的野生型和/或主要形式的多肽。一般，等位基因变体包括物种之间的变异，与来自同一物种的野生型和/或主要形式有至少80％,90％或更高的氨基酸相同性；相同性程度取决于基因和比较是种间还是种内。一般，种内等位基因变体与野生型和/或主要形式多肽有至少或至少约96％、97％、98％、99％或更高相同性。[0257]如本文所用，“等位基因”在本文中与“等位基因变体”可互换使用，指基因或其部分的替代形式。等位基因占据同源染色体的相同基因座或位置。当受试者有某一基因的2个相同等位基因时，该受试者被称为所述基因或等位基因的纯合子。当受试者有某一基因的2个不同等位基因时，该受试者被称为所述基因的杂合子。特定基因的等位基因可在单一核苷酸或数个核苷酸中彼此不同，且能包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因还可以是含有突变的基因形式。[0258]如本文所用，物种变体指不同物种之间的多肽变体，包括不同哺乳动物物种，如小鼠和人。一般，物种变体具有约或70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列相同性。物种之间的对应残基能如下确定：比较和比对序列以最大化匹配核苷酸或残基数目，例如从而序列之间的相同性等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％或等于或大于99％。随后，感兴趣的位置以参考核酸分子中赋予的数字给出。比对能手动或目测实现，尤其是当序列相同性大于80％时。[0259]如本文所用，剪接变体指通过基因组dna初级转录物的差异性加工所生成的变体，其导致多于一种类型的mrna。[0260]如本文所用，修饰涉及多肽氨基酸一级序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，且分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和取代。这与多肽自身修饰相反，后者包括翻译后修饰如糖基化、法尼基化、聚乙二醇化，和融合如与其他多肽融合以改变性质，例如血清半衰期，如通过白蛋白化，融合白蛋白例如人血清白蛋白，以及多肽的其他这类修饰。因此，提及氨基酸序列修饰是指插入、缺失、置换/取代，和其组合。多肽修饰指加入多肽的修饰，所述修饰不改变其序列。[0261]出于本文目的，氨基酸取代、缺失和/或插入能在任何u‑pa多肽或其催化活性片段中完成，只要所得蛋白表现出蛋白酶活性或其他活性(或若需要，可进行这些变化以消除活性)。修饰能通过形成保守氨基酸取代以及非保守氨基酸取代来完成。例如，可实现需要地或有额地利改变蛋白性质的氨基酸取代。在一个实施方案中，可完成防止多肽降解的突变。许多蛋白酶在碱性残基如r和k之后切割；为排除这类切割，碱性残基用非碱性残基取代。蛋白酶与抑制剂相互作用可被阻断，而同时保留催化活性，这是通过在抑制剂与蛋白酶相互作用位点实现非保守变化。其他活性也能改变。例如，可改变受体结合，而不改变催化活性。[0262]预期的氨基酸取代包括不消除蛋白裂解活性的保守性取代，如表3所示那些。如本文所述，考虑改变蛋白性质的取代，如移除切割位点和其他这类位点；这种取代一般是非保守性的，但本领域技术人员可以容易地实现。[0263]如本文所用，本领域技术人员已知氨基酸的合适保守性取代且一般能完成，而不改变所得分子的生物活性。本领域技术人员认识到，多肽非必需区中的单一氨基酸取代通常不显著改变生物活性(参见例如watson等.《基因分子生物学》(molecularbiologyofthegene),第4版,1987,本杰明‑卡明斯公司(thebenjamin/cummingspub.co.),p.224)。这类取代能根据下表3所示的那些完成：[0264][0265][0266]也允许其他取代，并能凭经验或根据已知保守性取代确定。[0267]如本文所用，术语启动子指基因的一部分，其所含的dna序列用于结合rna聚合酶和起始转录。启动子序列通常但不总是发现于基因的5’非编码区。[0268]如本文所用，分离或纯化的多肽或蛋白或其生物活性部分基本没有来自从中获取蛋白的组织细胞的细胞材料或其他污染蛋白，或当化学合成时，基本没有化学前体或其他化学物。如果制品显示没有易检测杂质，其能确定为基本游离，如通过本领域技术人员用于评估这类纯度的标准分析方法所测定，例如薄层层析(tlc)、凝胶电泳和高效液相色谱(hplc)，或者确定为足够纯，从而进一步纯化不会明显改变物质的物理和化学性质，如酶和生物活性。本领域技术人员已知纯化化合物的方法，以生成基本化学纯的化合物。然而，基本化学纯的化合物可以是立体异构体的混合物。这些示例中，进一步纯化可能增加化合物特定活性。[0269]术语“基本没有细胞材料”包括蛋白制品，其中蛋白与细胞的细胞组分分离，蛋白从所述细胞中分离或重组生成。在一个实施方案中，术语“基本没有细胞材料”包括蛋白酶蛋白制品，其具有小于约30％(干重)的非蛋白酶蛋白(本文也称为污染蛋白)，一般小于约20％的非蛋白酶蛋白或10％的非蛋白酶蛋白或小于约5％的非蛋白酶蛋白。当蛋白酶蛋白或其活性部分重组生成时，其也基本没有培养基，即培养基呈现小于约或等于20％,10％或5％的蛋白酶蛋白制品体积。[0270]如本文所用，术语“基本没有化学前体或其他化学物”包括蛋白酶蛋白制品，其中蛋白与参与蛋白合成的化学前体或其他化学物分离。该术语包括蛋白酶蛋白制品，其小于约30％(干重)、20％、10％、5％或更少的化学前体或非蛋白酶化学物或组分。[0271]如本文所用，用重组dna方法通过重组方式生成，是指使用熟知的分子生物学方法以表达克隆dna所编码蛋白。[0272]如本文所用，“表达”指通过多核苷酸转录和翻译来生成多肽的过程。多肽表达水平能用本领域已知任何方式评价，包括例如测定生成自宿主细胞的多肽量的方法。这类方法可包括但不限于定量细胞裂解物中的多肽，通过elisa，凝胶电泳后考马斯亮蓝染色，lowry蛋白测定和bradford蛋白测定。[0273]如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、维持、复制和/或扩增载体的细胞。宿主细胞还能用于表达载体编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体所含核酸得到复制，从而扩增核酸。[0274]如本文所用，“载体”或“质粒”是可复制核酸，当载体转化入合适宿主细胞时，从该核酸能表达一种或多种异源蛋白。提及载体，包括用于将异源核酸引入细胞以表达或复制其的独立元件。提及载体，也包括可引入多肽编码核酸或其片段的那些载体，一般是通过限制性酶切消化和连接。提及载体，还包括含有蛋白酶编码核酸如经修饰u‑pa的那些载体。载体用于将多肽编码核酸引入宿主细胞以扩增核酸或表达/展示核酸编码的多肽。载体通常维持游离型，但能设计成实现基因或其部分整合入基因组染色体。还考虑作为人工染色体的载体，如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。本领域技术人员熟知这些载剂的选择和使用。载体也包括“病毒载体”或“病毒性载体”。病毒载体是工程化的病毒，其可操作连接外源基因以转移(作为载剂或穿梭子)外源基因到细胞内。[0275]如本文所用，“表达载体”包括能够表达dna的载体，所述dna可操作连接能够实现这类dna片段表达的调节序列，如启动子区。这种额外区段可包括启动子和终止序列，任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体一般衍生自质粒或病毒dna，或能包含这两者的元件。因此，表达载体指重组dna或rna构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其在引入合适宿主细胞后，引起克隆dna表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，且包括真核细胞和/或原核细胞中可复制的那些以及维持游离型的那些或整合入宿主细胞基因组的那些。[0276]如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒性载体”。病毒载体是工程化的病毒，其可操作连接外源基因以转移(作为载剂或穿梭子)外源基因到细胞内。[0277]如本文所用，腺病毒指一组含dna的病毒(其导致人结膜炎和上呼吸道感染)的任一种。如本文所用，裸dna指无组蛋白的dna，其能用于疫苗和基因治疗。裸dna是遗传物质，在称为转化的基因转移期间从一个细胞转移到另一细胞。在转化中，纯化或裸dna由受体细胞摄取，这会给予受体细胞新的特征或表型。[0278]如本文所用，涉及核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作连接”，指核酸区域彼此功能相关。例如，编码前导肽的核酸可操作连接编码多肽的核酸，从而核酸能转录和翻译以表达功能性融合蛋白，其中前导肽实现融合多肽的分泌。一些示例中，编码第一多肽(如前导肽)的核酸可操作连接编码第二多肽的核酸且核酸转录为单一mrna转录物，但mrna转录物的翻译能产生2种表达多肽之一。例如，amber终止密码子能位于编码第一多肽的核酸与编码第二多肽的核酸之间，从而当引入部分amber抑制细胞时，所得单一mrna转录物能翻译生成含第一和第二多肽的融合蛋白，或能翻译生成仅第一多肽。另一示例中，启动子可操作连接编码多肽的核酸，从而启动子调节或介导核酸转录。[0279]如本文所用，“一级序列”指多肽的氨基酸残基序列或核酸分子的核苷酸序列。[0280]如本文所用，蛋白结合序列指能够与其他蛋白或肽序列特异结合的蛋白或肽序列，一般结合一组蛋白或肽序列或者特定蛋白或肽序列。[0281]如本文所用，“标签”或“表位标签”指氨基酸序列，通常加入多肽，如本文提供的u‑pa的n或c末端。纳入融合多肽的标签可促进多肽纯化和/或检测。通常，标签或标签多肽指某一多肽，其具有足够残基以提供抗体识别的表位或能用于检测或纯化，但仍短到足以使其不干扰所连接多肽活性。标签多肽通常足够独特，从而特异性结合其的抗体不与其所连接多肽的表位显著交叉反应。表位带标签的蛋白能进行亲和性纯化，使用针对标签的高特异抗体。[0282]合适的标签多肽一般具有至少5或6个氨基酸残基，通常在约8‑50个氨基酸残基之间，一般9‑30个残基之间。标签能连接一个或多个蛋白且允许检测蛋白或其从样品或混合物中的回收。这种标签熟知，并可以容易地合成和设计。示范性标签多肽包括用于亲和性纯化的那些，包括小泛素样修饰物(sumo)标签、flag标签、his标签、流感病毒血凝素(ha)标签多肽及其抗体12ca5,(field等.(1988)mol.cell.biol.8:2159‑2165)；c‑myc标签及其8f9、3c7、6e10、g4、b7及9e10抗体(参见例如evan等.(1985)molecularandcellularbiology5:3610‑3616)；和单纯疱疹病毒糖蛋白d(gd)标签及其抗体(paborsky等.(1990)proteinengineering3:547‑553)。用于检测表位标签抗体的抗体通常在本文称为二抗。[0283]如本文所用，金属结合序列指能够特异结合金属离子的蛋白或肽序列，一般是一组金属离子或特定金属离子。[0284]如本文所用，术语评价意在包括定量和定性测定，就意义上而言获得绝对值用于样品中所存在蛋白酶或其结构域的活性，以及获得指示活性水平的指数、比例、百分比、视觉的或其他值。评价可以是直接或间接的，实际检测的化学物种当然不需要本身是蛋白裂解产物，但可以例如是其衍生物或一些进一步的物质。例如，检测补体蛋白蛋白裂解产物可通过如sds‑page和考马斯亮蓝蛋白染色。[0285]如本文所用，生物活性指化合物体内活性或者体内施用化合物、组合物或其他混合物后产生的生理反应。因此，生物活性涵盖这类化合物、组合物和混合物的治疗效果及药物活性。生物活性能在设计成测试或使用这些活性的体外系统中观察。因而，出于本文目的，蛋白酶的生物活性是催化多肽的其催化活性。[0286]如本文所用，等同指2条核酸序列时，意味着所讨论的2条种序列编码相同氨基酸序列或等同蛋白。当等同用于指2种蛋白或肽时，意味着2种蛋白或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅有不显著改变蛋白或肽活性或功能的氨基酸取代(例如但不限于保守性变化如上表3所示那些)。当等同指性质时，性质不需要以相同程度存在(如2种肽能显示同一酶活性类型的不同速度)，但活性通常基本相同。互补指2条核苷酸序列时，意味着2条核苷酸序列能够杂交，通常在相对的核苷酸之间小于25％、15％或5％错配。如果有必要，指定互补性百分比。通常，选择2种分子，从而他们会在高度严格条件下杂交。[0287]如本文所用，调节蛋白活性或者基因或核酸表达的药剂可降低或增加或另外改变蛋白活性，或者以某种方式上调或下调或另外改变细胞中的核酸表达。[0288]如本文所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”蛋白酶指某一多肽，其可操作连接另一不同多肽。本文提供的嵌合或融合蛋白可包括一个或多个蛋白酶或其部分如其单链蛋白酶结构域，和用于任意一种或多种转录/翻译控制信号的一个或多个其他多肽，信号序列，定位标签，纯化标签，部分免疫球蛋白g结构域和/或靶向剂。这些嵌合或融合蛋白包括以重组方式作为融合蛋白生成的那些，以化学方式生成的那些如通过化学偶联例如偶联巯基，以及以任何其他方法生成的那些，其中至少一种蛋白酶或其部分直接或间接经接头连接另一多肽。[0289]如本文所用，可操作连接涉及融合蛋白时，指框内互相融合的蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽。非蛋白酶多肽能融合蛋白酶多肽的n或c末端。[0290]如本文所用，靶向剂是任何部分如蛋白或其有效部分，其提供缀合物与细胞表面受体的特异结合，在一些示例中，能内化结合的缀合物或其部分。靶向剂还可促进或有利于例如亲和性分离或纯化缀合物；缀合物附着表面；或检测缀合物或含缀合物的复合物。[0291]如本文所用，“接头”指连接2种多肽(或编码这类多肽的核酸)的氨基酸短序列。“肽接头”指连接2种多肽序列的氨基酸短序列。多肽接头示例是连接合成抗体片段中2条抗体链的接头，如scfv片段。熟知接头且任何已知的接头能用于所提供方法。多肽接头示例是(gly‑ser)n氨基酸序列，一些glu或lys残基分散各处以增加溶解度。本文描述其他示范性接头；任意这些和其他已知接头能与所提供组合物和方法一起使用。[0292]如本文所用，分子衍生物或类似物指衍生自分子的部分或修饰形式的分子。[0293]如本文所用，“疾病或失调”指生物体中的病理状态，导致其的原因或条件包括但不限于感染、获得性病症、基因状况、与环境暴露和人类行为相关的病症以及表征为可鉴定症状的病症。疾病或失调包括临床诊断疾病以及未诊断为临床疾病的生物体正常状态破坏。本文感兴趣的疾病和失调是涉及补体激活的那些，包括由补体激活介导的那些和补体激活在病因学或病理学中发挥作用的那些。本文感兴趣的疾病和失调包括表征为补体激活的那些(如年龄相关的黄斑变性和移植肾功能延迟)。[0294]如本文所用，当视网膜的较小中央部分(称为黄斑)恶化时，发生黄斑变性。有2类amd：干(萎缩性)和湿(新生血管或渗出性)。大部分amd作为干类型开始且在10‑20％个体中，其发展为湿类型。年龄相关的黄斑变性总是双侧的(即在双眼中都发生)，但不必定在双眼中以同样速度发展。[0295]如本文所用，年龄相关的黄斑变性(amd)是导致老年人视觉损伤和失明的炎症性疾病。补体系统的蛋白对该疾病发展重要。amd中的局部和全身炎症通过补体系统替代途径的失调作用来介导。[0296]如本文所用，移植肾功能延迟(dgf)是急性肾损伤(aki)的表现，具有移植过程独有的特性。其在移植手术后出现。移植肾功能延迟(dgf)是常见并发症，通常定义为移植后第一周期间对透析的需求。补体第三成分c3(c3)的内部肾合成通过激发t细胞介导的反应而有助于急性排斥反应。例如，在脑死亡供体中，局部肾c3水平在获取时较高且与移植后14天的肾功能逆相关。[0297]如本文所用，补体介导的疾病或失调是任意失调，其中任何一种或多种补体蛋白在疾病中发挥作用，这归因于有或没有补体蛋白或补体相关蛋白或者激活或灭活补体或补体相关蛋白。在一些实施方案中，补体介导的失调归因于补体蛋白的缺陷。在本文所述的其他实施方案中，补体介导的失调归因于激活或过度激活补体蛋白。补体介导的失调还归因于存在任何一种或多种补体蛋白和/或连续激活补体途径。[0298]如本文所用，“黄斑变性相关失调”指其中视网膜黄斑退化或变得功能失调(如因为黄斑细胞生长减慢、黄斑细胞(如rpe细胞)死亡或重排增加、丧失正常生物学功能或这些事件的组合)和一些病症中的任一种。黄斑变性导致细胞结构和/或正常黄斑胞外基质的完整性丧失和/或黄斑细胞功能丧失。黄斑变性相关疾病示例包括年龄相关的黄斑变性(amd)、地图状萎缩(ga)、北卡罗莱纳州黄斑营养不良症、索斯比氏眼底萎缩、斯特格氏病、图形样营养不良、best病、显性脉络膜小疣和malattialeventinese(放射状脉络膜小疣(radialdrusen))。黄斑变性相关疾病还涵盖在黄斑功能失调/变性之前或之后发生的黄斑外变化。因此，术语“黄斑变性相关失调”还广泛包括改变或破坏黄斑完整性或功能的任何病症(如破坏rpe或布鲁赫膜)。例如，该术语涵盖视网膜脱离、脉络膜视网膜变性、视网膜变性、视网膜光感受器细胞、rpe变性、粘多糖贮积病、视杆视锥(rod‑cone)营养不良、视锥视杆(cone‑rod)营养不良和视锥变性。[0299]本文所述黄斑变性相关失调包括黄斑变性，例如amd黄斑变性。黄斑变性相关失调包括通过抗vegf治疗如抗vegf抗体或激光治疗或植入式望远镜(implantabletelescope)治疗的失调。[0300]如本文所用，“治疗”有疾病或病症的受试者指受试者的症状得到部分或完全缓解，或在治疗后保持稳定。因此，治疗涵盖预防、疗法和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止疾病症状恶化或发展。治疗还涵盖本文所提供经修饰的u‑pa多肽和组合物的任何药物用途。[0301]如本文所用，“防止”或“预防”指方法，其中发展疾病或病症的风险或可能性降低。[0302]如本文所用，“治疗剂”、“治疗方案”、“辐射防护剂”或“化疗剂”指本领域技术人员已知的常规药物和药物疗法，包括疫苗。放疗剂为本领域熟知。[0303]如本文所用，“治疗”指任何方式，其中病症、失调或疾病的症状得到缓解或另外有益改变。治疗还涵盖本文组合物的任何药物用途。[0304]如本文所用，特定疾病或失调通过治疗如施用药物组合物或其他治疗剂“缓解症状”，指任何症状减少，无论永久或暂时，持续或瞬时，这能归因于施用组合物或治疗剂或者与之相关。[0305]如本文所用，“药学有效剂”包括任何治疗剂或生物活性剂，包括但不限于例如麻醉剂、血管收缩剂、分散剂，以及常规治疗剂，包括小分子药物和治疗蛋白。[0306]如本文所用，化合物或组合物用于治疗特定疾病的“有效量”是足以缓解或以某种方式减少疾病相关症状的量。这种量能作为单一剂量施用或根据方案施用，从而其是有效的。所述量能治愈疾病，但通常施用以缓解疾病症状。一般，需要重复施用以实现所需症状缓解。[0307]如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”指药剂、化合物、材料或组合物的量，其所含化合物在施用给受试者后至少足以生成治疗效果。因此，这是防止、治愈、缓解、抑制或部分抑制疾病或失调症状所需的量。[0308]如本文所用，“治疗效果”指治疗受试者引起的效果，其改变通常改善或缓解疾病或病症症状或者治愈疾病或病症。[0309]如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指药剂、化合物、材料或组合物的量，其所含化合物在施用于受试者时产生预期预防效果，如防止疾病或症状或延迟其发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性，或降低病毒感染的发生率。完全的预防效果通过施用一次剂量不必定发生，且仅在施用系列剂量后发生。因此，预防有效量能在一次或多次施用中施用。[0310]如本文所用，“施用非补体蛋白酶”如经修饰u‑pa蛋白酶，指非补体蛋白酶接触其底物的任何方法。施用可体内或离体或体外实现。例如，对于离体施用，从受试者中移出体液如血液并在体外接触经修饰非补体蛋白酶如经修饰u‑pa蛋白酶。对于体内施用，经修饰非补体蛋白酶如经修饰u‑pa蛋白酶能引入体内，如局部、外用、全身和/或其他引入途径。体外施用涵盖方法如细胞培养方法。[0311]如本文所用，“单位剂型”指适合人和动物对象且单独包装的物理离散单元，如本领域已知。[0312]如本文所用，待治疗的“患者”或“受试者”包括人以及人和非人动物。哺乳动物包括：灵长类动物，如人、黑猩猩、大猩猩和猴；家养动物，如狗、马、猫、猪、山羊和牛；和啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠。[0313]如本文所用，“组合”指2个或更多项目之间的任意关联。关联可以是空间的或指出于共同目的使用2个或更多项目。组合可以是2个或更多分开的项目，如2种组合物或2种集合，其混合物如2个或更多项目的单一混合物，或其任意变化。组合元件一般是功能关联或相关。[0314]如本文所用，“组合物”指2种或更多产物或化合物(如药剂、调节剂、调控剂等)的任意混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性或非水性制剂或其任何组合。[0315]如本文所用，稳定剂指为保护抗体或缀合物而加入制剂的化合物，如在保存或使用本文制剂的条件下(例如温度)。因此，纳入的是来自组合物的其他组分的防止蛋白降解的药剂。这类药剂示例是氨基酸、氨基酸衍生物、胺、糖、多元醇、盐和缓冲液、表面活性剂、抑制剂或底物以及本文所述其他药剂。[0316]如本文所用，“流体(fluid)”指能流动的任何组合物。因而，流体涵盖采用半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗液、乳膏形式的组合物以及其他这类组合物。[0317]如本文所用，“制品”是制备并出售的产品。如本技术通篇所用，该术语意在涵盖治疗剂，其中经修饰的u‑pa多肽或核酸分子包含在相同或不同包装物品中。[0318]如本文所用，“试剂盒”指包装组合，任选地包括使用组合的元件实施方法的试剂和/或其他产品和/或组分，。例如，提供的试剂盒包含经修饰蛋白酶多肽如本文所提供经修饰u‑pa蛋白酶或本文所提供核酸分子和出于某一目的的另一项目，包括但不限于施用、诊断和评价生物活性或特性。试剂盒任选地包括使用说明书。[0319]如本文所用，“细胞提取物”指制备自裂解或受破坏细胞的制品或部分。[0320]如本文所用，“动物”包括任何动物，例如但不限于：灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物如小鼠和大鼠；禽类如鸡；反刍动物如山羊、牛、鹿、绵羊；猪类如猪和其他动物。非人动物排除人作为考虑的动物。本文所提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大部分蛋白酶具有动物来源，包括哺乳动物来源。[0321]如本文所用，“单一剂量”制剂指含直接施用的单剂治疗剂的制剂。单一剂量制剂一般不包含任何防腐剂。[0322]如本文所用，多剂量指含有多剂治疗剂且能直接施用的制剂，以提供数个单剂治疗剂。剂量能在数分钟、小时、周、天或月的进程中施用。多剂制剂可允许剂量调整、剂量合并和/或剂量拆分。由于多剂制剂随着时间使用，其一般包含一种或多种防腐剂以防止微生物生长。[0323]如本文所用，“对照”或“标准品”指与测试样品基本相同的样品，除了其不用测试参数处理，或如果其是血浆样品，可来自不受感兴趣病症影响的健康志愿者。对照还可以是内部对照。例如，对照可以是具有已知性质或活性的样品，如病毒。[0324]如本文所用，单数形式“一种(a、an)”和“所述”包括复数指示物，除非上下文明确另有规定。因此，例如，提及“一种”药剂，包括一种或多种药剂。[0325]如本文所用，术语“或”用于指“和/或”，除非明确表示指仅二选一或如果替代方案是相互排斥的。[0326]如本文所用，范围和量能表示为“约”某一特定值或范围。约也包括精确量。因此，“约5个碱基”意味着“约5个碱基”以及“5个碱基”。[0327]如本文所用，“任选的”或“任选地”指随后所述事件或情况发生或不发生，且该描述包括所述事件或情况发生的示例以及不发生的示例。例如，任选地取代基团意味着基团未被取代或被取代。[0328]如本文所用，除非另有说明，用于任何保护基、氨基酸和其他化合物的缩写是依据其一般用法、公认缩略或iupac‑iub的生物化学命名委员会(参见(1972)biochem.11:1726)。[0329]为了阐明公开内容且不意在限制，详细描述被分成之后的分章节。[0330]b.u‑pa结构和功能[0331]尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa，也称为尿激酶或尿纤溶酶原激活物)是丝氨酸蛋白酶，其催化纤溶酶原水解成纤溶酶。u‑pa在尿、精液和许多癌组织中发现。其参与和纤溶酶原转化成纤溶酶相关的多种生物过程，纤溶酶本身是丝氨酸蛋白酶。纤溶酶在多个正常和病理过程中起作用，包括例如细胞迁移和组织破坏，这是通过其切割多种分子，包括纤维蛋白,纤连蛋白、蛋白聚糖和层粘连蛋白。u‑pa参与伤口愈合、炎症细胞迁移、新血管形成和肿瘤细胞浸润期间的组织重建。u‑pa还切割和激活其他物质，包括但不限于肝细胞生长因子/扩散因子(hgf/sf)、膜型基质金属蛋白酶1的潜在形式(mt‑sp1)、血小板衍生生长因子等。[0332]本文提供经修饰尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽，所述多肽修饰成切割c3中的抑制性序列，从而抑制c3活化成c3a和c3b片段。本文所提供经修饰的u‑pa多肽的活性/特异性使得其切割c3，活性和/或特异性或kcat/km相较未修饰的u‑pa多肽更高，尤其是seqidno:1‑6任一者。就天然生理底物即未修饰的u‑pa多肽的纤溶酶原而言，经修饰的u‑pa多肽可能具有减少的活性或特异性或两者。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽可抑制补体途径的补体激活。相较其他u‑pa底物如纤溶酶原，经修饰的u‑pa多肽还显示对切割c3的选择性增加。因而，本文所提供经修饰的u‑pa多肽不显示对生理天然u‑pa底物的不需要切割活性，从而其不显示不需要的副作用。在一些实施方案中，所述经修饰的u‑pa多肽是蛋白酶结构域或单链形式；这些示例中，游离半胱氨酸(通过胰凝乳蛋白酶编号的残基位置122)用丝氨酸取代，以在蛋白制备后减少或消除聚集。在经修饰的u‑pa多肽是全长或通过切割激活的其他形式的实施方案中，122位处的残基(通过胰凝乳蛋白酶编号)一般不用s取代，从而可形成二硫键以生成2链激活的多肽。[0333]1.丝氨酸蛋白酶[0334]丝氨酸蛋白酶(sp)包括分泌酶和隔离在胞质存储细胞器中的酶，具有多种生理作用，包括凝血、伤口愈合、消化、免疫应答和肿瘤浸润及转移。例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶在消化道中起作用；因子10、因子11、凝血酶和纤溶酶参与凝固几伤口愈合；c1r,c1s和c3转化酶在补体激活中发挥作用。[0335]命名为ii型跨膜丝氨酸蛋白酶的细胞表面蛋白类型是作为膜锚蛋白的蛋白酶，带有胞外结构域。作为细胞表面蛋白，其在胞内信号转导和调节细胞表面蛋白裂解事件中发挥作用。其他丝氨酸蛋白酶是膜结合的并以类似方式运行。其他是分泌型。许多丝氨酸蛋白酶在结合细胞表面受体后发挥其活性，并因而在细胞表面。细胞表面蛋白裂解是产生生物活性蛋白的机制，其调节多种细胞功能。[0336]丝氨酸蛋白酶包括分泌型和跨膜丝氨酸蛋白酶，参与包括肿瘤发展和进展的过程。尽管这些蛋白酶的精确作用尚未充分阐明，丝氨酸蛋白酶和其抑制剂参与控制许多胞内和胞外生理过程，包括癌细胞浸润和转移扩散的降解作用，涉及肿瘤发展的肿瘤新血管形成。蛋白酶参与胞外基质(ecm)的降解和重建，有助于组织重建且对癌浸润和转移是必需的。一些蛋白酶的活性和/或表达显示与肿瘤进展及发展相关。[0337]鉴定了超过20个家族(表示为s1‑s27)的丝氨酸蛋白酶，且其在结构相似性和其他功能证据基础上分成6个簇(sa、sb、sc、se、sf和sg)(rawlingsnd等.(1994)meth.enzymol.244:19‑61)。数个丝氨酸蛋白酶的反应机制类似。胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和羧肽酶c簇具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的共同催化三联体：丝氨酸用作亲核体，天冬氨酸用作亲电体且组氨酸用作碱。催化残基的几何定向在家族之间相似，尽管有不同的蛋白折叠。催化残基的线性排列通常反映簇关系。例如，胰凝乳蛋白酶簇(sa)中的催化三联体是有序的hds，但在枯草杆菌蛋白酶簇(sb)中是有序的dhs且羧肽酶簇(sc)中是sdh。[0338]胰凝乳蛋白酶超家族的丝氨酸蛋白酶示例包括组织型纤溶酶原激活物(tpa)、胰蛋白酶、胰酶样蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、弹性蛋白酶、尿激酶(或尿型纤溶酶原激活物,u‑pa)、顶体素、活化蛋白c、c1酯酶、组织蛋白酶g、糜酶、包括激肽释放酶和凝血酶在内的凝血级联系统蛋白酶以及因子viia、ixa、xa、xia和xiia(barret,a.j.,收录于:《蛋白酶抑制剂》(proteinaseinhibitors),ed.barrett,a.j.,等,elsevier,amsterdam,第3‑22页(1986)；strassburger,w.等,(1983)febslett.,157:219‑223；dayhoff,m.o.,《蛋白质序列与结构图谱》(atlasofproteinsequenceandstructure),卷5,美国生物医学研究基金会(nationalbiomedicalresearchfoundation),马里兰州银泉市.(1972)；和rosenberg,r.d.等.(1986)hosp.prac.,21:131‑137)。[0339]丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶活性取决于形成其活性位点的氨基酸残基组。残基之一通常是丝氨酸；由此其命名为丝氨酸蛋白酶。例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶共有一个相似结构且其活性丝氨酸残基在所有3个酶中处于所有同一位置(ser195)。尽管相似，但其具有不同底物特异性；其在蛋白消化期间切割不同肽键。例如，胰凝乳蛋白酶优选残基上的芳香族侧链，该残基的羰基碳是待切割的肽键部分。胰蛋白酶优选此位置的带正电lys或arg残基。丝氨酸蛋白酶的底物识别性质显著不同：一些高度特异(即蛋白酶参与凝血和免疫补体系统)；一些仅部分特异(即哺乳动物消化蛋白酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)；和其他如枯草杆菌蛋白酶、细菌蛋白酶是完全非特异的。尽管特异性有这些差异，丝氨酸蛋白酶的催化机制相当保守。[0340]靶蛋白通过丝氨酸蛋白酶的切割机制是基于通过丝氨酸的靶肽键亲核攻击。与天冬氨酸或金属相关的半胱氨酸、苏氨酸或水分子也能发挥此作用。在许多情况中，基团的亲核特性通过存在组氨酸而提高，通过天冬氨酸保持“质子受体状态”。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的匹配的侧链建立了大部分丝氨酸蛋白酶常见的催化三联体。例如，胰凝乳蛋白酶的活性位点残基以及与胰凝乳蛋白酶相同家族成员的丝氨酸蛋白酶例如mtsp‑1，是asp102、his57和ser195。[0341]胰凝乳蛋白酶超家族中所有丝氨酸蛋白酶的催化结构域具有序列同源性和结构同源性。序列同源性包括以下保守性：1)特征性活性位点残基(如胰蛋白酶情况中的ser195,his57和asp102)；2)氧阴离子穴(如胰蛋白酶情况中的gly193,asp194)；3)形成结构中二硫键的半胱氨酸残基(hartley,b.s.,(1974)symp.soc.gen.microbiol.,24:152‑182)。结构同源性包括1)特征为2个希腊钥匙结构的共同折叠(richardson,j.(1981)adv.prot.chem.,34:167‑339)；2)催化残基的共同配置(deposition)；和3)分子核心内结构的详细保护(stroud,r.m.(1974)sci.am.,231:24‑88)。[0342]在丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家族中，底物与酶之间的主干相互作用完全保守，但侧链相互作用变化显著。含有活性位点s1‑s4口袋的氨基酸特性确定了该特定口袋的底物特异性。一个丝氨酸蛋白酶的氨基酸嫁接到同一折叠的另一丝氨酸蛋白酶上，可修饰彼此的特异性。通常，含有s1‑s4口袋的蛋白酶氨基酸在底物4‑5埃内具有侧链。这些氨基酸具有蛋白酶底物的相互作用一般称为“第一壳体”相互作用，因为它们直接接触底物。然而，有最终放置第一壳体氨基酸的“第二壳体”和“第三壳体”相互作用。第一壳体和第二壳体底物结合效果主要由β‑桶状结构域决定。由于这些环不是蛋白核心元件，维持折叠的完整性，同时有新底物特异性的环变体能在进化过程中选择，以在分子水平完成必要的代谢或调节。通常就丝氨酸蛋白酶而言，下列一级序列的氨基酸是特异性的决定因素：195、102、57(催化三联体)；189、190、191、192和226(s1)；57，在58与64之间的环，以及99(s2)；192、217、218(s3)；cys168与cys180、215、以及97‑100(s4)之间的环；和41及151(s2’)，基于胰凝乳蛋白酶编号，其中s1位置的氨基酸影响p1特异性，s2位置的氨基酸影响p2特异性，s3位置的氨基酸影响p3特异性，s4位置的氨基酸影响p4特异性。丝氨酸蛋白酶中的189位是埋于口袋底部、确定s1特异性的残基。u‑pa的结构决定因素列于表4，各指定蛋白酶的蛋白酶结构域与胰凝乳蛋白酶的蛋白酶结构域比对。cys168‑cys182和60环栏标题下面的数字指示氨基酸之间的环以及环中的氨基酸数目。cys191‑cys220栏标题下面的是/否名称指示蛋白酶中是否存在二硫键。这些区域在胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族内可变且本身代表结构决定因素。[0343]2.结构[0344]u‑pacdna克隆自许多哺乳动物物种。示范性u‑pa前体多肽或前尿激酶原多肽包括但不限于人(seqidno:1且由seqidno:7编码)、小鼠(seqidno:52)、大鼠(seqidno:53)、牛(seqidno:54)、猪(seqidno:55)、兔(seqidno:56)、鸡(seqidno:57)、黄狒狒(seqidno:58)、苏门答腊猩猩(seqidno:59)、狗(seqidno:60)、羊(seqidno:61)、狨猴(seqidno:62)、恒河猴(seqidno:63)、北部白颊长臂猿(seqidno:64)和黑猩猩(seqidno:65)u‑pa多肽。mrna转录物通常翻译产生前体蛋白，其在n末端含有20个氨基酸的信号序列。转运到er后，移出信号肽以产生尿激酶原多肽。示范性尿激酶原多肽包括但不限于人(seqidno:3)、小鼠(seqidno:66)、大鼠(seqidno:67)、牛(seqidno:68)、猪(seqidno:69)、兔(seqidno:70)、鸡(seqidno:71)、黄狒狒(seqidno:72)、苏门答腊猩猩(seqidno:73)、狗(seqidno:74)和羊(seqidno:75)u‑pa多肽。例如，人u‑pamrna转录物通常翻译形成431氨基酸前体蛋白(seqidno:1)，其在n末端metargalaleuleualaargleuleuleucysvalleuvalvalseraspserlysgly(seqidno:1的氨基酸残基1‑20)含有20个氨基酸的信号序列。因此，转运到er和去除信号肽后，生成411氨基酸尿激酶原多肽，具有seqidno:3所示氨基酸序列。如下进一步详述，尿激酶原是酶原或前酶，其通过蛋白裂解进一步加工以产生2链成熟的u‑pa多肽。因而，例如，提及成熟u‑pa(seqidno:3)，野生型链激活u‑pa包含第一链(a链)，以及残基1‑158由二硫键连接残基159‑411(b链)，这是经过cys148(c97a胰凝乳蛋白酶编号)与cys279(c122胰凝乳蛋白酶编号)之间的二硫键进行的。由此，在本文所提供经修饰的u‑pa多肽中，当生成蛋白酶结构域时，其包含c122s取代，但当生成采用2链形式的激活形式时，122处的残基(胰凝乳蛋白酶编号)是c，从而其与另一c形成二硫键，一般在激活序列中(参见下面和实施例15的讨论)。[0345]人前体u‑pa具有seqidno:1所示氨基酸序列并由seqidno:7所示的核苷酸序列编码。seqidno:3显示人前u‑pa，也称为成熟u‑pa，缺乏信号序列。存在2种人u‑pa同种型，如通过选择性剪接所生成。人u‑pa的同种型1是上面seqidno:1所述的标准形式。在人u‑pa的同种型2中，seqidno:1的氨基酸1‑29用seqidno:51的氨基酸1‑12取代，所得蛋白含有414个氨基酸(列于seqidno:51)。已知人u‑pa的等位基因变体和其他变体。例如，已知upa变体在seqidno:1所示氨基酸序列中包含氨基酸修饰v15l。另一示例中，已知经修饰的u‑pa多肽在seqidno:1所示的氨基酸序列(对应seqidno:4所示的氨基酸序列)中包含氨基酸修饰c299s(通过胰凝乳蛋白酶编号的c122s)。额外变体包括在seqidno:3所示的成熟u‑pa中含有氨基酸修饰p121l、d130g、c131w、i194m、k211q、g366c和a410v的那些(对应seqidno:1中的氨基酸修饰p141l、d150g、c151w、i214m、k231q、g386c和a430v)。[0346]合成u‑pa多肽并作为单链酶原分子(也称为尿激酶原或单链尿激酶)分泌，其通过多种蛋白酶转化成活性2链u‑pa，包括例如纤溶酶、激肽释放酶、组织蛋白酶b、蛋白裂解酶和神经生长因子‑γ。切割产生双连形式是在人尿激酶原序列的残基158与159(seqidno:3)之间发生(对应seqidno:1中的氨基酸残基178和179)。2条所得链通过cys148与cys279之间的二硫键连接，从而形成2链形式的u‑pa。2链形式的u‑pa也称为高分子量u‑pa(hmw‑u‑pa)。hmw‑u‑pa能进一步加工成低分子量u‑pa(lmw‑u‑pa)，这是通过将a链切割成短链a(a1,seqidno:3的氨基酸136‑157)和氨基末端片段。通过对应cys148和cys279的cys经二硫键连接21‑178和179‑411(seqidno:3)。[0347]尿激酶型纤溶酶原激活物u‑pa是经典的丝氨酸蛋白酶，其包含his‑asp‑ser催化三联体，切割纤溶酶原中的特定arg‑val键以形成纤溶酶。纤溶酶进而可在seqidno:3的lys158‑ile159(通过胰凝乳蛋白酶编号对应于lys15‑ile16)切割u‑pa，形成上述2链形式。人u‑pa的催化三联体包括seqidno:3的氨基酸his204,asp255和ser356(通过胰凝乳蛋白酶编号对应于his57,asp102和ser195)。seqidno:3所示的人u‑pa的残基ser138和ser303是磷酸化的(franco等.(1997)jcellbiol137:779‑791)。人u‑pa包含在seqidno:3的氨基酸残基thr18处的o‑连接糖基化如岩藻糖基化，和seqidno:3的氨基酸残基asn302处的n‑连接糖基化。成熟人u‑pa包含seqidno:3残基c11‑c19、c13‑c31、c33‑c42、c50‑c131、c71‑c113、c102‑c126、c189‑c205、c197‑c268、c293‑c362、c325‑c341和c352‑c380之间的链内二硫键以及seqidno:3残基c148‑c279之间的链间二硫键。[0348]u‑pa成熟形式是411残基蛋白(对应seqidno:1所示的氨基酸序列的氨基酸残基21‑431，所述序列是含有20氨基酸信号肽的前体形式)。u‑pa包含3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域，三环结构域和生长因子结构域。在人u‑pa成熟形式中，氨基酸1‑158代表n末端a链，包括生长因子结构域(氨基酸1‑49)、kringle结构域(氨基酸50‑131)和域间接头区(氨基酸132‑158)。氨基酸159‑411代表c末端丝氨酸蛋白酶结构域或b链。合成u‑pa并作为单链酶原分子分泌，其通过多种蛋白酶转化成活性2链u‑pa，包括例如纤溶酶、激肽释放酶、组织蛋白酶b和神经生长因子‑γ。切割成双连形式是在成熟u‑pa序列残基158与159之间发生(对应seqidno:3中的氨基酸残基178和179)。2条所得链通过二硫键保持在一起，从而形成2链形式的u‑pa。[0349]尿激酶型纤溶酶原激活物包含3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域，kringle结构域和生长因子结构域。在酶原或前酶形式的人u‑pa中，seqidno:3的氨基酸1‑158代表n末端a链(或长链a)，包括表皮生长因子结构域(氨基酸1‑49)、kringle结构域(氨基酸50‑131)和域间接头区(氨基酸132‑158)，且氨基酸159‑411代表催化活性c末端丝氨酸蛋白酶结构域或b链。表皮生长因子结构域负责u‑pa结合细胞表面锚定的u‑pa受体(upar)。在胞外基质中，u‑pa通过结合u‑pa受体而附于细胞膜。lmw‑u‑pa具有裂解活性，但不结合u‑pa受体。丝氨酸蛋白酶结构域包含通过胰凝乳蛋白酶编号的残基37、60、96、110、170和185周围表面暴露的环。激活或切割后，氨基末端插入催化蛋白酶结构域的疏水结合槽，形成疏水相互作用，以及盐桥到asp194的侧面口袋，这在催化生成构象中稳定底物结合口袋和氧阴离子穴。根据胰凝乳蛋白酶编号，asp194参与氢键结合gly142的主链氨基和lys143的主链羰基(blouse等.(2009)jbiolchem284:4647‑4657)。切割后的构象变化涉及激活结构域的4个无序区，包括激活环(残基16‑21)、自溶环(残基142‑152)、氧离子稳定环(残基184‑194)和s1入口框(残基216‑223)，所有编号是根据胰凝乳蛋白酶编号(参见blouse等.(2009)jbiolchem284:4647‑4657；hedstrom(2002)chemrev102:4501‑4524；huber和bode(1978)accchemres11:114‑122；madison等.(1993)science262:419‑421)。[0350]u‑pa的结构决定因素如下表4所示，编号是基于成熟胰凝乳蛋白酶编号。cys168‑cys182和60的环栏标题下面的数字指示2个氨基酸之间的环以及环中的氨基酸数目。cys191‑cys220栏标题下面的“是”名称指示存在二硫键。这些区域在胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族内可变，且本身代表结构决定因素。修饰u‑pa多肽以改变s1‑s4口袋中的任意一个或多个氨基酸，可影响u‑pa多肽对靶底物的特异性或选择性。扩大底物特异性(p1‑p4)揭示了u‑pa对p1arg后的切割有高度特异性，优先p2位的小氨基酸，优先p3位的小极性氨基酸(thr和ser)，不优先p4位(ke等.(1997)j.biol.chem.,272:16603‑16609；harris等.