一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法
技术领域
1.本发明属于组织工程技术领域，具体涉及了一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法。
背景技术：
2.水凝胶是一种具有三维空间网状结构，以水为分散介质的高分子网络体系，这种高分子网络体系能够吸收大量的水分，具有固体和液体的双重性质。它因为具有较高的含水量、对氧气和营养物质的良好扩散性以及与天然细胞外基质相似的结构而在组织工程领域备受关注。
3.丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物相容性、优异的机械强度，但是丝素蛋白溶液黏度低，打印结构保形性差，且丝素蛋白大分子链上没有细胞粘附位点，限制了其在生物3d打印中的应用。明胶是由胶原部分水解获得，具有生物活性基序rgd，可供细胞粘附。此外，明胶溶液的黏度可调，其打印结构可实现良好的保形性。而纯明胶具有温敏特性，低温下可凝胶，但力学性能差，难以满足诸多生物3d打印材料对物理机械性能的要求。将丝素蛋白与明胶进行复配，避免单一材料的性能不足，同时可实现两种材料的优势互补，在生物3d打印中具有更好地应用前景。
4.目前，已有多项公开专利与技术用于制备丝素蛋白/明胶复合水凝胶材料。cn201810521171.7公开了一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶及其制备方法。该方法通过对明胶材料进行甲基丙烯酸酐改性，赋予明胶紫外光诱导能力，在紫外光和超声地共同作用下，制备稳定的互穿网络水凝胶。虽然该技术在后期成胶时无需额外添加化学交联剂，但明胶的改性过程中仍存在工序复杂以及使用改性剂、催化剂存在的潜在生物相容性问题。cn201910619312.3公开了一种光诱导双改性的丝素蛋白/明胶复合生物墨水材料及其制备方法。该方法分别对丝素和明胶组分进行甲基丙烯酰化改性，再通过紫外光引发交联反应获得更高的交联度。该技术仍通过光敏改性方式实现丝素蛋白与明胶组分的相互交联反应，无法避免光敏改性步骤以及改性过程对材料生物相容性的潜在影响。值得注意的是，上述两项技术均采用紫外光作为辐照光源，短波紫外光对生物材料中的细胞或药物往往存在辐射危害，不利于后期的实际应用。cn201810822707.9公开了一种丝素蛋白/明胶双交联水凝胶及其制备方法。该方法通过对明胶进行酪胺根接枝改性，将改性明胶溶于丝素蛋白溶液，然后加入辣根过氧化物酶引发丝素蛋白/明胶的共价交联，最后浸泡醇溶液获得丝素蛋白/明胶水凝胶的方法。该方法应用生物酶技术实现改性明胶与丝素蛋白的共价交联，但生物酶技术的引发效率低、耗时长，同时对环境要求较为严格。此外，该技术仍基于明胶材料的接枝改性，工艺相对复杂。
5.综上，现有制备丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的技术普遍需要对组分材料进行接枝改性，工艺复杂，技术难度大。同时，无法兼顾丝素蛋白/明胶复合材料的交联反应效率和生物相容性，因此开发一种无需改性，高效简单，生物相容性优良的丝素蛋白/明胶共交联
水凝胶的制备方法与技术十分必要，这对丝素蛋白/明胶共交联水凝胶在生物3d打印领域的应用具有重要价值。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法，以解决现有技术在制备丝素蛋白/明胶共交联水凝胶时工艺复杂，耗时长，涉及改性存在潜在的生物相容性等问题。
7.为了解决上述技术问题，采用如下技术方案
8.一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
9.(1)丝素蛋白/明胶共混液的制备
10.将脱胶后的生丝坯布经过溶解、透析、离心、浓缩，获得丝素蛋白溶液，然后将一定凝胶强度的特定比例的固体明胶颗粒加入一定分子量的丝素蛋白溶液中溶胀15～30min，在60℃的条件下搅拌直至明胶颗粒完全溶解，制得丝素蛋白/明胶共混液；
11.(2)光交联丝素蛋白/明胶前驱液的制备
12.将步骤(1)制得的丝素蛋白/明胶共混液中加入一定量溶解后的光引发体系，制得光交联丝素蛋白/明胶前驱液，避光保存备用；
13.(3)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备
14.将步骤(2)中的光交联丝素蛋白/明胶前驱液置于3d打印设备储液槽/管中，通过温度调节丝素蛋白/明胶共混液的流变性能，然后用3d打印设备打印获得预设结构，在打印过程中/打印后通过一定强度的可见光辐照交联，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
15.优选后，所述步骤(1)中的丝素蛋白分子量选自5000～14000da，明胶的凝胶强度选自150～300bloom。
16.优选后，所述步骤(1)中丝素蛋白/明胶共混液中明胶浓度在10％～50％，所述步骤(3)中储液管温度低于30℃时满足挤出式3d打印的要求；所述步骤(1)中丝素蛋白/明胶共混液中明胶浓度在0～40％，所述步骤(3)中储液槽温度在37℃～60℃时满足数字光处理式3d打印的要求。
17.优选后，所述步骤(2)的光引发剂用量为丝素蛋白和明胶质量的0.005％～6％。
18.优选后，所述步骤(2)中的光引发体系为氧化还原光引发体系，选自共轭染料/氧化剂、低氧化态过渡金属盐/过硫酸盐、高氧化态盐中的任意一种。
19.优选后，所述的氧化剂选自二苯基碘鎓六氟磷酸盐、双(4
‑
甲基苯)碘鎓六氟碳酸盐、双(4
‑
叔丁基苯)碘鎓六氟碳酸盐、过氧化氢、过氧化钠、过氧化钾中的一种；所述的染料选自酸性红87、酸性红94、姜黄素、核黄素、曙红y、酞菁、酞菁二钠、四苯基卟啉氯化铁、吖啶黄中的一种。
20.优选后，所述的低氧化态过渡金属盐选自三(2,2
′‑
联吡啶)钌(ⅱ)二(六氟磷酸)盐、氯化三(2,2
′‑
联吡啶)钌(ⅱ)、(4,4
′‑
二叔丁基
‑
2,2
′‑
联吡啶)双[(2
‑
吡啶基)苯基]铱(ⅲ)六氟磷酸盐、(2,2
′‑
联吡啶)双[2
‑
(2,4
‑
二氟苯基)吡啶]铱(iii)六氟磷酸盐、(1,3
‑
二氨基环己烷)二氯化铂、(2,2
′‑
联吡啶)二氯化铂中的一种；所述的过硫酸盐选自过硫酸钾、
过硫酸钠、过硫酸铵中的一种。
[0021]
优选后，所述的高氧化态盐选自9
‑
(2,6
‑
二甲基苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、9
‑
均三甲苯基
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、9
‑
(2
‑
联苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、9
‑
(2,5
‑
二甲基苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、10
‑
甲基
‑9‑
苯基吖啶高氯酸盐、2,4,6
‑
三苯基吡喃四氟硼酸盐、9
‑
均三甲基苯基
‑
2,7,10
‑
三甲基吖啶高氯酸盐中的一种。
