选择和检测结合肽的方法与流程

1.本发明属于mrna展示技术领域。更具体地，本发明涉及针对细胞表达的或可溶性的肽来选择、检测和/或富集肽的方法、以及具有期望功能特性的肽。


背景技术：

2.信使rna(mrna)展示是一种针对可溶性肽和可溶性蛋白质的选择技术。(szostak r.et al.,rna
‑
peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins.proc.natl.acad.sci.94,12297
‑
12302(1997))。采用信使rna展示能够构建高度多样化的肽库，其中可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸。可以通过不同的方法并入非天然氨基酸，包括抑制琥珀密码子和利用修饰的trna(非天然氨基酸与trna的化学缀合物)或使用由人工核酶制成的高度灵活的trna氨酰化酶(称为flexizymes)(niwa n.et al.,a flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water
‑
friendly leaving group.bioorganic&med.chem.letters 19(14),3892
‑
3894(2009))。
3.应用mrna 展示来选择肽的方法传统上包括从dna 变体库转录mrna并将这些mrna变体退火到短dna接头上，该接头在其3'末端与嘌呤霉素缀合(ishizawa t.et al.,trap display:a high
‑
speed selection method for the generation of functional polypeptides.j.am.chem.soc.135(14),5433
‑
5440(2013))。这将产生一个mrna:dna接头
‑
嘌呤霉素文库。通过添加细菌或兔网织红细胞裂解物或pure启动翻译。
4.在翻译过程中，核糖体沿着单个mrna移动，并将存储在mrna中的遗传信息翻译成肽序列。当核糖体遇到设计在肽序列末端的tag终止密码子时，它们会在没有释放因子1的情况下停滞，从而允许嘌呤霉素进入核糖体位点a。结果，嘌呤霉素在多肽生长链和mrna之间形成共价键。翻译停止，与融合嘌呤霉素的dna接头杂交的mrna现在与肽相连。然后将mrna逆转录为cdna以允许进行pcr扩增和生成在选择过程中具有减少的非特异性结合的稳定dna:rna双链体。针对感兴趣的靶标，选择文库，洗去非特异性肽，并洗脱结合物(binder)。通过定量pcr(qpcr)监测选择效率。下一代测序用于确定多轮序列后富集的肽序列。
5.虽然通过mrna文库选择已经产生了针对可溶性肽的特异性强结合物，但mrna展示并不适用于针对细胞表达的靶标的选择。因此，仍然需要针对细胞表达的靶标例如蛋白质或蛋白质类似物进行选择的方法。此外，大多数先前的方法使用qpcr来确定输出与输入分子的比率(百分比回收率)以确定效率。然而，选择的肽既包括特异性结合物也包括非特异性结合物。因此，需要仅选择特异性结合物的方法。
6.发明概述
7.因此，本发明提供了针对细胞表达的和可溶性的肽或肽类似物来选择mrna展示文库的方法。本发明还提供了一种以定量方式监测每一轮选择中靶特异性肽的富集的手段，这将是更为准确的用于确定效率的度量方式。此外，可以基于实时获得的数据修改本发明的选择条件，以针对可溶性和细胞表达的靶标进行选择。此外，本发明允许并入facs以针对
细胞表达的和重组的蛋白选择靶特异性的肽，允许进行功能选择(选择在基于细胞的测定中具有期望功能的肽)，并能够鉴定在细胞中内化的肽。
8.嘌呤霉素连接到短dna接头上以获得嘌呤霉素
‑
dna 接头。然后将荧光团与嘌呤霉素
‑
dna接头的5'末端融合，从而使所得dna接头在其3'末端与嘌呤霉素融合，并在其5'末端与荧光团融合。因此，当与dna接头退火时，文库中的每个mrna