(2000)procnatlacadsciusa,97:7754‑7759)。[0351][0352]3.功能/活性[0353]尿激酶型纤溶酶原激活物是丝氨酸蛋白酶，其催化纤溶酶原水解成纤溶酶。纤溶酶直接作用于胞外基质蛋白降解(andreasen等.(2000)cell.mol.lifesci.57:25‑40)。u‑pa在细胞粘附、迁移和侵袭、组织重建和癌中发挥重要作用(blasi等.(2002)revmolcellbiol3:932；andreasen等.(2000)cell.mol.lifesci.57:25‑40；mondino和blasi(2004)trendsimmunol25:450；ploug(2003)currpharmdes9:1499)。u‑pa的异常表达与类风湿性关节炎、变应性血管炎、着色性干皮病和恶性肿瘤的浸润能力相关。[0354]u‑pa通过结合高亲和性细胞表面受体upar来调节。u‑pa结合upar可增加纤溶酶原激活并提高胞外基质降解和细胞侵袭。upar与u‑pa之间形成的二元复合物与膜相关纤溶酶原相互作用形成高阶激活复合物，其就纤溶酶原激活而言降低km(即对底物大致亲和性的动力学常数)(bass等.(2002)biochem.soc.trans.,30:189‑194)。u‑pa结合upar可保护蛋白酶免受同源抑制剂即pai‑1抑制。这是因为通常存在于血浆的单链u‑pa不易受pai‑1抑制，血浆中的任何活性u‑pa会被pai‑1抑制。受体结合的活性u‑pa就pai‑1抑制而言完全可用，然而，pai‑1不能进入结合的活性分子(bass等.(2002)biochem.soc.trans.,30:189‑194)。由此，u‑pa主要作用于细胞表面且其功能与纤溶酶依赖性细胞外周蛋白裂解的激活相关。[0355]u‑pa还切割肝细胞生长因子/扩散因子(hgf/sf)、膜型基质金属蛋白酶1的潜在形式(mt‑sp1；蛋白裂解酶)、血小板衍生生长因子c(pdgf‑c)、血小板衍生生长因子d(pdgf‑d)、血小板衍生生长因子dd(pdgf‑dd)和其他蛋白(参见例如hurst等.(2012)biochemj441:909‑918；ustach和kim(2005)molcellbiol5:6279‑6288；ehnman等.(2009)oncogene28(4):534‑544)。纤溶酶降解纤维蛋白凝块，切割纤维蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白和血管性血友病因子，蛋白水解补体系统的介质并激活胶原酶。如此，纤溶酶参与血栓溶解或胞外基质降解，连接纤溶酶与血管疾病和癌症。例如，观察到纤溶酶原激活系统的组分在恶性肿瘤中高表达。肝细胞生长因子/扩散因子可调节细胞生长、细胞运动和形态发生，这是通过激活型hgf结合hgf受体c‑met和其刺激有丝分裂发生的能力，细胞运动和基质浸入将其与血管生成、肿瘤发生和组织再生相连接。血小板衍生生长因子可调节细胞生长及分裂，并在血管生成中发挥重要作用，血管生成在失控时，是癌的特征。一旦通过蛋白裂解激活，pdgf结合pdgf受体即酪氨酸激酶，导致磷酸化和涉及癌的一些下游信号通路。由于u‑pa和上述蛋白在血管疾病中的作用，本文所提供u‑pa多肽改变成针对这些蛋白的选择性下降。通过特异性和活性变化，本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示对天然底物的活性降低或无活性或无显著活性，以及相较未修饰的u‑pa，对补体蛋白c3的活性高。因此，采用治疗剂量，本文所提供经修饰的u‑pa多肽特异性抑制补体激活，但对天然u‑pa靶标切割没有或很少副作用。[0356]c.通过靶向c3的补体抑制[0357]相较于不含氨基酸修饰的u‑pa(如野生型人u‑pa(参见seqidno:1或3))或其催化结构域或蛋白酶结构域(参见seqidno:2)或根据胰凝乳蛋白酶编号包含取代c122s的对应未修饰的u‑pa多肽，本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示对补体蛋白c3中抑制性切割序列的特异性和/或活性增加。在残基122有s的取代不改变对c3的特异性或活性，但聚集减少。由于c3参与补体的3个起始途径(参见图1)，通过蛋白裂解抑制来靶向c3可提供用于灭活补体级联的通用和广泛治疗靶标。c3的灭活切割阻断了补体以及替代途径扩增环的末端活性。所有3个途径在c3汇集(参见例如图1)。通过抑制补体激活的能力，这种经修饰的u‑pa多肽能用于治疗补体激活相关的多种疾病、病症和病状，如炎症反应和自身免疫病。补体激活与疾病和病症发展相关，这是通过促进局部炎症和组织破坏，其部分由生成效应分子和膜攻击复合物所导致。在一个示例中，如许多自身免疫病，补体产生组织破坏，因为其在不合适情况下激活，如抗体对于宿主组织。其他情况下，补体能正常激活，如通过败血症，但仍促成疾病发展，如在呼吸窘迫综合征中。病理上，如果控制不当，补体能导致对血管(血管炎)、肾脏基底膜和附着内皮及表皮细胞(肾炎)、关节滑膜(关节炎)和红细胞(溶血)的大量损伤。c3在补体激活中的作用如下进一步详细讨论。[0358]1.补体蛋白c3和其在起始补体中的作用[0359]补体系统包括超过30种可溶和细胞膜结合蛋白，其不仅在抗体介导免疫应答中发挥作用，还在固有免疫应答中运作以识别和杀伤病原体如细菌、病毒感染细胞及寄生虫。补体激活通过3个不同途径在病原体表面上起始：经典途径，替代途径和凝集素途径。这些途径区别在于起始所需的组分不同，但途径最终产生同一组效应分子(如c3转化酶)，其切割补体蛋白c3以激发膜攻击复合物(mac)形成(参见例如图1)。因此，补体蛋白c3是治疗的有吸引力靶标，因为c3调节会引起多种调理素、过敏毒素和mac的调整。此外，天然产生的补体抑制蛋白包括因子h(fh)、cr1、补体受体ig(cr1g)、daf和mcp，其在c3水平抑制。[0360]有三(3)种补体激活途径(参见描述这些途径的图1)。补体途径不同；各自依赖不同分子和机制用于起始。所述途径的相似处在于其汇集产生同一组效应分子，即c3转化酶。在经典和凝集素途径中，c4b2b用作c3转化酶；在替代途径中，c3bbb是c3转化酶(见表5)。c3切割产生了c3b和c3a，前者用作调理素和补体系统的主要效应分子以用于后续补体反应，后者是炎症的肽介质。c5b介导补体激活的“后面”事件，起始一系列反应，最终产生膜攻击复合物(mac)。尽管3种途径生成不同的c3和c5转化酶，但所有途径都生成c3和c5的裂解产物并形成mac。或者，c3能由外来蛋白酶切割和激活，如溶酶体酶和弹性蛋白酶(markiewski和lambris(2007)amjpathology171:715‑727；ricklin和lambris(2007)natbiotechnol25:1265‑1275)。[0361][0362]a.经典途径[0363]c1q是补体经典途径的第一成分。c1q是与蛋白凝集素家族相关的钙依赖性结合蛋白，这归因于总体共有的结构同源性(malhotra等,(1994)clinexpimmunol.97(2):4‑9；holmskov等.(1994)immunoltoday15(2):67‑74)。胶原凝集素通常称为模式识别分子，一般用作调理素以靶向病原体用于免疫细胞的吞噬作用。与胶原凝集素如mbl不同，c1q的羧基末端球状识别结构域不具有凝集素活性，但能用作“带电”模式识别分子，这归因于其球状结构域的表面静电势的显著差异(gaboriaud等.(2003)j.biol.chem.278(47):46974‑46982)。[0364]c1q以2种不同方式起始补体经典途径。首先，经典途径通过c1q与免疫复合物(即抗原‑抗体复合物或者聚集的igg或igm抗体)相互作用来激活，从而连接抗体介导的体液免疫应答与补体激活。当igm或igg的fab部分(可变区)结合抗原时，fc(恒定)区的构象改变，允许c1q结合。c1q必须结合至少2个待活化的fc区。然而，c1q也能够在没有抗体的情况下激活补体，从而在对感染的固有或直接免疫应答中发挥作用。除了通过抗体起始，还通过c1q与非免疫分子如聚阴离子(细菌脂多糖、dna和rna)、某些小多糖、病毒膜、反应蛋白(crp)、血清淀粉样p成分(sap)以及细菌、真菌和病毒膜成分相互作用实现补体激活。[0365]c1q是c1复合物的一部分，其所含单一c1q分子结合2个分子，所述2个分子各具有酶原c1r和c1s。一个以上c1q球状结构域结合靶表面(如聚集的抗体或病原体)，导致(c1r:c1s)2复合物构象变化，引起c1r蛋白酶激活以切割c1s，从而产生活性丝氨酸蛋白酶。活性c1s切割后续补体成分c4和c2以产生c4b及c2b，其共同形成经典途径的c3转化酶。c3转化酶使c3切割成c3b和c3a，前者共价附于病原体表面并用作调理素，后者刺激炎症。一些c3b分子与c4b2b复合物相关联，产生作为经典级联c5转化酶的c4b2b3b。表6概括了参与补体经典途径的蛋白。[0366][0367][0368]b.替代途径[0369]替代途径由外来病原体在没有抗体的情况下起始。由替代途径起始补体是通过c3自发水解成c3b而发生。由于血清和组织蛋白酶活性，少量c3b总存在于体液。宿主自身细胞通常包含高水平膜唾液酸，其如果结合会灭活c3b，但细菌包含较低外部唾液酸水平并因此结合c3b而不灭活其。病原体表面的c3b由蛋白酶酶原因子b识别。因子b由因子d切割。因子d是补体系统的唯一激活蛋白酶，其作为活性酶循环，而不是酶原，但由于因子b是因子d的唯一底物，正常血清中存在低水平活性蛋白酶对宿主一般是安全的。通过因子d切割因子b可产生活性产物bb，其能与c3b关联形成c3bbb，即替代途径的c3转化酶。与经典途径类似，c3转化酶从c3生成更多c3b和c3a。c3b共价附于病原体表面并用作调理素且另外起始替代途径，而c3a刺激炎症。一些c3b连接复合物形成c3bbb3b，即替代途径c5转化酶。c3bbb3b由血浆蛋白备解素或因子p稳定，其结合微生物表面并使转化酶稳定。表7概括了参与补体替代途径的蛋白。[0370][0371]c.凝集素途径[0372]凝集素途径(也称为mbl途径)在通过凝集素蛋白识别和结合病原体相关分子模式(pamp；即碳水化合物部分)后起始。激活补体凝集素途径的凝集素蛋白示例包括甘露糖结合凝集素(mbl)和纤维胶凝蛋白(即l‑纤维胶凝蛋白,m‑纤维胶凝蛋白和h‑纤维胶凝蛋白)。mbl是蛋白凝集素家族成员，从而作为由相同多肽链构成的亚基寡聚物存在，各自含有半胱氨酸富集、胶原样、颈和碳水化合物识别或凝集素结构域。mbl用作模式识别分子以通过其球状凝集素结构域识别碳水化合物部分，尤其是病原体表面的中性糖如甘露糖或n‑乙酰氨基葡萄糖(glcnac)，采用钙依赖性方式。mbl还用作调理素以促进吞噬细胞对细菌、病毒和真菌病原体的吞噬作用。凝集素途径的额外引发剂包括纤维胶凝蛋白，包含l‑纤维胶凝蛋白、m‑纤维胶凝蛋白和h‑纤维胶凝蛋白(参见例如liu等.(2005)jimmunol.175:3150‑3156)。与mbl类似，纤维胶凝蛋白识别碳水化合物部分，例如n‑乙酰氨基葡萄糖和甘露糖结构。[0373]通过mbl或纤维胶凝蛋白激活替代途径与通过c1q激活经典途径类似，其中单一凝集素分子与2个蛋白酶酶原相互作用。在凝集素蛋白的情况中，酶原是mbl相关的丝氨酸蛋白酶masp‑1和masp‑2，其与经典途径的c1r和c1s酶原密切同源。通过凝集素蛋白识别pamp后，例如通过结合病原体表面，masp‑1和masp‑2被激活以切割c4和c2形成mbl级联c3转化酶。随后，c3b连接复合物以形成mbl级联c5转化酶。masp激活不仅参与响应微生物，而且参与涉及暴露中性糖的任何反应，包括但不限于组织损伤，如器官移植中所观察到的。如同替代途径，mbl级联独立于抗体被激活；如同经典途径，mbl级联采用c4和c2形成c3转化酶。表8概括了参与补体凝集素途径的蛋白。[0374][0375]d.补体介导的效应子功能[0376]无论使用哪种起始途径，最终结果是形成补体蛋白的活化片段(如c3a,c4a和c5a过敏毒素以及c5b‑9膜攻击复合物)，其用作效应分子以介导不同效应子功能。细胞识别补体效应分子以起始效应子功能(如趋化和调理作用)可通过各种补体受体介导。补体受体分布于广泛范围的细胞类型，包括红细胞、巨噬细胞、b细胞、中性粒细胞和肥大细胞。补体成分结合受体后，受体起始胞内信号级联，引起细胞反应如刺激细菌的吞噬作用和从细胞分泌炎性分子。例如，补体受体cr1和cr2识别c3b、c4b及其产物，对刺激趋化而言重要。cr3(cd11b/cd18)和cr4(cd11c/cd18)是整合素，在吞噬反应中同样重要，但也在响应ic3b的白细胞粘附和迁移中发挥作用。c5a和c3a受体是g蛋白偶联受体，在c5a和c3a过敏毒素的许多促炎介导功能中起作用。例如，c3a受体c3ar存在于肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞和单核细胞，且直接参与c3a的促炎效果。[0377]因此，通过补体受体，这些补体效应分子片段介导数种功能，包括白细胞趋化、巨噬细胞活化、血管通透性和细胞裂解(frank,m.和fries,“l.补体”(l.complement).收录于paul,w.(编)《基础免疫学》(fundamentalimmunology),雷文出版社(ravenpress),1989)。补体产物的一些效应子功能汇总列于表9。[0378][0379][0380]i.补体介导的裂解：膜攻击复合物[0381]所有3个途径的补体级联终步骤是形成膜攻击复合物(mac)(图1)。c5能由任何c5转化酶切割成c5a和c5b。c5b联合溶液中的c6和c7，c5b67复合物经c7上的疏水位点与病原体脂膜相关联。c8和同样具有疏水位点的数个c9分子加入形成膜攻击复合物，也称为c5b6789或c5b‑9。c5b‑9在膜中形成孔，从中水和溶质能穿过，导致渗透裂解和细胞死亡。如果补体对抗原激活，而没有c5b67能粘附的脂膜，则c5b67复合物可结合附近细胞并起始旁观者溶解。单一mac能裂解红细胞，但有核细胞能内吞mac并修复损伤，除非存在多个mac。革兰氏阴性菌(具有暴露的外膜)和包膜病毒，一般易受补体介导的裂解影响。不太受影响的是革兰氏阳性菌(其质膜由其厚肽聚糖层保护，细菌在其细胞壁周围带有荚膜或粘液层)或病毒没有脂包膜。同样，mac能由在膜插入前结合复合物的蛋白破坏，如链球菌补体抑制剂(sic)和丛生蛋白。通常，mac有助于通过导致裂解来破坏革兰氏阴性菌以及展示外来抗原的人细胞(病毒感染细胞、肿瘤细胞等)，并且还能破坏包膜病毒的包膜。[0382]ii.炎症[0383]炎症是一种过程，其中血管扩张并变得更通透，因而使机体防御细胞和防御化合物能够离开血液及进入组织。补体激活引起数种促炎介质如c3a,c4a和c5a形成。血清或血浆中的完整过敏毒素通过羧肽酶n迅速转化成更稳定、不太具有活性的c3a‑desarg,c4a‑desarg或c5a‑desarg形式。c3a,c4a和c5a以及较小程度上的其desarg衍生物，是有效的生物活性多肽，由于其炎症活性而被称为过敏毒素。过敏毒素结合多个细胞类型上的受体以刺激平滑肌收缩、增加血管通透性和激活肥大细胞以释放炎症介质。c5a是最有效的过敏毒素，主要作用于白血球，尤其是中性粒细胞。c5a刺激白细胞在感染位点附于血管壁，这是通过刺激粘附分子表达增加，从而白细胞能从血管中挤出并进入组织，此过程称为血球渗出。c5a还刺激中性粒细胞生成用于胞外杀伤的活性氧、蛋白水解酶和白细胞三烯。c5a还能通过诱导生成趋化因子、细胞因子和其他促炎介质来进一步间接放大炎症过程。c5a还与肥大细胞相互作用以释放血管扩张剂如组胺，从而血管变得更通透。c3a还与白血球相互作用，主要影响嗜曙红细胞指示c3a在过敏性炎症中的作用。c3a诱导平滑肌收缩、增强血管通透性、导致嗜碱性粒细胞脱粒及释放组胺和其他血管活性物质。c2a能转变成c2激肽，c2激肽通过引起血管扩张来调节血压。[0384]尽管c3b的失活衍生物ic3b在技术上不视作过敏毒素，但其功能是诱导白细胞粘附血管内皮和诱导生成促炎性细胞因子il‑1，这是通过结合其细胞表面整合素受体。通过诱导细胞粘附分子如e‑选择素表达和诱导白介素‑8分泌，c5b‑9还间接刺激白细胞粘附、激活和趋化(bhole等.(2003)critcaremed31(1):97‑104)。c5b‑9还刺激有助于炎症的二级介质释放，例如前列腺素e2、白三烯b4和血栓素。[0385]人补体成分c3和c5转化产生其各过敏毒素产物，可参与某些天然产生的病理状态，包括自身免疫失调如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性肿瘤、心肌梗塞、purtscher’s视网膜病、败血症和成人呼吸窘迫综合征。在某些医源性补体激活相关病症中检测到c3a和c5a循环水平增加，如：心肺旁路手术、肾透析和尼龙纤维白细胞去除术(nylonfiberleukaphoresis)。[0386]iii.趋化[0387]趋化是细胞响应其环境中的化合物而定向迁移的过程。在免疫应答中，多种趋化因子指导细胞如吞噬细胞移动到感染位点。例如，c5a是用于循环中性粒细胞的主要趋化因子，但也能诱导单核细胞趋化。吞噬细胞移向增加浓度的c5a且随后经其cr1受体粘附c3b分子，c3b分子附着于抗原。用嗜碱性粒细胞、嗜曙红细胞、中性粒细胞和单核吞噬细胞观察，c5a的趋化效果在低至10‑10m浓度时有活性。[0388]iv.调理作用[0389]补体的一个重要作用是促进吞噬细胞对病原体的摄取和破坏。这通过称为调理作用的过程发生，其中结合靶细菌的补体成分与吞噬细胞如中性粒细胞或巨噬细胞表面的补体受体相互作用。此示例中，补体效应分子称为调理素。病原体的调理作用是c3b和c4b的主要功能。ic3b也用作调理素。c3a和c5a增加吞噬细胞上c3b受体的表达并提高其代谢活性。[0390]c3b以及较小程度上的c4b，有助于从身体移除有害免疫复合物。c3b和c4b使免疫复合物附于红细胞上的cr1受体。红细胞随后将复合物递送到脾和肝内固定的巨噬细胞以用于破坏。免疫复合物能导致有害的iii型超敏反应。[0391]v.体液免疫应答激活[0392]b细胞激活需要抗原连接b细胞受体(bcr)。然而，显示补体在使b细胞对抗原反应阈值降低多至1000倍中起作用。这通过c3d或c3dg结合b淋巴细胞上的cr2受体发生，c3d或c3dg是从c3分解片段产生的补体产物，其能与bcr共连接。当用c3d调理的抗原颗粒例如免疫复合物经c3d结合cr2受体以及经抗原结合bcr时，共连接发生。当c3d结合抗原时，抗原复合物共连接也能发生，以提高其被抗原呈递细胞如树突细胞摄取，抗原呈递细胞随后能呈递抗原给b细胞以增强抗原反应。cr2缺陷型小鼠展示出b细胞功能缺陷，导致天然抗体水平下降和体液免疫应答受损。[0393]2.c3结构和功能[0394]本文所提供变异u‑pa多肽切割补体蛋白c3或其蛋白裂解片段，从而抑制补体。人补体蛋白c3(uniprot登录号p01024)是1663氨基酸单链前原蛋白，具有seqidno:47所示氨基酸序列。蛋白由位于染色体19的41kb基因编码(seqidno:46所示核苷酸序列)。前原蛋白包含22氨基酸信号肽(seqidno:47的氨基酸1‑22)和四精氨酸序列(seqidno:47的氨基酸678‑681)，其通过弗林蛋白酶样酶去除，导致含β链(seqidno:47的23‑667)和α链(seqidno:47的672‑1663)的成熟2链蛋白形成，其通过氨基酸残基cys559与cys816之间的链间二硫键连接。成熟2链蛋白具有seqidno:77所示氨基酸序列。[0395]在补体级联中，补体蛋白c3通过蛋白裂解进一步加工以形成多个c3蛋白裂解片段。如上所述，所有3种补体起始途径在c3转化酶c4b2b和c3bbb汇合。c3转化酶在seqidno:47残基748与749之间切割c3(参见下表10)，产生过敏毒素c3a(seqidno:47的氨基酸672‑748)和调理素c3b(c3bα链；seqidno:47的氨基酸749‑1663)。c3a参与炎症且c3b形成c5转化酶，最终引起c5a过敏毒素和mac。本文所提供变异u‑pa多肽抑制补体，并且因此，不在此glar切割位点切割。[0396]c3b具有多个补体成分的结合位点，包括c5、备解素(p)、因子h、b和i、补体受体1(cr1)和膜辅因子蛋白(mcp)(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。因子i是血浆蛋白酶，其在辅因子h、cr1和mcp存在下结合可导致c3b失活，而在因子d存在下结合因子b和p可导致c3转化酶扩增及起始mac。因子i在辅因子存在下于seqidno:47的残基1303‑1304,1320‑1321和954‑955之间切割c3b(参见下表10)，产生片段ic3b(seqidno:47的氨基酸749‑1303)和c3f(seqidno:47的氨基酸1304‑1320)。因子i随后切割ic3b，产生c3c(c3cα链片段1；seqidno:47的氨基酸749‑954)和c3dg(seqidno:47的氨基酸955‑1303)。最终结果是c3b永久失活(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。由于因子i灭活c3b，因子i切割位点是由本文所提供变体u‑pa多肽切割的候选。额外c3b蛋白裂解片段包括c3g(seqidno:47的氨基酸955‑1001)、c3d(seqidno:47的氨基酸1002‑1303)和c3cα链片段2(seqidno:47的氨基酸1321‑1663)。补体蛋白c3的切割序列如下表10所示，该表列出p4‑p1残基，切割位点(p1‑p1’位点)的氨基酸残基和蛋白酶负责切割。本文所提供经修饰的u‑pa多肽不在这些位点切割。[0397][0398]a.c3a[0399]c3a(seqidno:47的氨基酸672‑748)是过敏毒素，其参与炎症、嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱粒、血管通透性增强、平滑肌收缩及诱导抑制t细胞。[0400]b.c3b[0401]c3b(seqidno:47的氨基酸749‑1663)在补体级联中具有多种作用。c3b是调理素，其促进吞噬细胞对病原体的摄取和破坏。另外，c3b联合c3转化酶以产生c5转化酶，其激活补体蛋白c5，从而产生c5a过敏毒素和c5b，与c6、c7、c8和c9组合形成膜攻击复合物。此外，如上面章节1b所述，c3b参与补体起始的替代途径。c3b受补体调节蛋白因子i调控，因子i是血浆蛋白酶，使c3b降解成多个片段，包括ic3b、c3c、c3d、c3f和c3dg，从而永久性灭活c3b。[0402]c3b在补体介导效应功能中发挥关键作用，这是通过其结合c3转化酶c4b2b和c3bbb的能力，从而产生c5转化酶c4b2b3b和c3bbb3b。c5转化酶将酶原c5切割成其活性片段，即c5a过敏毒素和c5b。c5a参与趋化和炎症，c5b参与mac形成。[0403]c.c3b抑制剂[0404]c3b具有多个补体成分的结合位点，包括c5,备解素(p)、因子hb和i、补体受体1(cr1)和膜辅因子蛋白(mcp)(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。因子i是血浆蛋白酶，其在辅因子h、cr1和mcp存在下结合可导致c3b失活，而在因子d存在下结合因子b和p可导致c3转化酶扩增及起始mac。因子i在辅因子存在下于seqidno:47的残基1303‑1304,1320‑1321和954‑955之间切割c3b，产生片段ic3b(seqidno:47的氨基酸749‑1303)和c3f(seqidno:47的氨基酸1304‑1320)。尽管c3b的失活衍生物ic3b在技术上不视作过敏毒素，其用于诱导白细胞粘附血管内皮和诱导生成促炎性细胞因子il‑1，这是通过结合其细胞表面整合素受体。蛋白ic3b用作调理素。因子i随后切割ic3b，产生片段c3c(c3cα链片段1；seqidno:47的氨基酸749‑954和c3cα链片段2；seqidno:47的氨基酸1321‑1663)和c3dg(seqidno:47的氨基酸955‑1303)。最终结果是c3b永久失活(参见sahu和lambris(2001)immunologicalreviews180:35‑48)。c3dg能进一步切割产生片段c3g(seqidno:47的氨基酸955‑1001)和c3d(seqidno:47的氨基酸1002‑1303)。[0405]d.切割c3的经修饰的u‑pa多肽[0406]本文提供经修饰和变异尿激酶型纤溶酶原激活物(u‑pa)多肽。还提供含经修饰的u‑pa多肽的缀合物，如融合蛋白，从而所得其激活形式切割c3。本文所提供经修饰的u‑pa多肽相较于野生型、天然或参考u‑pa多肽，显示活性或特性改变。例如，本文所提供u‑pa多肽包含相较于野生型、天然或参考u‑pa多肽的修饰，所述野生型、天然或参考u‑pa多肽如seqidno:1‑6任一者所示，或与seqidno:1‑6任一者有至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，尤其至少95％序列相同性，例如seqidno:5所示参考u‑pa蛋白酶结构域。本文所提供经修饰的u‑pa多肽包括改变(抑制)补体激活的u‑pa多肽，这是通过实现补体蛋白c3的抑制性切割。本文所提供经修饰的u‑pa多肽包括实现补体蛋白c3抑制性切割的那些。包括实现c3抑制性切割的那些，其活性或特异性kcat/km高于不含修饰(取代、缺失和/或插入)的对应形式或序列如seqidno:1‑6任一者所示的未修饰的u‑pa对应形式。相较于不含氨基酸修饰的对应u‑pa多肽，经修饰的u‑pa多肽还可能对未修饰的u‑pa所切割或识别底物和靶标的特异性和/或选择性降低，包括切割纤溶酶原和/或结合upar。[0407]本文所提供经修饰的u‑pa多肽通过抑制性或灭活切割补体蛋白c3来抑制或灭活补体。本文所提供经修饰的u‑pa多肽抑制或灭活补体，这是通过在切割位点切割补体蛋白c3，导致c3抑制或失活。灭活或抑制切割补体蛋白c3可以在c3的任何序列，只要所得c3切割导致补体失活或激活受抑制。由于本文所提供经修饰的u‑pa多肽抑制补体激活，经修饰的u‑pa多肽不影响c3的酶原形式切割，以产生c3a和c3b活化形式。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽不在seqidno:47的残基748‑749之间切割c3，其会引起c3a和c3b产生。补体蛋白c3的抑制或灭活切割位点可凭经验确定或鉴定。若必要，经修饰的u‑pa多肽能测试其抑制补体的能力，如下面章节e所述和实施例所示范。[0408]本文所提供经修饰的u‑pa多肽催化补体蛋白c3的抑制性或灭活切割。本文所提供经修饰的u‑pa多肽在任何切割序列切割补体蛋白c3，只要所得c3片段失活或无法激活补体介导效应子功能。本文所提供经修饰的u‑pa多肽对天然u‑pa靶标的特异性和/或选择性改变(即降低)，所述靶标包括纤溶酶原和upar。在一个示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割纤溶酶原的特异性降低。另一示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对结合upar的选择性降低。一些示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割纤溶酶原的特异性降低且结合upar的选择性降低。其他示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割补体蛋白c3的特异性增加，而对切割纤溶酶原的特异性减少。其他示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3的选择性增加，而对纤溶酶原和/或upar的选择性降低。[0409]本文所提供和实施例所述经修饰的u‑pa多肽是例如u‑pa的经分离蛋白酶结构域。也考虑其保留蛋白酶活性的较小部分。本文所提供经修饰的u‑pa多肽是u‑pa蛋白酶结构域的突变体，特别是其中蛋白酶结构域内cys残基游离(即不与蛋白的任何其他cys残基形成二硫键)的经修饰的u‑pa多肽用另一氨基酸取代置换，优选保守氨基酸取代或不消除活性的取代，例如用丝氨酸的取代，以及消除糖基化位点的经修饰的u‑pa多肽。也考虑具有保留催化活性的其他氨基酸取代的经修饰的u‑pa多肽(示范性氨基酸取代参见例如表3)。[0410]本文所提供经修饰的u‑pa多肽包含一个或多个氨基酸修饰，从而其以导致补体失活或抑制的方式切割补体蛋白c3。所述修饰可以是单氨基酸修饰，如单一氨基酸取代(置换)、插入或缺失，或多氨基酸修饰，如多个氨基酸取代、插入或缺失。示范性修饰是氨基酸取代，包括单或多氨基酸取代。氨基酸取代可以是保守取代如表3所示，或非保守取代如本文任意所述。本文所提供经修饰的u‑pa多肽相较于不含修饰的u‑pa多肽，可包含至少或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多修饰位置。[0411]本文所述修饰能在任何u‑pa多肽中进行。例如，修饰在以下u‑pa多肽中进行：人u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6的或其所示的氨基酸序列，或其等位基因变体；小鼠u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:52或66的或其所示的氨基酸序列；大鼠u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:53或67的或其所示的氨基酸序列；牛u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:54或68的或其所示的氨基酸序列；猪u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:55或69的或其所示的氨基酸序列；兔u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:56或70的或其所示的氨基酸序列；鸡u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:57或71的或其所示的氨基酸序列；非洲黄狒狒u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:58或72的或其所示的氨基酸序列；苏门答腊猩猩u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:59或73的或其所示的氨基酸序列；狗u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:60或74的或其所示的氨基酸序列；羊u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:61或75的或其所示的氨基酸序列；狨猴u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:62的或其所示的氨基酸序列；恒河猴u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:63的或其所示的氨基酸序列；北部白颊长臂猿u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:64的或其所示的氨基酸序列；和黑猩猩u‑pa多肽，所述多肽具有包括seqidno:65的或其所示的氨基酸序列；或在序列变体或催化活性片段中进行，其显示与seqidno:1‑6和52‑75任一者至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。[0412]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能在本文所提供u‑pa多肽的任何区域或结构域中修饰，只要经修饰的u‑pa多肽保留其实现补体蛋白c3灭活或抑制性切割的能力。本文所提供经修饰的u‑pa多肽可以是单链或2链多肽、物种变体、等位基因变体、同种型或其催化活性片段，例如其蛋白酶结构域。本文所提供u‑pa多肽可以是全长或截短u‑pa多肽。本文所提供经修饰的u‑pa多肽可以是u‑pa的蛋白酶结构域或u‑pa的蛋白酶结构域修饰形式。还考虑用于本文的是酶原、前体或成熟形式的经修饰的u‑pa多肽，只要u‑pa多肽保留其实现补体蛋白c3抑制性或灭活切割的能力。u‑pa多肽中的修饰可对也包含其他修饰的u‑pa多肽形成，包括多肽一级序列的修饰和非一级序列的修饰。例如，本文所述修饰可以在作为融合多肽或嵌合多肽的u‑pa多肽中。本文所提供经修饰的u‑pa多肽还包括缀合聚合物如peg试剂的多肽。[0413]出于本文目的，提及修饰的位置和氨基酸，包括一个或多个氨基酸取代，在本文中参考seqidno:1‑6任一者所示的u‑pa多肽。于另一u‑pa多肽中制备本文所提供任何修饰是在本领域技术人员水平范围内，这是通过鉴定另一u‑pa多肽的对应氨基酸残基进行的，如seqidno:1‑6任一者所示u‑pa多肽或其显示与seqidno:1‑6任一者所示u‑pa多肽有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的变体。通过比对u‑pa多肽与seqidno:1‑6任一者所示参考u‑pa多肽，能鉴定另一u‑pa多肽的对应位置。出于修饰(如氨基酸取代)目的，对应氨基酸残基可以是任何氨基酸残基，且不需与seqidno:1‑6任一者所示残基相同。通常，通过与例如seqidno:5中残基比对鉴定的对应氨基酸残基是与seqidno:5相同的氨基酸残基，或其保守或半保守氨基酸残基。还应理解本文所提供示范性取代能在u‑pa多肽对应残基处形成，如u‑pa的蛋白酶结构域，只要取代不同于u‑pa多肽的未修饰形式，如u‑pa的蛋白酶结构域。基于此描述和本文他处的描述，生成含一个或多个所述突变的经修饰的u‑pa多肽以及各自测试本文所述性质或活性，在本领域技术人员水平范围内。[0414]本文所提供经修饰的u‑pa多肽通过蛋白裂解介导的抑制或灭活补体蛋白c3来改变补体活性。此外，本文所提供经修饰的u‑pa多肽对切割纤溶酶原和/或结合upar的特异性下降。例如，本文所提供经修饰的u‑pa多肽就切割纤溶酶原而言显示小于100％的u‑pa多肽野生型活性，如小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更小的野生型或参考u‑pa多肽的纤溶酶原切割活性，例如不含氨基酸修饰的对应多肽。另一示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽就upar而言显示小于100％的u‑pa多肽野生型结合活性，如小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更小的野生型或参考u‑pa多肽的upar结合活性，例如不含氨基酸修饰的对应多肽。[0415]本文还提供编码任意本文所提供经修饰的u‑pa多肽的核酸分子。一些示例中，编码核酸分子还能修饰成包含异源信号序列以改变(如增加)多肽表达和分泌。本文所提供经修饰的u‑pa多肽和编码核酸分子能通过本领域已知任何方法生成或分离，包括从天然来源分离，分离细胞、组织和生物体中的重组生成蛋白，通过重组方法和包括计算机步骤在内的方法、合成方法和本领域技术人员已知的任何方法。本文所提供经修饰多肽和编码核酸分子可通过本领域技术人员已知的标准重组dna技术生成。可采用本领域已知的任何方法以实现靶蛋白中任意一个或多个氨基酸突变。方法包括标准定点或随机突变编码核酸分子，或固相多肽合成方法。例如，编码u‑pa多肽的核酸分子能进行突变，如随机突变编码核酸、易错pcr、定点突变、重叠pcr、基因重排或其他重组方法。编码多肽的核酸分子随后能引入宿主细胞以异源表达。因而，本文还提供编码本文所提供任意经修饰的u‑pa多肽的核酸分子。一些示例中，合成生成经修饰的u‑pa多肽，如使用固相或溶液相肽合成。核酸分子可在基因治疗载体中提供，如aav或腺病毒载体，以表达体内所编码修饰u‑pa多肽，如眼部或用于全身施用。所编码u‑pa多肽可以是全长多肽或蛋白酶结构域或者有活性或能激活的其他形式。[0416]本文所提供u‑pa多肽修饰成对补体蛋白c3抑制性或灭活切割序列切割的特异性和/或选择性增加。u‑pa多肽能用本领域已知修饰蛋白的任何方法修饰。这种方法包括定点和随机突变。试验如本文所提供和本领域已知用于补体激活生物功能的试验，可用于评价经修饰的u‑pa多肽的生物功能以确定经修饰的u‑pa多肽就切割和灭活而言是否靶向补体蛋白c3。本文提供鉴定u‑pa多肽和经修饰的u‑pa多肽的示范性方法。[0417]1.示范性修饰u‑pa多肽[0418]本文提供的经修饰的u‑pa多肽包含u‑pa多肽中的一个或多个，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个和更多氨基酸修饰，且切割补体蛋白c3，从而补体受抑制或失活。修饰在一级氨基酸序列中，包括取代、缺失和插入氨基酸残基。当处于活性形式时，修饰改变u‑pa多肽的特异性/活性。本文的经修饰的u‑pa多肽选择成识别和切割补体蛋白中的靶位点，尤其是c3以使其失活。它们还能进一步修饰和筛选成对体内底物如纤溶酶原的特异性/活性降低。它们可通过任何适当的蛋白酶筛选方法鉴定。本文的经修饰的u‑pa多肽用美国专利号8,211,428所述筛选方法鉴定，其中修饰蛋白酶的文库与同源或其他抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂(其修饰成包括反应位点环中的靶序列以捕获会切割这种靶标的修饰蛋白酶)反应。[0419]本文所提供经修饰的u‑pa多肽展示出对在灭活的c3位点处补体蛋白c3的活性或特异性kcat/km增加，还可对纤溶酶原的活性或特异性下降和/或展示出对靶位点补体蛋白c3的选择性、特异性和/或活性增加，其中经修饰的u‑pa多肽灭活c3。相较于野生型或有取代c122s(通过胰凝乳蛋白酶编号)的野生型对应形式，经修饰的u‑pa多肽显示对切割和灭活c3的活性增加。具体地，相较于seqidno:5的u‑pa蛋白酶结构域(有c122s的u‑pa蛋白酶结构域)，经修饰的u‑pa多肽的蛋白酶结构域显示c3的灭活切割活性提高。活性提高可以是相较于未修饰的u‑pa的10％、20％、50％、100％、1倍、2倍、3倍、4、5、6、7、8,9、10倍或更多。[0420]经修饰的u‑pa多肽可对天然底物如纤溶酶原的活性降低。例如，经修饰的u‑pa多肽可就纤溶酶原显示野生型或参考u‑pa多肽如seqidno:5所示u‑pa多肽的99％u‑pa活性，以及就切割c3以灭活其而言显示至少0.5倍、1倍、2倍、3倍或更多。例如，本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示小于或小于约99％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少的野生型或参考u‑pa多肽的u‑pa活性，所述野生型或参考u‑pa多肽如不含氨基酸修饰(例如氨基酸取代)的对应多肽，例如seqidno:5所示u‑pa蛋白酶结构域。[0421]例如，能通过例如氨基酸取代或置换修饰的示范性位置包括但不限于对应位置173、178、179、180、181、185、186、187、188、208、209、249、250、252、306、314或353的任何位置，参考seqidno:3所示氨基酸序列(对应位置30、35、36、37、37a、38、39、40、41、60a、60b、97a、97b、99、149、157或192，根据胰凝乳蛋白酶编号)。例如，氨基酸位置可以是在对应苯丙氨酸(f)位置的取代，参考seqidno:3所示氨基酸位置，在一个或多个位置173、r178、r179、h180、r181、v185、t186、y187、v188、d208、y209、t249、l250、h252、y306、m314或q353(对应f30、r35、r36、h37、r37a、v38、t39、y40、v41、d60a、y60b、t97a、l97b、h99、y149、m157和q192，分别根据胰凝乳蛋白酶编号)。[0422]任意上述位置的示范性氨基酸取代如表11所示。提及表11的对应位置，参考seqidno:3所示位置(也参见下面的实施例)。应理解取代能通过比对seqidno:3所示序列而在另一u‑pa多肽的对应位置进行，其中对应位置是匹配的位置。例如，取代能在有seqidno:2所示序列的u‑pa蛋白酶结构域，或在有seqidno:5所示序列的参考u‑pa蛋白酶结构域进行。一些示例中，氨基酸取代可在seqidno:5所示u‑pa多肽或其变体的对应位置，所述变体与其具有至少或至少约75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，尤其是95％或更高序列相同性，只要所得经修饰的u‑pa多肽相较对纤溶酶原的u‑pa活性，显示对补体蛋白c3的特异性改变(即提高)和/或对补体蛋白c3的选择性改变。一个示例中，任何一个或多个取代在seqidno:1‑6任一者中，只要所得经修饰的u‑pa多肽相较对纤溶酶原的u‑pa活性，显示对补体蛋白c3的特异性改变(即提高)和/或对补体蛋白c3的选择性改变。[0423][0424]本文所提供经修饰的u‑pa多肽的氨基酸修饰示例包括但不限于以下取代：在对应173位(根据胰凝乳蛋白酶编号是30)的位置处的酪氨酸(y)；在对应178位(根据胰凝乳蛋白酶编号是35)的位置处的w；在对应178位的位置处的y；在对应178位的位置处的q；在对应179位(根据胰凝乳蛋白酶编号是36)的位置处的h；在对应180位(根据胰凝乳蛋白酶编号是37)的位置处的e；在对应180位的位置处的p；在对应180位的位置处的d；在对应180位的位置处的n；在对应180位的位置处的g；在对应180位的位置处的k；在对应180位的位置处的y；在对应181位(根据胰凝乳蛋白酶编号是37a)的位置处的q；在对应181位的位置处的p；在对应181位的位置处的e；在对应181位的位置处的n；在对应181位的位置处的s；在对应185位(根据胰凝乳蛋白酶编号是38)的位置处的d；。在对应185位的位置处的e；在对应186位的位置处(根据胰凝乳蛋白酶编号是39)的w；在对应186位的位置处的y；在对应187位(根据胰凝乳蛋白酶编号是40)的位置处的h；在对应187位的位置处的f；在对应187位的位置处的q；在对应188位(根据胰凝乳蛋白酶编号是41)的位置处的r；在对应188位的位置处的l；在对应208位的位置处的p；在对应208位(根据胰凝乳蛋白酶编号是60a)的位置处的t；在对应209位(根据胰凝乳蛋白酶编号是60b)的位置处的q；在对应209位的位置处的h；在对应209位的位置处的s；在对应209位的位置处的a；在对应209位的位置处的t；在对应209位的位置处的l；在对应249位(根据胰凝乳蛋白酶编号是97a)的位置处的e；在对应249位的位置处的i；在对应250位(根据胰凝乳蛋白酶编号是97b)的位置处的a；在对应250位的位置处的g；在对应252位(根据胰凝乳蛋白酶编号是99)的位置处的q；在对应306位(根据胰凝乳蛋白酶编号是149)的位置处的k；在对应306位的位置处的r；在对应314位(根据胰凝乳蛋白酶编号是157)的位置处的k；或在对应353位(根据胰凝乳蛋白酶编号是192)的位置处的h；各自参考seqidno:3所示氨基酸位置。在对应279位的位置处的s(根据胰凝乳蛋白酶编号的122s)取代游离cys，从而降低聚集趋势。[0425]含有2个或更多氨基酸修饰的示范性经修饰的u‑pa多肽如下表12所示，其用于切割c3的活性如表14所述。sequenceidno涉及含有所示举取代的示范性u‑pa蛋白酶结构域，其包括c122s处的取代以减少或消除聚集。c122是游离半胱氨酸，其能引起蛋白酶多肽之间的交联。应理解蛋白酶结构域是示范性、全长和前体分子，以及蛋白酶结构域的其他催化活性部分，全长和前体多肽能包括所示举取代，以形成全长的激活修饰u‑pa多肽和其他形式。[0426][0427][0428][0429]2.额外修饰[0430]本文所提供任何经修饰的u‑pa多肽能包含一个或多个额外修饰。