[0022]
优选后，所述步骤(3)中可见光光源选自与对应引发体系光谱匹配的主波长，具体为主波长范围450～480nm的蓝光led，主波长范围490～570nm的绿光led，380～800nm带滤光片的氙灯中的一种。
[0023]
优选后，所述步骤(1)经过溶解、透析、离心、浓缩，获得丝素蛋白溶液的具体步骤为：将已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温；然后将上述溶液转移至纤维素透析袋中，置于去离子水中透析3～4d；将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理20min，即得到丝素蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩后，置于5℃环境下保存备用。
[0024]
由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：
[0025]
1、本发明提出了一种适用于3d打印的丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备方法，所用丝素蛋白和明胶组分无需光敏改性步骤，避免了改性过程中光敏改性剂、改性催化剂、交联剂等对体系生物相容性的潜在影响；
[0026]
2、本发明提出了一种适用于3d打印的丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备方法，可调控丝素蛋白/明胶复合打印前驱液的流变参数，打印后丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料结构强度可调，具有良好的保形性和结构稳定性；
[0027]
3、本发明提出的一种适用于3d打印的丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备方法，以可见光作为引发光源，可实现丝素蛋白与明胶的高效共交联反应，且对负载细胞和药物无辐射危害。
具体实施方式
[0028]
本发明旨在提供一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法，其原理为：在可见光辐照诱导下，激发态光引发剂与丝素蛋白或明胶结构中的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等结构发生电子转移反应，生成相应的活泼自由基，再经自由成键反应，实现丝素蛋白和明胶大分子间的共交联结构。
[0029]
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明：
[0030]
实施例1：
[0031]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为5.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0032]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为200bloom的明胶颗粒加入
8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0033]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0012g氯化三(2,2
’‑
联吡啶)钌(ⅱ)六水合物，0.0096g过硫酸钾加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0034]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于数字光处理(dlp)3d打印设备的液槽中，调节液槽温度为39℃，在打印过程中用400nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0035]
实施例2：
[0036]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为8.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0037]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将2.5g凝胶强度为230bloom的明胶颗粒加入7.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为25％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0038]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0079g二苯基碘鎓六氟磷酸盐，0.0032g核黄素加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0039]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于数字光处理(dlp)3d打印设备的液槽中，调节液槽温度为40℃，在打印过程中用420nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0040]
实施例3：
[0041]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为6.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0042]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为180bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0043]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0018g 9
‑
(2,5
‑
二甲基苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0044]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于挤出式3d打印设备的液管中，调节液管温度为25℃，在打印后用530nm
绿光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0045]
实施例4：
[0046]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为10.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0047]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为210bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0048]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0098g 9