‑
dna
‑
肽分子都会自动带上荧光团标记，从而实现facs和流式细胞术与mrna展示平台的集成。在类似的方法中，可以将标签(例如flag
tm
标签)并入mrna
‑
dna
‑
肽复合物中，以便对该标签具有特异性的荧光肽、抗体或其他荧光分子与mrna
‑
dna
‑
肽分子结合，从而实现facs和流式细胞术的整合。
9.facs和流式细胞术的这种整合提供了一种在每轮选择中以定量方式监测靶特异性肽富集的手段，而先前的方法使用qpcr来确定输出与输入分子的比率(百分比回收率)。本发明的方法提供了优于qpcr百分比回收率测定的优势，对于后者，在每一轮选择期间，特异性和非特异性结合物均被选择。因此，使用qpcr百分比回收率测定导致的是，在每轮选择中对特异性和非特异性结合物两者的量度。而通过流式细胞术和facs的富集和选择允许选择大部分特异性的结合物。
10.本发明的方法也是有利的，因为可以基于实时获得的数据修改选择条件。此外，这种方法允许结合facs以针对细胞表达的和重组的蛋白来选择靶特异性肽，允许进行功能选择，并能够鉴定可以细胞内化的肽。
11.因此，本发明提供检测或选择靶标的结合肽的方法，其中该方法包括检测或选择与至少一种可检测物质连接的mrna
‑
dna
‑
肽复合物。在一个实施方案中，可检测物质是荧光团。在一个特定实施方案中，荧光团是有机染料、生物荧光团或量子点。在一个特定实施方案中，可检测物质是alexa fluor。在一些实施方案中，可检测物质与嘌呤霉素接头缀合。
12.本发明还提供了检测或选择靶标的结合肽的方法，其中该方法包括检测或选择与至少一种可检测物质连接的mrna
‑
dna
‑
肽复合物，并且其中可检测物质是标签。在一个实施方案中，标签包含天然或非天然氨基酸。在一个实施方案中，标签是肽标签。在一个特定的实施方案中，肽标签是flag
tm
标签。在一个实施方案中，标签通过荧光分子检测。在一个特定的实施方案中，通过荧光肽检测标签。在另一个特定的实施方案中，标签通过荧光抗体检测。
13.在一个实施方案中，本发明的方法包括固定在能够进行分选的材料上的靶标。在一个特定实施方案中，能够进行分选的材料是珠子。在一个实施方案中，靶标是肽、蛋白质、核酸、糖、脂质、哺乳动物细胞或哺乳动物细胞提取物。在一个特定的实施方案中，靶标是肽或蛋白质。
14.在一个实施方案中，本发明的方法包括包含至少一个非天然氨基酸的结合肽。
15.在另一个实施方案中，通过可检测物质检测或选择本发明方法的结合肽。在一些此类实施方案中，通过流式细胞术或facs检测或选择结合肽。在其他这样的实施方案中，通过elisa、分光光度法、荧光光谱法或显微术检测或选择结合肽。在一个优选的实施方案中，结合肽通过流式细胞术检测。在另一个优选的实施方案中，通过facs选择结合肽。在一个实施方案中，检测并选择结合肽。在一些这样的实施方案中，结合肽通过流式细胞术检测并且结合肽通过facs选择。
16.在一个实施方案中，本发明的方法包括将至少一种可检测物质掺入mrna文库以产
生mrna
‑
可检测物质复合物。在另一个实施方案中，本发明的方法包括翻译mrna
‑
可检测物质复合物以产生mrna
‑
肽
‑
可检测物质复合物。在进一步的实施方案中，本发明的方法包括逆转录mrna
‑
肽
‑
可检测物质复合物以获得mrna
‑
dna
‑
肽
‑
可检测物质复合物。在一个特定实施方案中，本发明的方法包括将至少一种可检测物质掺入mrna文库以产生mrna
‑
可检测物质复合物，翻译mrna
‑
可检测物质复合物以产生mrna
‑
肽
‑
可检测物质复合物，和将mrna
‑
肽
‑
可检测物质复合物逆转录得到mrna
‑
dna
‑
肽
‑
可检测物质复合物。在一个实施方案中，通过流式细胞术检测mrna
‑
dna
‑
肽
‑
可检测物质复合物。在另一个实施方案中，通过facs选择mrna
‑
dna
‑
肽
‑
可检测物质复合物。