额外修饰可包括例如本领域已知的任何氨基酸取代、缺失或插入，通常是相较对纤溶酶原的u‑pa活性会增加对补体蛋白c3的特异性和/或对补体蛋白c3的选择性改变的任意那些。同样，考虑改变任何其他感兴趣活性的修饰。本领域众所周知一级序列的氨基酸修饰是叠加的(参见例如wells(1990)biochem29:8509‑8517)。本文所提供任何经修饰的u‑pa多肽能包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多额外氨基酸修饰以提供其他活性或改变活性。[0431]能纳入本文所提供经修饰的u‑pa多肽的额外修饰示例包括但不限于描述于以下的那些：美国专利号4,997,766；5,126,134；5,129,569；5,275,946；5,571,708；5,580,559；5,648,253；5,728,564；5,759,542；5,811,252；5,891,664；5,932,213；5,980,886；6,248,712；6,423,685；7,070,925；7,074,401；7,807,457；7,811,771；8,211,428；美国专利公开号2002/0106775；2004/0265298；2004/0146938；2009/0010916；2011/0055940；2008/0020416；2006/0142195；国际专利公开号wo1988/008451；wo1989/010401；wo1990/004635；wo1996/013160；wo2002/40503；petersen等.(2001)eurjbiochem268:4430‑4439；skeldal等.(2006)febsj273:5143‑5149；sun等.(1997)jbiolchem272:23818‑23823；blouse等.(2009)jbiolchem284:4647‑4657；nelles等.(1987)jbc262:5682‑5689；crowley等.(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:5021‑5025；zeslawska等.(2000)jmolbiol301:465‑475；zeslawska等.(2003)jmolbiol328:109‑118；quax等.(1998)arteriosclerthrombvascbiol18:693‑701；homandberg和wai(1990)thrombinres58:403‑412；zaitsev等.(2010)blood115:5241‑5248；yang等.(1994)biochemistry33:606‑612；davidow等.(1991)proteineng4:923‑928；boutad和castellino(1993)archbiochembiophys303:222‑230；tsujikawa等.(1996)yeast12:541‑553；carriero等.(2002)biolchem383:107‑113；stopelli等.(1985)proc.natl.acad.sci.u.s.a.82:4939‑4943；stoppelli等.(1987)jbiolchem262:4437‑4440；francoetal.(1998)jbiolchem273:27734‑27740；francoetal.(1997)jcellbiol137:779‑791；li等.(1995)jbiolchem270:30282‑30285；botkjaer等.(2009)biochemistry48:9606‑9617；bdeir等.(2003)blood102:3600‑3608；eguchi等.(1990)jbiochem108:72‑79；miyake等.(1988)jbiochem104:643‑647；bergstrom等.(2003)biochem42:5395‑5402；sun和liu(2005)proteins61:870‑877；sun等.(1998)biochemistry37:2935‑2940；anderson等.(2008)biochemj412:447‑457；li等.(1992)biochimbiophysacta1159:37‑43；lijnen等.(1988)eurjbiochem177:575‑582；lijnen等.(1988)eurjbiochem172:185‑188；lijnen等.(1992)eurjbiochem205:701‑709；lijnen等.(1994)eurjbiochem224:567‑574；lijnen等.(1990)jbiolchem265:5232‑5236；yoshimoto等.(1996)biochimbiophysacta1293:83‑89；magdolen等.(1996)eurjbiochem237:743‑751；nienaber等.(2000)jbiolchem275:7239‑7248；gurewich等.(1988)jclininvest1956‑1962；liu等.(1996)biochemistry35:14070‑14076；liu等.(2002)circres90:757‑763；mukhina等.(2000)jbiolchem275:16450‑16458；peng等.(1997)biochemmolbiolint41:887‑894；turkmen等.(1997)electrophoresis18:686‑689；peng等.(1999)biotechnollett21:979‑985；ueshima等.(1994)thrombhaemost71:134‑140；和melnick等.(1990)jbiolchem265:801‑807。本领域所述示范性氨基酸修饰的非限制性示例包括以下任意一种或多种：s9a、c13a、t18a、c19a、v20a、s21a、n22y、n22a、n22q、n22r、k23a、k23h、k23q、k23e、y24a、f25a、s26a、s26f、n27a、n27r、i28a、h29a、h29r、w30a、w30r、w30f、n32s、k35a、g38r、e43a、i44a、d45a、k46a、s47a、s47g、k48a、k48p、t49a、y51a、n54a、l80h、q81r、q82p、t83r、h99y、p105a、d106a、n107a、r108a、r108d、r109a、r110a、g118n、l119r、k120r、k120a、p121l、l122t、l122r、v123y、v123w、q124a、e125a、h129a、d130g、c131w、k135g、k135s、k135y、k135q、k136p、s138e、c148s、c148a、k151e、t152a、r154g、r154p、r154a、p155r、p155l、p155a、p155n、p155s、p155g、p155q、r156p、r156a、r156h、r156s、r156y、r156e、r156g、r156l、f157l、f157t、f157g、f157q、f157d、f157e、k158r、k158e、k158a、k158h、k158s、k158y、k158g、k158w、k158v、k158m、i159r、i159a、i159p、i159g、i160a、i160k、g162r、e163a、f164v、f164a、f164v、i167l、p171l、f173i、f173v、f173l、f173t、f173g、f173m、a175s、y177a、r178a、r179a、h180a、r181a、s184a、t186a、t186e、t186d、y187a、y187h、v188a、s192n、i194m、s195a、h204a、h204q、f206a、d208a、y209a、p210a、k211a、k211q、k212a、e213a、d214a、y215a、i216a、y218a、r221a、s222l、r223g、r223a、l224a、l224p、n225a、s226p、n227a、q229a、e231g、k233e、k233a、f234a、e235k、e235a、e237a、i240v、k243e、k243a、d244a、y245a、d255a、r262a、k264a、e265a、r267a、c268y、c279s、c279a、f289l、g290d、e294g、i295t、g297d、f298a、g299a、g299h、k300a、k300h、k300w、e301d、e301a、e301h、n302a、n302q、n302v、n302l、n302i、n302s、n302t、s303e、s303a、s303e、t304a、t304v、t304m、d305a、y306a、y306g、y306v、y306h、l307a、y308a、p309a、p309s、p309t、p309v、p309g、p309n、p309l、p309d、p309r、p309h、p309f、p309w、e310a、q311a、l312p、l312v、l312m、k313y、k313t、k313a、k313h、t315a、t315i、v316a、v317a、y330h、a343t、d344a、q346a、w347a、k348a、k348e、t349i、d350a、s351a、q353a、g354r、d355a、s356a、g357e、g366c、r378c、r378a、k383a、k385a、r400a、h402a、k404a、e405a、e406ag408a或a410v，根据seqidno:3所示氨基酸序列。额外修饰包括引入糖基化位点的氨基酸取代。[0432]经修饰的u‑pa多肽包括含有化学或翻译后修饰的那些。一些示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽不包含化学或翻译后修饰。化学或翻译后修饰包括但不限于聚乙二醇化、唾液酸化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟化、pas化、hes化、磷酸化、连接多聚化结构域如fc，和本领域已知其他多肽修饰。除了本文提供的任意一种或多种氨基酸修饰，如氨基酸取代、插入、缺失和其组合，本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用本领域已知任何方法缀合或融合任何部分，包括化学和重组方法，提供的所得多肽处于活性形式时，保留实现补体蛋白c3抑制性或灭活切割的能力。[0433]例如，除了本文提供的任意一种或多种氨基酸修饰如氨基酸取代，本文所提供经修饰的u‑pa多肽还能包含其他在或不在多肽一级序列中的修饰，包括但不限于采用以下的修饰：碳水化合物部分、聚乙二醇(peg)部分、硅烷基化部分、来自免疫球蛋白g的fc结构域或者任何其他结构域或部分。例如，[0434]a.免疫原性降低[0435]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能修饰成免疫原性降低。免疫原性降低可如下实现：通过消除来自多肽的抗原表位的序列变化或通过改变翻译后修饰。本领域技术人员熟悉鉴定多肽中抗原表位的方法(参见例如liang等.(2009)bmcbioinformatics,10:302；yang等.(2009)rev.med.virol.,19:77‑96)。一些示例中，能修饰一个或多个氨基酸以移出或改变抗原表位。另一示例中，改变蛋白的糖基化也能影响免疫原性。例如，考虑改变肽的糖基化，只要多肽保留实现补体蛋白c3抑制性或灭活切割的能力。糖基化位点可通过单突变移除。糖基化位点能通过引入标准序列而添加，如通过插入单或多个突变，例如nxs(t)，其中x不是脯氨酸。糖基化位点还可增加血清半衰期。[0436]b.fc结构域[0437]经修饰的u‑pa多肽能连接免疫球蛋白多肽的fc区。通常，这种融合保留至少一个功能活性铰链，免疫球蛋白重链恒定区的ch2和ch3结构域。例如，igg1的全长fc序列包括下面seqidno:45所示序列的氨基酸99‑330。[0438][0439]用于higg1的示范性fc序列如所示seqidno:50：[0440][0441]其包含对应seqidno:45氨基酸100‑110的几乎所有铰链序列；seqidno:45所示ch2和ch3结构域的完整序列。[0442]另一示范性fc多肽如pct申请公开号wo93/10151所示，且是从人igg1抗体(seqidno:50)n末端铰链区延伸到天然c末端fc区的单链多肽。形成连接的精确位点并不关键：熟知具体位点且能选择以优化habp多肽的生物活性、分泌或结合特征。例如，其他示范性fc多肽序列在seqidno:45所示序列的氨基酸c109或p113处开始(参见例如美国公开号2006/0024298)。[0443]除了higg1fc，还能使用其他fc区和其他多聚化结构域。例如，当由fc/fcγr相互作用介导的效应子功能最小化时，考虑与募集补体或效应细胞较弱的igg亚型融合，例如igg2或igg4的fc。另外，fc融合能包含免疫球蛋白序列，其基本由属于任意抗体种类的免疫球蛋白基因编码，包括但不限于igg(包含人子类igg1、igg2、igg3或igg4)、iga(包含人子类iga1和iga2)、igd、ige和igm类抗体。接头能用于共价连接fc与另一多肽以产生fc嵌合体。[0444]还熟知经修饰fc结构域。一些示例中，fc区修饰成显示与fcr的结合改变，以引起效应子功能相比野生型免疫球蛋白重链fc区的效应子功能改变(即更多或更少)。因此，经修饰fc结构域可具有改变的亲和性，包括但不限于对fc受体的亲和性增加或较低或没有。例如，不同igg子类对fcγrs的亲和性不同，igg1和igg3通常对受体的结合显著优于igg2和igg4。不同fcγrs介导不同的效应子功能。fcγr1,fcγriia/c和fcγriiia是免疫复合物引发激活的正调节物，其特征是具有带免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的胞内结构域。然而，fcγriib具有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)并因而是抑制性的。改变fc区对受体的亲和性能调节与fc结构域相关的效应子功能和/或药代动力学性质。经修饰fc结构域为本领域技术人员已知且描述于文献，示范性修饰参见例如美国专利号5,457,035；美国专利公开号us2006/0024298；和国际专利公开号wo2005/063816。[0445]所得嵌合多肽包含fc部分和从中形成的多聚体，易通过蛋白a或蛋白g柱上的亲和层析纯化。[0446]另一示例中，经修饰的u‑pa多肽能连接人血清白蛋白(hsa)，如hsa的残基25‑608，或全长或其部分：[0447][0448]c.缀合聚合物[0449]一些示例中，本文所提供经修饰的u‑pa多肽缀合其他聚合物。聚合物能增加多肽大小以降低肾脏清除并因而提高半衰期或修饰蛋白结构以增加半衰期或减少免疫原性。能缀合u‑pa多肽的示范性聚合物包括天然和合成均聚物，如多元醇(即聚oh)、多胺(即聚nh2)和聚羧酸(即聚cooh)以及其他杂聚物，即包含一个或多个不同偶联基团的聚合物，如羟基和胺基。合适聚合分子的示例包括选自以下的聚合分子：聚环氧烷(pao)如聚烷撑二醇(pag)，包括聚乙二醇(peg)、聚乙二醇单甲醚(mpeg)和聚丙二醇，peg‑缩水甘油醚(epox‑peg)、peg‑氧羰基咪唑(cdi‑peg)、支化聚乙二醇(pegs)、聚乙烯醇(pva)、聚羧酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、聚‑d,l‑氨基酸、乙烯马来酸酐共聚物、苯乙烯马来酸酐共聚物、葡聚糖，包括羧甲基‑葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素、壳聚糖水解产物、淀粉如羟乙基‑淀粉和羟丙基‑淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物、瓜尔胶、普鲁兰多糖、菊粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、海藻酸水解产物和生物聚合物。[0450]通常，聚合物是聚环氧烷(pao)如聚氧化乙烯，例如peg，一般是mpeg，其具有一些能够交联的反应基。通常，聚合物是无毒聚合分子如(甲氧基)聚乙二醇(mpeg)，其可用相对简单的化学方法共价缀合u‑pa多肽(如蛋白表面的粘附基团)。[0451]用于附着u‑pa多肽的合适聚合分子包括但不限于：聚乙二醇(peg)和peg衍生物如甲氧基‑聚乙二醇(mpeg)、peg‑缩水甘油醚(epox‑peg)、peg‑氧羰基咪唑(cdi‑peg)、分枝peg和聚氧化乙烯(peo)(参见例如roberts等,advanceddrugdeliveryreview2002,54:459‑476；harris和zalipsky(编.)“聚乙二醇，化学和生物应用(poly(ethyleneglycol),chemistryandbiologicalapplications)”acssymposiumseries680,1997；mehvar等,j.pharm.pharmaceut.sci.,3(1):125‑136,2000；harris和chess(2003)natrevdrugdiscov.2(3):214‑21；和tsubery,jbiol.chem279(37):38118‑24,2004)。聚合分子可具有范围为约3kda‑约60kda的分子量。在一些实施方案中，所述缀合本文所提供经修饰的u‑pa多肽的聚合分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大于60kda的分子量。[0452]经共价粘附(缀合)peg或peg衍生物(即“聚乙二醇化”)来修饰多肽的方法为本领域熟知(参见例如u.s.2006/0104968；u.s.5,672,662；u.s.6,737,505；和u.s.2004/0235734)。聚乙二醇化的技术包括但不限于专门接头和偶联化学(参见例如harris,adv.drugdeliv.rev.54:459‑476,2002)、使多个peg部分附于单缀合位点(如通过使用支化peg；参见例如veronese等,bioorg.med.chem.lett.12:177‑180,2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如chapman等,naturebiotech.17:780‑783,1999)和定向酶促聚乙二醇化(参见例如sato,adv.drugdeliv.rev.,54:487‑504,2002)(还参见例如lu和felix(1994)int.j.peptideproteinres.43:127‑138；lu和felix(1993)peptideres.6:142‑6,1993；felix等.(1995)int.j.peptideres.46:253‑64；benhar等.(1994)j.biol.chem.269:13398‑404；brumeanu等.(1995)jimmunol.154:3088‑95；还参见caliceti等.(2003)adv.drugdeliv.rev.55(10):1261‑77和molineux(2003)pharmacotherapy23(8pt2):3s‑8s)。本领域所述方法和技术能生成蛋白，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个peg或peg衍生物附于单蛋白分子。[0453]本领域描述用于聚乙二醇化的多种试剂。这类试剂包括但不限于：n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化peg、琥珀酰亚胺mpeg、mpeg2‑n‑羟基琥珀酰亚胺、mpegα‑甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丙酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg羧甲基3‑羟丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg‑丙酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg丙醛、同双功能peg丁醛、peg马来酰亚胺、peg酰肼、对硝基苯碳酸酯peg、mpeg‑苯并三唑碳酸酯、丙醛peg、mpeg丁醛、分枝mpeg2丁醛、mpeg乙酰、mpeg哌啶酮、mpeg甲基酮、mpeg“无接头”马来酰亚胺、mpeg乙烯砜、mpeg硫醇、mpeg邻吡啶硫酯、mpeg邻二硫吡啶、fmoc‑peg‑nhs、boc‑peg‑nhs、乙烯砜peg‑nhs、丙烯酸peg‑nhs、荧光素peg‑nhs和生物素peg‑nhs(参见例如monfardini等,bioconjugatechem.6:62‑69,1995；veronese等,j.bioactivecompatiblepolymers12:197‑207,1997；u.s.5,672,662；u.s.5,932,462；u.s.6,495,659；u.s.6,737,505；u.s.4,002,531；u.s.4,179,337；u.s.5,122,614；u.s.5,183,550；u.s.5,324,844；u.s.5,446,090；u.s.5,612,460；u.s.5,643,575；u.s.5,766,581；u.s.5,795,569；u.s.5,808,096；u.s.5,900,461；u.s.5,919,455；u.s.5,985,263；u.s.5,990,237；u.s.6,113,906；u.s.6,214,966；u.s.6,258,351；u.s.6,340,742；u.s.6,413,507；u.s.6,420,339；u.s.6,437,025；u.s.6,448,369；u.s.6,461,802；u.s.6,828,401；u.s.6,858,736；u.s.2001/0021763；u.s.2001/0044526；u.s.2001/0046481；u.s.2002/0052430；u.s.2002/0072573；u.s.2002/0156047；u.s.2003/0114647；u.s.2003/0143596；u.s.2003/0158333；u.s.2003/0220447；u.s.2004/0013637；us2004/0235734；u.s.2005/000360；u.s.2005/0114037；u.s.2005/0171328；u.s.2005/0209416；ep01064951；ep0822199；wo00176640；wo0002017；wo0249673；wo9428024；和wo0187925)。[0454]d.蛋白转导结构域[0455]可连接本文所提供经修饰的u‑pa多肽，如含抗体或其抗原结合片段的融合蛋白，缀合蛋白转导结构域(ptd)，这增加抗体在治疗靶位点的保留，如粘膜位点例如眼睛。可采用任何ptd，只要ptd促进在治疗位点(如粘膜位点)的靶细胞表面结合和/或靶细胞在治疗位点(如粘膜位点例如眼睛)摄取经修饰的u‑pa多肽。[0456]一般，ptd包括短的阳离子肽，其能通过静电粘附细胞膜而结合细胞表面且能通过膜转位被细胞摄取(kabouridis(2003)trendsbiotech21(11)498‑503)。所提供的ptd一般与靶细胞相互作用，这是通过结合糖胺聚糖(gag)例如透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白或硫酸软骨素和其衍生屋。[0457]蛋白转导结构域可以是任何长度。一般，ptd长度范围是5或约5‑100或约100个氨基酸长度。例如，ptd长度范围可以是5或约5‑25或约25个氨基酸长度。一些示例中，ptd是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸长度。[0458]单一ptd或其集合能缀合经修饰的u‑pa多肽。这些有利地用于治疗眼部或眼科疾病，例如糖尿病视网膜病变或黄斑变性，包括amd。例如，多拷贝的相同ptd(如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或更大的多聚体)或不同ptd能缀合经修饰的u‑pa多肽。[0459]数种蛋白和其肽衍生物具备细胞内化性质。本领域已知示范性ptd，包括但不限于下表所示的ptd，包括例如衍生自以下的ptd：人类免疫缺陷病毒1(hiv‑1)tat(seqidno:125‑135；ruben等.(1989)j.virol.63:1‑8),疱疹病毒被膜蛋白vp22(seqidno:140；elliott和o’hare(1997)cell88:223‑233),黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)触角足(antp)蛋白的同源异型蛋白(penetratinptd；seqidno:112；derossi等.(1996)j.biol.chem.271:18188‑18193),protegrin1(pg‑1)抗菌肽synb(例如synb1(seqidno:121),synb3(seqidno:122)和synb4(seqidno:123)；kokryakov等.(1993)febslett.327:231‑236)以及kaposi成纤维细胞生长因子(seqidno:105；lin等,(1995)j.biol.chem.270‑14255‑14258)。[0460]发现其他蛋白和其肽衍生物具备类似的细胞内化性质。衍生自这些蛋白的载体肽显示彼此的序列同源性小，但都是高阳离子和精氨酸或赖氨酸富集。确实，合成的聚精氨酸肽显示以高效率水平内化且能选择用于缀合以提供抗体(futaki等.(2003)j.mol.recognit.16:260‑264；suzuki等.(2001)j.biol.chem.276:5836‑5840)。ptd还能选自一种或多种合成ptd，包括但不限于转运素(seqidno:136；pooga等.(1988)fasebj.12:67–77；pooga等.(2001)fasebj.15:1451–1453),map(seqidno:103；oehlke等.(1998)biochim.biophys.acta.1414:127–139),kala(seqidno:101；wyman等.(1997)biochemistry36:3008–3017)和其他阳离子肽，例如variousβ‑cationicpeptides(akkarawongsa等.(2008)antimicrob.agentsandchemother.52(6):2120‑2129)。其他ptd肽和变异ptd也提供于例如美国专利公开号us2005/0260756,us2006/0178297,us2006/0100134,us2006/0222657,us2007/0161595,us2007/0129305,欧洲专利公开号ep1867661,pct公开号wo2000/062067,wo2003/035892,wo2007/097561,wo2007/053512和本文表13(下面)。本文提供或本领域已知的任何这类ptd能缀合所提供的治疗抗体。[0461][0462][0463]一些示例中，ptd能如下修饰：赖氨酸或精氨酸用另一碱性氨基酸取代，如赖氨酸用精氨酸取代或精氨酸用赖氨酸取代。。[0464]e.用于评价或监测补体介导功能的u‑pa活性的试验[0465]本文所提供经修饰的u‑pa多肽显示对补体蛋白c3的特异性和/或选择性改变。示范性经修饰的u‑pa多肽特异性切割补体蛋白c3，并因而改变补体激活。此外，本文所提供示范性经修饰的u‑pa多肽对切割天然u‑pa底物如纤溶酶原以及结合upar的特异性和/或选择性改变或降低。[0466]多个体外和体内试验能用于监测或筛选u‑pa多肽切割补体蛋白c3的能力和其对补体激活及补体介导疾病和失调的影响。这类试验为本领域技术人员已知。本领域技术人员能就切割补体蛋白c3测试特定u‑pa多肽和/或测试评估u‑pa对补体介导活性影响相较没有蛋白酶时的任何变化。一些这类试验如本文所示例。[0467]本文提供示范性体外和体内试验用于比较经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3功能的活性。如下所讨论，本领域技术人员已知多种试验，如用于检测补体激活的试验。本文还提供示范性试验以就野生型u‑pa活性如切割纤溶酶原或结合upar而言，测定经修饰的u‑pa多肽活性。还提供确定经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3特异性的试验。示范性试验如下所述。[0468]1.用于评价补体蛋白c3功能的u‑pa活性的方法[0469]相较于对应全长、支架或野生型经修饰u‑pa蛋白酶，经修饰u‑pa蛋白酶能显示对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性改变，从而灭活任意一种或多种补体蛋白，例如c3。经修饰u‑pa蛋白酶保留其蛋白酶活性，但能显示对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加。示范性经修饰u‑pa蛋白酶特异切割任意一种或多种补体蛋白，例如c3，从而改变补体蛋白活性。所有这类经修饰u‑pa蛋白酶是候选治疗剂，其对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加。[0470]经修饰u‑pa蛋白酶在体外和体内试验中显示对任意一种或多种补体蛋白的特异性和/或选择性增加时，能用于监测或筛选蛋白酶对补体介导功能的影响。本领域技术人员熟知这类试验。本领域技术人员可就切割任意一种或多种补体蛋白例如c3测试经修饰u‑pa蛋白酶，和/或测试经修饰u‑pa蛋白酶对补体介导活性影响相较没有经修饰u‑pa蛋白酶时的任何变化。一些这类试验如本文所示例。[0471]本文提供示范性体外和体内试验以比较经修饰u‑pa蛋白酶对任意一种或多种靶向补体蛋白功能的活性。许多试验可应用于其他蛋白酶和经修饰蛋白酶。如上所讨论，用于补体活性的试验包括但不限于以下试验：检测补体激活的活化产物例如c5b‑9mac复合物，和产生任意一种或多种补体切割产物如c4a,c5a,c3b及c3d。检测补体激活的试验也包括测量补体途径特定成分功能活性的功能试验，例如用于检测激活经典、凝集素或替代途径中任意一种的溶血实验。评价蛋白酶和经修饰蛋白酶对补体蛋白和/或补体介导功能影响的试验包括但不限于：sds分析然后是蛋白质印迹或考马斯亮蓝染色、酶免疫测定和溶血实验。在一个示例中，体外试验能用纯化补体蛋白进行。另一示例中，体内试验能如下进行：就补体功能激活测试物种血清，包括哺乳动物或人种。示范性试验如下所述。[0472]在一个示例中，体外试验能用纯化补体蛋白c3进行，如实施例2‑4所例示。另一示例中，体外试验能在生理相关溶液(即玻璃体液)中实施，如实施例5所例示。另一示例中，体外试验能用肽文库进行以评价切割特异性。另一示例中，可实施试验以评价经修饰的u‑pa多肽的正常功能，即针对正常底物的活性。本领域技术人员已知的多个疾病模型能用于测试本文所提供u‑pa多肽对多种补体介导疾病和失调的功效。[0473]a.蛋白检测[0474]蛋白检测是测量样品中个体补体蛋白的方式。可检测补体蛋白以评价u‑pa多肽对切割补体蛋白c3的影响，或者补体蛋白能作为评价补体激活的方式测量。补体蛋白c3在有或没有u‑pa多肽的情况下处理，能通过任意一种或多种试验分析，包括sds‑page然后是考马斯亮蓝染色或蛋白质印迹、酶免疫测定、免疫组化、流式细胞术、浊度测定、琼脂凝胶扩散或放射免疫扩散。用于蛋白检测的示范性试验如下所述。[0475]i.sds‑page分析[0476]有或没有增加u‑pa多肽浓度情况下的补体蛋白分析可如下进行：在sds‑page上分析蛋白，然后检测这些蛋白。这类示例中，可检测补体蛋白，这是通过染色总蛋白，如考马斯亮蓝染色、银染，或通过本领域技术人员已知的任何其他方法，或者通过蛋白质印迹，使用特异于指定蛋白的多克隆或单克隆抗体。通常，纯化的补体蛋白例如补体蛋白c3能在有或没有u‑pa多肽的情况下孵育。经处理补体蛋白可在sds‑page胶上解析，然后采用检测胶中蛋白的方法，例如考马斯亮蓝染色。经处理蛋白可与其同源全长蛋白作比较，可测定通过蛋白酶切割蛋白所形成的降解产物。[0477]在另一实施方案中，样品例如人血清或血浆，能在有或没有u‑pa多肽的情况下处理，或能在有或没有u‑pa多肽情况下处理动物或人之后收集。经u‑pa处理样品可在sds‑page胶上分析，且可检测特异补体蛋白，例如c3、c5或因子b，这是通过蛋白质印迹，使用针对该蛋白的单克隆或多克隆抗体。切割补体蛋白能与未用u‑pa多肽处理的样品作比较。另外，可刺激样品起始补体激活，例如通过与刺激经典途径激活的igg孵育，或通过刺激替代途径激活的lps。样品可在sds‑page上解析以检测任意一种或多种天然补体蛋白，从而确定相较未用u‑pa多肽处理的蛋白样品，是否存在指定蛋白的切割产物。这类示例中，天然补体蛋白的切割效应分子还能通过蛋白质印迹分析，使用单克隆和多克隆抗体以评价一个或多个补体途径的激活。补体效应分子示例可包括但不限于c3a、c3d、ic3b、bb和c5‑b9。例如，bb样品中的表达减少可能指示u‑pa多肽抑制补体替代途径激活。还能确定效应分子的切割产物以评估增加u‑pa多肽浓度本身对切割补体效应分子的影响。[0478]ii.酶免疫测定[0479]酶免疫测定(eia；也称为酶联免疫吸附试验；elisa)是测量样品中蛋白存在的试验。通常，检测蛋白是间接测量蛋白与抗体结合，抗体本身就化学标记有可检测底物如酶或荧光化合物。通过测量补体激活后产生的补体效应分子是否存在，eia试验能用于检测u‑pa多肽对补体激活的影响。这类示例中，样品例如人血清或血浆，能在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下预处理，随后通过起始分子孵育来活化以诱导补体激活，或者能在动物或人用u‑pa多肽处理后收集。例如，经典途径可通过igg孵育激活，替代途径可通过样品与lps孵育激活。特异于凝聚素途径的补体激活试验需要补体经典途径受抑制，因为凝聚素途径的c4/c2切割活性与补体经典途径共有。抑制经典途径可用高离子强度缓冲液实现，其抑制c1q结合免疫复合物并破坏c1复合物，而高离子强度缓冲液不影响mbl的碳水化合物结合活性。因此，凝聚素途径的激活能通过样品如人血清或血浆与甘露包被表面孵育来诱导，存在1mnacl。[0480]激活后，样品能通过添加pefabloc(罗氏(roche))和edta来淬灭，以尽可能减少途径的持续激活。可通过eia或elisa试验分析样品是否存在补体效应分子。本领域技术人员熟知用于测量补体蛋白的eia和elisa试验。可评估任何补体激活产物。用于测量补体激活的示范性补体激活产物包括ic3b、bb、c5b‑9、c3a、c3a‑desarg和c5a‑desarg。活化的补体途径可根据所测补体激活产物来测定。例如，测量bb切割产物是替代途径的独特标记。[0481]在一些示例中，eia能与检测经切割补体蛋白配对，这是通过sds‑page然后蛋白质印迹分析来分析蛋白酶处理、补体刺激的样品，以鉴定特定补体成分。使用密度测定软件，切割补体产物能与试验中切割的全长补体成分作比较，可测定所有主要降解产物的外观和切割百分比。[0482]iii.放射免疫扩散(rid)[0483]放射免疫扩散(rid)是依赖免疫复合物沉淀的技术，其在灌入时于纳入凝胶的抗体之间形成，且测试样品中存在的抗原引起样品孔周围的循环沉淀素线。沉淀素环的直径与测试样品中存在的抗体(或抗原)浓度成比例。通过比较测试样本沉淀素环的直径与已知标准，可实现特定抗体或抗原浓度的相对不灵敏估计。rid能用于检测样品中补体蛋白的量。例如，样品如人血清或血浆可在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下处理。蛋白酶预处理的样品能加入琼脂糖凝胶孔，所述孔制备成纳入针对任何一种补体蛋白的多克隆或单克隆抗体，所述补体蛋白例如包括但不限于c3、c5、c6、c7、c9或因子b。通过暴露于0.15mnacl而移除未沉淀蛋白后，沉淀蛋白环能通过蛋白染料染色来评价，例如考马斯亮蓝或crowles双染色。[0484]b.溶血实验[0485]功能性溶血实验提供关于补体功能的整体信息。此类试验采用抗体致敏或未致敏绵羊红细胞。溶血实验包括总溶血补体实验(ch50)，其测量经典途径和mac裂解绵羊rbc的能力。其依赖于经典途径成分(c1‑c9)连续激活以裂解绵羊红细胞，所述细胞用最优量的兔抗绵羊红细胞抗体致敏以制备细胞抗原‑抗体复合物。溶血实验还可包括替代途径ch50试验(兔ch50或apch50)，其测量替代途径和mac裂解兔rbc的能力。一个ch50和/或apch50单位定义为裂解测试中50％红细胞所需的血清量或稀释度。通常，为评价补体激活，样品如人血清或血浆可在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下处理，或可在有或没有u‑pa多肽情况下处理动物或人之后收集。蛋白酶处理的样品能随后混合用igg激活或致敏的绵羊红细胞。仅混合绵羊红细胞的水样品能用作总裂解对照以精确评估所分析样品的裂解百分比。向样品加入0.15mnacl可添加到终止裂解反应。通过测量血红蛋白释放，可评估经激活补体途径末端成分诱导的红细胞裂解。测量可通过样品的光密度(od)读数，使用od415nm处的分光光度计。[0486]在一个实施方案中，限制稀释溶血实验能用于测量任一途径特定成分的功能活性。这类试验中，采用的血清来源具有过量的所有补体成分，但缺乏样品所测成分，即培养基或血清来源就特定蛋白而言是补体耗尽的。因此，溶血取决于测试样品中所测成分的存在。这类试验中，纯化的补体蛋白例如任意一种天然补体蛋白，包括但不限于c3，可在有或没有增加u‑pa多肽浓度的情况下孵育。然后，蛋白酶处理的纯化补体蛋白能混合补体耗尽的培养基或血浆，igg活化绵羊红细胞和样品溶血可如上所述评估。在另一实施方案中，蛋白裂解能与补体激活相关联，这是通过测定蛋白酶处理样品的溶血活性，接着在sds‑page胶上分析样品，然后用蛋白染色剂染色，例如考马斯亮蓝。可就切割评价蛋白酶处理的纯化补体蛋白，可计算整个试验中切割的全长补体成分百分比。或者，蛋白酶处理的补体蛋白能通过蛋白质印迹分析。[0487]溶血实验的一个替代方案称为脂质体免疫测定(lia)，能用于评价经典途径的激活。lia(美国化学品公司(wacochemicalsusa),弗吉尼亚州里士满)采用二硝基苯基(dnp)包被的脂质体，其含有葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶。当血清混合脂质体和含有抗dnp抗体、葡萄糖‑6‑磷酸及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的底物时，活化的脂质体裂解且酶促比色反应发生，所述反应与总经典补体活性成比例。[0488]c.确定切割位点的方法[0489]补体蛋白c3的切割序列能通过本领域已知任何方法鉴定(参见例如发表的美国公开号us2004/0146938)。在一个示例中，通过孵育补体蛋白c3与本文所提供任意经修饰的u‑pa多肽，确定切割序列。u‑pa多肽孵育后，c3蛋白能通过sds‑page分离且降解产物能通过蛋白染色剂如考马斯亮蓝染色来鉴定。蛋白裂解片段可测序以确定切割序列的特性。鉴定后，基于所需靶底物切割序列设计的荧光肽底物能用于评价活性，如下所述。[0490]2.评价野生型u‑pa活性的方法[0491]本文所提供经修饰的u‑pa多肽对纤溶酶原和upar的特异性改变或降低。可测试u‑pa多肽以确定其就天然底物纤溶酶原而言是否保留催化效率和/或底物特异性。例如，切割纤溶酶原能如下评价：孵育u‑pa多肽与纤溶酶原，检测蛋白切割产物。另一示例中，切割纤溶酶原能如下体外测定：测量肽底物的荧光标记四肽的切割，所述底物例如荧光底物如连接四肽底物的荧光团acc(7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基香豆素)或amc(7‑氨基‑4‑甲基香豆素)。一些示例中，纤溶酶原激活试验用于确定本文所提供经修饰的u‑pa多肽的特异性。在其他示例中，确定本文所提供u‑pa多肽结合u‑pa受体(upar)的能力。[0492]a.切割纤溶酶原[0493]在一个示例中，经修饰的u‑pa多肽能用对应所需切割序列的单独荧光肽底物测定。例如，可切割任意一种或多种所需切割序列的经修饰u‑pa蛋白酶的测定方法包括：(a)使肽荧光样品(包含所需靶切割序列)接触蛋白酶，采用的方式使荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物序列释放，从而生成荧光部分；和(b)观察样品是否发生荧光的可检测变化，可检测变化指示样品中存在酶活性蛋白酶。这种示例中，所需靶切割序列通过本领域已知方法制备到荧光肽内。在一个实施方案中，所述单独肽切割序列能附于荧光标记底物例如acc或amc荧光离去基团，荧光部分的释放能作为蛋白酶对肽切割序列特异性的量度测定。靶切割序列的荧光增加率可用例如荧光分光光度计测量。荧光增加率能随着时间测量。米氏动力学常数可通过标准动力学方法确定。动力学常数kcat、km和kcat/km能如下计算：将底物浓度的倒数相比底物切割速度的倒数作图，并拟合lineweaver‑burk方程(1/速度＝(km/vmax)(1/[s]) 1/vmax；其中vmax＝[et]kcat)。二阶速度常数或特异性常数(kcat/km)是底物如何更好被特定蛋白酶切割的量度。例如，可制备acc‑或amc‑四肽如ac‑cpgr‑amc并与本文所提供经修饰的u‑pa多肽孵育，u‑pa多肽活性能通过测定荧光部分释放来评价。四肽的选择取决于靶标的所需切割序列且能凭经验确定。[0494]在其他实施方案中，也能分析u‑pa多肽以确认其处于活性形式时，切割全长蛋白情况下存在的所需序列。在一个示例中，纯化的靶蛋白即纤溶酶原能在有或没有选定u‑pa多肽的情况下孵育，监测切割事件可通过sds‑page，然后是用于蛋白的考马斯亮蓝染色和采用密度测定的切割产物分析。[0495]b.纤溶酶原激活试验[0496]本领域技术人员已知的任何试验能用于确定u‑pa多肽是否激活纤溶酶原。在一个示例中，纤溶酶原的激活可通过在纤溶酶原和可检测纤溶酶底物存在下孵育多肽来确定，所述底物例如生色底物h‑d‑val‑leu‑lys‑对硝基苯胺(chromogenixs‑2251)或荧光底物h‑d‑val‑leu‑lys‑7‑氨基‑4‑甲基香豆素。水解随后如下监测：在405nm测量吸光度，或用荧光读板仪检测荧光，激发波长为390nm且发射波长为480nm。另一示例中，评价纤溶酶原的激活，同时u‑pa多肽结合upar。这类示例中，u‑pa多肽首先结合细胞如u397细胞表面上的upar，然后加入纤溶酶原和可检测纤溶酶底物，且水解如上所述测量。[0497]c.u‑pa‑upar结合试验[0498]u‑pa多肽与upar的结合可通过本领域技术人员已知的任何试验评估，以检测蛋白‑蛋白结合相互作用，包括但不限于固相结合试验、elisa、表面等离子体共振和facs。在一个示例中，可使用elisa。重组upar固定于微量滴定板上，u‑pa多肽结合通过加入特异性结合u‑pa的试剂来评估，例如u‑pa结合抗体。另一示例中，结合能在基于细胞的试验中测定，使用细胞系例如表达u‑pa受体的u397细胞。u‑pa多肽能用例如生色、荧光或放射性底物标记以实现结合检测。[0499]d.c3切割[0500]经修饰upa多肽的活性能经底物补体蛋白人c3的切割来评估，这是通过测量多个浓度的经修饰upa蛋白酶孵育之后剩余的完整人c3含量。根据此试验，信号在完整人c3存在情况下产生，且随着c3切割而丧失。其他示例中，c3激活试验用于确定本文所提供经修饰upa多肽的特异性。[0501]纯化的c3蛋白可与经修饰的u‑pa多肽孵育，未消化人c3的残留水平能通过本领域技术人员已知的任何评价蛋白浓度的试验定量，例如使用放大发光邻近均相分析(珀金埃尔默(perkinelmer))。