‑
均三甲苯基
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0049]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于挤出式3d打印设备的液管中，调节液管温度为20℃，在打印后用540nm绿光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0050]
实施例5：
[0051]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为5.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0052]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为240bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0053]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0021g(2,2
′‑
联吡啶)双[2
‑
(2,4
‑
二氟苯基)吡啶]铱(iii)六氟磷酸盐六水合物，0.0098g过硫酸钠加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0054]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于数字光处理式(dlp)3d打印设备的液槽中，调节液槽温度为60℃，在打印后用400nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0055]
实施例6：
[0056]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质
量分数为20.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0057]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为260bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0058]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0016g姜黄素，0.0098g过氧化氢加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0059]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于挤出式3d打印设备的液管中，调节液管温度为25℃，在打印后用400nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0060]
以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为解决基本相同的技术问题，实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。
技术领域
1.本发明属于组织工程技术领域，具体涉及了一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法。
背景技术：
2.水凝胶是一种具有三维空间网状结构，以水为分散介质的高分子网络体系，这种高分子网络体系能够吸收大量的水分，具有固体和液体的双重性质。它因为具有较高的含水量、对氧气和营养物质的良好扩散性以及与天然细胞外基质相似的结构而在组织工程领域备受关注。
3.丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物相容性、优异的机械强度，但是丝素蛋白溶液黏度低，打印结构保形性差，且丝素蛋白大分子链上没有细胞粘附位点，限制了其在生物3d打印中的应用。明胶是由胶原部分水解获得，具有生物活性基序rgd，可供细胞粘附。此外，明胶溶液的黏度可调，其打印结构可实现良好的保形性。而纯明胶具有温敏特性，低温下可凝胶，但力学性能差，难以满足诸多生物3d打印材料对物理机械性能的要求。将丝素蛋白与明胶进行复配，避免单一材料的性能不足，同时可实现两种材料的优势互补，在生物3d打印中具有更好地应用前景。
4.目前，已有多项公开专利与技术用于制备丝素蛋白/明胶复合水凝胶材料。cn201810521171.7公开了一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶及其制备方法。该方法通过对明胶材料进行甲基丙烯酸酐改性，赋予明胶紫外光诱导能力，在紫外光和超声地共同作用下，制备稳定的互穿网络水凝胶。虽然该技术在后期成胶时无需额外添加化学交联剂，但明胶的改性过程中仍存在工序复杂以及使用改性剂、催化剂存在的潜在生物相容性问题。cn201910619312.3公开了一种光诱导双改性的丝素蛋白/明胶复合生物墨水材料及其制备方法。该方法分别对丝素和明胶组分进行甲基丙烯酰化改性，再通过紫外光引发交联反应获得更高的交联度。该技术仍通过光敏改性方式实现丝素蛋白与明胶组分的相互交联反应，无法避免光敏改性步骤以及改性过程对材料生物相容性的潜在影响。值得注意的是，上述两项技术均采用紫外光作为辐照光源，短波紫外光对生物材料中的细胞或药物往往存在辐射危害，不利于后期的实际应用。cn201810822707.9公开了一种丝素蛋白/明胶双交联水凝胶及其制备方法。该方法通过对明胶进行酪胺根接枝改性，将改性明胶溶于丝素蛋白溶液，然后加入辣根过氧化物酶引发丝素蛋白/明胶的共价交联，最后浸泡醇溶液获得丝素蛋白/明胶水凝胶的方法。该方法应用生物酶技术实现改性明胶与丝素蛋白的共价交联，但生物酶技术的引发效率低、耗时长，同时对环境要求较为严格。此外，该技术仍基于明胶材料的接枝改性，工艺相对复杂。
5.综上，现有制备丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的技术普遍需要对组分材料进行接枝改性，工艺复杂，技术难度大。同时，无法兼顾丝素蛋白/明胶复合材料的交联反应效率和生物相容性，因此开发一种无需改性，高效简单，生物相容性优良的丝素蛋白/明胶共交联
水凝胶的制备方法与技术十分必要，这对丝素蛋白/明胶共交联水凝胶在生物3d打印领域的应用具有重要价值。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法，以解决现有技术在制备丝素蛋白/明胶共交联水凝胶时工艺复杂，耗时长，涉及改性存在潜在的生物相容性等问题。
7.为了解决上述技术问题，采用如下技术方案
8.一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
9.(1)丝素蛋白/明胶共混液的制备