17.在一个实施方案中，本发明的方法包括转录模板dna文库以获得mrna文库。
18.在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括去除未与靶标结合的mrna
‑
dna
‑
肽复合物。在一个实施方案中，本发明的方法包括从靶标上移出mrna
‑
dna
‑
肽复合物。
19.在一个特定的实施方案中，通过添加酸或加热，移出mrna
‑
dna
‑
肽复合物。在一个特定的实施方案中，通过加热来移出mrna
‑
dna
‑
肽复合物。在一个实施方案中，该方法进一步包括通过pcr扩增该移出的mrna
‑
dna
‑
肽复合物的dna。在一个实施方案中，该方法进一步包括转录该扩增的dna以获得mrna文库。
20.在一个实施方案中，本发明的方法包括确定结合肽的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括确定结合肽的核酸序列。
21.在一个实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法检测或选择的结合肽。
22.本发明还提供与至少一种可检测物质连接的mrna
‑
dna
‑
肽复合物。在一个实施方案中，本发明提供与至少一种可检测物质连接的mrna
‑
dna
‑
肽复合物的文库。在一个实施方案中，可检测物质是荧光团。在一个实施方案中，荧光团是有机染料、生物荧光团或量子点。在一个特定实施方案中，可检测物质是alexa fluor。在一个实施方案中，可检测物质与嘌呤霉素接头缀合。在另一个实施方案中，可检测物质是标签。在一些此类实施方案中，标签包含天然或非天然氨基酸。在一个实施方案中，标签是肽标签。在一些这样的实施方案中，标签是flag
tm
标签。在一个实施方案中，标签通过荧光分子检测。在一个特定的实施方案中，荧光分子是连接到荧光团的肽或抗体。
23.发明详述
[0024]“肽”包括但不限于肽、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段和抗体融合蛋白。“肽”可以与多肽、蛋白质、抗体、抗体片段和抗体融合蛋白互换使用。如本文所用，“结合肽”是指结合靶标的肽(包括肽、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段和抗体融合蛋白)。
[0025]
如本文所用，“接头”是指可与翻译产物结合的试剂。接头包括但不限于氨基酸、氨基酸类似物、嘌呤霉素和嘌呤霉素类似物。优选地，接头是在其3'末端与氨基核苷例如嘌呤霉素或嘌呤霉素类似物融合的寡核苷酸。
[0026]
如本文所用，“靶标”是指可与翻译产物相互作用的分子。靶标可以是肽、蛋白质、核酸(dna或rna)、糖、脂质、哺乳动物细胞、哺乳动物细胞提取物、或具有与结合肽结合的能力的其它分子。靶标可以被纯化(包括部分纯化)、插入细胞膜、在噬菌体上展示、在酵母上展示、在杆状病毒上展示或在细胞上展示。靶标也可以是在纳米磷脂盘(nano discs)、amphipols或脂质体上呈递的哺乳动物细胞表达的蛋白质。nano discs和amphipols用于稳定膜结合蛋白。
[0027]
连接(掺入)dna
‑
接头的荧光团，或掺入mrna
‑
dna
‑
肽复合物中的标签，均是“可检测物质”的例子，所述可检测物质并入mrna
‑
dna
‑
肽复合物中。当涉及含有可检测物质的分子或其他此类结构时，“连接”和“掺入”(及其派生词)在本文中可以互换使用。
[0028]
本领域技术人员可以意识到，flag
tm
标签例如由肽序列dykdddk给出。除了flag
tm
标签，可用于本发明方法的其他肽标签的例子包括但不限于ha
‑
标签、his
‑
标签、c
‑
myc标签和s
‑
标签。
[0029]“翻译产物”是指mrna翻译的产物。优选地，翻译产物是可以结合靶标的肽。
[0030]