c3/upa多肽混合物与α‑小鼠igg包被的受体珠孵育，且孵育后，α‑hc3mab/受体珠混合物用生物素化α‑hc3pab孵育。链霉亲和素包被的供体珠加入混合物，随后测量‘alphascreen’信号(激发＝680nm,发射＝570nm)。此信号对应于剩余c3蛋白浓度。可计算切割50％可用hc3(ec50)所需的upa多肽浓度。[0502]acc‑agr elisa[0503]本文提供评价经修饰的u‑pa多肽的底物特异性的方法。使用发光肽底物例如7‑氨基‑4‑甲基香豆素(amc)发光肽底物或7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基香豆素(acc)发光肽底物，能用于测定经修饰蛋白酶活性，其中荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物中释放，荧光部分的释放能作为蛋白酶对肽切割序列特异性的量度测定。非靶底物切割序列或靶切割序列的增加率能用例如荧光分光光度计测量。荧光增加率能随着时间检测。米氏动力学常数可通过标准动力学方法确定。动力学常数kcat,km和kcat/km能如下计算：将底物浓度的倒数相比底物切割速度的倒数作图，并拟合lineweaver‑burk方程(1/速度＝(km/vmax)(1/[s]) 1/vmax；其中vmax＝[et]kcat)。特异性常数(kcat/km)是底物如何更好被特定蛋白酶切割的量度。[0504]在一个示例中，可测定补体蛋白的任意一种或多种切割序列并用作所需靶切割序列。例如，任意一种或多种c3切割序列。另一示例中，对应野生型蛋白酶底物的序列能用于分析剩余蛋白酶活性。[0505]在一个另外的实施方案中，全长补体蛋白能用作靶底物以相较于蛋白酶全长天然靶底物测定蛋白酶特异性。此外，全长补体蛋白能用于评价底物特异性与全长靶底物蛋白酶切割相比靶底物内所含四氨基酸p1‑p4底物切割序列之间的关联。在一个示例中，全长c3蛋白能用作任意一种或多种蛋白酶的所需切割靶标以评价特异性。此示例中，经修饰蛋白酶切割c3能与另一全长底物切割作比较，或该切割能与c3的荧光四肽切割序列作比较。全长蛋白通过蛋白酶切割的特异性常数可用凝胶密度测量确定，以评价在蛋白酶存在下孵育的全长靶底物带随着时间的密度测量变化。[0506]在一个另外的实施方案中，经修饰的u‑pa多肽的活性能在猕猴血浆或玻璃体液中延长孵育后评价。在一个示例中，剩余蛋白酶活性在80％猕猴玻璃体液中孵育后用荧光底物agr‑acc(7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基‑香豆素)测定。例如，seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽显示在玻璃体和pbs中孵育7天后切割荧光底物agr‑acc的能力相当。另一示例中，seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽在玻璃体液中孵育7天之前和之后切割荧光底物agr‑acc的水平相似。[0507]用肽文库评价特异性[0508]本文提供评价所得经修饰的u‑pa多肽的底物特异性的方法，使用偶联荧光肽的肽文库。经修饰的u‑pa多肽可在任何给定亚位点确认p1‑p4底物特异性，使用偶联荧光底物的肽文库(harris等,(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.97:7754；us2004/0175777；us2004/0146938)。使用一个或多个肽文库允许快速而容易确定蛋白裂解底物。此策略涉及使用肽文库，其中文库内的一个位置保持恒定(即p1位置)，而剩余位置(即p4‑p2和/或p1'和/或p2')由用于制备文库的所有氨基酸组合构成。使用组合荧光肽底物文库例如7‑氨基‑4‑甲基香豆素(amc)荧光肽底物或7‑氨基‑4‑氨甲酰甲基香豆素(acc)荧光肽底物，能用于测定经修饰蛋白酶活性，其中荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物中释放。本领域技术人员应理解这些方法提供多种替代文库形式。在一个示例中，蛋白酶能用p1‑多样性文库配置。p1‑多样性四肽文库包含acc‑或amc‑荧光四肽，其中p1位置系统性保持恒定，而p2、p3和p4位置包含15个氨基酸中任意一种或多种的等摩尔混合物。确定和考虑与具体酶相关的特定限制或底物序列特异性确定方法在本领域技术人员能力范围内。[0509]本领域技术人员认可存在许多方法制备肽。在一个示范性实施方案中，所述底物库通过将荧光标记底物附于固体支撑物来筛选。在一个示例中，来自底物肽的荧光离去基团如下合成：n‑fmoc香豆素衍生物缩合到酸不稳定性rink接头以提供acc树脂(backes等,(2000)natbiotechnol.18:187)。移出fmoc可生成游离胺。天然、非天然和修饰氨基酸能偶联胺，这能通过偶联额外氨基酸阐明。在一个替代的实施方案中，所述荧光离去基团可以是7‑氨基‑4‑甲基香豆素(amc)(harris等,(2000)proc.natl.acad.sci.u.s.a.97:7754)。肽合成完成后，肽‑荧光部分缀合物可从固体支撑物切去，或者，缀合物保持连接(tethered)于固体支撑物。[0510]通常，制备荧光肽或包含荧光肽的材料的方法包括：(a)提供含有荧光部分的第一缀合物，其共价结合固体支撑物；(b)使第一缀合物接触第一受保护氨基酸部分和活化剂，从而在羧基与第一缀合物的胺氮之间形成肽键；(c)脱保护，从而形成具有反应性胺部分的第二缀合物；(d)使第二缀合物接触第二受保护氨基酸和活化剂，从而在羧基与反应性胺部分之间形成肽键；和(e)脱保护，从而形成具有反应性胺部分的第三缀合物。在一个示范性实施方案中，所述方法还包括：(f)使第三缀合物接触第三受保护氨基酸和活化剂，从而在羧基与反应性胺部分之间形成肽键；和(e)脱保护，从而形成具有反应性胺部分的第四缀合物。[0511]对于难以偶联的氨基酸(如ile,val等)，游离、未反应的胺能保持在支撑物上且使后续合成和试验操作复杂化。在dmf中采用乙酸的3‑硝基三唑活性酯的专门加帽步骤可有效酰化剩余苯胺。未纯化底物序列溶液中能存在的所得乙酸加帽的香豆素一般不是蛋白酶底物序列。[0512]固相肽合成是制备本文所提供的多肽的肽骨架的示范性方法，其中序列的c末端氨基酸附于不溶性支撑物，然后依序加入序列中的剩余氨基酸。固相合成的技术描述于narany和merrifield,“固相肽合成”(solid‑phasepeptidesynthesis)；第3‑284页，收录于《肽：分析、合成、生物学》(thepeptides:analysis,synthesis,biology).卷2；《肽合成的特殊方法》(specialmethodsinpeptidesynthesis),a部分,gross和meienhofer编.纽约的学术出版社(academicpress),(1980)；和stewart等,(1984)《固相肽合成》(solidphasepeptidesynthesis),第2版.皮尔斯化学有限公司(piercechem.co.),罗克福德,ill。固相合成最易用市售可得肽合成仪完成，采用fmoc或t‑boc化学。[0513]例如，肽合成能用熟知的fmoc合成化学进行。例如，asp、ser、thr和tyr的侧链用叔丁基保护且cys残基的侧链用s‑三苯甲基和s‑叔丁基硫代保护，lys残基用t‑boc、fmoc和4‑甲基三苯甲基保护。适当保护的氨基酸试剂市售可得，或能用本领域认可的方法制备。使用多保护基团允许选择性去块和偶联荧光团与任何特定所需侧链。因此，例如，t‑boc脱保护用溶于二氯甲烷的tfa完成。fmoc脱保护用例如含20％(v/v)哌啶的dmf或n‑甲基吡咯烷酮完成，4‑甲基三苯甲基脱保护用例如溶于水的1‑5％(v/v)tfa或溶于dcm的1％tfa和5％三异丙基硅烷完成。a‑叔丁基硫代脱保护用例如水性巯基乙醇(10％)完成。移出叔丁基、t‑boc和s‑三苯甲基用例如tfa:苯酚:水:巯基乙烷二硫代(85:5:5:2.5:2.5),或tfa:苯酚:水(95:5:5)完成。[0514]任何特定位置或位置组合处的多样性能用至少2、6、12、20种或更多氨基酸的混合物引入，以扩展肽链。氨基酸的混合物可包括任何有用量的特定氨基酸与任何有用量的一个或多个不同氨基酸的组合。在一个实施方案中，所述混合物是氨基酸的等速混合物(采用适当比例的混合物以允许所有组分的等摩尔反应性)。经修饰蛋白酶例如本文所述经修饰u‑pa蛋白酶，能用对应所需切割序列的单独荧光肽底物测定。可切割任意一种或多种c3切割序列的经修饰蛋白酶的测定方法包括：(a)使肽荧光样品(包含c3切割序列)接触蛋白酶，采用的方式使荧光部分在蛋白酶作用后从肽底物序列释放，从而生成荧光部分；和(b)观察样品是否发生荧光的可检测变化，可检测变化指示样品中存在酶活性蛋白酶。这种示例中，可制备acc‑或amc‑四肽并与经修饰的蛋白酶孵育，该蛋白酶活性能通过测定荧光部分释放来评价。[0515]测定溶液中的蛋白酶仅需要向荧光蛋白酶指示肽加入一定量的蛋白酶储液并测量吸收谱中激发带的后续荧光增加或减少。溶液和荧光指示剂还能组合并在优化蛋白酶活性的“消化缓冲液”中测定。本领域技术人员熟知适合测定蛋白酶活性的缓冲液。一般，选择缓冲液的ph对应于特定蛋白酶最适ph。例如，特别适合测定弹性蛋白酶活性的缓冲液包含50mm磷酸钠,1mmedta,ph8.9。测量最易在荧光计中完成，该仪器提供“激发”光源用于荧光团且随后检测在特定波长后续发射的光。用缺乏蛋白酶的对照指示溶液比较可提供蛋白酶活性量度。活性水平能如下精确定量：产生用于蛋白酶/指示剂组合的标准曲线，其中测定由已知活性的蛋白酶溶液生成的荧光变化速度。[0516]尽管检测荧光化合物能用荧光计完成，检测也能通过本领域技术人员熟知的多种其他方法实现。因此，例如，当荧光团在可见光波长中发射时，检测可以是简单目测响应光源激发的荧光。检测还可以通过图像分析方式，采用接口到数字转换器或其他图像采集系统的摄像机。检测还可以通过经滤器可视化呈现，如在荧光显微镜下。显微镜能提供由操作者简单目测的信号。或者，信号能记录于胶片或使用图像分析系统。信号还能使用图像分析系统或光度计简单实时定量。[0517]因此，例如，用于样品蛋白酶活性的基础试验涉及在缓冲液(在所测定具体蛋白酶的最适ph)或测试条件(如玻璃体液或血清)中悬浮或溶解样品，向缓冲液加入荧光蛋白酶肽指示剂，用分光荧光计监测所得荧光变化，如示于例如harris等,(1998)jbiolchem273:27364。分光荧光计设置成在荧光团激发波长激发荧光团。荧光蛋白酶指示剂是蛋白酶的底物序列，其由于蛋白酶切割指示剂而改变荧光。[0518]还测定经修饰蛋白酶以确认其在全长蛋白背景下呈现时是否切割所需序列。含有c3切割位点的靶底物蛋白处于c3激活切割或活性位点中。本文描述评价靶蛋白切割的方法和/或为本领域熟知。在一个示例中，纯化的补体蛋白例如c3能在有或没有经修饰蛋白酶情况下孵育，监测切割事件可通过sds‑page，然后进行蛋白的考马斯亮蓝染色和采用密度测定的切割产物分析。还测定靶蛋白活性，例如在溶血实验中，使用本文所述或本领域熟知的方法，以确认其功能是否被切割事件破坏。[0519]3.特异性[0520]靶底物如补体蛋白c3或纤溶酶原通过经修饰的u‑pa多肽切割的特异性常数可用凝胶密度测量确定，以评价在u‑pa多肽存在下孵育的全长靶底物随着时间的密度测量变化。在特定实施方案中，经修饰的u‑pa多肽的特异性比较能用于确定经修饰的u‑pa多肽是否相较野生型u‑pa多肽显示对c3的特异性改变，例如增加。通过切割靶底物相较非靶底物(如u‑pa的天然野生型底物)的特异性常数，可测定u‑pa对靶底物如补体蛋白c3的特异性。经修饰的u‑pa多肽对靶底物c3vs非靶底物如纤溶酶原的特异性常数比例，能用于确定经修饰的u‑pa多肽切割的效率比。比较经修饰的u‑pa多肽与野生型u‑pa多肽的切割效率比，能用于评价对靶底物的特异性倍数变化。相较于野生型u‑pa多肽对靶底物相比非靶底物的特异性，特异性可以是至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000倍或更多。[0521]u‑pa多肽天然底物的切割动力学分析能与补体蛋白c3中所需靶底物切割分析作比较，以评价经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3的特异性。可评估二阶抑制速度常数(ki)以监测经修饰的u‑pa多肽对补体蛋白c3的效率和反应性。出于本文目的，经修饰的u‑pa多肽切割c3，从而补体激活受抑制，如实施例所示，其相比未修饰的u‑pa多肽(或用c122s取代修饰的u‑pa多肽，该取代消除游离半胱氨酸，因而减少聚集)具有显著更高的活性，如至少高5倍的活性。例如，seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽在本文所述试验中切割人c3，ec50为19nm，相比之下seqidno:5的野生型蛋白酶结构域为3380nm。[0522]4.疾病模型[0523]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用于本领域技术人员已知的任何临床相关疾病模型，以确定其对补体介导疾病或失调的影响。示范性试验包括但不限于用于以下的试验：移植，包括用人胰岛细胞的体外试验(tjernberg等.(2008)transplantation85:1193‑1199)和用猪肾的离体试验(fiane等.(1999)xenotransplantation6:52‑65)；生物相容性，包括体外人工表面诱发的炎症(lappegard等.(2008)jbiomedmaterresa87:129‑135；lappegard等.(2005)annthoracsurg79:917‑923；nilsson等.(1998)blood92:1661‑1667；schmidt等.(2003)jbiomedmaterresa66:491‑499)；炎症，包括体外大肠杆菌(e.coli)诱发的炎症(mollnes等.(2002)blood100:1867‑1877)和肝素/鱼精蛋白复合物在狒狒中诱发的炎症(soulika等.(2000)clinimmunol96:212‑221)；兔、猴和啮齿动物中的年龄相关的黄斑变性(chi等.(2010)advexpmedbiol703:127‑135；pennesi等.(2012)mol.aspectsmed.33(4):487‑509；fletcher等.(2014)optm.vis.sci.91(8):878‑886；forest等,(2015)diseasemodelsandmechanisms8:421‑427)；和猪(hanto等,(2010)amjtransplant10(11):2421‑2430)及狗(petrinec等,(1996)surgery61:1331‑1337)中的移植肾功能延迟恢复。[0524]f.生成经修饰的u‑pa多肽编码核酸的方法[0525]本文所示经修饰的u‑pa多肽的多肽能通过本领域用于蛋白纯化和重组蛋白表达的熟知方法获得。多肽还能化学合成。包括截短形式在内的修饰或变体可用标准重组dna方法工程化自野生型多肽。例如，经修饰的u‑pa多肽可从野生型多肽工程化，如通过定点突变。[0526]1.制备或分离编码u‑pa多肽的核酸[0527]多肽能通过本领域已知用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法来克隆或分离。这类方法包括pcr扩增核酸和筛选库，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。例如，当多肽通过重组方式生成时，可使用本领域技术人员已知鉴定编码所需基因的核酸的任何方法。本领域的任何可用方法能用于获得全长或部分(即涵盖完整的编码区)编码u‑pa的cdna或基因组dna克隆，如来自细胞或组织来源。[0528]核酸扩增方法能用于分离编码所需多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链式反应(pcr)方法。这类方法示例包括使用perkin‑elmercetus热循环仪和taq聚合酶(geneamp)。含核酸的材料能用作起始材料，从中可分离所需多肽编码核酸分子。例如，dna和mrna制品、细胞提取物、组织提取物、液体样品(如血液、血清、唾液)以及来自健康和/或疾病对象的样品能用于扩增方法。来源可来自任何真核物种，包括但不限于脊椎动物、哺乳动物、人、猪、牛、猫、鸟、马、犬和其他灵长类动物来源。核酸文库也能用作起始材料来源。引物可设计成扩增所需多肽。例如，引物能基于从中产生所需多肽的表达序列来设计。引物能基于多肽氨基酸序列的反向翻译来设计。若需要，简并引物能用于扩增。与所需序列3’和5’末端序列杂交的寡核苷酸引物能用作引物，以通过来自核酸样品的pcr序列扩增。引物能用于扩增完整的全长u‑pa或其截短序列，如编码本文所提供任何可溶性u‑pa多肽的核酸。通过扩增产生的核酸分子能测序并确认以编码所需多肽。[0529]额外核苷酸序列可连接多肽编码核酸分子，包括含有限制性内切核酸酶位点的接头序列以用于将合成基因克隆入载体的目的，例如蛋白表达载体或载体，其设计用于编码dna序列的核心蛋白扩增。此外，指定功能dna元件的额外核苷酸序列可操作连接多肽编码核酸分子。这类序列示例包括但不限于：设计成促进胞内蛋白表达的启动子序列，和设计成促进蛋白分泌的分泌序列例如异源信号序列。本领域技术人员已知这类序列。额外核苷酸残基序列如指定蛋白结合域的碱基序列也能连接编码酶的核酸分子。这种区域包括但不限于促进或编码蛋白的残基序列，其促进酶摄取到特定靶细胞内，或另外改变合成基因的产物的药物动力学。[0530]例如，可加入标记和/或其他部分以协助多肽的检测或亲和纯化。例如，额外核苷酸残基序列如指定表位标签或其他可检测标记的碱基序列也能连接编码酶的核酸分子。这类序列示例包括编码sumo标签或his标签或flag标签的核酸序列。[0531]鉴定和分离的核酸分子随后能插入适当克隆载体。可使用本领域已知的大量载体‑宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰病毒，但载体系统必须与所用宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如λ衍生物，或质粒如pcmv4、pbr322或puc质粒衍生物或bluescript载体(stratagene,加利福尼亚州拉荷亚)。例如，通过连接dna片段到有互补粘性末端的克隆载体内，可完成插入克隆载体。插入用topo克隆杂体(英杰公司(invitrogen),加利福尼亚州卡尔斯巴德)实现。[0532]如果互补限制性位点用于裂开克隆载体内存在的dna，dna分子末端能酶促修饰。或者，任何所需位点能通过连接核苷酸序列(接头)到dna末端而生成；这些连接的接头可包含编码限制性内切核酸酶识别序列的特定化学合成寡核苷酸。在一种替代方法中，切割的载体和蛋白基因能通过同聚物加尾修饰。[0533]重组分子可引入宿主细胞，例如通过转化、转染、感染、电穿孔和超声细胞穿孔，从而产生了多拷贝基因序列。在特定实施方案中，宿主细胞用重组dna分子转化能够产生多拷贝基因，所述重组dna分子纳入了经分离蛋白基因、cdna或合成的dna序列。因此，基因可如下大量获得：培养转化子，从转化子中分离重组dna分子，且必要时，从经分离重组dna取回插入基因。[0534]除了重组生成，本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用固相技术通过直接肽合成生成(参见例如stewart等.(1969)《固相肽合成》(solid‑phasepeptidesynthesis),whfreeman公司(whfreemanco.),旧金山；merrifieldj(1963)jamchemsoc.,85:2149‑2154)。体外蛋白合成可用手工技术或自动化实施。自动化合成可用例如appliedbiosystems431a肽合成仪(珀金埃尔默,加利福尼亚州福斯特城)实现，依据厂商提供的说明书。多肽的不同片段能用化学方法单独或联合化学合成。[0535]本文还提供活性或活化或可激活形式的经修饰的u‑pa多肽的表达方法，如2链激活形式和二聚体。如本文所讨论和描述及实施例14‑16所例示，可制备编码经修饰的u‑pa多肽融合蛋白的核酸。编码经修饰u‑pa蛋白酶结构域的核酸连接编码其他序列的核酸，包括但不限于分泌信号例如u‑pa信号序列、iggkapp链信号序列、il‑2信号序列、u‑pa的n末端部分(用于生成全长u‑pa)，激活序列例如u‑pa激活序列或弗林蛋白酶序列，和融合伴侣如白蛋白，以改变u‑pa性质如血清半衰期，和/或序列如his标签和/或sumo以增加表达和/或促进分离。这些核酸分子能在本领域技术人员熟知的合适宿主细胞中表达，以生成经修饰u‑pa和/或融合蛋白。一般，核酸编码信号序列或其他运输序列以分泌或运输至纯化用的基因座。纳入编码激活序列的核酸，能用于生成激活形式的经修饰的u‑pa多肽。[0536]2.产生突变体或修饰核酸和编码多肽[0537]本文所提供的修饰可通过标准重组dna技术形成，如对本领域技术人员常规的那些。可采用本领域已知实现靶蛋白中任意一个或多个氨基酸突变的任何方法。方法包括编码核酸分子的标准定点突变(使用例如试剂盒，如可获自stratagene的quikchange)，或通过固相多肽合成方法。[0538]3.载体和细胞[0539]为重组表达一种或多种所需蛋白如本文所述任何经修饰的u‑pa多肽，含有所有或部分编码蛋白的核苷酸序列的核酸能插入合适表达载体，即包含转录和翻译所插入蛋白编码序列必需的元件的载体。必需的转录和翻译信号还可由酶基因的天然启动子和/或其侧翼区提供。[0540]还提供含有酶编码核酸的载体。也提供含有载体的细胞。所述细胞包括真核和原核细胞，且载体适合其中的用途。一般，所述细胞是能够实现编码蛋白糖基化的细胞。[0541]提供含有载体的真核和原核细胞。这类细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、古细菌细胞(archea)、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。细胞用于生成其蛋白，这是通过使上述细胞在细胞表达编码蛋白的条件下生长，并回收表达蛋白。出于本文目的，例如，酶能分泌入培养基。[0542]宿主细胞株可就其调节插入序列表达或以所需方式加工表达蛋白的能力进行选择。这样的多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。翻译后加工能影响多肽的折叠和/或功能。不同宿主细胞例如但不限于cho(dg44、dxb11、cho‑k1)、hela、mcdk、293和wi38，具有用于这类翻译后活性的特定细胞机器和特征机制，且能选择成确保正确修饰和加工所引入蛋白。一般，细胞选择的是能够引入n‑连接糖基化到所表达多肽内的细胞。因此，提供含有载体的真核细胞。真核细胞示例是哺乳动物中国仓鼠卵巢(cho)细胞。例如，缺乏二氢叶酸还原酶的cho细胞(如dg44细胞)用于生成本文所提供多肽。[0543]提供的载体包含编码经修饰的u‑pa多肽的核苷酸序列，偶联天然或异源信号序列以及其多拷贝。能选择载体以表达细胞中的酶蛋白或从而酶蛋白作为分泌蛋白表达。[0544]在一个实施方案中，提供的载体包含核苷酸序列，其编码具有蛋白酶活性的多肽且包含所有或部分蛋白酶结构域，或其多个拷贝。还提供包含核苷酸序列的载体，其编码蛋白酶结构域和额外部分的蛋白酶蛋白，多至且包括全长蛋白酶蛋白，以及其多个拷贝。能选择载体以在细胞中表达支架或经修饰蛋白酶蛋白或其蛋白酶结构域，或从而蛋白酶蛋白作为分泌蛋白表达。当蛋白酶结构域表达时，所述核酸连接编码分泌信号的核酸，如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)α‑接合因子信号序列或其部分或天然信号序列。[0545]多种宿主‑载体系统能用于表达蛋白编码序列。这些包括但不限于感染有病毒(如痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)的哺乳动物细胞系统；感染有病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或转化有噬菌体、dna、质粒dna或粘粒dna的细菌。载体表达元件的强度和特异性不同。根据所用宿主‑载体系统，可使用一些适当转录和翻译元件中的任意一种。[0546]本领域技术人员已知的用于将dna片段插入载体的任何方法能用于构建表达载体，所述载体包括含有适当转录/翻译对照信号和嵌合基因和蛋白编码序列。这些方法可包括体外重组dna和合成技术及体内重组(遗传重组)。表达编码蛋白或其结构域、衍生物、片段或同源物的核酸序列，可由第二核酸序列调节，从而基因或其片段在转化有重组dna分子的宿主中表达。例如，蛋白表达能通过本领域已知的任何启动子/增强子控制。在一个特定实施方案中，所述启动子对所需蛋白的基因而言非天然。可使用的启动子包括但不限于sv40早期启动子(bernoist和chambon,nature290:304‑310(1981)),劳斯肉瘤病毒3’长末端重复所含启动子(yamamoto等.cell22:787‑797(1980)),疱疹胸苷激酶启动子(wagner等,proc.natl.acad.sci.usa78:1441‑1445(1981)),金属硫蛋白基因的调控序列(brinster等,nature296:39‑42(1982))；原核表达载体如β‑内酰胺酶启动子(jay等,(1981)proc.natl.acad.sci.usa78:5543)或tac启动子(deboer等,proc.natl.acad.sci.usa80:21‑25(1983)；还参见“来自重组细菌的有用蛋白(usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”:收录于scientificamerican242:79‑94(1980))；含有胭脂碱合酶启动子的植物表达载体(herrara‑estrella等,nature303:209‑213(1984))或花椰菜花叶病毒35srna启动子(garder等,nucleicacidsres.9:2871(1981)),和光合酶二磷酸核酮糖羧化酶的启动子(herrera‑estrella等,nature310:115‑120(1984))；来自酵母和其他真菌的启动子如gal4启动子,醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子碱性磷酸酶启动子以及显示组织特异性且用于转基因动物的下列动物转录控制区:弹性蛋白酶i基因控制区，其在胰腺泡细胞中具有活性(swift等,cell38:639‑646(1984)；ornitz等,coldspringharborsymp.quant.biol.50:399‑409(1986)；macdonald,hepatology7:425‑515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰岛β细胞中具有活性(hanahan等,nature315:115‑122(1985)),免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴样细胞中具有活性(grosschedl等,cell38:647‑658(1984)；adamsetal.,nature318:533‑538(1985)；alexander等,mol.cellbiol.7:1436‑1444(1987)),小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中具有活性(leder等,cell45:485‑495(1986)),白蛋白基因控制区，其在肝中具有活性(pinckert等,genesanddevel.1:268‑276(1987)),甲胎蛋白基因控制区，其在肝中具有活性(krumlauf等,mol.cell.biol.5:1639‑1648(1985)；hammer等,science235:53‑58(1987)),α‑1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中具有活性(kelsey等,genesanddevel.1:161‑171(1987)),β珠蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中具有活性(magram等,nature315:338‑340(1985)；kollias等,cell46:89‑94(1986)),髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑部少突胶质细胞中具有活性(readhead等,cell48:703‑712(1987)),肌球蛋白轻链‑2基因控制区，其在骨骼肌中具有活性(shani,nature314:283‑286(1985)),和促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑中具有活性(mason等,science234:1372‑1378(1986))。[0547]在一个特定实施方案中，使用的载体包含与编码所需蛋白或其结构域、片段、衍生物或同源物的核酸可操作连接的启动子，一个或多个复制起点，和任选存在的一个或多个选择性标记(如抗生素抗性基因)。根据表达系统，有效翻译u‑pa序列还需要特定起始信号。这些信号包括atg起始密码子和相邻序列。在u‑pa的起始密码子和上游序列或其催化活性片段插入适当表达载体时，不需要额外翻译控制信号。在仅插入编码序列或其部分的情况中，必须提供包括atg起始密码子在内的外源转录控制信号。此外，起始密码子必须在正确的读框内以确保完整插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可具有不同来源，可以是天然以及合成的。通过纳入对所用细胞系统合适的增强子，能提高表达效率(scharf等.(1994)resultsproblcelldiffer20:125‑62；bittner等.(1987)methodsinenzymol,153:516‑544)。no:1‑6、8‑44和52‑75任一者所示的蛋白酶结构域或与seqidno:1‑6、8‑44和52‑75任一者所示的序列显示至少65％、70％、75％、80％、84％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。[0556]为了长期、高收率生成重组蛋白，需要稳定表达。例如，能用表达载体转化稳定表达经修饰的u‑pa多肽的细胞系，所述载体包含病毒复制起点或内源表达元件和选择性标记基因。引入载体后，可允许细胞在富集培养基中生长1‑2天，然后转到选择性培养基。选择性标记的目的在于赋予选择抗性，且其存在允许成功表达所引入序列的细胞生长和回收。稳定转化细胞的抗性细胞能用适合细胞类型的组织培养技术增殖。[0557]任意数目的选择系统能用于回收转化细胞系。这些包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(wigler等,(1977)cell11:223‑232)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(lowyi等.(1980)cell,22:817‑23)基因，其可分别用于tk‑或aprt‑细胞。同样，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性能用作选择基础。例如，可使用dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性(wiglerm等.(1980)proc.natl.acad.sci,77:3567‑70)；npt，其赋予对氨基糖苷类新霉素和g‑418的抗性(colbere‑garapinf等.(1981)j.mol.biol.,150:1‑14)；和als或pat，其分别赋予对氯磺隆和草丁膦乙酰转移酶的抗性。描述了其他选择性基因，例如trpb或hisd，前者允许细胞利用吲哚取代色氨酸，后者允许细胞利用histinol取代组氨酸(hartmansc和rcmulligan(1988)proc.natl.acad.sci,85:8047‑8051)。可见的标记物例如但不限于花青素、β‑葡萄糖醛酸酶和其底物gus、荧光素酶和其底物萤光素，也能用于鉴定转化子以及定量特定载体系统引起的瞬时或稳定蛋白表达含量(rhodesca等.(1995)methodsmol.biol.55:121‑131)。[0558]可监测u‑pa多肽的存在和表达。例如，通过在适当条件下就透明质酸酶的酶活性测试条件培养基，可检测功能性多肽。本文提供评价所表达蛋白溶解度和活性的示范性试验。[0559]a.原核细胞[0560]原核生物尤其是大肠杆菌提供生成大量蛋白的系统。大肠杆菌转化是本领域技术人员熟知的一项简单快速技术。大肠杆菌的表达载体能包含诱导型启动子；这类启动子用于诱导高水平蛋白表达和对宿主细胞显示一定毒性的蛋白表达。诱导型启动子示例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、t7和sp6rna启动子以及温控型λpl启动子。[0561]蛋白例如本文所提供的任意蛋白，可在大肠杆菌细胞质环境中表达。细胞质是还原环境且就一些分子而言，这能导致不溶性包涵体形成。还原剂如二硫苏糖醇和β‑巯基乙醇以及变性剂如胍‑hcl和尿素，能用于使蛋白重新溶解。替代方法是在细菌周质空间中表达蛋白，所述细菌周质空间提供氧化环境和伴侣蛋白样及二硫化物异构酶并且能引起可溶性蛋白生成。通常，前导序列融合待表达蛋白，这指导蛋白到周质。前导序列随后通过周质内的信号肽移除。靶向周质的前导序列示例包括来自果胶裂解酶基因的pelb前导序列和衍生自碱性磷酸酶基因的前导序列。一些情况下，周质表达允许所表达蛋白漏入培养基。蛋白分泌允许从细胞上清中快速简单纯化。非分泌蛋白能通过渗透裂解获自周质。与胞质表达类似，在一些情况下，蛋白可变为不溶性，变性剂和还原剂能用于促进溶解和复性。诱导和生长的温度还可能影响表达水平及溶解度，通常使用25℃‑37℃的温度。一般，细菌生成非糖基化蛋白。因此，如果蛋白功能需要糖基化，糖基化可在从宿主细胞纯化后体外添加。[0562]b.酵母细胞[0563]酵母如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)，是熟知的酵母表达宿主，能用于生成蛋白如本文所述任意蛋白。酵母可用游离型复制载体或通过同源重组经稳定染色体整合来转化。通常，诱导型启动子用于调节基因表达。这类启动子示例包括gal1、gal7和gal5以及金属硫蛋白启动子如cup1、aox1或其他毕赤酵母(pichia)或其他酵母启动子。表达载体通常包括选择性标记如leu2、trp1、his3和ura3，用于选择和维持转化的dna。酵母中表达的蛋白一般可溶。与伴侣蛋白如bip和蛋白质二硫键异构酶共表达能提高表达水平和溶解度。另外，可就分泌指导酵母中表达的蛋白，使用分泌信号肽融合如来自酿酒酵母的酵母接合型α因子分泌信号和与酵母细胞表面蛋白如aga2p交配粘附受体或解腺嘌呤阿氏酵母(arxulaadeninivorans)葡糖糖化酶的融合。可工程化蛋白酶切割位点如用于kex‑2蛋白酶的切割位点，以随着表达多肽离开分泌途径而从该表达多肽去除融合序列。酵母还能够在asn‑x‑ser/thr基序处糖基化。[0564]c.昆虫和昆虫细胞[0565]昆虫细胞尤其是使用杆状病毒表达时，用于表达多肽如u‑pa多肽。昆虫细胞表达高水平蛋白且能够进行高等真核生物所用的大部分翻译后修饰。杆状病毒具有限制性宿主范围，这提高真核表达的安全性并减少调控考虑。典型的表达载体使用用于高水平表达的启动子，如杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒如苜蓿银纹夜蛾(autographacalifornica)核型多角体病毒(acnpv)、家蚕(bombyxmori)核型多角体病毒以及昆虫细胞系如sf9，衍生自草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)、美洲粘虫(pseudaletiaunipuncta)(a7s)和黑脉金斑蝶(danausplexippus)(dpn1)。对于高水平表达，待表达分子的核苷酸序列紧邻病毒多角体蛋白起始密码子下游融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确加工且能用于将表达蛋白分泌入培养基。细胞系美洲粘虫(a7s)和黑脉金斑蝶(dpn1)生成糖基化模式类似哺乳动物细胞系统的蛋白。示范性昆虫细胞是改变成减少免疫原性的那些，包括有“哺乳动物化”杆状病毒表达载体的那些和缺乏酶ft3的那些。[0566]昆虫细胞中的替代表达系统是使用稳定转化的细胞。细胞系如schnieder2(s2)和kc细胞(黑腹果蝇(drosophilamelanogaster))和c7细胞(白纹伊蚊(aedesalbopictus))，能用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子能用于在镉或铜重金属诱导存在情况下诱导高水平表达。表达载体通常用选择性标记如新霉素和潮霉素维持。[0567]d.哺乳动物表达[0568]哺乳动物表达系统能用于表达蛋白，包括u‑pa多肽。表达构建体可转移到哺乳动物细胞，这是通过病毒感染如腺病毒或直接dna转移如脂质体、磷酸钙、deae‑葡聚糖以及物理方式如电穿孔和微注射进行的。用于哺乳动物的表达载体通常包括mrna加帽位点、tata盒、翻译起始序列(kozak共有序列)和聚腺苷酸化元件。还可加入ires元件以允许和另一基因双顺反子表达，如选择性标记。这种载体经常包括为了高水平表达的转录启动子‑增强子，例如sv40启动子‑增强子、人巨细胞病毒(cmv)启动子和劳斯肉瘤病毒(rsv)长末端重复。这些启动子‑增强子在许多细胞类型中具有活性。组织和细胞型启动子及增强子区域也能用于表达。示范性启动子/增强子区包括但不限于来自诸如以下基因的那些：弹性蛋白酶i、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1‑抗胰蛋白酶、β珠蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链2和促性腺释放激素基因控制。选择性标记能用于选择和维持有表达构建体的细胞。选择性标记基因示例包括但不限于潮霉素b磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(dhfr)和胸苷激酶。例如，表达可在甲氨蝶呤存在下进行以仅选择表达dhfr基因的那些细胞。融合细胞表面信号分子如tcr‑ζ和fcεri‑γ，能指导活性状态的蛋白在细胞表面上表达。[0569]许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。示范性细胞系包括但不限于cho、balb/3t3、hela、mt2、小鼠ns0(非分泌性)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、sp2/0、cos、nih3t3、hek293、293s、2b8和hkb细胞。细胞系也可适应无血清培养基，其促进分泌蛋白从细胞培养基中纯化。示例包括cho‑s细胞(加利福尼亚州卡尔斯巴德,cat#11619‑012)和无血清ebna‑1细胞系(pham等,(2003)biotechnol.bioeng.84:332‑42.)。还可获得适应在特殊培养基中生长的细胞系，所述培养基优化用于最大表达。例如，dg44cho细胞适应在化学成分确定、无动物产品的培养基中悬浮培养生长。[0570]e.植物[0571]转基因植物细胞和植物能用于表达蛋白，如本文所述任何蛋白。表达构建体通常转移到植物，使用直接dna转移如微粒轰击和peg介导的转移入原生质体以及农杆菌介导转化。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件和翻译对照元件。表达载体和转化技术通常在双子叶植物宿主如拟南芥(arabidopsis)和烟草与单子叶植物宿主如玉米和稻之间不同(divided)。用于表达的植物启动子示例包括花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶启动子、二磷酸核糖羧化酶启动子和泛素及ubq3启动子。选择性标记如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶和新霉素磷酸转移酶，常用于促进选择和维持转化细胞。转化的植物细胞能在培养物中作为细胞、聚集体(愈伤组织)维持，或再生为完整植物。转基因植物细胞还可包藻类，其工程化成生成透明质酸酶多肽。由于植物具有不同于哺乳动物细胞的糖基化模式，可能影响这些宿主中生成的蛋白选择。[0572]5.纯化[0573]用编码经修饰的u‑pa多肽的核酸序列转化的宿主细胞能在适合表达和从细胞培养物回收编码蛋白的条件下培养。重组细胞生成的蛋白一般可分泌，但能根据所用序列和/或载体而胞内包含。如本领域技术人员所理解，含有u‑pa编码核酸的表达载体能用信号序列设计，所述序列促进u‑pa直接分泌通过原核或真核细胞膜。[0574]因此，从宿主细胞纯化多肽的方法取决于所选宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，蛋白一般在移出细胞后从培养基中纯化。对于胞内表达，细胞可裂解且蛋白纯化自提取物。当转基因生物如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官能用作起始材料以制备裂解的细胞提取物。另外，生成转基因动物可包括在牛奶或鸡蛋中生成多肽，其能收集且如果必要，蛋白可用本领域标准方法提取并进一步纯化。[0575]蛋白如经修饰的u‑pa多肽能用本领域已知的标准蛋白纯化技术纯化，包括但不限于sds‑page、大小分级和尺寸排阻层析、硫酸铵沉淀和离子交换层析如阴离子交换。亲和纯化技术还能用于提高效率和制品纯度。例如，结合u‑pa蛋白的受体和其他分子能用于亲和纯化。[0576]表达构建体还能工程化成向蛋白添加亲和标签如小泛素样修饰物(sumo)标签、myc表位、gst融合或his6，且分别用sumo或myc抗体、谷胱甘肽树脂和ni‑树脂亲和纯化。这类标签能连接本文他处所述的u‑pa编码核苷酸序列，其能促进可溶性蛋白的纯化。例如，经修饰的u‑pa多肽可表达为重组蛋白，带有一个或多个加入以促进蛋白纯化的额外多肽结构域。这种纯化促进结构域包括但不限于金属螯合肽如允许在固定金属上纯化的组氨酸‑色氨酸模块，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白a结构域和用于flags延伸/亲和纯化系统的结构域(英姆纳克斯公司(immunexcorp.),华盛顿州西雅图)。在纯化结构域与所表达u‑pa多肽之间纳入可切割接头序列如因子xa或肠激酶(加利福利亚州圣地亚哥)可用于促进纯化。一个这种表达载体提供含有u‑pa多肽和肠激酶切割位点的融合蛋白表达。小泛素样修饰物(sumo)标签促进imiac(固定化金属离子亲和层析)上的纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白纯化多肽的方式。[0577]纯化可通过本领域已知任何方法评价，包括凝胶电泳、正交hplc法、染色和分光光度技术。表达和纯化的蛋白能用本领域技术人员已知的任何试验或方法分析，例如章节3所述。这些包括基于蛋白物理和/或功能性质的试验，包括但不限于通过凝胶电泳分析、免疫测定和u‑pa活性试验。[0578]6.额外修饰[0579]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能修饰成提高或改变药代动力学和药理学性质。特定地，经修饰的u‑pa多肽可缀合聚合物如peg部分或葡聚糖或唾液酸化以在血清和包括玻璃体液在内其他体液中降低免疫原性和/或增加半衰期。