10.将脱胶后的生丝坯布经过溶解、透析、离心、浓缩，获得丝素蛋白溶液，然后将一定凝胶强度的特定比例的固体明胶颗粒加入一定分子量的丝素蛋白溶液中溶胀15～30min，在60℃的条件下搅拌直至明胶颗粒完全溶解，制得丝素蛋白/明胶共混液；
11.(2)光交联丝素蛋白/明胶前驱液的制备
12.将步骤(1)制得的丝素蛋白/明胶共混液中加入一定量溶解后的光引发体系，制得光交联丝素蛋白/明胶前驱液，避光保存备用；
13.(3)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备
14.将步骤(2)中的光交联丝素蛋白/明胶前驱液置于3d打印设备储液槽/管中，通过温度调节丝素蛋白/明胶共混液的流变性能，然后用3d打印设备打印获得预设结构，在打印过程中/打印后通过一定强度的可见光辐照交联，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
15.优选后，所述步骤(1)中的丝素蛋白分子量选自5000～14000da，明胶的凝胶强度选自150～300bloom。
16.优选后，所述步骤(1)中丝素蛋白/明胶共混液中明胶浓度在10％～50％，所述步骤(3)中储液管温度低于30℃时满足挤出式3d打印的要求；所述步骤(1)中丝素蛋白/明胶共混液中明胶浓度在0～40％，所述步骤(3)中储液槽温度在37℃～60℃时满足数字光处理式3d打印的要求。
17.优选后，所述步骤(2)的光引发剂用量为丝素蛋白和明胶质量的0.005％～6％。
18.优选后，所述步骤(2)中的光引发体系为氧化还原光引发体系，选自共轭染料/氧化剂、低氧化态过渡金属盐/过硫酸盐、高氧化态盐中的任意一种。
19.优选后，所述的氧化剂选自二苯基碘鎓六氟磷酸盐、双(4
‑
甲基苯)碘鎓六氟碳酸盐、双(4
‑
叔丁基苯)碘鎓六氟碳酸盐、过氧化氢、过氧化钠、过氧化钾中的一种；所述的染料选自酸性红87、酸性红94、姜黄素、核黄素、曙红y、酞菁、酞菁二钠、四苯基卟啉氯化铁、吖啶黄中的一种。
20.优选后，所述的低氧化态过渡金属盐选自三(2,2
′‑
联吡啶)钌(ⅱ)二(六氟磷酸)盐、氯化三(2,2
′‑
联吡啶)钌(ⅱ)、(4,4
′‑
二叔丁基
‑
2,2
′‑
联吡啶)双[(2
‑
吡啶基)苯基]铱(ⅲ)六氟磷酸盐、(2,2
′‑
联吡啶)双[2
‑
(2,4
‑
二氟苯基)吡啶]铱(iii)六氟磷酸盐、(1,3
‑
二氨基环己烷)二氯化铂、(2,2
′‑
联吡啶)二氯化铂中的一种；所述的过硫酸盐选自过硫酸钾、
过硫酸钠、过硫酸铵中的一种。
[0021]
优选后，所述的高氧化态盐选自9
‑
(2,6
‑
二甲基苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、9
‑
均三甲苯基
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、9
‑
(2
‑
联苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、9
‑
(2,5
‑
二甲基苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐、10
‑
甲基
‑9‑
苯基吖啶高氯酸盐、2,4,6
‑
三苯基吡喃四氟硼酸盐、9
‑
均三甲基苯基
‑
2,7,10
‑
三甲基吖啶高氯酸盐中的一种。
[0022]
优选后，所述步骤(3)中可见光光源选自与对应引发体系光谱匹配的主波长，具体为主波长范围450～480nm的蓝光led，主波长范围490～570nm的绿光led，380～800nm带滤光片的氙灯中的一种。
[0023]
优选后，所述步骤(1)经过溶解、透析、离心、浓缩，获得丝素蛋白溶液的具体步骤为：将已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温；然后将上述溶液转移至纤维素透析袋中，置于去离子水中透析3～4d；将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理20min，即得到丝素蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩后，置于5℃环境下保存备用。
[0024]
由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：
[0025]
1、本发明提出了一种适用于3d打印的丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备方法，所用丝素蛋白和明胶组分无需光敏改性步骤，避免了改性过程中光敏改性剂、改性催化剂、交联剂等对体系生物相容性的潜在影响；
[0026]
2、本发明提出了一种适用于3d打印的丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备方法，可调控丝素蛋白/明胶复合打印前驱液的流变参数，打印后丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料结构强度可调，具有良好的保形性和结构稳定性；
[0027]
3、本发明提出的一种适用于3d打印的丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备方法，以可见光作为引发光源，可实现丝素蛋白与明胶的高效共交联反应，且对负载细胞和药物无辐射危害。
具体实施方式
[0028]
本发明旨在提供一种适用于3d打印的光诱导丝素蛋白/明胶共交联水凝胶的制备方法，其原理为：在可见光辐照诱导下，激发态光引发剂与丝素蛋白或明胶结构中的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等结构发生电子转移反应，生成相应的活泼自由基，再经自由成键反应，实现丝素蛋白和明胶大分子间的共交联结构。
[0029]
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明：
[0030]
实施例1：
[0031]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为5.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0032]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为200bloom的明胶颗粒加入
8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0033]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0012g氯化三(2,2
’‑
联吡啶)钌(ⅱ)六水合物，0.0096g过硫酸钾加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0034]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于数字光处理(dlp)3d打印设备的液槽中，调节液槽温度为39℃，在打印过程中用400nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0035]