如本文所用，“选择”及其派生词是指从文库中的其他分子中实质性地分离某个分子。经过多轮选择，预计具有所需表型的分子将在文库中富集。
[0031]
如本文所用，“天然氨基酸”是指在标准翻译中使用的20种氨基酸，它们是α
‑
氨基羧酸(或取代的氨基羧酸)。这包括丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(he)、脯氨酸(pro)、色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)、甲硫氨酸(met)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser))、苏氨酸(thr)、酪氨酸(tyr)、半胱氨酸(cys)、谷氨酰胺(gin)、天冬酰胺(asn)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)。
[0032]
如本文所用，“非天然氨基酸”是指，通常在结构上不同于天然翻译过程中使用的20种天然氨基酸的氨基酸。非天然氨基酸可以包括具有修饰的官能团的天然存在的氨基酸。它包括所有非天然氨基酸或人工氨基酸，包括但不限于d
‑
氨基酸、n
‑
甲基氨基酸、α
‑
甲基氨基酸、n
‑
酰基氨基酸、b(β)
‑
氨基酸、y(γ)
‑
氨基酸和0(δ)
‑
氨基酸。δ氨基酸是其侧链结构的一部分发生化学变化/修饰的天然氨基酸，或具有氨基酸骨架上的氨基或羧基被取代的结构的衍生物。其中引入了非天然氨基酸的肽，或如本文所称的“非天然肽”，包括具有这些各种非天然氨基酸作为组分的聚合物。非天然肽可以部分或全部由非天然氨基酸构成。因此，非天然肽可具有结构不同于标准酰胺键的主链。
[0033]
如本文所用，“文库”是指多数种分子的群，例如多数种核酸、翻译产物、产物/接头/mrna复合物、和翻译产物/接头/mrna
‑
cdna复合物分子的群。文库的多样性可以表现为不同的基因序列。dna或rna文库是指编码肽文库的dna文库或rna文库。
实施例
[0034]
实施例：检测mrna
‑
dna
‑
肽复合物与靶标的结合
[0035]
在mrna
‑
dna
‑
肽可检测复合物中与其mrna连接的肽(本文称为“肽a”)被用于确定流式细胞术是否可用于检测肽与其靶标(本文称为“靶标a”)的结合。靶标a可以是融合到avi标签的重组蛋白(该标签被重组融合到目的肽上以利于其在体内通过生物素连接酶(bira)进行位点特异性生物素化)。
[0036]
编码每个肽的信使rna与荧光团(例如alexa fluor 647)缀合的嘌呤霉素接头退火。然后，使用pdps启动体外翻译(ivt)并逆转录mrna，产生mrna
‑
dna
‑
肽a复合物。将mrna
‑
dna
‑
肽a复合物添加到生物素化的靶标a
‑
avi标签上以进行结合。将链霉亲和素包被的珠子添加到ivt混合物(包含靶标a
‑
avi标签)中，将链霉亲和素包被的珠子与结合mrna
‑
dna
‑
肽复合物的生物素化靶标a的复合物拉下(pull
‑
down)、洗涤并稀释在facs缓冲液中，之后进行流式细胞术。链霉亲和素珠与缺乏氨基酸和氨酰trna合成酶(ars)[ivt(
‑
)]的体外转录翻译混合物(ivt混合物)混合，用作阴性对照，以确保通过流式细胞术观察到的结合对靶标
a
‑
avi标签结合肽具有特异性。
[0037]
遵循本实施例中基本上如上所述的程序，预计将检测到mrna
‑
dna
‑
肽复合物与其靶标(靶标a)的强结合。
[0038]
遵循本实施例中基本上如上所述的程序，检测到了mrna
‑
dna
‑
肽复合物与其靶标(靶标a)的强结合。
[0039]
实施例：mrna文库选择过程中的靶标特异性富集
[0040]
为了确定流式细胞术是否可用于通过检测靶标特异性肽的富集来监测选择，可以针对与链霉亲和素珠结合的重组靶标a
‑
avi，检查选择轮次。
[0041]