[0580]a.聚乙二醇化[0581]聚乙二醇(peg)用于生物材料、生物技术和医学，主要是因为peg是生物相容性、无毒、水溶性且通常无致免疫性的聚合物(zhao和harris,acssymposiumseries680:458‑72,1997)。在药物递送领域，peg衍生物广泛用于共价结合(即“聚乙二醇化”)蛋白以减少免疫原性、蛋白裂解和肾清除，从而增加血清半衰期和提高溶解度(zalipsky,adv.drugdel.rev.16:157‑82,1995)。类似地，peg结合低分子量、相对疏水药物以提高溶解度、降低毒性和改变生物分布。通常，聚乙二醇化药物作为溶液注射。[0582]一个相关应用是合成制剂的交联可降解peg网以用于药物递送，因为用于设计可降解、可溶性药物载体的基本相同化学也能用于设计可降解凝胶(sawhney等.,macromolecules26:581‑87,1993)。还已知高分子间复合物可通过混合2种互补聚合物溶液来形成。这类复合物一般通过所涉及聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子‑聚阳离子)和/或氢键(多元酸‑多碱)以及水溶解中聚合物之间的疏水相互作用来稳定(krupers等.,eur.polymj.32:785‑790,1996)。例如，在适当条件下混合聚丙烯酸(paac)和聚氧化乙烯(peo)溶液引起复合物形成，这主要基于氢键结合。这些复合物在生理条件下解离被用于递送游离药物(即非聚乙二醇化)。互补聚合物的复合物形成自均聚物和共聚物。[0583]用于聚乙二醇化的许多试剂被称为peg部分(聚乙二醇化)治疗蛋白。这类试剂包括但不限于多肽与以下的反应：n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化peg、琥珀酰亚胺mpeg、mpeg2‑n‑羟基琥珀酰亚胺、mpegα‑甲基丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丙酸琥珀酰亚胺酯、mpeg丁酸琥珀酰亚胺酯、mpeg羧甲基3‑羟丁酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg‑丙酸琥珀酰亚胺酯、同双功能peg丙醛、同双功能peg丁醛、peg马来酰亚胺、peg酰肼、对硝基苯‑碳酸酯peg、mpeg‑苯并三唑碳酸酯、丙醛peg、mpeg丁醛、支化mpeg2丁醛、mpeg乙酰、mpeg哌啶酮、mpeg甲基酮、mpeg“无接头”马来酰亚胺、mpeg乙烯砜、mpeg硫醇、mpeg邻吡啶硫酯、mpeg邻二硫吡啶、fmoc‑peg‑nhs、boc‑peg‑nhs、乙烯砜peg‑nhs、丙烯酸peg‑nhs、荧光素peg‑nhs和生物素peg‑nhs(参见例如monfardini等,bioconjugatechem.6:62‑69,1995；veronese等,j.bioactivecompatiblepolymers12:197‑207,1997；u.s.5,672,662；u.s.5,932,462；u.s.6,495,659；u.s.6,737,505；u.s.4,002,531；u.s.4,179,337；u.s.5,122,614；u.s.5,324,844；u.s.5,446,090；u.s.5,612,460；u.s.5,643,575；u.s.5,766,581；u.s.5,795,569；u.s.5,808,096；u.s.5,900,461；u.s.5,919,455；u.s.5,985,263；u.s.5,990,237；u.s.6,113,906；u.s.6,214,966；u.s.6,258,351；u.s.6,340,742；u.s.6,413,507；u.s.6,420,339；u.s.6,437,025；u.s.6,448,369；u.s.6,461,802；u.s.6,828,401；u.s.6,858,736；u.s.2001/0021763；u.s.2001/0044526；u.s.2001/0046481；u.s.2002/0052430；u.s.2002/0072573；u.s.2002/0156047；u.s.2003/0114647；u.s.2003/0143596；u.s.2003/0158333；u.s.2003/0220447；u.s.2004/0013637；us2004/0235734；wo0500360；u.s.2005/0114037；u.s.2005/0171328；u.s.2005/0209416；ep01064951；ep0822199；wo00176640；wo0002017；wo0249673；wo9428024；和wo0187925)。[0584]在一个示例中，聚乙二醇的分子量范围为约3kda‑约50kda，通常约5kda‑约30kda。peg共价结合药物(称为“聚乙二醇化”)可通过已知化学合成技术完成。例如，通过使nhs‑活化peg与蛋白在适当反应条件下反应，可完成蛋白的聚乙二醇化。[0585]尽管就聚乙二醇化描述了许多反应，那些最普遍适应在温和反应条件下赋予方向性且不必需广泛的下游加工以移出有毒催化剂或副产物。例如，单甲氧基peg(mpeg)仅具有一个反应性末端羟基，因而其应用限制了所得peg‑蛋白产品混合物的一些异质性。实现有效蛋白聚乙二醇化需要在与末端甲氧基相反的聚合物末端羟基的激活，旨在使衍生的peg更易受亲核攻击。攻击亲核剂通常是赖氨酰残基的ε‑氨基，但如果局部条件有利，其他胺也能反应(例如组氨酸的n末端α‑胺或环胺)。更定向附着在含有单赖氨酸或半胱氨酸的蛋白中可行。后一种残基能通过用于硫醇特异修饰的peg‑马来酰亚胺靶向。或者，peg酰肼可与高碘酸盐氧化的透明质酸降解酶反应并在nacnbh3存在下还原。更特定地，聚乙二醇化cmp糖可与透明质酸降解酶在适当糖基转移酶存在下反应。一种技术是“聚乙二醇化”技术，其中一些聚合分子偶联讨论中的多肽。使用此技术时，免疫系统在识别多肽表面负责抗体形成的表位方面有困难，从而减少免疫应答。对于直接引入人体循环系统以产生特定生理效应的多肽(即药物)，典型的潜在免疫应答是igg和/或igm反应，而经呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)可能导致ige反应(即过敏反应)。解释免疫应答减少的理论之一是聚合分子遮蔽多肽表面上负责免疫应答引起抗体形成的表位。另一理论或至少部分因素是缀合物越重，获得的免疫应答越少。[0586]通常，为制备本文提供的聚乙二醇化经修饰的u‑pa多肽，peg部分经共价结合与多肽缀合。可制备用于聚乙二醇化的经修饰的u‑pa多肽而不进行c122s取代；c122反而能用作缀合peg部分和/或形成所需二硫键的位点，如用于2链活化形式或二聚体。[0587]用于聚乙二醇化的技术包括但不限于专门的接头和偶联化学(参见例如harris,adv.drugdeliv.rev.54:459‑476,2002)、多个peg部分附于单一缀合位点(如通过使用支化peg；参见例如veronese等,bioorg.med.chem.lett.12:177‑180,2002)、位点特异性聚乙二醇化和/或单聚乙二醇化(参见例如chapman等,naturebiotech.17:780‑783,1999)和定点酶促聚乙二醇化(参见例如sato,adv.drugdeliv.rev.,54:487‑504,2002)。本领域所述方法和技术可生成有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个peg或peg衍生物的蛋白，所述peg或peg衍生物附于单一蛋白分子(参见例如美国专利公开号2006/0104968)。[0588]b.融合蛋白和其他缀合物[0589]本文提供u‑pa与本文所提供经修饰的u‑pa多肽的缀合物。这类缀合物示例是实施例14‑16例示的融合蛋白。如本文所述，一些缀合物通过切割所包括的激活多肽而活化时，形成2链活化的u‑pa多肽；其他如含有fc结构域的那些，能经fc结构域连接形成2链。其他包含序列，如促进表达和分离/纯化的sumo和his‑sumo。实施例14和15以及图1‑4，描绘和叙述所得缀合物。为用作药物，经修饰的u‑pa多肽一般以活化形式提供，如2链活化形式。应理解下列讨论描述能包括信号序列的融合多肽和在所生成产物中不出现的其他调控序列。特定地，融合多肽可包括激活序列，其中在切割后，所得多肽是2链激活多肽。其是多肽活化形式，其一般是施用于对象的药物产品。[0590]i.示范性融合蛋白和其他蛋白缀合物[0591]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能融合其他多肽和其部分以及融合多个部分以赋予所需性质，如血清半衰期增加和/或免疫原性降低和/或其他性质。这些包括例如融合白蛋白，融合靶部分如抗体和其抗原结合片段，融合免疫球蛋白，fc融合，修饰糖基化模式、法尼基化和其他这类修饰(关于改善治疗蛋白药代动力学性质的多种融合蛋白的综述，参见strohl(2015)biodrugs29:215‑239)。用于改变治疗药理性质的任何这类形式能施用于本文所提供经修饰的u‑pa多肽。一般，修饰是多肽或其部分时，经修饰u‑pa作为融合蛋白生成。对于非多肽修饰如聚乙二醇化，修饰在分离蛋白上实现。经修饰的u‑pa多肽包括在残基122(通过胰凝乳蛋白酶编号)具有cys的那些，以提供翻译后或纯化后修饰的位点。经修饰的u‑pa多肽包括作为全长和其催化活性部分的那些，如蛋白酶结构域，或者成熟多肽或活化的2链多肽。[0592]还提供融合蛋白，包含本文所提供经修饰的u‑pa多肽和一种或多种其他多肽。提供药物组合物，包含配置用于经适当途径施用的这类融合蛋白。融合蛋白如下形成：以任何顺序连接经修饰的u‑pa多肽与另一多肽，如抗体或其片段、生长因子、受体、配体和出于促进蛋白酶纯化目的的其他这类药剂，通过引导u‑pa多肽到靶细胞或组织而改变经修饰的u‑pa多肽的药效学性质，和/或增加u‑pa多肽的表达或分泌。在u‑pa多肽融合蛋白内，u‑pa多肽可以是u‑pa多肽的全部或其催化活性部分或者u‑pa多肽化活性部分以及非全长u‑pa的另一u‑pa部分。本文所提供融合蛋白几乎全部保留其对补体蛋白c3的特异性和/或选择性。一般，u‑pa融合多肽相较于非融合u‑pa多肽保留至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％底物特异性和/或选择性，包括相较非融合u‑pa多肽的96％、97％、98％、99％或更高底物特异性。[0593]ii.产生构建体[0594]u‑pa融合蛋白可通过标准重组技术生成。例如，编码不同多肽序列的dna片段能根据常规技术框内连接在一起，如通过采用钝端或交错端末端用于连接，限制性酶切以提供合适末端，酌情填补粘性末端，碱性磷酸酶处理以防止不需要的连接，和酶促连接。在另一实施方案中，所述融合基因能通过常规技术合成，包括自动化dna合成仪。或者，基因片段的pcr扩增可用在2个连续基因片段之间产生互补突出的锚引物完成，所述连续基因片段随后能退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见例如ausubel等.(编)《精编分子生物学实验指南》(currentprotocolsinmolecularbiology),约翰威利父子公司(johnwiley&sons),1992)。许多编码融合部分(如his标签、sumo多肽或gst多肽)的表达载体市售可得。编码u‑pa的核酸能克隆入这类表达载体，从而融合部分框内连接u‑pa多肽。[0595]示范性表达载体包括任何哺乳动物表达载体，例如pcmv。对于细菌表达，这类载体包括pbr322、puc、pskf、pet23d以及融合载体如mbp、gst和lacz。其他真核载体例如含有来自真核病毒的调控元件的任意载体能用作真核表达载体。这些包括例如sv40载体、乳头瘤病毒载体和衍生自eb病毒的载体。示范性真核载体包括pmsg、pav009/a 、pmt010/a 、pmamneo‑5、杆状病毒pdsce，以及允许在以下启动子指导下表达蛋白的任何其他载体：cmv启动子、sv40早期启动子、sv40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多面体启动子或显示有效用于真核生物表达的其他启动子。[0596]iii.信号序列[0597]u‑pa融合蛋白可包含信号肽(sp或信号序列或定位信号或前导肽)以指导蛋白酶运输。信号肽是在初生蛋白n末端发现的序列基序，其靶向蛋白以跨内质网膜转运到其细胞内特定目的地，或如果蛋白待分泌则转运到细胞外。因此，sp选择和修饰sp会影响蛋白靶向(zhang等.(2005)jgenemed7:354‑365)。为了更有效活性开发了优化的sp。开发计算机模型和算法以预测sp效率及定义sp共有序列(burdukiewicz等.(2018)intjmolsci19(12):3709；peason等.(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444‑2448)。[0598]已知多种蛋白具有sp，包括但不限于：受体(核、4跨膜、g蛋白偶联和酪氨酸激酶)、细胞因子(趋化因子)、激素(生长和分化因子)、神经肽和血管介质、蛋白激酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸二酯酶、核苷酸环化酶、基质分子(粘附、钙粘素、胞外基质分子、整合素和选择素)、g蛋白、离子通道(钙、氯、钾和钠)、蛋白酶、转运子/泵(氨基酸、蛋白、糖、金属和维生素；钙、磷酸、钾和钠)以及调控蛋白。在一些示例中，初始信号肽优化用于蛋白在就生产选定的所需宿主细胞中的分泌。u‑pa多肽如本文所提供经修饰u‑pa蛋白酶结构域能直接或间接融合非u‑pa信号肽以用于u‑pa靶向。[0599]信号肽可以是抗体的信号肽，如抗体重链和抗体轻链的信号肽。抗体同种型可包括但不限于igg、igm、igd、iga和ige。因此，重链可包括γ、μ、δ、α和ε重链，轻链可包括κ或λ轻链。本文所示u‑pa融合蛋白能用抗体信号肽制备，如人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列，例如seqidno:999所示信号序列。[0600]其他示范性信号肽衍生自人白介素‑2(il‑2)，广泛用于研究和蛋白生成(bamford等(1998)jimmunol160:4418；komada等(1999)biolpharmbull22:846)。开发了碱性和疏水性增加的经修饰il‑2sp，使得融合蛋白分泌上升多至3.5倍(zhang等(2005)j.genemed.7:354)。本文的u‑pa融合蛋白可用例如il‑2信号肽制备，如人il2信号肽(hil2sp)，例如seqidno:1000所示信号序列。[0601]本文所示示范性u‑pa融合蛋白可包含信号肽以指导蛋白酶转运。例如，seqidno:1004、1005、1010、1011、1014‑1018、1036和1040所示u‑pa融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)。另一示例中，seqidno:1006‑1009、1012、1013、1034和1035所示u‑pa融合多肽包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)。[0602]iii.示范性融合蛋白和肽接头[0603]经修饰的u‑pa多肽与另一多肽的连接能直接或间接经接头实现。在一个示例中，连接可以是化学连接，如通过异双功能剂或硫醇连接或其他这类连接。u‑pa多肽与另一多肽的融合可以融合到经修饰的u‑pa多肽，如经修饰u‑pa蛋白酶结构域的n或c末端。例如，能用于有本文所提供u‑pa多肽的融合蛋白的多肽非限制性示例包括来自免疫球蛋白g的fc结构域、血清白蛋白(即人血清白蛋白)、结合iim型胶原的scfv(c2scfv)、透明质酸结合域(habd)、gst(谷胱甘肽s‑转移酶)多肽、his标签(即hhhhhh)、小泛素样修饰物(sumo)标签、流感病毒血凝素(ha)标签多肽和其抗体12ca5和/或异源信号序列(如来自凝血酶或小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)或人白介素‑2(hil2))。融合蛋白可包含额外成分，如协助细胞摄取蛋白的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(mbp)(参见国际pct申请公开号wo01/32711)。[0604]肽接头能纳入u‑pa融合蛋白。在一个示例中，肽接头能融合第一多肽c末端和第二多肽n末端。此结构可重复多次，从而至少一个且任选地2、3、4个或更多多肽经肽接头在其各自末端彼此连接。例如，融合蛋白能包括序列x‑y‑z，其中x是野生型或经修饰u‑pa催化结构域，y是肽接头，z是所有或部分融合伴侣(如hsa、fc、habd或c2scfv)。一些示例中，x是全部的经修饰u‑pa，包括u‑pa的n末端和u‑pa的蛋白酶结构域。其他示例中，x是部分的经修饰u‑pa，包括u‑pa蛋白酶结构域直接上游的12个氨基酸以及u‑pa蛋白酶结构域。另一示例中，多肽可包括序列a‑x‑y‑z，其中“a”是另一融合伴侣，如多肽例如sumo或his‑sumo，其促进表达和/或分离所得多肽。[0605]肽接头一般包括gly、ser和其组合，或ala和脯氨酸。接头一般包含2到多至20或25个残基。肽接头示例包括但不限于：‑‑gly‑gly‑‑、gsg、ags(seqidno:1003)、ggggs(seqidno:1001)、ggssgg(seqidno:1002)、ssssg(seqidno:1024)、gkssgsgsesks(seqidno:1025)、ggstsgsgkssegkg(seqidno:1026)、gstsgsgksssegsgstkg(seqidno:1027)、gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1028)、egkssgsgseskef(seqidno:1029)、或alaalaproala或(alaalaproala)n(seqidno:1030)，其中n是1‑6，如1、2、3、4、5或6。[0606]连接部分描述于例如huston等(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:5879‑5883,whitlow等(1993)proteinengineering6:989‑995,和newton等,(1996)biochemistry35:545‑553。其他合适肽接头包括美国专利号4,751,180或4,935,233所述那些中的任意一种。编码所需肽接头的多核苷酸能插入其间，且与编码包括u‑pa蛋白酶结构域在内所有或部分u‑pa的多核苷酸在同一读框内，使用任何适当的常规技术。在一个示例中，融合蛋白包含u‑pa多肽如u‑pa蛋白酶结构域，和融合伴侣如hsa、fc、habd或c2scfv，其通过肽接头分开。[0607]示范性u‑pa融合多肽包括在u‑pa蛋白酶结构域c末端的接头，其连接u‑pa蛋白酶结构域与融合伴侣c末端如hsa或fc。u‑pa接头和u‑pa‑接头‑hsa分子任选地包含表位标签和/或用于表达及分泌的信号。示范性u‑pa‑接头‑fc融合蛋白如seqidno:1018所示，包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、his‑sumo(seqidno:990)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)、接头(seqidno:1002)和人igg1重链的fc片段(seqidno:992)。[0608]其他示例中，示范性u‑pa融合蛋白是u‑pa‑接头‑hsa融合多肽，如seqidno:1015‑1017所示融合蛋白。例如，seqidno:1015所示的融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa的n末端结构域(seqidno:1042)、野生型u‑pa激活序列(seqidno:997)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)、接头(seqidno:1002)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1016所示的融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa激活序列中的弗林蛋白酶激活位点(seqidno:996)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)、接头(seqidno:1002)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1017所示融合多肽包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、his‑sumo(seqidno:990)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)、接头(seqidno:1002)和hsa(seqidno:991)。[0609]其他示例中，接头在u‑pa蛋白酶结构域n末端并连接蛋白酶结构域与n末端融合伴侣。例如，融合蛋白可包含连接u‑pa的n末端fc。示范性fc‑接头‑u‑pa融合多肽如所seqidno:1004所示，其包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、人igg1重链的fc片段f(seqidno:992)、接头(seqidno:1003)、野生型u‑pa激活序列(seqidno:997)和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)。[0610]iv.融合伴侣[0611]融合蛋白是已知用于改善肽或生物药物药代动力学的修饰，例如含有以下的融合蛋白：融合fc，融合人血清白蛋白(hsa)，融合单链片段可变(scfv)抗体例如结合ii型胶原的scfv(c2scfv)，融合habd、以及融合其他多肽。这些还包括缀合线性或支链单甲氧基聚乙二醇(peg)，引起分子量和流体力学半径增加以及肾的肾小球过滤速度下降。改善药代动力学参数的另一方法包括修饰糖基化模式，导致清除率降低和半衰期延伸。[0612]示范性u‑pa融合多肽包括将融合伴侣(即hsa、habd、c2scfv或fc)n末端置于u‑pa蛋白酶结构域或其c末端置于u‑pa蛋白酶结构域。示范性u‑pa融合蛋白如seqidno:1004所示，其中融合伴侣在u‑pa蛋白酶结构域的n末端。示范性u‑pa融合蛋白如seqidno:1006‑1018所示，其中融合伴侣在u‑pa蛋白酶结构域的c末端。[0613](a)fc结构域[0614]一些u‑pa融合蛋白示例包括免疫球蛋白多肽重链，最常是重链恒定结构域。用于人igg亚型的重链恒定区示范性序列如seqidno:45(igg1)、seqidno:1020(igg2)、seqidno:1021(igg3)和seqidno:1022(igg4)所示。例如，对于seqidno:45所示示范性重链恒定区，ch1结构域对应于氨基酸1‑98，铰链区对应于氨基酸99‑110，ch2结构域对应于氨基酸111‑223，ch3结构域对应于氨基酸224‑330。[0615]在一个示例中，u‑pa融合蛋白可包括免疫球蛋白多肽的fc区，如人免疫球蛋白。通常，这种融合保留至少功能活性铰链，免疫球蛋白重链恒定区的ch2和ch3结构域。例如，igg1的全长fc序列包括seqidno:45所示序列的氨基酸105‑330。用于higg1的示范性fc序列如seqidno:992和1023所示，包含对应于seqidno:45氨基酸100‑110的几乎所有铰链序列，和如seqidno:45所示用于ch2和ch3结构域的完整序列。另一示范性fc多肽如pct申请wo93/10151所示，且是单链多肽，从n末端铰链区延伸到人igg1抗体fc区的天然c末端(seqidno:50)。形成连接的精确位点不关键：熟知特定位点且能选择以优化u‑pa多肽的生物活性或稳定性。例如，其他示范性fc多肽序列在seqidno:45所示序列的氨基酸c109或p113处开始(参见例如美国公开号2006/0024298)。[0616]除了higg1fc，其他fc区也能纳入本文所提供u‑pa融合蛋白。例如，当由fc/fcγr介导的效应子功能最小化时，考虑融合igg同种型，其募集补体或效应细胞较弱，例如igg2或igg4的fc。另外，fc融合能包含免疫球蛋白序列，其基本由属于任意抗体种类的免疫球蛋白基因编码，包括但不限于抗体的igg(包括人亚类igg1、igg2、igg3或igg4)、iga(包括人亚类iga1和iga2)、igd、ige和igm种类。此外，接头能用于共价连接fc与另一多肽以产生fc嵌合体。[0617]本文也考虑经修饰的fc结构域用于有u‑pa融合多肽的嵌合体。一些示例中，fc区修饰成显示与fcr的结合改变，从而引起效应子功能相比野生型免疫球蛋白重链fc区的效应子功能改变(即更多或更少)。因此，经修饰的fc结构域可具有改变的亲和性，包括但不限于对fc受体的亲和性增加或较低或没有。例如，不同igg亚类对fcγr的亲和性不同，igg1和igg3通常与受体的结合显著优于igg2和igg4。不同fcγr介导不同效应子功能。fcγr1、fcγriia/c和fcγriiia是免疫复合物引发激活的正调节物，其特征是具有含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的免疫胞内结构域。然而，fcγriib具有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)并因而是抑制性的。一些示例中，可修饰本文所提供u‑pa多肽‑fc融合蛋白以增强结合补体蛋白c1q。此外，fc能修饰成改变其结合fcrn，从而改善u‑pa‑fc融合多肽的药代动力学。因此，改变fc区对受体的亲和性能调节与fc结构域相关的效应子功能和/或药代动力学性质。经修饰fc结构域为本领域技术人员已知且描述于文献，示范性修饰参见例如美国专利号5,457,035；美国专利公开号us2006/0024298；和国际专利公开号wo2005/063816。[0618]在一些示例中，形成u‑pa多肽多聚体。通常，多肽多聚体是2个嵌合蛋白的二聚体，其通过直接或间接连接2个相同或不同u‑pa多肽如u‑pa蛋白酶结构域与fc多肽而产生。一些示例中，编码u‑pa‑fc融合蛋白的基因融合物插入适当表达载体。所得u‑pa‑fc融合蛋白可在转化有重组表达载体的宿主细胞内表达，允许像抗体分子一样组装，其中链间二硫键在fc部分之间形成以产生二价u‑pa多肽。[0619]含有fc区的u‑pa融合多肽也能工程化成包括带金属螯合物或其他表位的标签。带标签的结构域可用于通过金属‑螯合物层析快速纯化，和/或通过抗体以允许检测蛋白质印迹、免疫沉淀或生物试验中的抗体消耗/阻断。[0620]示范性u‑pa‑fc融合多肽包括u‑pa蛋白酶结构域和fc的融合。示范性u‑pa‑fc融合蛋白如seqidno:1004、1006、1010、1011、1012和1018所示。u‑pa‑fc分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，示范性u‑pa‑fc融合多肽如seqidno:1004、1010和1011所示，包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、人igg1重链的fc片段(seqidno:992)和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21或987)，位于fc的n末端(seqidno:1004)或c末端(seqidnos:1010和1011)。另一示例中，seqidno:1006和1012所示示范性u‑pa‑fc融合多肽包含u‑pa蛋白酶结构域n末端的人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:5或21)和人igg1重链的fc片段(seqidno:992)。[0621](b)血清白蛋白[0622]u‑pa融合蛋白能用白蛋白作为融合伴侣产生，以增加半衰期、稳定性、生物利用度、分布和/或改善u‑pa的药代动力学。许多连接人血清白蛋白(hsa)的产品被批准用作治疗剂，包括用作癌症治疗剂和用于2型糖尿病治疗(alqahtani等.(2019)biomedandpharmacotherapy113:108750；roscoe等,(2018)mol.pharmaceutics151:15046‑5047；strohl,w.r.(2015)biodrugs4:215‑239)。一些示例中，缺乏信号序列和激活序列的成熟hsa蛋白与感兴趣蛋白融合。在u‑pa融合蛋白的一些示例中，血清白蛋白如人血清白蛋白(hsa)缀合u‑pa，如u‑pa蛋白酶结构域。示范性hsa如seqidno:991所示。[0623]u‑pa‑hsa融合多肽包括融合u‑pa蛋白酶结构域和hsa。示范性u‑pa‑hsa融合蛋白如seqidno:1007和1013‑1017所示。u‑pa‑hsa分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，示范性u‑pa‑hsa融合多肽如seqidno:1014‑1017所示，包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987或21或)和c末端hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1013所示示范性u‑pa‑hsa融合多肽包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:5)和c末端hsa(seqidno:991)。[0624](c)结合ii型胶原的scfv(c2scfv)[0625]重组抗体片段采用单链片段可变(scfv)抗体形式例如结合ii型胶原的scfv(c2scfv)，能用作与u‑pa的融合伴侣。生成自噬菌体展示的scfv抗体可融合标记物，或者活性或治疗蛋白(ahmad等(2012)clindevimmunol2012:980250)。融合scfv能用于增加缀合蛋白的收率和活性(martin等,(2006)bmcbiotech6:46)。[0626]单链片段可变抗体包括由肽接头或二硫键连接的重(vh)和轻(vl)链可变区(glockshuber等(1990)biochemistry29(6):1362–1367)。肽接头在多肽链折叠中发挥关键作用。常用接头包括用于灵活性的gly和ser残基或提高溶解度的glu和lys(whitlow等(1993)proteinengineering6(8):989–995)。[0627]scfv能融合蛋白以特异性递送到抗原呈递细胞(ahmad等(2012)clindevimmunol2012:980250)。例如，可产生scfv以靶向ii型胶原，如用作研究药剂，和作为治疗分子到表达人ii型胶原位点的递送剂。例如，scfv是分离的单克隆抗体或其结合人ii型胶原的片段，包括vh区和vl区，其中c2scfv所含氨基酸序列具有seqidno:993所示序列。[0628]示范性u‑pa‑c2scfv融合多肽包括融合u‑pa蛋白酶结构域和c2scfv。示范性u‑pa‑c2scfv融合蛋白如seqidno:1008所示。u‑pa‑c2scfv分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，seqidno:1008所示的示范性u‑pa‑c2scfv融合多肽包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和c末端c2scfv(seqidno:993)。[0629](d)透明质酸结合域(habd)[0630]在一些示例中，u‑pa融合蛋白包含habd融合伴侣，如肿瘤坏死因子刺激基因6(tsg‑6)，例如seqidno:994所示的tsg‑6(对应于人tsg‑6的氨基酸32‑134；ncbino:np_009046.2)。u‑pa融合蛋白可用habd如tsg‑6产生，作为融合伴侣以增加半衰期、稳定性、生物利用度、分布和/或改善u‑pa的药代动力学。[0631]肿瘤坏死因子刺激基因6(tsg‑6、肿瘤坏死因子α‑诱导蛋白6、tnfaip6；ncbino:np_009046.2)是～35kda分泌型糖蛋白，由单一n末端连接模块和c末端cub结构域构成。tsg‑6的表达通过炎症介质在许多细胞类型中诱导，包括细胞因子和生长因子。通过其据报道含有大致氨基酸35‑132的连接模块，tsg‑6是多形核白细胞游走的有效抑制剂。tsg‑6与丝氨酸蛋白酶抑制剂即间α抑制剂(iαi)形成稳定复合物并加强iαi的抗纤溶酶活性。tsg‑6还对富含ha的细胞周围包被和胞外基质的形成及重塑重要。[0632]示范性u‑pa‑habd融合多肽包括融合u‑pa蛋白酶结构域和habd。示范性u‑pa‑habd融合蛋白如seqidno:1009所示。u‑pa‑habd分子任选地包含表位标签或用于表达和分泌的信号。例如，示范性u‑pa‑habd融合多肽如seqidno:1009所示，包含人il2信号肽(hil2sp)序列(seqidno:1000)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和c末端habd(seqidno:994)。[0633]v.激活位点[0634]示范性u‑pa融合蛋白包含用于u‑pa激活的位点。例如，u‑pa融合蛋白包括野生型u‑pa序列用于自动激活；包含弗林蛋白酶序列用于在蛋白表达期间激活；或在分泌信号切割后激活，都产生活化的u‑pa蛋白酶。[0635](a)弗林蛋白酶[0636]弗林蛋白酶蛋白参与分泌途径内失活前体蛋白在单一、成对或多碱性共同位点的内切蛋白水解成熟加工(nakayama(1997)biochem.j.327:625‑635；seidah和chretien,currentopinionsinbiotechnology(1997)8:602‑607)。新合成的前体蛋白从内质网运到高尔基体区室后，前肽在两步式加工事件中于弗林蛋白酶切割基序处自催化去除(leduc等(1992)j.biol.chem267:14304‑14308；anderson等(1997)embo1508‑1518)。弗林蛋白酶需要r‑x‑x‑r位点用于切割，最优加工出现在r‑x‑k/r‑r基序(molloy等(1992)j.biolchem267:16396‑16402)。示范性u‑pa激活序列如seqidno:995和996所示，包含弗林蛋白酶rrkr切割位点。[0637]u‑pa融合蛋白可包括位于u‑pa蛋白酶结构域的n末端的弗林蛋白酶激活位点，从而u‑pa蛋白在表达期间活化。表达期间的u‑pa激活如通过在u‑pa激活序列纳入弗林蛋白酶激活位点，意在去除对下游加工期间激活步骤的需求。[0638]产生u‑pa融合多肽，包括弗林蛋白酶激活位点和u‑pa蛋白酶结构域。示范性弗林蛋白酶‑u‑pa蛋白如seqidno:1010、1014和1016所示。弗林蛋白酶激活的u‑pa分子任选地包含融合伴侣和或用于表达及分泌的信号。例如，seqidno:1014和1016所示示范性u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa激活序列中的弗林蛋白酶激活位点(seqidno:995或996)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21或987)和hsa(seqidno:991)。seqidno:1014所示的u‑pa融合蛋白还包括u‑pa的n末端(如seqidno:1或seqidno:1042的氨基酸21‑178所示)，位于弗林蛋白酶‑u‑pa蛋白酶结构域的n末端，其带有seqidno:987所示的u‑pa蛋白酶结构域。另一示例中，seqidno:1010所示的u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、u‑pa激活序列中的弗林蛋白酶激活位点(seqidno:995)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和fc(seqidno:992)。[0639](b)u‑pa[0640]u‑pa酶原激活通过u‑pa催化结构域n末端的单肽键切割发生，起始蛋白构象变化。本文产生的u‑pa构建体可包含12氨基酸u‑pa激活序列(seqidno:997)或其修饰形式(seqidno:998)，或者可含有包括激活序列在内的u‑pan末端延伸部分，从而u‑pa包括全长成熟多肽，如seqidno:3所示多肽。其他示例中，u‑pa包括n末端，如seqidno:1或seqidno:1042的氨基酸21‑178所示u‑pa的n末端区，和12氨基酸u‑pa激活序列(seqidno:997)或u‑pa激活序列修饰形式(seqidno:998)。[0641]制备含有本文所提供经修饰的u‑pa多肽的融合蛋白。产生u‑pa融合多肽，包括野生型或经修饰u‑pa激活位点和u‑pa蛋白酶结构域。示范性u‑pa蛋白如seqidno:1004、1005、1011和1015所示，包含用于激活的野生型u‑pa激活位点。融合肽任选地包含融合伴侣和/或用于表达和/或分泌的信号。例如，seqidno:1004所示示范性u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、fc(seqidno:992)、u‑pa激活序列(seqidno:995)和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)。另一示例中，seqidno:1005所示u‑pa融合蛋白包含全长成熟u‑pa序列(seqidno:3，带有seqidno:987所示经修饰蛋白酶结构域)和n末端人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)。另一示例中，seqidno:1011所示u‑pa融合蛋白包含n末端人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、全长成熟u‑pa序列(seqidno:3，带有seqidno:987所示的经修饰蛋白酶结构域)和fc(seqidno:992)。另一示例中，seqidno:1015所示u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、包括u‑pa激活序列在内的u‑pan末端(如seqidno:1的氨基酸21‑178所示)和hsa(seqidno:991)。经修饰的u‑pa多肽如seqidno:1006、1007、1009和1010的那些，在表达后证明有u‑pa蛋白酶活性。有弗林蛋白酶激活序列的经修饰u‑pa显示最高活性，所述序列位于在c末端有igfc融合的u‑pa的n末端。[0642]vi.纯化标签[0643]示范性u‑pa融合蛋白包含用于纯化u‑pa或u‑pa融合蛋白的标签。用于纯化u‑pa融合蛋白的示范性标签如上面章节f所示。示范性u‑pa融合蛋白能包含用于纯化的sumo或his序列。[0644](a)his标签[0645]u‑pa融合蛋白可包括his标签如seqidno:989所示的6xhis，和u‑pa蛋白酶结构域。[0646]产生u‑pa融合多肽，包括his纯化标签和u‑pa蛋白酶结构域。示范性his‑u‑pa融合蛋白如seqidno:1017和1018所示。带his标签的u‑pa分子任选地包含融合伴侣和/或用于表达及分泌的信号。例如，seqidno:1017所示的示范性his‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1018所示的示范性his标签‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和fc(seqidno:992)。[0647](b)sumo[0648]u‑pa融合蛋白可包括his标签和/或能纳入用于在包涵体中积聚的sumo序列。例如，seqidno:990所示his‑sumo序列和u‑pa蛋白酶结构域能连接全长经修饰的u‑pa多肽或其催化活性部分，如蛋白酶结构域或经修饰的u‑pa多肽的更大部分。产生u‑pa融合多肽，包括his‑sumo标签和u‑pa蛋白酶结构域。示范性his‑sumo‑u‑pa蛋白如seqidno:1017和1018所示。带his‑sumo标签的u‑pa分子任选地包含融合伴侣和/或用于表达及分泌的信号。例如，seqidno:1017所示的示范性his‑sumo‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和hsa(seqidno:991)。另一示例中，seqidno:1018所示示范性his‑sumo‑u‑pa融合蛋白包含人免疫球蛋白轻链κ前导信号肽序列(seqidno:999)、6xhis(seqidno:989)、sumo(seqidno:1031)、u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)和fc(seqidno:992)。[0649]7.核酸分子[0650]本文提供编码u‑pa多肽的核酸分子。核酸分子包括任意所编码u‑pa多肽或其催化活性部分的等位基因变体或剪接变体。在一个实施方案中，本文所提供核酸分子与任意核酸编码的u‑pa多肽或其催化活性部分有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列相同性。在另一实施方案中，核酸分子可包括有任意u‑pa多肽或其催化活性部分简并密码子序列的那些，如本文提供的那些。[0651]提供核酸分子或含有核酸分子催化活性部分的融合蛋白，其可操作连接启动子，如用于哺乳动物细胞表达的诱导型启动子。这类启动子包括但不限于cmv和sv40启动子；腺病毒启动子，如响应hpve7癌蛋白的e2基因启动子；pv启动子，如响应pve2蛋白的pbvp89启动子；和由hiv或pv或致癌基因激活的其他启动子。[0652]本文所提供u‑pa蛋白酶也能在基因转移载体中递送给细胞。转移载体还能编码额外治疗剂以治疗疾病或失调，如类风湿性关节炎或心血管疾病或amd或dgf，为了所述疾病或失调施用所述蛋白酶。通过向对象施用核酸，编码蛋白酶的转移载体能全身使用。例如，转移载体可以是病毒载体，例如腺病毒载体。编码蛋白酶的载体还能纳入干细胞且这类干细胞施用于对象，如通过在治疗位点移植或嫁接干细胞。例如，间充质干细胞(msc)可工程化成表达蛋白酶且这类msc在移植位点植入以用于治疗。[0653]g.组合物、制剂和剂量[0654]能以任何常规方式配制包含经修饰的u‑pa多肽、经修饰u‑pa融合蛋白或编码核酸分子的药物组合物，这是通过混合选定量的多肽与一个或多个生理上可接受载体或赋形剂进行的。在大部分实施方案中，经修饰的u‑pa多肽或融合蛋白在组合物中采用活化形式来施用。因此，例如，多肽是2链活化形式，或当融合蛋白包含多聚化结构域时，该蛋白可以是多聚体如二聚体。[0655]选择载体或赋形剂在管理专业人员技术范围内且可取决于若干参数。这些包括例如施用模式(即全身、口头、经鼻、肺部、局部、外用或任何其他模式)和所治疗疾病。本文所提供药物组合物能配制用于单剂(直接)施用或稀释或其他修饰。制剂中的化合物浓度在施用后可有效递送，其含量就预期治疗而言有效。通常，组合物配制用于单剂施用。为配制组合物，一定重量分数的化合物或其混合物以有效浓度溶解、悬浮、分散或另外混合于选定载剂，从而所治疗病症得到缓解或改善。适合本文所提供化合物施用的药物载体或载剂包括本领域技术人员已知适合特定施用模式的任意这类载体。[0656]1.经修饰的u‑pa多肽的施用[0657]出于本章节目的，经修饰的u‑pa多肽指含有修饰的u‑pa多肽，如经修饰蛋白酶结构域，且包括缀合物如融合蛋白。