实施例2：
[0036]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为8.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0037]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将2.5g凝胶强度为230bloom的明胶颗粒加入7.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为25％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0038]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0079g二苯基碘鎓六氟磷酸盐，0.0032g核黄素加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0039]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于数字光处理(dlp)3d打印设备的液槽中，调节液槽温度为40℃，在打印过程中用420nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0040]
实施例3：
[0041]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为6.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0042]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为180bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0043]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0018g 9
‑
(2,5
‑
二甲基苯基)
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0044]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于挤出式3d打印设备的液管中，调节液管温度为25℃，在打印后用530nm
绿光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0045]
实施例4：
[0046]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为10.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0047]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为210bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0048]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0098g 9
‑
均三甲苯基
‑
10
‑
甲基吖啶高氯酸盐加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0049]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于挤出式3d打印设备的液管中，调节液管温度为20℃，在打印后用540nm绿光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0050]
实施例5：
[0051]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质量分数为5.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0052]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为240bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0053]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0021g(2,2
′‑
联吡啶)双[2
‑
(2,4
‑
二氟苯基)吡啶]铱(iii)六氟磷酸盐六水合物，0.0098g过硫酸钠加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0054]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于数字光处理式(dlp)3d打印设备的液槽中，调节液槽温度为60℃，在打印后用400nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0055]
实施例6：
[0056]
(1)丝素蛋白溶液的制备：将20g已脱胶的生丝坯布剪碎投入到摩尔比为1:2:8的cacl2‑
ch3ch2oh
‑
h2o三元溶解体系中，浴比为1:20，在70℃的条件下溶解3h，冷却至室温。然后将上述溶液转移至纤维素透析袋(8000～14000da)中，置于去离子水中透析3～4d。将透析完毕后的丝素蛋白溶液离心处理(25℃，10000r/min)约20min，即得到质量分数约为1.8％丝素蛋白溶液。将上述丝素蛋白溶液置于电热鼓风干燥箱内，在40℃下干燥浓缩至质
量分数为20.0％后，置于5℃环境下保存备用。
[0057]
(2)丝素蛋白/明胶共混液的制备：将1.5g凝胶强度为260bloom的明胶颗粒加入8.5g丝素蛋白溶液中溶胀15min，然后将其置于恒温水浴锅内，在60℃下搅拌溶解，制得明胶含量为15％的丝素蛋白/明胶共混液。
[0058]
(3)光诱导丝素蛋白/明胶前驱体的制备：取0.0016g姜黄素，0.0098g过氧化氢加入到10g丝素蛋白/明胶共混液中搅匀，制得光诱导丝素蛋白/明胶前驱体，避光保存备用。
[0059]
(4)3d打印丝素蛋白/明胶光诱导共交联水凝胶材料的制备：取上述光诱导丝素蛋白/明胶前驱体置于挤出式3d打印设备的液管中，调节液管温度为25℃，在打印后用400nm蓝光辐照20min，得到具有稳定结构的丝素蛋白/明胶共交联水凝胶材料。
[0060]
以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为解决基本相同的技术问题，实现基本相同的技术效果，所作出地简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