氯乙酰苯丙氨酸用于启动翻译并与c端工程改造的半胱氨酸残基形成稳定的硫醚键。通过qpcr确定百分比回收率来监测选择。在每一轮中都加入了针对链霉亲和素珠的负选择，以消除非特异性链霉亲和素结合物。预计百分比回收率的增加在后面的轮次中最为显著，提示已识别的靶标a结合物群体的富集。
[0042]
然后使用下一代测序，确定后几轮的肽序列。少数肽的高频率可表明这些特定肽的富集。为了确定观察到的百分比回收率增加是否可能是由于选择了非特异性结合物所导致，将来自后一轮的肽序列与来自前一轮的肽序列进行比较。预计，使用qpcr方法，非特异性结合物将在后一轮被富集。这些非特异性结合物可能包括具有由一个或两个氨基酸组成的截短序列的肽。
[0043]
按照基本上如上所述的程序，少数肽的高频率表明了这些特定肽的富集。比较后一轮与前一轮的肽序列显示了，这些高度富集的肽是由一个或两个氨基酸组成的截短序列。在大多数情况下，随着选择轮次的增加，非特异性结合物将在后面的轮次中被富集。qpcr无区分地定量输出dna分子的数量，因此使用此方法无法区分真特异性肽与非特异性肽。因此，应采用qpcr以外的其他方法来改进对特异性结合物的选择。
[0044]
为了跟踪来自不同选择轮次的靶标a结合肽的富集，使用流式细胞术。来自不同轮次输出的dna被分离并通过pcr扩增，以用荧光团缀合的嘌呤霉素接头重构每个肽库，并通过流式细胞术评估每个库与靶标a
‑
avi的结合。链霉亲和素加ivt(
‑
)样品用于设门和作为阴性对照。尽管预计通过qpcr的百分比回收率增加，但预计通过流式细胞术的不同轮次的结合增加，如果有的话，也将很小。这可能部分是由于减少了选择从流式细胞术回收的非特异性结合物。
[0045]
遵循基本上如上所述的程序，通过qpcr的百分比回收率的增加表明了后几轮应该与靶标的结合强得多。然而，通过流式细胞术没有观察到肽库与靶标的特异性结合。通过流式细胞术得出的缺少肽库与靶标的结合，被后几轮选择中截短的非特异性肽的富集所证实。
[0046]
实施例：使用facs从mrna 文库中分离靶标特异性结合物
[0047]
为了确定针对靶标a
‑
avi筛选的文库是否可以通过facs进行分选，使用与荧光团(例如alexa flour 647)融合的嘌呤霉素接头，转录和翻译来自后面轮次输出的dna，并进行流式细胞术以检测结合。门控围绕与链霉亲和素珠复合的靶标a
‑
avi，预计低百分比的肽将与靶标a结合(预分选的库)。通过流式细胞术分选阳性群体，并通过流式细胞术评估来自分选轮次的肽库与肽a
‑
avi的结合。预计结果表明，与预分选的库相比，该分选库的结合显著增加。预计结果还表明，与使用传统mrna选择方法相比，通过facs进行的选择会导致靶标
a结合肽的更多富集，并且通过facs进行的选择是消除背景结合物和分离特异性肽的有效方法。
[0048]
遵循基本上如上所述的程序，低百分比的肽结合到靶标a(预分选库)。通过流式细胞术分选了该阳性群体，并通过流式细胞术评估了来自该分选轮次的肽库与靶标a
‑
avi的结合。结果表明了，与预分选的库相比，该分选库的结合显著增加。结果还表明了，与使用传统的百分比回收率方法相比，通过facs进行的选择导致了靶标a特异性结合肽的更多富集，并且通过facs进行的选择是消除背景结合物和分离特异性肽的有效方法。
[0049]
为了进一步确定通过百分比回收率的选择是否可能导致特异性和非特异性结合物两者的富集，将分选轮次的肽序列与相应未经分选轮次的肽序列进行比较。预计分选轮次的几个最高频率序列将与未分选轮次不同。此外，通过facs分选后，预计特异性肽的频率会增加。这表明使用修饰的嘌呤霉素接头通过facs选择mrna展示文库可以高效分离具有强结合亲和力和特异性的肽。
[0050]
遵循基本上如上所述的程序，来自分选轮次的几个最高频率序列肽不同于未分选轮次。通过facs分选后，特异性肽的频率增加了。这表明，使用修饰的嘌呤霉素接头通过facs选择mrna展示文库可以高效分离具有强结合亲和力和特异性的肽。
[0051]
实施例：细胞表达肽的检测和选择