多肽能配制为组合物中唯一的药物活性成分或联合其他活性成分。多肽可靶向用于递送，如通过缀合靶向剂例如抗体。脂质体悬液包括组织靶向脂质体，也适合作为药学上可接受载体。这些能根据本领域技术人员已知的方法制备。例如，脂质体制剂能如美国专利号4,522,811所述制备。脂质体递送可包括缓释制剂，包括药物基质如胶原凝胶和修饰有纤连蛋白的脂质体(参见例如weiner等(1985)jpharmsci.74(9):922‑5)。[0658]将活性化合物纳入药学上可接受载体，其量足以产生治疗有益效果，而对所治疗对象没有不需要的副作用。治疗有效浓度可凭经验确定，这是通过在已知的体外和体内系统中测试，如本文所提供的试验。[0659]本文所提供u‑pa多肽(即活性化合物)能体外、离体或体内施用，这是通过使混合物如体液或其他组织样本接触本文所提供u‑pa多肽进行的，包括本文所提供任意经修饰的u‑pa多肽。例如，当离体施用化合物时，来自对象的体液如玻璃体或组织样本可接触管或滤器上包被的u‑pa多肽，例如旁路机中的管或滤器。当体内施用时，活性化合物能通过任何适当途径施用，例如口服、经鼻、肺部、胃肠外、静脉内、皮内、玻璃体内、视网膜内、视网膜下、眼周、皮下或外用，采用液体、半液体或固体形式，且以适合各施用途径的方式配制。确定剂量在医生技术范围内，且可视特定疾病、施用途径和对象而定。示范性剂量包括例如0.1‑1mg。[0660]经修饰的u‑pa多肽和生理上可接受盐及溶剂能配制用于经吸入施用(通过口或鼻)、口服、肺部、胃肠外或直肠施用。对于吸入施用，经修饰的u‑pa多肽可以来自压缩包或雾化器的喷雾剂呈现形式递送，使用合适推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体。在压力气雾剂的情况中，剂量单位能通过提供阀确定以递送计量数量。例如，明胶的胶囊和弹筒用于吸入器或吹药器，能配制成含有治疗化合物和适当粉末基如乳糖或淀粉的粉末混合物。[0661]对于肺的肺部施用，经修饰的u‑pa多肽可以喷雾剂呈现形式递送，来自雾化器、turbo雾化器或微处理器控制的定量口服吸入器，使用合适推进剂。一般，气雾剂的粒径较小，如范围为0.5‑5微米。在配制用于肺部施用的药物组合物情况中，通常不使用洗涤剂表面活性剂。肺部药物递送是有希望的非侵入性全身施用方法。肺代表一种有吸引力的药物递送途径，主要归因于用于吸附的高表面积、薄肺泡上皮、广泛血管化、没有肝的首关代谢和相对低代谢活性。[0662]对于口服施用，药物组合物可采用例如片剂、药丸、液体悬液或胶囊形式，其通过常规方式用药学上可接受赋形剂制备，如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙甲纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂能用本领域熟知的方法包被。用于口服施用的液体制剂采用例如溶液、糖浆剂或悬液的形式，或其能呈现为干产品，以在使用前用水或其他合适载剂构建。这类液体制品可通过常规方式用药学上可接受添加剂制备，如悬浮剂(例如山梨糖醇浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性载剂(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如羟苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制品在适当时还能包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。[0663]用于口服施用的制品能配制用于活性化合物的控释。对于颊部施用，组合物可采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。[0664]经修饰的u‑pa多肽能配制为持久(depot)制剂。这类长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌肉内注射施用。因此，例如，治疗化合物能用适当聚合或疏水材料(例如，作为溶于可接受油的乳液)或离子交换树脂配制，或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐。[0665]经修饰的u‑pa多肽能配制用于经注射胃肠外施用(如通过团注(bolusinjection)或连续输注)。注射用制剂可采用单位剂型(如在安瓶或多剂量容器中)呈现，添加有防腐剂。组合物可采用形式如溶于油或水性载剂的悬液、溶液或乳液，且能包含制剂如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，活性成分能采用粉末‑冻干形式，以在使用前用合适载剂如无菌无热原水构建。[0666]经修饰的u‑pa多肽能配制用于眼或眼科递送。眼的药物递送可以是例如外用、口服或全身和/或注射。例如，经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物可外用施用，如采用滴眼剂形式。另一示例中，经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物能通过眼周和/或玻璃体内或视网膜内或视网膜下施用，例如通过眼周或视网膜内或玻璃体内注射。[0667]经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物或编码经修饰的u‑pa多肽的核酸能配制用于全身施用以治疗dgf。另一示例中，经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物或编码经修饰的u‑pa多肽的核酸直接输注或注入肾或者移植肾相邻或周围的组织或器官。经修饰的u‑pa多肽或含有经修饰的u‑pa多肽的药物组合物可在同种异体移植时间前或伴随慢性方式连续施用的移植时间前施用，和/或可在诸如发作确实发生等事件中的排斥反应期间施用。[0668]药物组合物能配制用于局部或外用应用，如外用应用于皮肤(经皮)和粘膜，例如在眼中，采用凝胶、乳膏和洗剂(lotion)形式，且应用于眼睛或者脑池内或椎管内应用。这类溶液尤其是预期用于眼部应用的那些，可配制为0.01％‑10％等渗溶液和约ph5‑7，采用适当盐。化合物可配制为外用的气雾剂，如经吸入(参见例如美国专利号4,044,126,4,414,209和4,364,923，所述专利描述递送类固醇的气雾剂，该类固醇对治疗炎症疾病尤其是哮喘有用)。[0669]药物组合物中的活性化合物浓度取决于活性化合物的吸附、失活和排出率，给药方案，施用量以及本领域技术人员已知的其他因素。如本文进一步所述，剂量可凭经验确定，使用经修饰的u‑pa多肽相较未修饰和/或野生型u‑pa多肽的性质及活性(如切割一个或多个补体蛋白)对比。[0670]若需要，组合物可以在包装、试剂盒或分配器装置中呈现，其能包括含有活性成分的一个或多个单位剂型。在一些示例中，组合物可包被在装置上，如试管或滤器，例如在旁路机中。例如，包装包含金属或塑料薄膜，如泡罩包装。包装或分配器装置可随附施用说明书。含有活性剂的组合物能包装为含有包装材料和本文所提供药剂的制品，以及指示药剂所用疾病的标签。[0671]还提供含编码u‑pa多肽的核酸分子的组合物，包括表达载体。在一些实施方案中，所述编码u‑pa多肽的核酸分子与其编码表达载体的组合物适用于基因治疗。核酸能体内施用而不是递送蛋白，如全身或通过其他途径或离体如通过移出细胞，包括淋巴细胞，在其中引入核酸，并再引入宿主或相容受体。[0672]2.施用编码经修饰u‑pa多肽的核酸(基因治疗)[0673]经修饰的u‑pa多肽能通过表达核酸分子而递送给细胞和组织。经修饰的u‑pa多肽可以以编码经修饰的u‑pa多肽的核酸分子施用，包括离体技术和直接体内表达。核酸能通过本领域技术人员已知的任何方法递送给细胞和组织。分离的核酸能纳入载体以进一步操作。通过表达编码核酸分子来施用u‑pa多肽的方法包括施用重组载体。载体能设计成维持游离型，如通过纳入复制起点，或能设计成整合入细胞中的染色体。[0674]u‑pa多肽还可用于离体基因表达治疗，使用载体。本领域技术人员已知合适的基因治疗载体和递送方法。例如，细胞能工程化成表达经修饰的u‑pa多肽，如通过将u‑pa多肽编码核酸整合入基因组位置，可操作连接调控序列或从而其放置成在基因组位置可操作连接调控序列。这类细胞随后能局部或全身施用给对象，如需要治疗的患者。用于体内或离体基因治疗的示范性载体包括病毒载体和非病毒载体如脂质体或人工染色体。[0675]可采用病毒载体，包括例如腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒(aav)、逆转录病毒如慢病毒、ebv、sv40、巨细胞病毒载体、痘苗病毒载体，和其他设计用于基因治疗的载体。载体可以是保持游离型的那些或能整合入所治疗对象染色体的那些。经修饰的u‑pa多肽可在病毒载体中编码，如aav，其施用给需要治疗的对象。[0676]适合基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒和上述其他病毒。例如，腺病毒表达技术为本领域熟知，腺病毒生成和施用方法也熟知。可获得腺病毒血清型，例如来自美国菌种保藏中心(马里兰州罗克维尔市)。腺病毒可离体使用，例如细胞分离自需要治疗且转导有表达经修饰的u‑pa多肽的腺病毒载体的患者。适当的培养阶段后，转导细胞局部和/或全身施用给对象。或者，表达u‑pa多肽的腺病毒颗粒被分离和在药学上可接受载体中配制以递送治疗有效量，从而防止、治疗或缓解对象的疾病或病症。在一个实施方案中，所述待治疗疾病由补体激活导致。通常，腺病毒颗粒递送的剂量范围为1颗粒‑1014颗粒/千克对象体重，一般为106或108颗粒‑1012颗粒/千克对象体重。[0677]核酸分子能引入人工染色体和其他非病毒载体。人工染色体如aces(参见lindenbaum等.nucleicacidsres.(2004)32(21):e172)能工程化成编码和表达u‑pa多肽。简言之，哺乳动物人工染色体(mac)提供以自主复制、非整合模式向细胞引入大负载遗传信息的方式。mac中独特的基于哺乳动物卫星dna的人工染色体表达系统(aces)能在不同物种细胞系中从头可重复产生，且易从宿主细胞染色体中纯化。纯化的哺乳动物ace随后可再引入多种受体细胞系，在该处其在没有选择压力的情况下维持较长时间，使用ace系统。采用此方法，在lmtk(‑)和cho细胞中实现1或2个基因靶标的特定加载。[0678]引入经修饰的u‑pa多肽编码核酸的另一方法是酵母中的两步式基因取代技术，开始是用克隆于酵母人工染色体(yac)的完整腺病毒基因组(ad2；ketner等.(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:6186‑6190)和含腺病毒序列的质粒以靶向特定yac克隆中的区域，用于感兴趣基因的表达盒以及正和负选择性标记。对yac特别感兴趣，因为其允许纳入较大基因。此方法能用于构建基于腺病毒的载体，其携带编码任意上述经修饰的u‑pa多肽的核酸以基因转移到哺乳动物细胞或整体动物。[0679]核酸可封装于载剂如脂质体，或引入细胞如细菌细胞，尤其是减毒细菌，或者引入病毒载体。例如，当采用脂质体时，与内吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白能用于靶向和/或促进摄取，如衣壳蛋白或其亲特定细胞类型的片段，用于循环中经历内化的蛋白的抗体，和靶向胞内定位及提高胞内半衰期的蛋白。[0680]在一些实施方案中，需要提供核酸来源，带有靶向细胞的药剂，如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，或靶细胞上受体的配体。本文提供的多核苷酸和表达载体可通过任何适当方法形成。进一步提供含有上述核酸分子的核酸载体。还提供含有上述核酸分子的核酸载体和含有这些载体的细胞。[0681]对于离体和体内方法，将经修饰的u‑pa多肽编码核酸分子引入来自适当供体或待治疗对象的细胞。可出于治疗目的引入核酸的细胞包括例如适合待治疗疾病或病症的任何所需、可获得的细胞类型，包括但不限于表皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞如t淋巴细胞、b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干或祖细胞，包括造血干或祖细胞，例如获自骨髓、脐带血、外周血、胎肝和其其他来源的干细胞。[0682]对于离体治疗，移出来自与待治疗对象相容供体的细胞或来自待治疗对象的细胞，向这些分离细胞引入核酸且修饰细胞施用于对象。治疗包括直接施用，例如在多孔膜内封装，其植入患者(参见例如美国专利号4,892,538和5,283,187)。适合核酸体外转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体和阳离子脂质(如dotma、dope和dc‑chol)电穿孔、微注射、细胞融合、deae‑葡聚糖和磷酸钙沉淀方法。dna递送方法能用于体内表达u‑pa多肽。这类方法包括脂质体递送核酸和裸dna递送，包括局部和全身递送例如使用电穿孔、超声和磷酸钙递送。其他技术包括微注射、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移和球状质体融合。[0683]体内表达经修饰的u‑pa多肽可与额外分子表达相连。例如，u‑pa多肽表达可与细胞毒性产物的表达相连，如在工程病毒中或在细胞毒性病毒中表达。这类病毒能靶向特定细胞类型，其是治疗效果的靶标。表达的u‑pa多肽能用于增强病毒的细胞毒性。[0684]体内表达u‑pa多肽可包括操作性连接u‑pa多肽编码核酸分子与特定调控序列如细胞特异或组织特异性启动子。u‑pa多肽也能表达自载体，其在靶细胞类型和/或组织中特异性感染和/或复制。诱导型启动子能用于选择性调节u‑pa多肽表达。[0685]作为裸核酸或在载体、人工染色体、脂质体和其他载剂中的核酸分子，能通过全身施用、外用、局部和其他施用途径施用于对象。当全身性和体内时，核酸分子或含有核酸分子的载剂能靶向细胞。[0686]施用还可以是直接的，如通过载体或细胞施用，其通常靶向细胞或组织。例如，肿瘤细胞和增殖细胞可以是用于体内表达u‑pa多肽的靶细胞。用于体内表达u‑pa多肽的细胞还包括与患者自体同源的细胞。这类细胞可从患者取出，引入用于表达u‑pa多肽的核酸，然后通过注射或移植施用于患者。[0687]施用以治疗amd和其他眼疾病[0688]可施用编码经修饰的u‑pa多肽的核酸以治疗病因学涉及补体激活的疾病或病症，其中抑制其能缓解疾病或病症症状或另外治疗疾病或病症。核酸如载体例如病毒载体设计用于递送本文所述经修饰的u‑pa多肽编码核酸，可根据疾病或病症通过任何合适途径或不同途径的组合施用对象。实现核酸递送可通过直接递送到眼睛(如眼部递送、视网膜下注射、玻璃体内(ivt)注射、视网膜内注射或外用(例如滴眼剂)递送)或全身途径递送，如动脉内、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内和其他施用途径。[0689]本领域技术人员可选择与施用对象和病毒相容的任何施用模式，且还可能导致病毒到达和进入靶细胞类型或组织，如眼睛，例如视网膜色素上皮(rpe)细胞和/或感光细胞。施用途径能由本领域技术人员根据任意多种因素选择，包括疾病性质、靶细胞或组织特性(如细胞类型)和待施用的特定病毒。可选择在靶向感兴趣细胞或组织的地方施用，如眼睛，例如视网膜色素上皮(rpe)细胞和/或感光细胞或视网膜下腔。[0690]例如，经修饰的u‑pa多肽编码核酸如病毒表达载体能递送给靶细胞，其以疾病为特征，如眼疾病例如amd。例如，含有病毒的组合物可通过视网膜下注射递送，如视网膜下注入视网膜色素上皮(rpe)、感光细胞或其他眼细胞(如视网膜神经节细胞)。在一些示例中，视网膜下施用病毒如含有本文所述核酸的任意病毒，需要熟练的医生实施玻璃体切除术(即其中在视网膜内形成针孔(视网膜造孔术)并注射液体，如含有病毒的液体，例如本文所述任何病毒)。视网膜下注射能经角膜途径实现，通过瞳孔且随后穿过晶状体、玻璃体和视网膜。其他示例中，视网膜下注射可如下进行：将针或任何其他施用装置穿过巩膜，进入平坦部或色边缘区，通过中部或后部玻璃体并到达视网膜另一侧，到视网膜下腔内。其他示例中，视网膜下注射可如下进行：将针或任何其他施用装置穿过巩膜，通过眼脉络膜和布鲁赫膜，防止视网膜递送到rpe。视网膜下施用的其他合适途径可由熟练的技术人员或医生或外科医生确定。一些示例中，水泡形成标志着施用成功。[0691]在其他示例中，组合物包含经修饰的u‑pa多肽编码核酸以在眼中表达，可通过玻璃体内注入眼部细胞递送，如施用以靶向玻璃体细胞和内层视网膜细胞。在一些示例中，玻璃体内注射如下进行：将针或任何其他施用装置穿过平坦部，通过中部或后部玻璃体并到达视网膜另一侧。玻璃体内注射后，可递送含有病毒的组合物以感染神经节细胞。其他示例中，通过玻璃体内注射递送的含病毒组合物靶向内核层细胞。递送功效取决于病毒滴度和血清型。在一些示例中，治疗包括直接玻璃体内注射，联合玻璃体内植入式装置(即生物溶蚀性和非生物溶蚀性植入式装置)以增加眼睛后部的所施用药剂浓度(hwang等(2012)jkoreanmedsci27:1580‑85)。[0692]在其他示例中，含有经修饰的u‑pa多肽编码核酸的组合物通过睑静脉注射入靶眼部细胞。其他示例中，病毒离体施用(如应用于切除的rpe脉络或胎儿视网膜细胞或视网膜细胞)以移植到眼睛，例如作为视网膜移植物。其他示例中，本领域技术人员如熟练的医生可选择含有本文所述核酸的任何病毒的合适施用途径。若需要，施用途径能组合。[0693]在一个示例中，病毒在靶细胞如疾病细胞存在的位点局部施用，即眼睛或视网膜。外用施用常用于眼前节的眼疾病(patel等.worldjpharmacol(2013)2:47‑64)。[0694]在一个示例中，玻璃体内递送的病毒能在细针(27‑30g)内通过玻璃体内的平坦部施用。技术人员会确定针轴离多远插入眼睛(如插入深度)、施用速度(如应用于柱塞的压力)、斜面的取向角以及轴与平坦部之间的角度。[0695]h.治疗应用和治疗方法[0696]本文所提供经修饰的u‑pa多肽靶向补体蛋白c3且允许调节补体介导的疾病和失调。治疗蛋白酶如本文所提供经修饰的u‑pa多肽相比传统治疗方法具有许多潜在优势。其中主要是以催化方式灭活疾病靶标(即一个到许多化学计量)。因此，蛋白酶能在显著低于靶浓度的浓度下维持有效调控。另外的差异化优势包括(1)不可逆灭活；(2)低给药剂量；(3)给药频率减少(4)小分子尺寸；(5)靶向翻译后修饰的能力；(6)中和高靶标浓度的能力；和(7)靶向远离活性位点的能力。作为治疗剂，蛋白酶必须仍显示下列特征：(1)达到分子靶标(胞外)和(2)对于疾病状态关键的靶标具有足够严格的特异性。本文所提供的经修饰的u‑pa多肽能用于治疗补体介导疾病和失调。[0697]技术人员应理解补体系统在疾病过程中的作用并知道多种这类疾病。提供关于示范性疾病和补体蛋白c3在其病因学及病理学中作用的简要讨论。本文所提供经修饰的u‑pa多肽和核酸分子能用于治疗涉及补体途径激活的任何病症，尤其是炎性病症，包括急性炎症病症如败血性休克和慢性炎症病症如类风湿性关节炎(ra)。急性和炎性病症可表现为免疫介导疾病，例如自身免疫病或由免疫复合物介导的炎症所导致的组织损伤。补体介导的炎性病症也可表现为具有炎症成分的神经退行性或心血管疾病。此章节提供本文所提供经修饰的u‑pa多肽的示范性应用和施用方法。所述这些治疗是示范性的且不限制本文所提供经修饰的u‑pa多肽的应用。这类方法包括但不限于治疗下面所述和列举的生理及医学状况的方法。这类方法包括但不限于治疗年龄相关的黄斑变性(amd)、地图状萎缩(ga)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、移植肾功能延迟(dgf)、败血症、类风湿性关节炎(ra)、膜增生性肾小球肾炎(mpgn)、红斑狼疮、多发性硬化(ms)、重症肌无力(mg)、哮喘、炎症性肠病、呼吸窘迫综合征、免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤、多脏器功能衰竭、阿尔茨海默氏病(ad)、由事件或处理导致的缺血再灌注损伤，如心肌梗塞(mi)、中风、心肺转流(cpb)或冠状动脉旁路搭桥、血管成形术或血液透析，慢性阻塞性肺病(copd)、特发性肺纤维化(ipf)和/或格林‑巴利综合征的方法。[0698]用本文所提供经修饰的u‑pa多肽治疗疾病和病症可通过任何适当途径使用本文所述合适制剂实现，包括但不限于皮下注射、口服、玻璃体内、视网膜内、视网膜下、眼周和经皮施用。若必要，特定剂量和持续时间及治疗操作可凭经验确定或推测。例如，野生型u‑pa多肽的示范剂量能用作起始点以确定合适剂量。相较于野生型u‑pa多肽具有更高特异性和/选择性的经修饰的u‑pa多肽可在减少的剂量或频率有效。剂量水平能基于多种因素确定，如个体体重、总体健康、年龄、所用特定化合物的活性、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病严重度和过程、患者疾病倾向和治疗医生的判断。可联合载体材料以生成单一剂型的活性成分量会根据所治疗宿主和特定施用模式而变化。[0699]患者病症改善后，若必要，可施用化合物或组合物的维持剂量；施用剂量、剂型或频率或其组合可改良。一些情况下，对象在任何疾病症状复发后可能需要长期间歇疗法。[0700]1.补体激活介导的疾病[0701]补体级联是一把双刃剑，通过促进吞噬作用和炎症来引起针对细菌以及病毒侵入的保护。相反，甚至当补体正常运作时，其可能通过促进局部炎症而促成疾病发展和组织损伤。因此，病理学效果由负责补体保护作用的相同介质介导。例如，过敏性和趋化肽c5a通过募集和激活嗜中性粒细胞来驱动炎症，c3a能导致其他吞噬细胞的病理性激活，膜攻击复合物能杀死或损伤细胞。在一个示例中，如许多自身免疫病中，补体产生组织损伤，因为其在不恰当情况下活化，如通过针对宿主组织的抗体活化。其他情况下，补体能正常激活，如通过败血症，但仍促成疾病发展，如在呼吸窘迫综合征中。如果不适当控制，补体能在病理上导致对血管(血管炎)、肾脏基底膜以及附着的内皮细胞和上皮细胞(肾炎)、关节滑膜(关节炎)和红细胞(溶血)的重大损害。[0702]补体在若干疾病的免疫发病机理中起作用，包括自身免疫病如类风湿性关节炎(参见例如wang等(1995)proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:8955‑8959；moxley等(1987)arthritis&rheumatism30:1097‑1104)、红斑狼疮(wang等(1996)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:8563‑8568；andbuyon等(1992)arthritisrheum.35:1028‑1037)和急性肾小球性肾炎(couser等(1995)jamsocnephrol.5:1888‑1894)。涉及补体系统激活的其他病状包括败血症(参见例如stove等(1996)clindiaglabimmunol3:175‑183；hack等(1989)am.j.med.86:20‑26)、呼吸窘迫综合征((参见例如zilow等(1990)clin.exp.immunol.79:151‑157；和stevens等(1986)j.clin.invest.77:1812‑1816)、多脏器功能衰竭((参见例如hecke等(1997)shock7:74；和heideman等(1984)j.trauma24:1038‑1043)、缺血再灌注损伤如在心血管疾病如中风或心肌梗塞中发生(austenwg等(2003)intjimmunopatholpharm16(1):1‑8)、年龄相关的黄斑变性(bradley等.eye25:683‑693(2011)；gemenetzi等.eye30:1‑14(2016))和移植肾功能延迟(danobeitia等.[摘要].amjtransplant.2013；13(suppl5)；yu等(2016)amjtransplant16(9):2589‑2597；castallano等(2010)amjpathol176(4):1648‑1659)。一些补体介导疾病的范例如下所述。[0703]a.类风湿性关节炎[0704]类风湿性关节炎(ra)是慢性炎症性疾病。其是自身免疫病，其中免疫系统攻击正常组织成分，就如同它们是入侵的病原体。与类风湿性关节炎相关的炎症主要攻击关节内部。血管、心脏和肺内衬的膜还可能发炎。ra表征为在发炎滑膜和确立的疾病淋巴滤泡及生发中心内存在活化的b细胞和浆细胞。这引起高水平的局部免疫球蛋白生成和包括igg及igm类风湿因子在内的免疫复合物沉积，这在滑膜中且与关节软骨相关联，其能用作补体级联的起始剂。在发炎的类风湿性关节中发现补体成分如c3a、c5a和c5b‑9水平提高。这些补体成分能加剧ra相关炎症，这是通过诱导多种促炎活性如血管通透性、白细胞趋化的改变以及多个细胞类型的激活和裂解。[0705]b.败血症[0706]败血症是由严重感染如细菌感染导致的疾病，引起全身性炎症应答。细菌细胞壁成分脂多糖通常与败血症相关，尽管其他细菌、病毒和真菌感染能刺激败血症状。如果身体的天然免疫系统无法抵御入侵的微生物，从而例如免疫应答的促炎结果对宿主组织有害，则经常发生败血性休克。败血症早期表征为过度补体激活，引起补体过敏毒素如c3a、c4a和c5a生成增加，其作用于增加血管通透性，刺激从中性粒细胞生成超氧化物并刺激组胺释放。c5a的作用能有助于对细菌感染的高效免疫应答，但若保持不受调控，c5a也能有严重破坏性。在大肠杆菌诱导的炎症模型中，阻断c5a可通过限制c5a介导的中性粒细胞激活来改善败血症动物的结果，所述激活能导致中性粒细胞介导的组织损伤。[0707]对细菌感染的固有免疫应答的持续损伤通常导致慢性败血症或败血性休克，其可能威胁生命。在败血症后期，中性粒细胞的“休眠”活性促成疾病持续，其与早期出现的极度活跃相反。后期中，中性粒细胞的主要功能下降，包括趋化性、呼吸爆发活力和细菌杀伤能力。补体且尤其是c5a，也在败血症后期发挥作用。败血症期间的c5a过度生成与血中性粒细胞“失活”相关联，此过程与中性粒细胞上c5a诱导的其自身受体c5ar下调相关(guo等(2003)fasebj13:1889)。中性粒细胞上的c5ar水平下降与血中性粒细胞结合c5a的能力减弱、趋化反应受损、过氧化物生成损失和细菌活性受损相关联。然而，c5ar水平能在败血症后期开始“恢复”且与有益疾病结果示例相关。[0708]c.多发性硬化[0709]多发性硬化(ms)和其动物模型实验性变应性脑脊髓炎(eae)是中枢神经系统(cns)的炎性脱髓鞘病。在ms中，神经组织炎症导致髓磷脂损失，髓磷脂是脂肪物质，用作脑和脊髓中神经纤维的一种保护绝缘套。此脱髓鞘留下沿着神经细胞覆盖物的多区域瘢痕组织(硬化)，这破坏神经实施电脉冲进出大脑的能力，生成多种ms症状。ms由活化的淋巴细胞、巨噬细胞/小神经胶质细胞和补体系统介导。补体激活可通过其双重作用促进这些疾病的发病机理：活化末端复合物c5b‑9促进脱髓鞘的能力和亚溶解型c5b‑9保护少突胶质细胞(olg)免于细胞凋亡的能力。[0710]d.阿尔茨海默氏病[0711]阿尔茨海默氏病(ad)表征为脑内的缠结(异常配对的蛋白tau螺旋丝，其通常结合微管)和斑块(胞外沉积，主要由β淀粉样蛋白构成)。尽管ad的精确病因不完全清楚，ad脑受影响区域的慢性神经炎症表明促炎介质能发挥作用。ad脑内的缠结和斑块沉积有活化的补体片段，例如c4d和c3d。同样，ad脑内的营养不良性神经突可就mac进行免疫组化染色，指示ad中这些神经突的自催化攻击和伴随的神经突损失。ad的补体激活通过聚集的淀粉样β蛋白所诱导的抗体独立机制发生。此外，补体级联能由正五聚蛋白、c反应蛋白(crp)和淀粉样蛋白p(ap)激活，其在ad中都上调(mcgeer等,(2002)trendsmolmed8:519)。ad的补体激活标志为补体介质增加，通过补体调控蛋白如cd59的补偿性上调，未充分控制所述激活。因此，补体激活的促炎结果加剧ad发展且可能促成神经突破坏。[0712]e.缺血再灌注损伤[0713]缺血再灌注损伤是缺血事件和血流后续恢复之后持续的损伤，由对缺氧损害的炎症应答引起。缺血再灌注损伤在心脏手术操作期间，例如开心手术或血管成形术后，可以是急性的，或者随着充血性心力衰竭或闭塞性心血管疾病，可以是慢性的。能导致缺血再灌注损伤的损伤示例包括心肌梗塞(mi)和中风。炎症应答的起始可能由随着再灌注发生的组织氧水平增加以及伴随的代谢物积聚引起，所述代谢物可产生免疫刺激的氧自由基。缺血再灌注损伤与多个事件相关，包括心肌梗塞、脑缺血事件、肠缺血的严重度，和许多方面的血管外科、心外科、创伤和移植。损伤表现为固有免疫系统的炎症事件，尤其是补体系统的激活，响应作为非自身的新改变组织。如此，缺血再灌注损伤表征为血管通透性增加导致的组织水肿和多形核白细胞流入导致的急性炎性细胞浸润。[0714]补体系统的激活在缺血再灌注损伤的炎症事件中发挥作用。缺血损伤导致细胞膜改变，影响外部表面的脂质、碳水化合物或蛋白，从而这些暴露的表位改变并能用作新抗原(修饰的自身抗原)。循环igm识别和结合新抗原以在受损细胞表面上形成免疫复合物。形成的抗原‑抗体复合物是补体经典途径的经典激活物，尽管所有途径可能都在某种程度上参与损伤的加剧作用。补体经典途径参与缺血再灌注损伤由c3或c4基因缺陷型小鼠证明，其在损伤的后肢和动物模型中展示出针对局部损伤的等同保护(austen等(2003)intjimmunopathpharm16:1)。相反，在缺血损伤的肾模型中，c3、c5和c6缺陷型小鼠受到保护，而c4缺陷型小鼠没有，表明替代补体途径的重要性(guo等(2005)annrevimmunol23:821)。补体激活后诱导的介质在局部损伤位点针对细胞膜起始炎症应答。[0715]补体在缺血再灌注损伤中的主要效应机制是中性粒细胞通过补体成分例如c5a流入发炎组织和激活。中性粒细胞激活引起局部受损器官中的活性氧生成增加和溶酶体酶释放，这最终导致细胞凋亡、坏死和器官功能损失。产生末端mac即c5b‑9也促成缺血再灌注损伤中的局部组织损伤。[0716]f.眼失调[0717]正常眼中，补体系统在低水平连续激活；膜结合和可溶性眼内补体调控蛋白严格调节此自发补体激活。低水平补体激活提供保护抵御病原体，而不导致对自身组织的任何损害和视力丧失。补体系统和补体调控蛋白控制自身免疫性葡萄膜炎中的眼内炎症并在角膜炎症、年龄相关的黄斑变性和糖尿病视网膜病变发展中起重要作用。补体系统在糖尿病视网膜病变以及糖尿病神经病变和糖尿病心血管病变的发病机理中具有重要作用(参见例如ghosh等(2015)endocrrev36:272–288)。自发补体激活能导致感染后的角膜组织损害。补体抑制是多种眼疾病治疗中的相关治疗靶标(参见例如purushottam等(2007)molimmunol.44:3901–3908)。[0718]年龄相关的黄斑变性(amd)[0719]年龄相关的黄斑变性是描述多种疾病的临床术语，所述疾病表征为中心视力的逐步丧失。amd是许多工业国家中老年个体视力丧失的主要原因(jager等(2008)nengljmed358:2606‑2617)。发生视力丧失归因于黄斑进行性变性，黄斑是眼后部区域，包括高密度视锥细胞，其专门用于高灵敏度中心视力。[0720]amd能表现为干(非新生血管)amd和/或湿amd。干amd是更常见(85‑90％病例)和温和形式的amd，且表征为黄斑中或下面的小、圆形、黄白病变(脉络膜小疣)。晚期干amd或地图状萎缩导致由pre感光细胞损失引起的视网膜变薄、黄斑退化和最终的失明。尽管更稀少，与湿amd相关的视力丧失一般比干amd更剧烈。湿amd包括形成致病性血管，称为脉络膜新生血管(cnv)，其中异常血管在视网膜色素上皮(rpe)层下方发展。cnv通过布鲁赫膜断裂或其破坏从下面脉络入侵视网膜能导致amd中的视力丧失，布鲁赫膜是脉络与视网膜色素上皮(rpe)之间的胞外基质(例如，归因于视网膜下出血和/或瘢痕)。[0721]amd的早期临床特点包括布鲁赫膜变厚和出现脉络膜小疣(gass,j.d.(1972)trans.am.ophthalmol.soc.70:409‑36)，其是由聚集蛋白组成的胞外脂蛋白沉积(即白蛋白、载脂蛋白e(apoe))、补体途径成分(如补体因子h(cfh),c1q,c3,c5,c5b,c6,c7,c8,c9和玻连蛋白(hageman等.,(2001)prog.retin.eye.res29:95‑112；hageman等(2005)proc.nat.acad.sci.102:7227‑7232；mullins等(2000)fasebh14:835‑846；anderson等,(2010)pro.retin.eyeres.29:95‑112))、免疫球蛋白和/或β淀粉样蛋白(crabb等,(2002)procnatlacadsci99:14682‑14687；johnson等,(2002)99:11830‑11835))以及位于rpe与布鲁赫膜之间的脂质和细胞组分。[0722]amd中的炎症由替代补体途径失调介导。补体成分c3和c5是amd患者中脉络膜小疣的主成分(mullins等,(2000)fasebj14,835‑46；johnson等,(2000)expeyeres70,441‑9；anderson等,(2002)amjophthalmol134,411‑31；和leitner等,(2001)expeyeres73,887‑96)。假设脉络膜小疣的生物发生涉及能引发补体激活和mac形成的慢性炎症过程，其可裂解rpe细胞或破坏rpe细胞的生理性自体稳衡，导致amd的炎症特征(johnson等(2001)expeyeres73,887‑896)。在amd患者血液中还检测到补体蛋白(如c3d)((scholl等,(2008)plosone3:e2593)，指示amd诱导炎症可能是全身性的。有遗传证据证明补体在干amd发病机理中的作用(klein等.science308(5720):385‑389(2005)；yates等,nejm357:553‑561(2007))，坎普他汀(和坎普他汀衍生物apl‑1及apl‑2)和c3的小肽抑制剂pot‑4(potentiapharmaceuticals)可减缓amd中的地图状萎缩发展(ricklin等(2008)adv.exp.med.biol.632:273‑292)，表明c3(即c3抑制)可以是amd治疗的可行靶标。[0723]g.器官移植和移植肾功能延迟(dgf)[0724]补体在缺血再灌注损伤的发病机理发挥作用。肾再灌注损伤的机制取决于c5a和c5b‑9的生成，两者都对肾小管有直接毒性，促进急性肾小管坏死和细胞凋亡，并导致缺血后急性肾功能衰竭和组织纤维化。进而，产生这些末端途径成分取决于肾内合成c3和对补体激活必要的其他补体成分可用性。供体器官的c3表达水平强烈取决于冷缺血时间(elham等(2010)curropinorgantransplant.15:486–491)。[0725]实体移植器官排斥受初始炎症应答和后续适应性同种免疫应答影响，两者都受多个补体成分影响。补体蛋白在缺血再灌注过程的移植后器官损伤和调节适应性免疫应答激活中发挥重要作用。抑制补体或调节补体蛋白分子功能可减少移植器官损伤并增加器官寿命(参见例如elham等(2010)curropinorgantransplant.15:486–491)。为治疗干预靶向补体成分可在器官回收、转移和移植后的时间减少器官损伤。示例性的这样的器官是肾。可施用本文所提供经修饰的u‑pa多肽以缓解和/或治疗移植后的器官损伤。[0726]移植肾功能延迟(dgf)如肾功能延迟恢复是一个肾移植患者子集中出现的病症，其中移植器官在移植后无法立即正常运作。其他可能的移植包括但不限于心、肺、血管组织、眼、角膜、晶状体、皮肤、骨髓、肌肉、结缔组织、胃肠组织、神经组织、骨、干细胞、胰岛、软骨、肝细胞和造血细胞。肾dgf表征为肾移植的急性坏死且临床定义为移植后不久的透析需求。移植过程期间的急性肾损伤经常表现为dgf。dgf的潜在病理学是来自供体衍生因素(如供体年龄和缺血持续时间)和受体因素(如再灌注损伤、免疫应答和免疫抑制剂药物治疗)的贡献的复合体。[0727]补体级联成分和补体激活起到作为移植排斥和缺血再灌注损伤介质的关键作用，所述损伤导致dgf。动物研究确立了补体在缺血再灌注损伤中的关键作用。例如，针对c5的人源化单克隆抗体依库丽单抗可阻断补体激活且显示在一个高风险肾移植患者子集中防止移植肾功能延迟(参见例如《水平扫描研究和情报中心简报》(horizonscanningresearchandintelligencecentrebrief),2016年9月；johnson等(2015)curropinorgantransplant20(6):643‑651；yu等(2016)amjtransplant16(9):2589‑2597)。粒状c4d沉积与人肾移植受体的dgf相关(等(2014)transplint27(3):312‑321)。c3生成增加与肾移植排斥相关(pratt等(2002)natmed8(6):582‑587；damman等(2011)nephroldialtransplant26(7):2345‑2354)。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用作治疗剂以防止或缓解或消除移植排斥和dgf。[0728]2.治疗应用[0729]a.免疫介导的炎症疾病[0730]本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于治疗炎症性疾病。可用蛋白酶治疗的炎症性疾病包括急性和慢性炎症性疾病。示范性炎症性疾病包括中枢神经系统疾病(cns)、自身免疫病、气道高反应性病症如哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病和免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤。[0731]实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)能用作多发性硬化(ms)模型(piddlesden等,(1994)jimmunol152:5477)。eae可在许多遗传易感物种中通过用髓磷脂和髓磷脂组分如髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)免疫来诱导。例如mog诱导的eae概括了人ms的基本特征，包括慢性、复发临床病程、炎症的病理组织学三联体(pathohistologicaltriadofinflammation)、反应性胶质化和形成汇合的大脱髓鞘斑块。经修饰的u‑pa多肽可在eae动物模型中评价。施用经修饰的u‑pa多肽，如通过每日腹腔注射，监测相较对照动物的症状过程和进展。可加剧疾病的炎性补体成分水平能如下测量：在溶血实验中测定血清补体活性和测定补体成分例如c1、c3和c9的沉积。[0732]补体激活调节疾病中的炎症，如类风湿性关节炎(ra)(wang等,(1995)proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:8955)。经修饰的u‑pa多肽能用于治疗ra。例如，u‑pa多肽能局部或全身注射。经修饰的u‑pa多肽能每日或每周给药。聚乙二醇化u‑pa多肽可用于诱导免疫原性。在一个示例中，ii型胶原诱导性关节炎(cia)能在作为自身免疫炎性关节疾病模型的小鼠中诱发，其在组织学上类似表征为炎性滑膜炎、血管翳形成以及软骨和骨侵蚀的ra。为诱导cia，牛ii型胶原(b‑cii)在弗氏完全佐剂存在情况下能于尾基部皮内注射。21天后，小鼠能用相同操作再免疫。为检测u‑pa多肽效果，b‑cii初始攻击后3周，u‑pa多肽或对照能每周腹腔施用2次，持续3周。小鼠在初始免疫后7周杀死以用于组织学分析。为评价u‑pa多肽对已建立疾病的治疗效果，u‑pa多肽能在一个或多个后肢发生临床关节炎后每日施用，持续共10天。初始受影响关节的肿胀程度可通过测量爪厚度用卡尺监测。2种模型中，血清能取自小鼠以用于溶血实验和测量激活的补体标记物例如c5a及c5b‑9。另一示例中，可获得灵长类动物模型用于ra治疗。可在u‑pa多肽治疗对象和对照中监测触痛及肿胀关节的反应以评估u‑pa多肽治疗。[0733]经修饰的u‑pa多肽能用于治疗免疫复合物(ic)介导的急性炎性组织损伤。ic介导的损伤由针对组织中ic沉积的局部炎症应答导致。随后的炎症应答特征为水肿、中性粒细胞增多、出血和最终的组织坏死。ic介导的组织损伤可在体内阿瑟氏(rpa)反应中研究。简言之，rpa反应中，过量抗体(例如兔igg抗鸡卵清蛋白)注入动物例如大鼠或豚鼠的皮肤，所述动物之前静脉输注对应抗原(即鸡卵清蛋白)(szalai等.,(2000)jimmunol164:463)。rpa反应开始前不久，u‑pa多肽或丸剂对照能通过静脉内注射经右股静脉与对应抗原同时施用。或者，u‑pa多肽能在rpa反应最初一小时中施用，在抗原注射后立即开始且就在抗体皮肤注射之前。u‑pa多肽对产生补体依赖性ic介导的组织损伤的影响可在rpa开始后多个时间如下评价：通过收集血液以确定血清溶血活性，和通过收获受感染皮肤区域以定量病变大小。[0734]治疗性u‑pa多肽如本文所述那些，能用于治疗败血症和导致致命休克的严重败血症。补体介导的致命休克的模型能用于测试u‑pa多肽作为治疗剂的效果。在一个这类示例中，大鼠能用痕量脂多糖(lps)致敏，然后施用针对补体膜抑制剂的单克隆抗体(抗crry)(mizuno等,(2002)intarchallergyimmunol127:55‑62)。可在致命休克开始过程中如lps致敏前、lps致敏后或施用抗crry后施用u‑pa多肽或对照，可评估大鼠从致命休克的恢复。[0735]b.神经退行性疾病[0736]补体激活加剧了阿尔茨海默氏病(ad)发展且促进ad脑的神经突损失。本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于ad。模拟一些ad神经病理和行为特征的小鼠模型能用于评价u‑pa多肽的治疗效果。转基因小鼠模型示例包括在积极启动子控制下向小鼠引入人淀粉样前体蛋白(app)或早老素1(ps1)蛋白，所述蛋白带有生成疾病的突变。这些小鼠发展出ad特征，包括β‑淀粉样蛋白斑块和营养不良性神经突的增加。用于app和ps1突变蛋白的双重转基因小鼠发展出更大数目的纤维状β‑淀粉样蛋白斑块并显示与斑块相关的活化神经胶质和补体因子。u‑pa多肽能通过例如每日腹腔或静脉内注射施用，并监测相较于对照动物症状的过程和发展。[0737]c.心血管疾病[0738]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能用于治疗心血管疾病。u‑pa多肽能用于治疗心血管疾病，包括缺血再灌注损伤，由中风、心肌梗塞、心肺转流术、冠状动脉旁路搭桥术、血管成形术或血液透析引起。u‑pa多肽还能用于治疗与心肺转流术相关的炎症应答，其可能促成组织损伤。一般，u‑pa多肽可在诱导补体介导缺血再灌注损伤的治疗或事件之前、同时或之后施用。在一个示例中，u‑pa多肽可在通过补体介导、缺血损伤诱导事件的对象治疗前施用给对象，所述事件例如冠状动脉旁路搭桥术或血管成形术。[0739]u‑pa多肽对缺血再灌注损伤治疗的效果可在损伤的动物模型中评估。一个这类模型中，在心包前形成切口的兔子内诱导心肌缺血，这是通过在左前降支(lad)冠状动脉周围从其起点开始5‑8mm放置3‑0丝线并收紧结扎线，从而血管完全闭塞(buerke等,(2001)jimmunol167:5375)。u‑pa多肽例如经修饰的u‑pa多肽或对照载剂如盐水，能在冠状动脉闭塞后55分钟(即再灌注前5分钟)以增加剂量大剂量(asabolus)静脉内施用。5分钟后(即缺血共60分钟后)，lad结扎线能解开且心肌缺血可再灌注3小时。再灌注阶段结束时，收紧lad周围的结扎线。u‑pa多肽对缺血损伤的效果能如下分析：评价对心肌坏死的影响、血浆肌酸激酶水平和中性粒细胞激活标志物，例如髓过氧物酶活性和超氧自由基释放。