[0052]
传统的mrna展示选择方法无法有效检测细胞表达的肽，因为该系统固有的高噪声导致对非特异性肽的选择。使用针对细胞表达的重组异二聚体蛋白质(本文中称为“蛋白质p”；生物素化；连接链霉亲和素珠子)的pdps，完成四轮选择。链霉亲和素珠用于拉下肽与蛋白质ii的复合物，并通过确定每轮的百分比回收率来监测选择。在第四轮观察到了百分比回收率的显著增加(表1)，因此部分地通过降低靶标浓度以有利于分离更强的结合物，来增加选择的严格性。
[0053]
表1.针对重组蛋白ii在每轮的选择中的百分比回收率
[0054]
轮次针对生物素化的蛋白ii的％回收率10.002420.007230.2742.9250.057
[0055]
为了确定细胞表达的蛋白质是否可以用作本发明方法的靶标，针对重组或细胞表达的蛋白质ii，使用流式细胞术，以在选择期间监测蛋白质ii
‑
结合物的富集。来自第二轮到第五轮输出的dna被转录，退火到修饰的嘌呤霉素接头上，并翻译以构成每轮的荧光团文库。通过流式细胞术检测每个mrna
‑
dna
‑
肽库与重组或细胞表达的蛋白质ii的结合。
[0056]
按照基本上如上所述的程序，通过流式细胞术检测，第二轮到第五轮的输出与重组和细胞表达的蛋白ii产生了强烈的结合(表2)。这些数据证明本发明的方法可用于选择重组和细胞表达的肽。
[0057]
表2.来自不同选择轮次并通过流式细胞术检测的mrna
‑
dna
‑
肽文库与蛋白质ii的结合
[0058][0059]
然后将来自第二轮输出的dna用于使用facs分选蛋白质ii结合物。由于在第一轮选择中使用了重组形式的蛋白质，因此用在cho细胞上表达的蛋白质ii进行分选，以分离与两种形式(重组或细胞表达的)靶标均结合的化合物。为了确定通过facs分选是否会导致蛋白质ii结合物的富集，检查分选前和分选后的肽库与蛋白质ii的结合。结果表明，如通过流式细胞仪确定，分选后特异性结合物的群体富集(分选前为4％结合物，分选后为40％结合物)。已分选的库与缺乏蛋白质ii表达的亲本cho细胞的结合是最小的。第二轮(已分选)肽的下一代测序显示，出现了新家族，其序列在预分选和后续轮次选择(通过常规mrna展示选择方法进行)中未以可检测水平存在。
[0060]
为了确定第二轮(已分选)库中最富集的肽与第五轮相比的结合和功能活性如何，将从第二轮(已分选)库中鉴定的肽进行化学合成并在基于细胞的功能测定中进行测试，以确定是否蛋白质ii与其配体的结合可以被分选的肽阻断。预计数据将证明第二轮(已分选)库中存在的肽将抑制蛋白质ii与其配体的相互作用。这些结果将表明，在较早选择轮次中的facs分选可以导致具有功能活性的肽的分离和鉴定，并且由于进行多轮选择，这些肽可能在后续轮次中从文库中耗尽。
[0061]
按照基本上如上所述的程序，存在于第二轮(已分选)库中的肽抑制了蛋白质ii与其配体的相互作用。
[0062]
实施例：与荧光团缀合的dna
‑
接头的设计和优化
[0063]
荧光团缀合(连接)到嘌呤霉素接头的5'末端，由此允许通过流式细胞术检测mrna
‑
dna
‑
肽复合物。使用nhs酯接头或不同长度的间隔区，可以将荧光团直接与寡核苷酸的5'末端缀合。连接可以例如如下进行：通过多个六乙二醇间隔物将嘌呤霉素与短寡核苷酸接头的3'
‑
末端共价连接。据认为，当多跨膜的膜蛋白(gpcr和离子通道)是靶标时，或者当肽与蛋白质的腔或沟结合时，增加间隔物的长度是最有效的。例如，mrna
‑
dna
‑
肽与表达在hek细胞表面的多跨膜的细胞表达蛋白(本文称为“蛋白iii”)复合物的结合，随着间隔物长度增加，通过流式细胞术更好地被检测(表3)。这可能是由于随着接头长度的增加，荧光团的可及性增强了。然而，表3中的数据还表明，间隔物可以不是流式细胞术检测所需要的。
[0064]
表3使用修饰的嘌呤霉素接头检测mrna
‑
dna
‑
蛋白质iii复合物的结合
[0065][0066]
*没有外源受体的hek细胞用作阴性对照。