[0740]在经分离小鼠心脏用含6％人血浆的krebs‑henseleit缓冲液灌注后维持的补体介导心肌损伤的另一模型中，经修饰的u‑pa多肽治疗能用于限制对心脏的组织损害。这类示例中，用于灌注心脏的缓冲液可补充有不同剂量的经修饰的u‑pa多肽。可就人c3和c5b‑9的沉积、冠状动脉灌注压、舒张末压和心率测定灌注的心脏。[0741]本文所提供经修饰的u‑pa多肽能在心肺转流术(cpb)或冠状动脉旁路搭桥术之前或之后用作治疗剂以抑制炎症免疫应答，所述炎症免疫应答通常在旁路后发生且可能促进组织损伤。体外旁路回路中全血的体外再循环能用于刺激血小板和白血球变化以及cpb诱导的补体激活(rinder等(1995)j.clin.invest.96:1564)。这种模型中，u‑pa多肽或对照缓冲液能以不同剂量加入已含有来自健康供体血液和猪肝素的转移包，且就在血液加入体外回路之前。血样可在再循环后5、15、30、45、60、75和90分钟获取并测定用于补体研究，例如溶血实验和/或补体激活试验以测量c5a、c3a和/或sc5b‑9。加入体外回路前取出的血液处理前样品能用作对照。可实施血液样品的流式细胞术以确定血液中循环白血球(即中性粒细胞)上的粘附分子水平，例如cd11b和p选择素水平。[0742]d.年龄相关的黄斑变性(amd)[0743]本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于测试年龄相关的黄斑变性(amd)。可用蛋白酶治疗的年龄相关的黄斑变性(amd)包括湿amd、干amd和地图状萎缩。[0744]可获得模拟许多人疾病特征的多个amd动物模型(pennesi等(2012)mol.aspectsmed.33(4):487‑509))。补体途径基因的突变显示增加或减少amd易感性(edwards等(2005)science308(5720):421‑424；hageman等(2005)proc.nat.acad.sci102(20):7227‑7232；klein等(2005)science308(5720):385‑389)。例如，在通常与c3b相互作用的补体因子h(cfh)中，单一核苷酸多态性y402h防止c3b结合因子b，导致抑制c3形成。y402h与人中amd风险上升相关，先前在43‑59％amd患者中鉴定突变(haines等(2005)science308(5720):419‑421；thakkinstian等(2006)hum.mol.genet.15(18):2784‑2790；zareparsi等(2005)am.j.hum.genet.77(1):149‑153)。[0745]没有形成cfh能力的转基因小鼠发展出amd特征，包括视网膜异常、视力下降和补体沉积(coffey等(2007)proc.nat.acad.sci.104:16651‑16656)。补体蛋白因子b(montes等(2009)proc.nat.acad.sci.106(11):4366‑4371)、c2(gold等(2006)nat.genet.38(4):458‑462)和c3(maller等(2007)nat.genet.39(10):1200‑1201；yates等(2007)newengl.j.med.357(6):553‑561)的突变与发展amd的风险增加或减少相关，这是基于其对多个补体蛋白表达和/或活性的影响(reynolds等(2009)invest.ophthalmol.vis.sci.50(12):5818–5827)。[0746]经修饰的u‑pa蛋白酶如本文所提供经修饰的u‑pa蛋白酶能用作治疗剂，其中u‑pa蛋白酶用于切割补体蛋白c3的活性如底物特异性或选择性改变。施用本文所提供经修饰的u‑pa蛋白酶，例如通过每月两次玻璃体内或视网膜下或视网膜内注射，监测症状相较于对照动物或对象的过程和发展。可加剧疾病的补体成分水平也能如下测量：在溶血实验中测定血清补体活性和测定补体成分例如c1、c3和c9的沉积。[0747]补体激活在年龄相关的黄斑变性(amd)的疾病发展中发挥作用(参见例如bradley等,(2011)eye25:683‑693；gemenetzi等(2016)30:1‑14)。经修饰的u‑pa多肽能用于治疗amd。例如，u‑pa多肽或含有u‑pa多肽如本文所述经修饰的u‑pa多肽的药物组合物，能玻璃体内或视网膜内或视网膜下或眼周注射。经修饰的u‑pa多肽可每日或每周或更低频率给药，例如每月或更低频率，如每月两次。对于amd，每月给药经修饰的u‑pa多肽是可能的，所述多肽未进一步“修饰”用于眼部延长持续时间(如融合蛋白、聚乙二醇化等)(也考虑每月两次给药)。适当“修饰”后，每3个月(或更低频率)是可行的。经修饰的u‑pa多肽能改良，如通过聚乙二醇化以降低潜在免疫原性和/或增加血清半衰期。对于amd，使用每月给药或每月两次给药的经修饰的u‑pa多肽，所述多肽未进一步修饰用于眼部延长持续时间(如融合蛋白、聚乙二醇化等)。若通过聚乙二醇化修饰，给药能每3个月或更长时间完成。[0748]e.器官移植[0749]移植肾功能延迟(dgf)[0750]本文所述经修饰的u‑pa多肽能用于治疗移植肾功能延迟(dgf)，包括例如作为肾移植受体中缺血再灌注损伤结果的dgf。u‑pa多肽也能用于治疗器官移植相关的炎症应答，其可能促进组织损伤。一般，u‑pa多肽可在诱导补体介导缺血再灌注损伤的治疗或事件之前、同时或之后施用。在一个示例中，u‑pa多肽可在通过补体介导、缺血损伤诱导事件的对象治疗前施用于对象，所述事件例如肾移植或肾同种异体移植。u‑pa多肽对治疗移植肾功能延迟例如缺血再灌注损伤所引起移植肾功能延迟的效果，可在模拟人肾同种异体移植或移植物所展示特征的损伤动物模型中评估。[0751]存在导致dgf的早期移植功能障碍的早期生物标志物可指示对治疗的需求，包括用于肾小管上皮细胞损伤的生物标志物。鉴定了dgf的生物标志物(即血清肌酸)(malyszko等(2015)naturescientificreports5:11684；wanga等(2015)plosone10(9):e0136276)。早期检测dgf的生物标志物和治疗干预例如用经修饰的u‑pa多肽的治疗处理，可改善临床结果。[0752]补体激活调节失调中的疾病发展，如器官移植例如肾移植后的移植肾功能延迟(yu等(2016)amjoftransplantation16(9):2589‑2597)。经修饰的u‑pa多肽能用于治疗dgf。例如，可施用u‑pa多肽用于全身递送或能直接注入移植物或周围组织。经修饰的u‑pa多肽可在移植之前、期间或之后施用。经修饰的u‑pa多肽可每日或每周或更低频率给药，例如每月或更低频率，如每月两次。一些情况下，施用单一全身剂量的经修饰的u‑pa多肽。也考虑在数小时中多次输注经修饰的u‑pa多肽。[0753]经修饰的u‑pa多肽能长期递送，若需要，例如经修饰的u‑pa多肽如本文所述经修饰的u‑pa多肽能每日或以另一方案递送，从而在同种异体移植受体中维持有效量。经修饰的u‑pa多肽能用于在受体中延长同种异体移植物存活，尤其是同种异体移植物的长期存活。聚乙二醇化u‑pa多肽能用于减少免疫原性。[0754]3.联合疗法[0755]本文所提供经修饰的u‑pa多肽可与其他现有药物和治疗剂联用以治疗疾病及病症。这种治疗可结合其他抗炎药物和/或治疗剂实施。抗炎药物和用于联合疗法的药剂示例包括非甾体抗炎药(nsaid)，包含水杨酸盐，如阿司匹林，传统nsaid如布洛芬、萘普生、酮洛芬、纳布美通、吡罗昔康、双氯芬酸或吲哚美辛，和cox‑2选择性抑制剂如塞来昔布(以商标销售)或rotecoxin(以商标销售)。用于联合疗法的其他化合物包括抗代谢物如甲氨蝶呤和来氟米特，皮质类固醇或其他类固醇如可的松、地塞米松或强的松，镇痛药如对乙酰氨基酚，氨基水杨酸盐如氨水杨酸以及细胞毒性剂如硫唑嘌呤(以商标销售)、环磷酰胺(以商标销售)和环孢霉素a。能用于联合疗法的额外药剂包括生物反应调节剂。生物反应调节剂可包括促炎性细胞因子抑制剂，包括tnf‑α抑制剂，如依那西普(以商标销售)、英夫利昔(以商标销售)或adalimumad(以商标销售)以及il‑1抑制剂如阿那白滞素(以商标销售)。生物反应调节剂还可包括抗炎细胞因子如il‑10、b细胞靶向剂如抗cd20抗体(以商标销售)、靶向t抗原的化合物、粘附分子阻断剂、趋化因子受体拮抗剂，激酶抑制剂如丝裂原活化蛋白(map)激酶、c‑junn末端激酶(jnk)的抑制剂或核因子(nf)κb(nfκb)以及过氧化物酶体增殖激活受体‑γ(ppar‑γ)配体。能用于联合疗法的额外药剂包括免疫抑制剂。免疫抑制剂可包括他克莫司或fk‑506；霉酚酸；神经钙调蛋白抑制剂(cni)；csa；西罗莫司或已知抑制免疫系统的其他药剂。[0756]本文所提供经修饰的u‑pa多肽还可与药剂联用，施用所述药剂以治疗心血管疾病和/或在治疗心血管疾病过程中施用，例如本文所述有助于与补体介导缺血再灌注损伤相关的炎性病症的那些。例如，所提供u‑pa多肽能联合抗凝剂施用。示范性抗凝剂示例包括但不限于肝素、华法林、醋硝香豆醇、苯茚二酮、edta、柠檬酸盐,草酸盐和直接凝血酶抑制剂如阿加曲班、重组水蛭素、比伐卢定和希美加群。[0757]本文所提供经修饰的u‑pa多肽还可与施用以治疗dgf的药剂联用。例如，本文所提供u‑pa多肽能联合免疫抑制剂施用。这类组合用于延长受体中的同种异体移植物存活，尤其是同种异体移植物的长期存活。在优选实施方案中，配制和制备所述组合，从而其适合长期施用于同种异体移植物的受体，例如，采用稳定制剂。在某些实施方案中，配制和制备所述组合，从而其适合向同种异体移植物的受体同步施用经修饰的u‑pa多肽与免疫抑制药物。在某些实施方案中，配制和制备所述组合，从而其适合向同种异体移植物的受体依序(任一顺序)施用经修饰的u‑pa多肽与免疫抑制药物。[0758]本文所提供经修饰的u‑pa多肽还可与施用以治疗黄斑变性的其他药剂联用。例如，经修饰的u‑pa多肽能用以下任意一种或多种一起施用：兰尼单抗(以商标lucentistm销售)；贝伐单抗(以商标avastintm销售)；哌加他尼钠(以商标macugentm销售)；阿柏西普(以商标eyleatm销售)；和维替泊芬(以商标visudynetm销售)。本文所提供u‑pa多肽还可与植入式望远镜、激光疗法或激光凝固、手术和/或光动力治疗联用，单独或联合治疗性维替泊芬，以治疗黄斑变性。[0759]额外药剂如其他补体抑制剂能用作抗炎药，与本文所述经修饰的u‑pa多肽形成联合疗法。这类其他补体抑制剂示例包括眼镜蛇蛇毒因子(cvf)，聚阴离子分子如肝素、硫酸葡聚糖、聚乙烯硫酸、聚赖氨酸或苏拉明，天然分子如k‑76cooh、迷迭香酸或中草药麻黄提取物，合成分子如甲磺酸萘莫司他(fut‑175)，c1s的合成抑制剂(c1s‑inh‑248)或针对c1s和fd的抑制剂(bcx‑1470)，肽抑制剂如坎普他汀，补体的抗体抑制剂如抗‑c5(n19‑8)\人源化抗‑c5(h5g1.1)、抗‑c6或抗‑c8抗体和可溶形式的膜补体调节剂如可溶性cr1(scr1)、可溶性daf(sdaf)、可溶性mcp(smcf)或可溶性cd59(scd59)(morgan等,(2003)molimmunol.40:159)。[0760]含有本文所述u‑pa多肽的药物组合物能用于治疗任意一种或多种由补体激活介导的炎症性疾病或病症。还提供u‑pa多肽与另一疗法或化合物的组合，以治疗炎症性疾病或病症。u‑pa多肽和抗炎剂能包装为单独组合物，以共同或依序或间歇施用。或者，其可提供为施用用的单一组合物或作为单一组合物施用的2种组合物。所述组合能包装为试剂盒，任选地带有额外试剂、使用说明书、小瓶和其他容器、注射器以及使用经修饰的u‑pa多肽的其他项目。实施例[0761]仅出于阐述目的纳入下列实施例，而不意在限制本发明范围。[0762]实施例1.克隆和表达经修饰的u‑pa多肽以及筛选在qhar/as位点切割c3的经修饰的u‑pa多肽[0763]a.克隆u‑pa[0764]将编码人u‑pa多肽(uniprotp00749；如seqidno:1所示)中的氨基酸179‑431(根据根据胰凝乳蛋白酶编号带有c122s突变)(如seqidno:5所示)的核酸克隆入pe‑sumo‑amp表达载体，小泛素样修饰物(sumo)标签的c末端。构建体包括信号肽(氨基酸1‑20)和蛋白酶结构域(氨基酸179‑431)。[0765]b.产生经修饰的u‑pa多肽[0766]通过quikchange定点突变(stratagene)根据厂商说明产生经修饰的u‑pa多肽，特定设计的寡核苷酸用作引物以将设计的突变纳入新合成的dna。设置pcr反应，含有作为模板的野生型u‑padna和设计成含有所需突变的寡核苷酸引物。pcr后，各反应产物用dpni消化以去除dam甲基化的亲代dna链。然后，dna转化入大肠杆菌xl‑1blue超感受态细胞(stratagene)并接种于含50μg/ml羧苄青霉素的选择性琼脂。质粒dna分离自选定克隆，测序以确认预期突变在u‑pa编码dna内选定位置纳入而没有任何额外不需要的突变。[0767]c.制备u‑pa多肽[0768]1.转化[0769]将编码野生型和各变体u‑pa多肽的dna克隆入pe‑sumo‑amp表达载体，该载体c末端对着小泛素样修饰物(sumo)标签和前结构域，如上面章节a所详述，所得构建体转化入bl21gold(de3)大肠杆菌细胞(安捷伦科技(agilenttechnologies),产品目录号:230132)。约50μl化学感受态bl21gold(de3)细胞用0.5μl合适质粒dna(通常含有1pg–50ng总dna)转化。细胞和dna在冰上孵育30分钟，细胞随后在42℃热激45秒，冰上再孵育2分钟。450μl室温terrific肉汤(tb)培养基(vwrinternational,产品目录号100219‑866)加入混合物，细胞在tb培养基中孵育1小时，240rpm,37℃振荡。20μl的此转化混合物在2xyt培养基 100μg/ml羧苄青霉素板上铺开并37℃孵育过夜，所述板来自天惠华(teknova，产品目录号:y4420)。[0770]2.表达u‑pa多肽[0771]含有所需u‑pa多肽编码dna的细胞(通常获自单一“确认”菌落，来自上述转化过程)在约50ml培养基中生长，所述培养基通过组合50μl羧苄青霉素,0.3ml20％乳糖溶液,5ml磷酸盐缓冲液和45ml基础terrific肉汤(tb)培养基(天惠华,产品目录号l0350)制备。细胞和生长培养基在inforsmultitron摇床中37℃,400rpm旋转。生长18‑22小时后，细菌如下沉淀：在50mlfalcon离心管中在具有fiberlitef13‑14x50cs离心转子的beckmansorvalrc6plus离心机(赛默飞世尔(thermo‑fisher))中4℃，7,000rpm离心10分钟。离心后，倒出上清。[0772]来自50ml培养物的细胞沉淀重悬于10ml细胞裂解缓冲液a(50mmtris,ph8.0,50mmnacl,2mmedta,0.1mg/ml溶菌酶)。通过在37℃,240rpm振荡1小时，细胞团块重悬于缓冲液a。所得混合物在7,000rpm离心15分钟，倒出上清。所得沉淀重悬于含20μlbenzonasetm(密理博西格玛(milliporesigma))的10ml提取试剂(默克密理博(merckmillipore),nc9591474)。通过在37℃,240rpm涡旋和振荡1小时，使细胞重悬。振荡后，剩余不溶性材料通过在4℃,10,000rpm离心15分钟沉淀，倒出上清。通过在10ml洗涤缓冲液a[50mmtris(ph8.0),300mmnacl和1％tritonx‑100]中用powergen500均质器(飞世尔科技(fisherscientific),14‑261‑04p)均质化，重悬所得沉淀。含有重悬u‑pa多肽包涵体(ib)的此混合物在4℃,10,000rpm离心15分钟，弃去上清。新的沉淀重悬于10ml洗涤缓冲液b(50mmtris(ph8.0))，重复均质化直至沉淀分散均匀。所得混合物再次在4℃,10,000rpm离心15分钟，倒出上清，允许沉淀空气干燥10‑15分钟。此u‑pa多肽包涵体(ib)沉淀能在‑20℃保存或立即用于下述打开和再折叠。[0773]3.打开upa[0774]不溶性sumo‑u‑pa多肽融合蛋白包涵体在5ml打开缓冲液[6mguhcl,50mmtrisph8,(天惠华,产品目录号:g0380)]中溶解和变性。在再折叠过程当天加入新制备的dtt到10mm终浓度。此ib溶液在37℃,240rpm搅拌至少1小时(通常2小时)，或直至包涵体充分溶解。充分溶解的ib溶液澄清，但能显示褐色色彩。[0775]4.再折叠u‑pa[0776]5ml上述打开的u‑pa多肽溶液分成2.5ml的2个等分样品，各等分样品加入200ml再折叠缓冲液[1.5m精氨酸,50mmtrisph8.0,150mmnacl,5mmgsh(还原型l‑谷胱甘肽,西novexbis‑tris凝胶的各“泳道”，在1xmes运行缓冲液中于200v运行40分钟。通过考马斯亮蓝染色凝胶然后脱色，“呈现”蛋白。含有在约25kda迁移的单一带的部分用液氮速冻并‑80℃保存，直至使用。单独u‑pa多肽样品的品质通过活性试验和质谱进一步评估。[0786]d.选择和鉴定切割c3以使其灭活的经修饰的u‑pa多肽[0787]经修饰的u‑pa多肽如下鉴定：针对经修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(pai‑1)筛选经修饰的u‑pa多肽文库，如美国专利号8,211,428详述(还参见发表的美国申请公开号us‑2014‑0242062‑a1)。抑制性丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或其片段用于筛选，在丝氨酸蛋白酶抑制蛋白与蛋白酶之间能够形成共价酰基酶中间物。一般，所用的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白在体内正常靶向蛋白酶。在试验中，通过取代其反应位点环(rsl)以包括靶序列(即c3中的活性位点)的经修饰的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白可捕获修饰蛋白酶，该蛋白酶会切割靶位点形成稳定复合物。随后分离/鉴定捕获的经修饰的蛋白酶。对于u‑pa，pai‑1,pai‑2,pai‑3尤其是pai‑1(是其抑制剂)，是同源丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制蛋白pai‑1如下修饰：用qharashlg(c3的残基737‑745,seqidno:47，其是人c3的活性位点)取代如下所示的残基。选择所有经修饰的u‑pa多肽，使得它们在c3的活性位点内切割。特别地，它们在r与a之间切割。[0788]qhar↓ashl[0789]atiii"饵"(如下)带有插入序列qharashlg(对应c3的灭活切割位点(seqidno:47的残基737‑745)):[0790][0791]上面经修饰pai‑1中的突变如下:[0792]rcllrrqharashl341350突变v1c11突变n150h150150突变k154t154154突变q319l319319突变a340l340340突变v341r341341突变i342r342342突变v343q343343突变s344h344344突变m347a347347突变a348s348348突变p349h349349突变e350l350350突变m354i354354[0793]下面实施例2的表14列出突变，并为含有突变的经修饰的u‑pa多肽的示范性蛋白酶结构域提供seqid。编号是胰凝乳蛋白酶编号。产生经修饰的u‑pa多肽并选择成灭活c3，带有所示突变。尽管seqid涉及蛋白酶结构域，应理解突变能纳入前体、全长和成熟经修饰的u‑pa多肽。纳入c122s取代或其他用于s的保守取代以减少聚集；虽然有利，这是任选存在的。对于用于基因治疗或聚乙二醇化的经修饰u‑pa，c122s取代不纳入经修饰u‑pa或编码核酸。c122s能用作缀合聚乙二醇化部分或其他修饰的位点。体内表达时，聚集一般不是问题。同样，对于活性形式是由二硫键连接的两条链，残基122处的游离cys一般不修饰成ser，从而其可用于形成二硫键。[0794]实施例2.体外切割补体蛋白c3[0795]经修饰的u‑pa多肽用于灭活切割c3的活性如下测定：底物补体蛋白人c3与各种浓度的各修饰蛋白酶37℃孵育1小时后，测量完整人c3的量。根据此试验，信号在完整人c3存在下产生，并随着c3切割而丧失。[0796]在含有50mmtris,ph8.0,50mmnacl和0.01％tween‑20的缓冲液中，2μm血浆纯化的人c3(complementtechnologies；德克萨斯州泰勒)与经修饰的u‑pa多肽(0–250nm)37℃孵育1小时。通过加入egr‑cmk(haematologictechnologies,egrck‑01)到10μm终浓度，来淬灭经修饰的u‑pa多肽的活性，允许hc3/经修饰的u‑pa多肽混合物在环境温度维持30分钟。[0797]未消化的人c3的残留水平用放大发光邻近均相分析筛选(amplifiedluminescentproximityhomogeneousassayscreen)(以商标销售；珀金埃尔默)定量。在50mmtris,ph8.0,50mmnacl,0.01％tween‑20和0.2％bsa中，100μg/ml(珀金埃尔默#6760606)α‑小鼠igg包被的受体珠与5nm小鼠α‑hc3amab(艾博抗(abcam)#ab11872‑50)孵育，以形成受体珠混合物。受体珠混合物避光并置于旋转摇床30–60分钟。hc3/经修饰的u‑pa多肽反应混合物(如上制备)在50mmtris,ph8.0,50mmnacl,0.01％tween‑20,0.2％bsa中稀释1600倍，4μl等分样品置于384孔optiplate(珀金埃尔默#6007299)的重复孔中。8μlα‑hc3mab/受体珠混合物用8μl25nm生物素化山羊α‑hc3pab(用来自赛默科技(thermoscientific)#21327的ez‑link磺基‑nhs‑lc‑生物素试剂盒制备，来自complementtechnologies#a213的未生物素化形式)孵育。板随之避光并在环境温度孵育30分钟。此时间之后，向各孔加入4μl100μg/ml链霉亲和素包被供体珠(珀金埃尔默#6760606)并孵育60分钟，避光。接着用envision2104多标记读板仪(珀金埃尔默)测量alphascreen信号(激发＝680nm,发射＝570nm)。此信号(对应剩余hc3([hc3])浓度)根据浓度([alterase])作图，数据拟合下面的四参数方程以确定试验中切割50％可用hc3所需的经修饰的u‑pa多肽浓度(浓度)(ec50)，hill斜率(hill)以及最大(max)和最小(min)信号。[0798][0799]独立测量含有突变r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r(参见seqidno:21)的u‑pa变体切割hc3共13次，使用9个不同分组(lot)的蛋白酶。此经修饰的u‑pa多肽的平均ec50值测定为19nm(n＝13,sd＝2.2)；在结果报告于下表14的实验中，其为24.5nm。[0800]表14列出约600个经修饰的u‑pa多肽，其包括带有突变的蛋白酶结构域。结果示于下表14。大部分所测试经修饰的u‑pa多肽切割人补体蛋白c3比含有c122s取代的野生型蛋白酶结构域显著更有效(即ed50更低)；许多的ed50低于100nm。多肽包括c122s取代以防止例如蛋白酶结构域表达后聚集。在一些实施方案中，所述经修饰的u‑pa多肽是全长，其活化形成2链激活的多肽。对于这类实施方案，经修饰u‑pa蛋白酶结构域不包括c122s取代(根据成熟编号是279)；半胱氨酸形成二硫键(根据成熟编号在148c与279c之间，参考seqidno:3)。[0801]所测试u‑pa变体包括效力小于野生型u‑pa的那些，尤其是在一小时试验期间没有观察到hc3切割(即下表14中标示为na)的那些变体。其他低活性变体在试验期间切割小于25％hc3，并因而未赋值ed50。基于这些结果，技术人员能选择增加c3切割活性的突变。[0802]表14[0803][0804][0805][0806][0807][0808][0809][0810][0811][0812][0813][0814][0815][0816][0817][0818][0819][0820][0821][0822][0823][0824][0825][0826][0827][0828][0829][0830][0831][0832][0833][0834]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0835]实施例3.u‑pa变体在食蟹猴血浆中的抗c3活性[0836]一些经修饰的u‑pa多肽的离体抗c3活性在购买的食蟹猴血浆(biochemed)中测量。经修饰的u‑pa多肽切割c3的半数有效剂量(ed50)用elisa计算。简言之，示范性经修饰的u‑pa多肽连续稀释1:1.5倍，从1000nm到39.0nm(9点稀释)。hc3标准在含1％bsa的1xpbst(磷酸盐缓冲盐水tween‑20)中连续稀释1:1.5倍，从450到39(7点稀释)。1xpbst配方包括：[0837]1.在800ml蒸馏h2o中溶解下列物质[0838]о8gnacl[0839]о0.2gkcl[0840]о1.44gna2hpo4[0841]о0.24gkh2po4[0842]о2mltween‑20[0843]2.调整ph到7.2[0844]3.用额外蒸馏h2o调整体积到1l[0845]4.高压灭菌消毒.[0846]80％食蟹猴玻璃体血浆(获自biochemed)(在含50mmtris,ph8.0,50mmnacl和0.01％tween‑20的缓冲液中)和c3稀释液与终浓度0.1μm的经修饰的u‑pa多肽37℃孵育10分钟。80％血浆消化物在含1％bsa的1xpbst中稀释1:15,625，使用biomek液体处理系统(贝克曼库尔特(beckmancoulter))。平底eia板(伯乐(bio‑rad))包被有2.0μg/ml的纯化a213抗体(抗c4；quidel特色产品)，用50μl/孔样品或标准物孵育，用抗hc3a抗体(ab11872；艾博抗)在含1％bsa的1xpbst中检测。孔进一步用在含1％bsa的1xpbst中1:30,000稀释的hrp缀合山羊抗小鼠‑hrp抗体(杰克逊免疫研究公司(jacksonimmunoresearch)；产品目录号:115‑035‑003)包被，用westernbrightecl(化学发光)hrp底物显色以检测。[0847]ed50定义为生成50％c3损失的蛋白酶浓度。结果显示c3损失(即切割)增加，存在带有seqidno:8‑14和16‑20所示序列的经修饰的u‑pa多肽。u‑pa多肽蛋白酶结构域具有seqidno:8所示的序列，以高于其他数倍的ed50切割。结果示于下表15。[0848][0849][0850]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0851]实施例4.经修饰的u‑pa多肽在食蟹猴玻璃体液中的抗c3活性[0852]经修饰的u‑pa多肽的活性通过切割底物补体蛋白人c3来评估。2μm纯化的人c3(complementtechnologies；德克萨斯州泰勒)用经修饰的u‑pa多肽(0–250nm)在购买的猴玻璃体液(biochemed)中37℃孵育1小时。通过加入尿激酶抑制剂glu‑gly‑arg氯甲酮(egr‑cmk；haematologictechnologies,egrck‑01)到10μm终浓度，来淬灭经修饰的u‑pa多肽的活性，允许hc3/经修饰的u‑pa多肽混合物在环境温度维持30分钟。[0853]未消化的人c3的残留水平用elisa定量。所有经修饰的u‑pa多肽以相比含seqidno:5所示c122s取代的参考u‑pa多肽更高的转换数(每小时)切割补体蛋白c3，包括含有取代r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r、y40q/v41l/l97ba/c122s和y40q/v41l/l97ba/c122s以及y40q/v41r/l97ba/c122s的那些。结果示于下表16。[0854][0855][0856]*含有取代的蛋白酶结构域的seqid[0857]实施例5.经修饰的u‑pa多肽在食蟹猴玻璃体液中的离体稳定性[0858]在购买的食蟹猴玻璃体液或磷酸盐缓冲盐水(pbs)对照中评价经修饰的u‑pa多肽的离体稳定性。在玻璃体液中显示稳定性的经修饰的u‑pa多肽能用于治疗amd。[0859]80％食蟹猴玻璃体液(获自biochemed；产品目录号bc7615‑v1,bc60815‑v1,bc33115‑v6)(在含50mmtris,ph8.0,50mmnacl和0.01％tween‑20的缓冲液中)或pbs对照与终浓度0.1μm的经修饰的u‑pa多肽孵育。这些混合物37℃孵育7天，剩余蛋白酶活性用溶于50mmtris,ph8.0,50mmnacl,0.01％tween‑20的100μm荧光底物agr‑acc(7‑氨基‑4‑氨基甲酰甲基‑香豆素)测定(试验结果在激发波长＝380nm和发射波长＝460nm评价)。结果显示序列如seqidno:21‑33所示的经修饰的u‑pa多肽在食蟹猴血浆和pbs中展示出相当的活性。结果如下表17所示。[0860][0861][0862]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0863]在购买的食蟹猴玻璃体液中孵育7和28天后，评价下表18内抗c3u‑pa变体的离体稳定性。结果显示数个变体甚至在28天孵育后维持显著活性。结果如下表18所示。[0864][0865]*含有取代的蛋白酶结构域的seqid[0866]实施例6.人血浆中的离体药效学试验[0867]经修饰的u‑pa多肽(蛋白酶结构域)用80％人血浆孵育，然后加入红细胞以在补体活性溶血实验中评价补体蛋白c3的切割。在人血浆存在下进行功能分析，测试抗c3蛋白酶在药物相关环境下的活性，并且例如检测其是否对丝氨酸蛋白酶抑制蛋白或人血液中存在的其他蛋白酶抑制剂灭活敏感。一般，本文所提供的经修饰的u‑pa多肽在人血浆存在下不受抑制。这对治疗疾病和失调及病症如dgf非常重要，其中施用的经修饰的u‑pa多肽暴露于人血浆，如静脉内施用时。这对应用如通过玻璃体内或视网膜内或视网膜下注射治疗amd不太重要或不重要，其中经修饰的u‑pa多肽不暴露于人血浆。[0868]测量ed50值，这是实现50％补体活性抑制的蛋白酶浓度。野生型u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:5,带有c122s)和多个示范性经修饰u‑pa蛋白酶结构域连续稀释，从3μm到0.11μm(9点连续稀释1:2)以测量ed50。野生型u‑pa(seqidno:5)蛋白酶结构域和经修饰u‑pa蛋白酶结构域用0.2ml管中80％血浆的终浓度预孵育，这是通过组合4μl稀释蛋白酶溶液和16μl人血浆(柠檬酸钠作为抗凝剂；创新研究公司(innovativeresearch,inc.))进行的。这引起蛋白酶进一步稀释以产生0.6μm‑0.0022μm蛋白酶终浓度用于ec50操作。无蛋白酶对照(18μl血浆和2μlpbst)和背景对照(仅20μlpbst)也纳入试验。反应在37℃孵育1小时。反应混合物进一步稀释到20％血浆，加入70μlpbst。[0869]敏化的绵羊红细胞(diamdex,佛罗里达州迈阿密)如下浓缩到10x：使3.0ml等分样品成团，移出2.7ml缓冲液并在剩余0.3ml缓冲液中重悬细胞沉淀。浓缩的致敏红细胞以每孔12μl体积加入聚丙烯96孔板。6μl或60μl的预孵育蛋白酶/血浆混合物加入红细胞以分别产生1％血浆或10％血浆终浓度，终体积为120μl(添加pbst至终体积)。溶液室温振荡孵育45分钟。细胞在2000rpm旋转减慢5分钟以使未破裂细胞成团，移出100μl上清并置于澄清的96孔微量滴定板。[0870]通过在415nm读取光密度(od)，监测血红蛋白自裂解红细胞释放。溶血部分如下计算：从所有孔中减去背景对照，然后将实验样品除以无蛋白酶对照(阳性对照)，其中阳性对照的溶血分数设为1.00。通过在四参数逻辑曲线拟合(softmaxpro软件,分子仪器公司(moleculardevices),加利福尼亚州)中对溶血部分相比蛋白酶浓度作图，测量蛋白酶的溶血ed50(nm)。[0871]结果示于下表19，其列出80％人血浆中，带有c122s突变的seqidno:5所示的野生型u‑pa与经修饰的u‑pa多肽对溶血的ed50(nm)。如表19所示，80％人血浆中野生型u‑pa的ed50高于6μm；而示范性经修饰u‑pa蛋白酶结构域多肽抑制补体的能力显著增加，如ed50更低所指示(例如在173nm‑1.028μm之间)。[0872][0873][0874]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0875]实施例7.使用间接显色试验的纤溶酶原激活动力学分析[0876]进行间接显色试验以测定野生型和经修饰的u‑pa多肽的活性，后者作为纯化蛋白制品生成(参见madison等(1989)nature,339:721‑724；madison等(1990)jbiol.chem.,265:21423‑21426)。此试验中，游离对硝基苯胺释放自显色底物spectrozymepl(h‑d‑正亮氨酰六氢酪氨酰‑赖氨酸‑对硝基苯胺二乙酸盐,美国诊断公司(americandiagnostics,inc.))，这是通过u‑pa对纤溶酶原作用所产生的纤溶酶作用。游离对硝基苯胺的释放采用分光光度法在od405nm测量。[0877]对于试验，100μl反应混合物在含有50mmtris‑hcl(ph7.5),0.1mnacl,1.0mmedta和0.01％(v/v)tween80的缓冲液中合并，所述混合物包含0.25‑1ng待测试u‑pa酶,0.62mmspectrozymepl和0.2μmlys‑纤溶酶原(美国诊断公司)。反应在96孔平底微量滴定板(costar,inc.)中37℃孵育，在moleculardevicesthermomax中每30秒读取405nm处的光密度(od405)，持续1小时。计算动力学常数kcat、km和kcat/km(特异性常数)(参见例如madison,e.l(1989)nature339:721‑724)。[0878]结果示于下表20。结果显示经修饰的u‑pa多肽对底物纤溶酶原的酶活性显著下降。相较于未修饰的u‑pa，本文所提供的全部经修饰的u‑pa多肽对纤溶酶原的活性和特异性降低；对c3的特异性和活性以及抑制补体激活都增加许多倍。[0879][0880]*含有取代的示范性蛋白酶结构域的seqid[0881]实施例8.抗c3u‑pa变体在食蟹猴玻璃体液中的体内抗c3活性和稳定性[0882]评价seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽的体内活性和稳定性，其是含有取代r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r的蛋白酶结构域。玻璃体液中的稳定性和切割c3的能力是指示治疗amd候选物的参数。[0883]12只初始食蟹猴分入单一治疗组。研究动物的一个眼睛通过玻璃体内施用单剂125μg经修饰的u‑pa多肽。施用分离的蛋白酶结构域，其序列如seqidno:21所示，分子量约为25kda。右眼接受试验样品且左眼注射载剂对照。在下列每个时间点杀死4只动物：给药后24小时，第2天和第6天。玻璃体液样品收集自右眼和左眼，在经修饰的u‑pa多肽或载剂对照治疗后分析经修饰的u‑pa多肽稳定性和c3水平；c3和经修饰的u‑pa多肽浓度通过上面详述的elisa测定。[0884]玻璃体液样品中存在的经修饰的u‑pa多肽浓度通过elisa测定，所述样品获自给药后24小时，第2天和第6天。随后，通过加入egr‑cmk(haematologictechnologies,egrck‑01)到10μm终浓度，来淬灭经修饰的u‑pa多肽的活性，允许hc3/经修饰的u‑pa多肽混合物在环境温度维持30分钟。[0885]seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽的半衰期测定为约2天，这应该对应于人系统中的约5天(deng等.mabs3(1):61‑66(2011))。通过elisa从经修饰的u‑pa多肽的观察最高水平计算经修饰的u‑pa多肽(seqidno:21)的体内回收(即经修饰的u‑pa多肽的峰值水平除以经修饰的u‑pa多肽剂量)。100％体内回收的理论预测值是2.5μm。所测经修饰u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)的体内回收计算为约80％的预测值，或约2.0μm，所述蛋白酶结构域含有取代：r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r。[0886]玻璃体液中的c3水平通过elisa评估，如实施例3详述。载剂注射阴性对照眼睛中的c3水平范围是0.4nm‑50nm(2个来自载剂注射眼睛的样品彼此显著差异达到10，可能归因于玻璃体的血液污染)。u‑pa施用前的c3基线水平约为2.2nm。1天和7天后，变体治疗的眼睛中的c3无法检测。28天后，序列如seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽所治疗的眼睛中的c3浓度为2.2nm，这等同于治疗前水平。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽是治疗amd的候选物。[0887]实施例9.u‑pa中的示范性突变和确认切割位点[0888]表22(下面)列出u‑pa多肽中的示范性位置和突变，所述多肽包括全长、前体和蛋白酶结构域及其催化活性部分。[0889][0890][0891]取代在任何形式的u‑pa中，包括蛋白酶结构域(seqidno：2或5)；全长(seqidno：1或4)和成熟形式(seqidno：3或6)。取代能组合，包括如本文所例示的，包括多至15‑18个或更多取代。[0892]数据显示带有这些突变的经修饰的u‑pa多肽在多个物种中切割和灭活c3，如人和食蟹猴。人c3切割可在残基740与741之间(seqidno：47)，此切割使c3灭活：[0893]qharꢀ↓ashlꢀꢀꢀꢀꢀꢀ737‑744[0894]p4p3p1↓p1′ꢀp4′.[0895]如上和本公开内容通篇所证明，经修饰的u‑pa多肽切割并灭活c3。选择经修饰的u‑pa多肽用于此区域切割，通过测试其进行确认。例如，c3与含有取代r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r的经修饰u‑pa蛋白酶结构域(seqidno：21)或具有取代y40q/v41l/l97ba/c122s的经修饰u‑pa蛋白酶结构域(seqidno：40)孵育，酶与底物之比为1∶10或1∶50，持续共1小时。在0、5、10、20、40和60分钟从这些反应中取出样品，通过加入tfa和干冰速冻，在各样品中立即终止切割反应。进一步分析这些样品前，半胱氨酸侧链还原和烷基化，赖氨酸侧链的ε‑氨基通过o‑甲基异脲处理阻断，肽氨基末端随之标记有nhs‑ss‑生物素。捕获所得生物素化c3肽并用胰蛋白酶和gluc蛋白酶进一步消化。此第二蛋白酶消化后，肽产物再一次进行亲和性捕获。生物素接着通过还原从捕获肽去除，肽混合物通过lc‑ms/ms分析。在0分钟后的各时间点，观察到mw8289的片段，指示c3中qhar位点的精氨酸切割。这些反应中没有观察到额外的c3切割位点。因此，本文所提供经修饰的u‑pa多肽在qhar切割。[0896]qharꢀ↓ashlꢀꢀꢀꢀꢀꢀ737‑744[0897]p4p3p2p1↓p1′ꢀp4′.[0898]实施例10.食蟹猴玻璃体液中的u‑pa毒性[0899]经修饰的u‑pa多肽的安全性和耐受性在食蟹猴中体内评估。3只初始食蟹猴各分入三个治疗组。研究动物每个眼睛通过玻璃体内施用12.5μg、37.5μg或125μg的各修饰u‑pa多肽。右眼接受测试多肽且左眼注射载剂对照。临床观察动物(即摄食量)并实施眼科检查。眼科检查包括裂隙灯活组织镜检查和间接检眼镜观察，然后是给药前(t＝0)和给药后第2、8及15天的眼底彩色照相或光学相干断层成像(oct)。所有观察持续多至4周或直至分辨。[0900]就所有动物评估未观察到的损害作用水平(noael)。对于施用序列如seqidno:42所示的经修饰的u‑pa多肽的动物，noael是≥37.5μg。对于施用序列如seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽的动物，没有记录到有害作用；因此，就施用序列如seqidno:21所示的经修饰的u‑pa多肽的动物而言，noael是≥125μg(等同于人中的≥375μg/眼)。[0901]实施例11[0902]进行计算以在野生型u‑pa、野生型u‑pa(seqidno:5)蛋白酶结构域的c122s变体和示范性u‑pa变体蛋白酶结构域中鉴定候选免疫原性热点，从而确认示范性变体的突变不引入任何免疫原性热点。还进行计算以比较感兴趣的变体并对比蛋白组的热点总体谱(profile)。[0903]方法概述[0904]t细胞对外来蛋白反应中的重要步骤是结合和呈递构成肽(衍生自外来蛋白的切割)，呈递到任何具有hla复合物的宿主，所述复合物在抗原呈递细胞中表达。鉴定衍生自蛋白、预测结合已知hla的肽，能用于指示引发t细胞反应的序列中的可能热点。考虑具有已知免疫原性特性的蛋白变体时，比较所预测hla‑结合剂的谱可能有助于鉴定变化是否引入任何新的免疫原性热点。[0905]所述谱能用公开可得的数据库产生。例如，公开可得的结合预测服务(netmhcii2.2服务器)，丹麦技术大学，用于预测与hla的结合。netmhcii2.3服务器预测肽与hla‑dr、hla‑dq、hla‑dp和小鼠mhcii类等位基因的结合，使用人工神经元网路。可就25个hla‑dr等位基因、20hla‑dq、9hla‑dp和7个小鼠h2ii类等位基因获得预测。预测值以nmic50值给出，并作为一组1,000,000个随机天然肽的％‑排名。[0906]所述服务用于预测示范性变体(seqidno:40和seqidno:21)、野生型蛋白酶结构域(seqidno:2)和带有c122s的野生型蛋白酶结构域(seqidno:5)，针对一组14个hla‑dr变体(参见下表b)根据肽主要序列，15个连续氨基酸的所有可能肽的结合亲和性。对于各肽/hla对，netmhcii服务器提供预测的结合亲和性，以及分类为紧密结合剂(kd≤500)、弱结合剂kd≤50nm)或非结合剂(kd>500nm)。对于含有n个氨基酸的蛋白序列，这引起总共t＝(n‑14)x14可能肽—hla结合对。[0907]使用来自netmhcii服务器的结合预测，结果用于鉴定这些蛋白序列中的可能热点，这是基于鉴定若干候选结合对的区域。这些变化与对应蛋白序列中的已知变化作比较。[0908]对于各蛋白，总体结合分数基于所预测紧密结合肽—hla对(tb)数目、所预测弱结合肽—hla对(wb)数目和考虑的肽—hla对总数(t)：[0909]分数＝(tb 0.5*wb)/t[0910]表b‑纳入作为可能结合剂的hla‑dr分子[0911]hla‑drb1*1101[0912]hla‑drb1*0101[0913]hla‑drb1*0301[0914]hla‑drb1*0401[0915]hla‑drb1*0404[0916]hla‑drb1*0405[0917]hla‑drb1*0701[0918]hla‑drb1*0802[0919]hla‑drb1*0901[0920]hla‑drb1*1302[0921]hla‑drb1*1501[0922]hla‑drb3*0101[0923]hla‑drb4*0101[0924]hla‑drb5*0101[0925]当使用8个hla亚组时，此分数显示与epivax公司(罗得岛州普罗维登斯)产生的计算机免疫原性预测具有良好相同性，后者使用免疫信息学和体外技术以预测免疫原性。使用该8个hla亚组。对一组标准蛋白进行相同计算以提供针对其比较u‑pa变体的对比组。[0926]突变对所预测hla结合谱的影响[0927]对各‑hla复合物就用于任何变体u‑pa蛋白酶结构域的给定序列位置次数作图，kd截短为50nm和500nm。每列的比例固定，但列之间不同并与野生型多肽作比较以评价突变是否改变免疫原性谱。多肽之间没有观察到显著差异。[0928]聚集免疫原性分数[0929]为计算各序列的聚集免疫原性分数，8个hla组(表c)中各结合阈值处的肽—hla结合对总数先前通过epivax(罗得岛州普罗维登斯)验证，以提供与所公开计算机免疫原性分数的良好相同性。epivax是使用免疫信息学和体外技术以预测免疫原性的公司。这些值随后用于计算总分，如上面方法总结中所述。[0930]表c‑用于总体免疫原性分数的hla‑dr亚组[0931]hla‑drb1*0101[0932]hla‑drb1*0301[0933]hla‑drb1*0401[0934]hla‑drb1*0701[0935]hla‑drb1*0802[0936]hla‑drb1*1101[0937]hla‑drb1*1302[0938]hla‑drb1*1501[0939]8个hla亚组的肽—hla结合对数目和upa总分如下所示：[0940][0941]结果表明变体的免疫原性不会不同于野生型多肽。比较蛋白组的相同分析结果如下所示：[0942][0943][0944]实施例12.通过wt‑和变体u‑pa多肽的纤溶酶原激活[0945]通过本文所提供u‑pa多肽的wt‑和抗c3变体激活glu‑纤溶酶原的催化效率如下所述测试。来自这些实验的数据证明，抗c3u‑pa变体蛋白显示针对野生型u‑pa生理相关底物纤溶酶原的活性显著降低。联合来自实施例7的数据，这些数据证明抗c3u‑pa多肽不仅显示针对“新”底物c3的活性显著更高，而且针对wtu‑pa正常生理底物的活性显著降低。[0946]因此，相较于wt‑u‑pa，引入本技术所述抗c3变体的突变大幅改变抗c3变体多肽的底物特异性。[0947]通过wt‑和抗c3变体u‑pa多肽的纤溶酶原激活[0948]1)用单时间点反应分析(37c持续30分钟)[0949]a)反应条件[0950]测量野生型u‑pa/c122s(seqidno:5)以及抗c3u‑pa多肽变体的纤溶酶原激活活性，所述变体包含突变y40q/v41l/l97ba/c122s(seqidno:40)和r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r(seqidno:21)。反应混合物中的蛋白酶浓度是25nm(wt‑u＝pa)或250nm(抗c3u‑pa变体)且底物(即glu‑纤溶酶原)浓度是2.5um。反应体积是20ul且反应在37℃进行30分钟。各反应如下终止：加入2ul1mdtt和7ul4x样品缓冲液，加热至80℃，持续45s。终止的反应混合物加载到4–12％bis‑tris凝胶各孔中，在xtmes缓冲液内200v运行45分钟，随后用simplybluesafestain染色。[0951]b)测量反应产物(即纤溶酶)[0952]染色的sds凝胶分析表明wtu‑pa切割反应中存在的所有纤溶酶原，在30分钟孵育期间将其转化成2链、活性纤溶酶。相反，u‑pa变体y40q/v41l/l97ba/c122s(seqid40)在此反应中的活性大大低于wt‑u‑pa，而在此反应中没有观察到通过u‑pa变体r35q/h37y/r37ae/v38e/t39y/v41r/d60ap/y60bq/t97ai/l97ba/h99q/c122s/y149r的纤溶酶原激活。[0953]2)通过抗c3u‑pa多肽的glu‑纤溶酶原激活动力学[0954]通过wt‑或抗c3upa变体多肽的glu‑纤溶酶原激活动力学分析如下所述实施。激活反应在含有0.1％bsa的i＝0.16mhepes/nacl/edta缓冲液中37℃进行。u‑pa多肽以1nm(wt)或10nm(变体)的浓度存在。二级速度常数(kcat/km)衍生自显色底物s‑2251(h‑d‑val‑leu‑lys‑pna·2hcl)的水解初始反应速度(通过反应产物纤溶酶)相比glu‑纤溶酶原(即u‑pa底物)浓度(0–4μm)的拟合线性关系。还参见表24。[0955][0956]c4s突变不在蛋白酶结构域内[0957]15个变体之间的比较显示下面所附表24的结果，标记有“通过抗c3u‑pa变体的glu‑纤溶酶原激活”。[0958]对于表24：[0959]glu‑纤溶酶原通过c122supa或选定的upa变体在1nm或10nm蛋白酶的蛋白酶浓度激活。[0960]反应在含有0.1％bsa的i＝0.16mhepes/nacl/edta缓冲液中37℃完成。[0961]二级速度常数(kcat/km)衍生自显色底物s‑2251(h‑d‑val‑leu‑lys‑pna·2hcl)的水解初始反应速度vs.glu‑纤溶酶原浓度(0–4μm)的拟合线性关系。[0962]实施例13.示范性u‑pa蛋白酶结构域突变体在食蟹猴玻璃体液中切割补体蛋白c3[0963]示范性突变体如下表23所示，涉及seqidno:5所示的wtu‑pa蛋白酶结构域。带阴影的单元格指示相较于seqidno:5所示的参考u‑pa多肽，经修饰的u‑pa多肽在此残基突变。无阴影的单元格表明经修饰的u‑pa多肽包含与seqidno:5所示的参考u‑pa多肽相同的氨基酸。经修饰的u‑pa多肽的活性通过切割底物补体蛋白c3测定，如实施例2所详述和呈现，且表示为u‑pa治疗后的残留c3水平(nm)。通过经修饰的u‑pa多肽切割c3在购买的食蟹猴玻璃体液或磷酸盐缓冲盐水(pbs)对照中进行，如实施例3所详述。下表23所示的结果显示，相较于序列如seqidno:5所示的参考u‑pa蛋白酶结构域，经修饰的u‑pa多肽表现出针对c3的活性更高。玻璃体液和pbs中的活性％显示7天后剩余活性的百分比。经修饰的u‑pa多肽相较seqidno:5的参考野生型蛋白酶结构域相对稳定，其中一些显示比其他更高的稳定性。治疗候选物包括下表中的那些，具有较高c3切割活性和更高的稳定性，尤其是在玻璃体液中。[0964][0965]*含有取代的蛋白酶结构域的seqid[0966]其中，这些数据和其他数据显示：[0967]r35q：此突变使固有抗c3活性(即缓冲液中)增加约2.7倍和在80％人血浆存在下增加约4.3倍[0968]h37y：此突变使缓冲液中和存在80％人血浆的情况下，抗c3活性增加约2.4‑2.5倍[0969]r37ae：此突变使固有抗c3活性减少约3.2倍；然而，存在80％人血浆时，其对抗c3活性没有影响[0970]v38e：此突变改善缓冲液和玻璃体液中的蛋白稳定性，使80％人血浆中的抗c3活性提高～1.5倍[0971]t39y：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆中的抗c3活性增加约7.5‑8.5倍[0972]v41r：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆中的抗c3活性增加约25‑27倍[0973]d60ap：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆中的抗c3活性增加约1.2‑1.6倍[0974]y60bq：此突变使固有抗c3活性减少约1.7倍并使玻璃体中的蛋白稳定性在37℃孵育7天后下降～1.4倍；但存在80％人血浆时，其使抗c3活性增加约1.1倍[0975]t97ai：此突变使固有抗c3活性和80％人血浆存在下的抗c3活性增加约1.2‑1.3倍[0976]l97ba：此突变使缓冲液和80％人血浆中的抗c3活性增加约6.4‑8.2倍[0977]h99q：此突变使缓冲液和80％人血浆中的抗c3活性增加约2.9‑4.8倍[0978]y149r：此突变使缓冲液和80％人血浆中的抗c3活性减少约1.6‑2.1倍[0979]就较低突变负荷经修饰的u‑pa多肽中的取代获得类似结果，所述多肽包含：i41d/c122s/g151n/q192t(参见例如序列如seqidno：40所示的经修饰的u‑pa多肽，以及含有这些取代的全长和前体及成熟形式)。[0980]数据表明本文所提供经修饰的u‑pa多肽在多个物种中切割和灭活c3。例如，切割人c以灭活其，可以在残基740与741之间(seqidno：47)：[0981]qhar↓ashlꢀꢀꢀꢀꢀꢀ737‑744[0982]p4p3p1↓p1′ꢀp4′.[0983]实施例14.u‑pa‑人血清白蛋白(hsa)融合蛋白的克隆、表达和制备[0984]a.克隆u‑pa‑hsa融合多肽[0985]产生表达u‑pa‑hsa融合蛋白的构建体(seqidno：1015)。u‑pa‑接头‑hsa片段组装自合成寡核苷酸和/或pcr产物，并克隆入pcdna3.4‑topo载体(英杰(invitrogen)；产品目录号a14697)以在人巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子/增强子或专有表达载体(lakepharma)控制下表达。分泌信号序列(seqidno：999(metdtlllwvlllwvpgstg))克隆到u‑pan末端结构域(seqidno：3的氨基酸1‑158)和示范性经修饰u‑pa蛋白酶结构域(如seqidno：987所示)上游，并经接头(seqidno：1002(ggssgg))连接人血清白蛋白(hsa；seqidno：991)的编码区：[0986][0987]构建体包括信号肽(氨基酸1‑20)，u‑pan末端结构域，seqidno：21的经修饰蛋白酶结构域，除了122位的c(如seqidno：987所示)，gs接头(ggssgg，seqidno：1002)，然后是hsa编码区。完整构建体序列如seqidno:1015所示，是：[0988][0989]b.制备u‑pa‑hsa融合多肽[0990]1.u‑pa‑hsa融合多肽的转化和表达[0991]编码经修饰u‑pa‑hsa融合多肽的dna克隆入pcdna3_4表达载体(赛默飞世尔)或专有载体(lakepharma)，其c末端对着分泌信号序列，如章节a所详述。经修饰的u‑pa‑hsa融合蛋白随后以1l表达培养基体积在赛默飞世尔的hekexpi293或expicho表达细胞或lakepharma的专有tunachotm细胞系中表达6天。[0992]2.u‑pa‑hsa融合多肽的亲和纯化[0993]经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白的酶原形式用以captureselecttmhumanalbuminaffinitymatrixsystem销售的系统(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)；产品目录号19129701l或19127005)根据厂商说明纯化。通过向柱加入约10mlcaptureselecttm亲和基质树脂(赛默飞世尔)，对柱进行预备。允许存储溶液流过柱后，加入10个柱体积(cv)的pbs(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,2mmkh2po4,ph7.4)以洗涤树脂。其次，将含有u‑pa‑hsa融合蛋白的表达收获物应用于柱，随后用5‑10cv的pbs洗涤。结合的u‑pa‑hsa融合蛋白用10cv的洗脱缓冲液(20mmtris,2mmgcl2,ph7.0)洗脱。柱稍后用10cv的甘氨酸(0.2m,ph3.0)脱离并用10％tris‑hcl(1.5m,ph7.4)中和，pbs中再平衡。收集流通和洗脱步骤的样品，在还原和非还原sdspage凝胶上分析以评估样品纯度。u‑pa‑hsa融合蛋白在pbs中4℃透析16小时。[0994]3.经修饰的u‑pa‑hsa融合多肽的纤溶酶激活[0995]纤溶酶选择性切割野生型u‑pa和具有野生型u‑pa激活序列的其他u‑pa融合多肽中的单键，以激活u‑pa‑hsa酶原并形成2链u‑pa‑hsa融合蛋白，经二硫键连接c末端活性蛋白酶结构域，其经二硫键系于n末端u‑pa结构域。对于这些实验，所用构建体具有seqidno:1015所示序列，其包含seqidno:21的经修饰的u‑pa多肽，除了根据胰凝乳蛋白酶编号的c122s，是c122c以提供游离半胱氨酸，不纳入信号序列(seqidno:1015的残基1‑20)。激活后，所得产物具有2条链(参考seqidno:1015)：具有残基21‑178的a链和具有残基179‑1022的b链，u‑pa(残基179‑431)、接头(残基432‑437)和hsa(残基438‑1022)。a链和b链通过c168与c299之间的二硫键连接(对应根据胰凝乳蛋白酶编号的c122)。[0996]hsa结构域通过ggssgg接头保持缀合蛋白酶结构域c末端。激活遵循下列程序：通过用1xpbs洗涤树脂3次，制备纤溶酶‑琼脂糖树脂浆体(molecularinnovations；产品目录号hpl‑1)。然后，将200μl树脂悬浮液(在1xpbs中)/毫克u‑pa融合多肽加入含有透析u‑pa‑hsa融合多肽的pbs溶液。通过在室温温和振荡蛋白/树脂溶液3小时，完成u‑pa多肽酶原的“激活”。经修饰的u‑pa‑hsa多肽酶原其后完全转化成对应的活性经修饰u‑pa‑hsa蛋白酶。[0997]根据厂商说明，活性经修饰u‑pa‑hsa多肽用0.2μm旋转滤器(2.0ml容量)从纤溶酶树脂回收，离心以从纤溶酶树脂中回收活化的经修饰u‑pa‑hsa。为使回收最大化，可预想额外过滤技术(比照(asopposedto)旋转沉降树脂和用移液管提取回收上清)。其他低蛋白结合过滤装置也能用于进一步过滤树脂。活化的u‑pa‑hsa融合蛋白在4℃或冷冻下等分保存。确认完整激活步骤可通过sds‑page在还原条件下呈现，以分开n末端结构域与蛋白酶结构域hsa融合缀合物。[0998]4.抑制活化的经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白[0999]对于一些实验，需要使用催化失活形式的u‑pa‑hsa融合多肽(如seqidno:1015的残基21‑1022所示，如上所讨论；参见例如seqidno:1019)。为产生命名为抑制的经修饰u‑pa‑hsa(u‑pa‑hsai)的蛋白，活化的经修饰u‑pa‑hsa(u‑pa‑hsaa)与不可逆活性位点抑制剂glu‑gly‑arg‑氯甲酮(egr‑cmk)孵育，以防止经修饰的u‑pa‑hsa多肽的任何自催化或体内实验中的灭活/切割(参见例如实施例15和16)。为制备u‑pa‑hsai，冻干的egr‑cmk(molecularinnovations；产品目录号ggack)在10mmhcl中复水到100mm。浓缩的egr‑cmk以储料浓度加入活化的经修饰u‑pa‑hsa样品(u‑pa‑hsaa)以达到1xpbs中1mmegr‑cmk抑制剂的终抑制剂浓度，允许混合物rt孵育1小时。[1000]为评价u‑pa‑hsaa是否充分抑制，在稳定性实验中比较经修饰u‑pa‑hsai的降解与经修饰u‑pa‑hsaa。简言之，经修饰的u‑pa‑hsai和经修饰的u‑pa‑hsaa在37℃孵育0小时、1天或7天。在还原和非还原条件下，通过还原和非还原sds‑page凝胶电泳来目测监测经修饰u‑pa‑hsai和u‑pa‑hsaa降解。通过考马斯或其他类似市售可得染色剂来呈现条带。结果证明用抑制剂预孵育可稳定多肽，因为相较于在37℃孵育1天或7天后观察到的经修饰u‑pa‑hsaa降解，在多至7天的任何时间点没有观察到任何经修饰u‑pa‑hsai的降解产物。[1001]5.在激活后纯化u‑pa‑hsaa和u‑pa‑hsai多肽[1002]在终纯化轮期间，活性和抑制的经修饰u‑pa‑hsa多肽分离自高和低分子量杂质，使用尺寸排阻层析。纯化排除高分子量种类，其作为u‑pa‑hsa主峰前的单独峰洗脱。高分子量种类未进一步分析，然而，能代表在所述过程的表达或激活步骤中形成的聚集物或多聚体。认为第二、低分子量种类游离于表达期间产生的白蛋白或者激活也被消除。[1003]纯化如下推进：～300μl经修饰u‑pa‑hsai(0.8mg)样品或～400μl经修饰u‑pa‑hsaa(0.8mg)样品加载到尺寸排阻层析柱(hiprep16/60sephacryls‑200hr；通用电气医疗集团,产品目录号ge17‑1166‑01)，在pbs,ph7.0中，流速为0.5ml/min。蛋白一般根据厂商用于树脂的说明(通用电气医疗集团)纯化，主峰含有保留的经修饰u‑pa‑hsai或u‑pa‑hsaa。[1004]制品的品质和分离的程度通过还原及非还原sds‑page凝胶电泳进一步评估。经修饰u‑pa‑hsai或u‑pa‑hsaa多肽样品的洗脱部分加载到12孔非还原sds‑page凝胶各“泳道”，在40v运行，直至带充分可辨别，多个尺寸的蛋白种类通过银染色呈现以提高相比标准考马斯染色的灵敏度。收集含有在75kda预期分子量迁移的单带的部分，以约2mg/ml终浓度进行液氮速冻，‑80℃保存，直至使用。终浓度通过280nm吸收确定，使用nanodrop分光光度计。蛋白尺寸和表达稍后通过考马斯染色及sds‑page确认。单独u‑pa‑hsa多肽样品的品质通过活性试验和质谱进一步评估。[1005]实施例15.玻璃体内注射后的经修饰u‑pa蛋白酶结构域和经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白药代动力学评估[1006]评价经修饰的u‑pa‑hsa融合多肽的药代动力学和明显眼部毒性。融合蛋白包含经修饰的u‑pa多肽蛋白酶结构域(seqidno:987,其是seqidno:21,除了c122s是c122c)，如上面实施例14所述。融合蛋白具有seqidno:1019所示的序列，其是seqidno:1015的残基21‑1022。如实施例14所述，经修饰u‑pa的蛋白酶结构域如seqidno:987所示。活化和抑制的经修饰u‑pa‑hsa融合蛋白(seqidno:1015)的药代动力学概况在荷兰黑带兔(dutchbeltedrabbit)中体内评价，并与仅如seqidno:21所示经修饰u‑pa蛋白酶结构域的药代动力学概况作比较。3个治疗组的每个分配8只兔子(组1:经修饰的u‑pa‑hsaa；组2:经修饰的u‑pa‑hsai；组3:经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21))。研究动物每只眼睛通过玻璃体内注射(ivt)施用50μl的2.1mg/ml经修饰的u‑pa‑hsai和u‑pa‑hsaa或1.15mg/ml经修饰的u‑pa(seqidno:21)。对于含经修饰的蛋白酶的经修饰的u‑pa治疗组，右眼接受经修饰的u‑pa多肽且左眼注射pbs作为载剂对照(pbs)。下表概括了组和条件以及进行的评估：[1007][1008]*os和od分别指右和左眼[1009]1.经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa融合蛋白的眼部耐受性[1010]在给药阶段期间和安乐死之前，进行临床和眼部观察并记录体重。在给药后1、3、7和14天(组1和2)或1、3和7天(组3)对2只眼睛都进行眼部检查，眼睛刺激用德雷策标度打分。德雷策打分系统(draize等、(1944)jpharmexperther82(3)377‑90)评价角膜、虹膜和结膜中的眼睛刺激，提供以0‑2或0‑4量表打分刺激的标准。“0”分指示角膜、虹膜和结膜正常。在所有时间点，使用德雷策标准，所有动物的眼睛刺激打分为0，除了1只兔子有2个“1”分，指示“红”，其中“血管明确高于正常注射”和“球结膜水肿”具有结膜“高于正常的肿胀”。在第1天玻璃体内施用u‑pa‑hsai后数小时内，就组2(u‑pa‑hsai)的1只兔子观察到这些“1”分。最重要的是，在玻璃体内施用经修饰u‑pa和经修饰u‑pa‑hsa活化融合蛋白后，没有观察到毒性。[1011]2.经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa融合蛋白的药代动力学[1012]为确定经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa多肽浓度(nm)及药代动力学参数，在1、3、7和14天摘除双眼后收集眼组织及液体的终端样品，每个时间点使用2只动物。安乐死后，收集各兔子的双眼并切开以收集眼组织及液体(眼房水(ah)、玻璃体液(vh)、视网膜和脉络膜)，从而评价u‑pa和u‑pa‑hsa表达及活性。收集后，称重量的兔玻璃体液、视网膜和眼脉络膜在含2.8mm陶瓷珠的耐冲击微管(usascientific)中均质化。对于vh、视网膜和脉络膜组织，向各管加入磷酸盐缓冲盐水/毫克组织的恒定等分样品。视网膜和脉络膜样品9:1稀释(稀释液体积:组织体积)且vh样品4:1稀释(稀释液体积:vh体积)，使用磷酸盐缓冲盐水。样品在0‑10℃,5500rpm匀化，持续3×30秒循环，各循环之间有20秒停顿，直至彻底匀质化。[1013]vh中经修饰u‑pa和经修饰u‑pa‑hsa多肽的浓度(由elisa测定)(nm)及活性(nm)，分别用elisa和活性试验确定。对于浓度测定，抗u‑pa夹心elisa如下完成：捕获抗体pa1‑36166(英杰)在elisa板上4℃包被过夜或rt2小时，浓度为100mm碳酸盐缓冲液,ph9.5中的1.0ug/ml。板随后用pbst(含有tween的1xpbs)洗3x，然后用含1％bsa的pbs‑tween在4℃阻断过夜或rt2小时。50μl的各样品在rt振荡孵育30分钟，然后pbs洗3x，用检测抗体pa1‑36015(英杰，0.25ug/ml，持续30分钟)孵育。孔再次洗涤且随之用1:30,000稀释的hrp缀合抗山羊抗体(rockland)孵育39分钟，伴有rt振荡。用pbst洗6x后，结合的经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa多肽通过1步式tmb(34028,赛默(thermo))检测呈现，用2n硫酸淬灭，然后读取450nm吸光度。[1014]然后通过活性定量vh中经修饰的u‑pa和经修饰的u‑pa‑hsa多肽，使用基于淬灭‑荧光肽底物(fret)水解的试验并针对已知活性浓度的经修饰的u‑pa多肽的标准曲线校准。此试验采用基于人补体3(c3)切割序列的fret肽底物。肽序列是rqhar/ashl，其中“/”指示切割位点。肽的n末端侧标记有dabcyl荧光团，c末端侧标记有edans荧光团。肽切割可分开edans/dabcylfret对以产生荧光信号，其在多孔荧光酶标仪中测量。[1015]试验如下进行：测试样品通常在试验缓冲液(100mmtris,50mmnacl,0.01％tween‑80,ph7.4)中稀释到最低所需稀释度1:20。稀释的样品进一步1:2稀释，采用96孔板的80μmfret底物。稀释的测试样品与底物组合后，立即在荧光读板仪中评估fret底物水解后的荧光信号，每30秒测量，持续2小时。fret肽底物的酶促水解产生了edans荧光产物。将荧光强度的产生速率插入edans标准曲线以产生edans产物产生速率。特定活性可以2种方式计算。首先，产物产生速率乘以稀释因数以产生体积特定活性，单位为每ml样品每分钟反应的nmol产物(nmol/min/ml)。体积特定活性指示样品中活性酶总量。第二，特定活性如下计算：体积特定活性除以样品酶浓度以产生酶特定活性，单位为每mg酶每分钟反应的nmol产物(nmol/min/mg)。为测试确定未知样品(如体内pk样品)的表观蛋白酶浓度，样品的体积特定活性(nmol/min/ml)除以对照经修饰的u‑pa或经修饰的u‑pa‑hsa多肽的酶特定活性(nmol/min/mg)，以产生样品的表观蛋白酶浓度(mg/ml)。[1016]下表提供各眼和动物的数据。每只动物就各眼获得的浓度进行平均。然后，各动物的药物浓度在各时间点平均以补偿动物间变化。计算各时间点的均值并示于下表。所得数据随后接受下列分析方法：首先，lee等开发的半参数分段稳健回归方法(参见lee等,(1990)j.labclin.med.115:745‑748；和lee等(1997)“使用稳健回归技术以获得改进的凝血因子半衰期估。第十六届国际血栓与止血大会(theuseofrobustregressiontechniquestoobtainimprovedcoagulationfactorhalf‑lifeestimates.xvithcongressoftheinternationalsocietyforthrombosisandhemostasis),”意大利佛罗伦萨)用于计算半衰期。其是区室化模型。数据用程序demitasse评估，其经验证并用于fda提交。为分析时间曲线下面积(auc)和其他pk参数，使用基于梯形法则的非区室化模型。计算pk参数并示于下表。[1017]表[1018]idno:1000))；(2)野生型u‑pa激活序列(seqidno:997或998),弗林蛋白酶激活序列(seqidno:995,996或1041),或没有激活序列；(3)经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987或21)或野生型u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:2或5)；(4)接头(seqidno:1002或1003)；和(5)融合伴侣(即igg1fc(seqidno:992)；人血清白蛋白(hsa)(seqidno:991)；结合胶原蛋白iim的cfv(c2scfv)(seqidno:993)；或透明质酸结合域(habd)(seqidno:994))。c末端融合蛋白示例如seqidno:1006‑1010、1012、1013、1016和1040所示(参见例如图3a和3b)。[1031]也产生含有u‑pan末端区的c末端融合蛋白。构建体包含(从n末端到c末端)：(1)分泌信号(小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)；seqidno:999)；(2)野生型u‑pan末端区(seqidno:1的氨基酸21‑178或seqidno:1042)；(3)u‑pa激活序列(seqidno:997或998)或弗林蛋白酶激活序列(seqidno:995,996或1041)；(4)经修饰u‑pa催化结构域(seqidno:987或seqidno:5,除了根据胰凝乳蛋白酶编号的c122,或seqidno:21)；(5)接头(seqidno:1002或1003)；和(6)融合伴侣(即igg1fc(seqidno:992)；人血清白蛋白(hsa)(seqidno:991))。c末端融合蛋白示例如seqidno:1011,1014,1015和1036所示(参见例如图3c)。还参见seqidno:1010，其包含弗林蛋白酶激活序列取代u‑pa。[1032]还产生含有n末端sumo和c末端融合伴侣的融合蛋白。构建体包含(从n末端到c末端)：(1)分泌信号(小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)(seqidno:999))；(2)his接头和sumo序列(seqidno:990)；(3)经修饰u‑pa催化结构域(seqidno:987)；(4)接头(seqidno:1002)；和(5)融合伴侣(即igg1fc(seqidno:992)；或人血清白蛋白(hsa)(seqidno:991))。c末端融合蛋白示例如seqidno:1016和1017所示。[1033]产生未与融合伴侣融合的全长u‑pa蛋白作为对照(参见例如图2b)。构建体包含(从n末端到c末端)：(1)分泌信号(小鼠igκ链v‑iii区(iggκ)(seqidno:999))；(2)u‑pa的n末端结构域(seqidno:1040；seqidno:1的氨基酸21‑166)；(3)u‑pa激活序列(seqidno:997)；和(4)经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)。全长u‑pa蛋白示例如seqidno:1005所示。以下是产生的构建体概括：[1034][1035][1036]对照蛋白具有seqidno:1005所示的序列。对照蛋白包含u‑pan末端(seqidno:3的氨基酸1‑158)、野生型u‑pa激活序列和u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:987)且没有融合伴侣。seqidno:1004所示的融合蛋白包括在n末端的融合伴侣(fc)。seqidno:1006‑1009所示的融合蛋白具有c末端的不同融合伴侣且没有位于经修饰u‑pa蛋白酶结构域n末端的激活序列。seqidno:1010和1011所示的融合蛋白包含c末端的fc且彼此差异性激活：seqidno:1010所示融合蛋白包含弗林蛋白酶激活序列；seqidno:1011所示的融合蛋白包含u‑pa的n末端区和野生型u‑pa激活序列。seqidno:1012和1013所示的融合蛋白分别与seqidno:1006和1007所示的融合蛋白相同，但具有野生型u‑pa蛋白酶结构域取代经修饰的u‑pa蛋白酶结构域。[1037]seqidno:1014‑1016所示的融合蛋白包含c末端的hsa且彼此差异性激活：seqidno:1014所示的融合蛋白包含弗林蛋白酶激活序列；seqidno:1015所示的融合蛋白包含野生型u‑pa激活序列用于激活；seqidno:1016所示的融合蛋白包含弗林蛋白酶结构域用于激活。seqidno:1017和1018所示的融合蛋白分别包含n末端的sumo作为激活结构域，和c末端的hsa或igg‑fc。向seqidno:1010、1014和1016所示的融合蛋白加入弗林蛋白酶激活位点，从而蛋白能在表达期间活化，因而消除对下游加工期间激活步骤的需求。[1038]2.构建体产生[1039](a)制备u‑pa构建体[1040]构建体组装自合成寡核苷酸和/或pcr产物并克隆入pcdna3.4‑topo载体(英杰；产品目录号a14697)，以在人巨细胞病毒(cmv)立早启动子/增强子控制下表达。[1041](b)制备sumo‑u‑pa构建体[1042]为表达含有sumo标签的融合蛋白(如seqidno:1017和1018所示)，带有c122s的经修饰的u‑pa多肽编码dna(如seqidno:21所示)克隆入密码子优化的pe5表达载体(赛默科技；序列如seqidno:988所示)。pe5质粒包含位于sumo序列c末端的多克隆位点以克隆融合伴侣(hsa或fc)和经修饰的u‑pa蛋白酶结构域。最终的融合蛋白是(1)融合伴侣(hsa或fc)；(2)有c122s的经修饰的u‑pa蛋白酶结构域(seqidno:21)；其有(3)n末端6xhis纯化标签；和(4)sumo。[1043]b.制备u‑pa融合多肽[1044]u‑pa融合蛋白的预期分子量如下所示：[1045][1046][1047]1.u‑pa融合蛋白的转化、表达、折叠和再折叠[1048]序列如seqidno:1004‑1013所示的融合蛋白如上面实施例14所详述进行转化和表达。[1049]2.u‑pa‑sumo(小泛素样修饰物)融合蛋白的转化、表达、折叠和再折叠[1050]序列如seqidno:1017和1018所示的融合蛋白如下所详述制备。[1051]克隆用于大肠杆菌表达的sumo‑经修饰u‑pa融合多肽[1052]感受态bl21gold(de3)大肠杆菌细胞用表达载体(seqidno:988)中的u‑pa融合蛋白转化，其由赛默科技制备，使用标准热激方法。质粒dna重悬于50μlmq水以获得100ng/ml储液。质粒dna和感受态bl21goldde3细胞在冰上解冻。将0.5μldna加入无菌微量离心管的50μl细胞，冰上孵育30分钟。细胞/dna混合物通过在42℃放置45秒来热激。细胞/dna混合物移回到冰，冰上孵育2分钟。向细胞/dna混合物加入450μl预热(37℃)soc培养基，所得soc/细胞/dna混合物在37℃振荡孵育。soc(2‑200μl)中的细胞在lb‑羧苄青霉素板上接种并涂布，所述板37℃孵育过夜。从培养箱中取出具有细菌菌落的板，石蜡膜密封并4℃保存。各转化菌落的甘油储液通过标准方法制备并‑70℃保存。[1053]c.评价融合蛋白在哺乳动物细胞培养物中的蛋白表达[1054]来自expi293细胞培养物上清(参见实施例14)的蛋白浓度通过elisa评估且通过蛋白质印迹定性评估。蛋白质印迹后的蛋白表达在1‑5量表上打分，其中1代表最高表达而5代表没有表达。[1055]就各构建体测试6个样品。结果如下表所示。结果显示，通过elisa和蛋白质印迹，seqidno:1004、1007‑1009和1013所示的融合蛋白表达不良。seqidno:1005、1010和1011所示的蛋白具有最高表达，如定性蛋白质印迹和elisa所评价。[1056][1057]r平方＝0.9993；检测极限＝0.109ng/ml；定量限＝1.375ng/ml[1058][1059]d.融合蛋白激活策略[1060]多种策略用于u‑pa激活。seqidno:1004‑1005、1011和1015所示的蛋白通过纤溶酶活化，如上面实施例14所详述。seqidno:1010、1014和1016所示的蛋白预期通过表达期间的胞内弗林蛋白酶活化。seqidno:1006‑1008所示的蛋白预期在表达期间自激活。seqidno:1017和1018所示的蛋白通过sumo蛋白酶处理激活。为激活sumo‑u‑pa构建体，通常加入10单位sumo蛋白酶/1mg蛋白，允许4℃孵育过夜。histrap镍螯合柱上进一步纯化会有效移出带his标签的sumo部分。[1061][1062]e.测量酶活性[1063]含有u‑pa融合蛋白的expi293hek上清在40μm人c3fret肽上的体积特定活性如实施例15所述评价。计算插入的、稀释调整的初始速度(nmedans/min/μl样品)。seqidno:1004、1005、1008和1011‑1013所示的融合蛋白未显示活性。seqidno:1006、1007、1009和1010所示的融合蛋白证明u‑pa蛋白酶活性。带有u‑pa的n末端的弗林蛋白酶激活序列和c末端的igfc融合的经修饰的u‑pa(如seqidno:1010所示)，显示最高活性。结果如下表所示。[1064][1065]f.亲和性纯化[1066]seqidno:1010和1011所示的融合蛋白具有最高表达，如蛋白质印迹和elisa所评价。seqidno:1010和1011所示的弗林蛋白酶‑变体u‑pa‑fc和全长upa‑fc融合蛋白分别进行蛋白a亲和纯化，使用厂商推荐条件(通用电气医疗集团)。[1067]g.高表达融合蛋白的纯化和活性评价[1068]亲和纯化后，蛋白浓度通过280nm吸光度和u‑paelisa评价(参见实施例15)，而纯度通过sds‑page凝胶电泳和分析型尺寸排阻层析(sec)评估，如上面实施例14所述。2种融合蛋白都表达。通过凝胶电泳和染色以及通过分析型尺寸排阻层析(sec)评价时，认为序列如seqidno:1010所示的融合蛋白(u‑pa弗林蛋白酶w/ocys)纯度不佳。通过凝胶电泳，认为seqidno:1011所示融合蛋白(全长wtupaw/cys)的纯度良好。结果如下表所示：[1069][1070]在人c3fret肽试验中评价亲和纯化后的u‑pa酶活性，如上面实施例15所述。结果示于下表:[1071][1072]亲和纯化后的u‑pa酶活性在人c3fret肽试验中评价，如上面实施例15所述。酶活性在纤溶酶激活后评价，如上面实施例14所述。结果如下表所示：[1073][1074]h.描述具有切割c3的经修饰的u‑pa多肽的融合蛋白[1075]具有u‑pa多肽的融合蛋白如下所述。下列讨论提供示范性序列。[1076]1.催化结构域[1077]催化结构域(蛋白酶结构域)可以是本文所提供经修饰的u‑pa多肽的任意蛋白酶结构域(参见实施例2，表14，其提供含本文和实施例所述多个修饰的蛋白酶结构域的ed50)，尤其是ed50小于100nm的任意那些，如实施例2所述，或小于50nm、30nm或10nm的那些。经修饰upa蛋白酶结构域示例如seqidno:21所示，除了当使用其激活生成2链多肽时，残基122(通过胰凝乳蛋白酶编号)是c，而非seqidno:21中的s。对经修饰upa多肽蛋白酶结构域加标签：[1078]seqidno:987:iiggefttienqpwfaaiyqryeggseyyrcggslispcwvisathcfipqpkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadiaaqhndiallkirskegrcaqpsrtiqticlpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdrlypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal；[1079]seqidno:21经修饰upa多肽蛋白酶结构域，含有c122s突变:iiggefttienqpwfaaiyqryeggseyyrcggslispcwvisathcfipqpkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadiaaqhndiallkirskegrcaqpsrtiqtislpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdrlypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmtltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal[1080]相较于天然upa多肽蛋白酶结构域seqidno:2含有氨基酸取代:iiggefttienqpwfaaiyrrhrggsvtyvcggsl[i/m]spcwvisathcfidypkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadtlahhndiallkirskegrcaqpsrtiqticlpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdylypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmtltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal；[1081]或相较于蛋白酶结构域，其中残基122(通过胰凝乳蛋白酶编号)处的c是s，如seqidno:5所示:[1082]iiggefttienqpwfaaiyrrhrggsvtyvcggslispcwvisathcfidypkkedyivylgrsrlnsntqgemkfevenlilhkdysadtlahhndiallkirskegrcaqpsrtiqtislpsmyndpqfgtsceitgfgkenstdylypeqlkmtvvklishrecqqphyygsevttkmlcaadpqwktdscqgdsggplvcslqgrmtltgivswgrgcalkdkpgvytrvshflpwirshtkeenglal.[1083]如本文所示，经修饰的u‑pa多肽相较于天然u‑pa，显示蛋白裂解活性和生化性质改变。u‑pa多肽修饰成对切割c3的活性增加，如本文所述，且切割其天然底物的活性下降。no:997(qcgqktlrprfk)或seqidno:998(qsgqktlrprfk))或弗林蛋白酶切割序列(seqidno:995、996、1041或1044(如qcgqktlrrrkr、或qsgqktlrrrkr、或qsgktlrrkr或qsgqktlrrkr)。二硫键能在激活序列内的半胱氨酸与u‑pa催化结构域内的半胱氨酸(通过胰凝乳蛋白酶编号的c122)之间维持。切割激活位点后，活化分子保留在n末端片段激活或全部n末端结构域之间的共价连接。[1093]5.接头[1094]为连接u‑pa多肽与其他多肽序列，使用氨基酸的短、灵活序列(接头)。接头示例包括但不限于ggssgg或ggggs或ags(如seqidno:1001‑1003和1024‑1030所示那些)，以及详细描述中讨论的那些。这些重复序列连接的较长链接也纳入，从而接头具有序列(ggssgg)n 1，其中n是0或1‑20的整数。其他接头如序列表和详细描述所示。[1095]6.其他u‑pa修饰[1096]可加入其他肽序列如6xhissumo(如seqidnos:990和1031‑1033(dghhhhhhgslqdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdsl(t/r)flydgi(e/r)iqadq(t/a)pedldmedndiieahreqigg)所示那些)以促进u‑pa多肽的表达、分泌或纯化。对于改变或天然u‑pa多肽的额外化学和翻译后修饰能包括但不限于缀合聚合物，如聚乙二醇化、pas化和唾液酸化以改变u‑pa多肽的药效学性质。[1097]7.有n末端融合的示范性经修饰的u‑pa多肽[1098][1099][1100]*seqidno:21的u‑pa蛋白酶结构域(有和没有c122s取代)[1101]图2列出有n末端融合的u‑pa多肽示意图，如seqidno:1004和1005所示的n末端融合多肽。[1102]8.有c末端融合的示范性经修饰的u‑pa多肽[1103][1104][1105][1106][1107][1108][1109][1110][1111][1112][1113][1114][1115][1116][1117][1118][1119][1120]图3列出有c末端融合的u‑pa多肽示意图，如seqidno:1006‑1018和1036所示c末端融合多肽。[1121]i.用于评价u‑pa量和补体途径活性的试验[1122]在pcdna3_4载体转染后生成u‑pa多肽融合，所述载体在expi293tm细胞的哺乳动物表达系统中编码改变的和天然u‑pa多肽融合。在expi293tm细胞中正确表达的u‑pa多肽用hitrap蛋白ahp或captureselecttm人白蛋白亲和基质纯化，并加工用于生物分析试验如u‑paelisa以检测upa效加价或c3fret蛋白裂解试验以检测u‑pa多肽催化活性。结果如下表所示：[1123][1124][1125]1.u‑paelisa水平[1126]酶联免疫吸附测定(elisa)用于检测u‑pa多肽的存在(参见例如实施例15)。通常，检测u‑pa是u‑pa与捕获抗体(1.0ug/ml的pa1‑36166,英杰)结合的间接量度。捕获的u‑pa多肽随后用检测抗体(0.25ug/ml的pa1‑36015)检出，其由hrp缀合抗山羊抗体(rockland,605‑403‑b69)识别。hrp酶在加入tmb底物后引发比色反应。使用u‑paelisa法，鉴定了4个以高upa效价水平表达的u‑pa多肽(seqidno:1005、1010、1011、1012、1015)，2个中等效价的u‑pa多肽(seqidno:1006和1013)，和不表达的seqidno:1004、1007‑1009所示u‑pa多肽。[1127]2.酶活性(人c3fret肽)[1128]体外测量upa多肽对人c3的蛋白裂解活性，使用genscript(批号94045990005/pe6379)生产的人c3fret肽rhqarashledans/dabcyl(参见例如实施例15)。肽的n末端侧标记有dabcyl荧光团，c末端侧标记有edans荧光团。切割肽可分开edans/dabcylfret对以产生荧光信号，其在多孔读板仪中测量。将荧光强度的产生率针对edans标准曲线插值以产生edans产物产生率。产物产生率乘以稀释因子以产生体积特定活性，单位为每ml样品每分钟反应的nmol产物(nmol/min/ml)。体积特定活性指示样品中活性酶总量。第二特定活性如下计算：体积特定活性除以样品酶浓度以产生酶特定活性，单位为每mg酶每分钟反应的nmol产物(nmol/min/mg)。酶特定活性指示upa多肽在样品中的固有活性，无论浓度如何。使用人c3fret活性试验，seqidno:1010所示的upa多肽显示有活性。[1129]***[1130]本领域技术人员清楚了解一些修饰，预期本发明仅受所附权利要求范围限制。当前第1页12当前第1页12
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