一种微拟球藻遗传转化体系及合成甘油三酯的基因和应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种合成甘油三酯(tag)的基因、高效、稳定的遗传转化体系及其在提高甘油三酯含量中的应用。


背景技术：

2.真核微藻由于具有生长速度快、光合效率高、环境适应性强等特点，而被视作生产糖类、脂类及生物活性物质的“细胞工厂”(hu et al.,2008)。此外，部分真核微藻如小球藻、微拟球藻可在户外大规模培养，具有极大的工业化潜力(wijffels et al.,2010)。近年来，蓬勃发展的以各种组学数据为基础的系统生物学，开创了微藻合成生物学的崭新时代。在微藻合成生物学领域，要对某个特定藻种(株)进行设计改造，很大程度上取决于该藻种(株)的遗传转化体系是否建立。目前已有30余个微藻物种实现了基因导入与表达，尤其是在真核微藻的模式物种—莱茵衣藻中，已在细胞核、叶绿体和线粒体三套基因组中均建立了遗传转化体系(kindle et al.,1990；randolphanderson et al.,1993；boudreau et al.,1997)。然而，在微藻遗传转化体系的建立过程中，有两大瓶颈亟待突破：一是目前建立的遗传转化体系存在不稳定的隐患，以莱茵衣藻为例，其核转化藻株常会在传代过程中发生质粒丢失(kindle et al.,1990)；二是在工业微藻中，高效、稳定的遗传转化体系尚未建立，以小球藻为例，虽然异养培养技术早已成熟，但遗传转化体系的缺乏，极大地限制了小球藻的工业化进程(liu et al.,2019)。
3.目前，微拟球藻已经崛起为具有工业开发潜力的模式微藻，美国solix公司、aurora公司和以色列seambiotic公司都已将微拟球藻用于大规模户外养殖；由于微拟球藻基因组小(约30mb)，基因结构紧凑，冗余序列极少，因而适宜作为底盘生物创建新型光合细胞工厂(poliner et al.,2018)；目前，针对微拟球藻已经开发出多种遗传操作工具，例如同源重组(kilian et al.,2011；nobusawa et al.,2017)、过表达(xin et al.,2017)、rna干扰(xin et al.,2017)以及基于crispr/cas9的基因编辑(wang et al.,2016)，这些遗传工具将有力推动微拟球藻合成生物学的发展。然而，目前微拟球藻已报道的最高转化效率仅为2500cfu/μg dna(kilian et al.,2011)，虽可勉强满足靶基因的定向改造，但却不足以完成各种突变体库与合成生物学工程株系的高通量构建与筛选。因此，急需建立一套高效、稳定的微拟球藻遗传转化体系，以促进工业微藻合成生物学的快速发展。
4.甘油三酯(triacylglycerol,tag)是生物柴油的主要原料，微拟球藻能够在胁迫条件下大量积累tag，且与陆生油料作物相比，许多微拟球藻株系由于具备抗逆性强、对环境需求低等特点，而被视为潜力巨大的生物柴油来源(bondioli et al.,2012)。在高等植物和微藻中，现有证据表明tag合成的最后一步反应是该通路中的限速步骤，由二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,简称dgat)负责完成(chen et al.,2012)。在高等油料作物中，已有很多通过增加内源dgat表达量来提高tag含量的案例(roesler et al.,2016)。综上所述，利用微拟球藻遗传转化体系改造其dgat，进而提高细胞tag含量，具有明显的必要性和可行性，但并未有相关报道证明其是否能够实现。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种微拟球藻中合成甘油三酯(tag)的基因、高效、稳定的遗传转化体系及其在提高甘油三酯含量中的应用。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种合成甘油三酯(tag)的基因：
8.1)具有seq id no 1所示的碱基序列；
9.或，
10.2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的dna序列。
11.一种基因所编码的蛋白，所述基因所编码的蛋白为具有下列情况之一的氨基酸序列：
12.1)具有seq id no 3所示的氨基酸序列；
13.2)通过将seq id no 3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与seq id no 3的蛋白具有相同的生物学功能。
14.一种构建所述基因的方法，包括如下步骤：
15.1)从微拟球藻的cdna中扩增dgat基因；
16.2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻dgat基因的全长编码序列，即seq id no1所示的碱基序列。
17.一种所述基因的应用，所述合成甘油三酯(tag)的基因在调控生物体内tag含量中的应用。
18.一种构建所述的具有甘油三酯(tag)合成功能的基因的引物：引物为1)和2)：
19.1)nodgat2b-for：
[0020]5’
ggtaccacataatgacgcaggtc 3’；
[0021]
2)nodgat2b-rev：
[0022]5’
gaattctcacttaataagcagcttcttg 3’。
[0023]
一种通用的微拟球藻遗传转化表达载体：
[0024]
1)含seq id no2所示的碱基序列；
[0025]
或，
[0026]
2)含与序列表中序列2所限定的核酸序列具有90％以上同源性、且具有相同功能的dna序列。
[0027]
所述优选通用的微拟球藻遗传转化表达载体为载体pxj450。
[0028]
一种通用的微拟球藻遗传转化表达载体的应用，所述表达载体在改造微拟球藻基因组序列及遗传表型中的应用。
[0029]
具体为：将对数生长期的微拟球藻藻液、通用表达载体和鲑鱼精dna混匀于f/2液体培养基，然后于25℃，100rpm条件下避光复苏48h；复苏后离心收集藻体沉淀，将其与玉米淀粉悬液混匀，混匀后于含zeocin和nahco3的f/2琼脂糖平板上，25℃避光培养3天后，再以25℃，80μmol m-2
s-1
光照培养直至克隆长出，使微拟球藻高效、稳定的转化。
[0030]
一种重组载体，重组载体含seq id no 1和seq id no 2所述的dna序列。
[0031]
进一步的说，优选重组载体为pxj419。
[0032]
一种宿主细胞，宿主细胞含所述重组载体。所述宿主细胞为微拟球藻。
[0033]
一种重组载体高效、稳定的转化方法：
[0034]
将对数生长期的微拟球藻藻液、重组载体和鲑鱼精dna混匀于f/2液体培养基，然后于25℃，100rpm条件下避光复苏48h；复苏后离心收集藻体沉淀，将其与玉米淀粉悬液混匀，混匀后于含zeocin和nahco3的f/2琼脂糖平板上，25℃避光培养3天后，再以25℃，80μmol m-2
s-1
光照培养直至克隆长出，使微拟球藻高效、稳定的转化。
[0035]
所述重组载体优选为含seq id no 1和seq id no 2的表达载体。
[0036]
综上，利用上述合成甘油三酯(tag)的基因及转化方法可进一步的提高微拟球藻甘油三酯含量。
[0037]
本发明所具有的优点：
[0038]
本发明转化方法，其转化效率超过海洋微拟球藻中已报道的最高水平，且获得的载体片段可在海洋微拟球藻中稳定存在而不丢失。过表达上述基因能够显著提高微拟球藻甘油三酯含量，也证明了该基因在提高生物体生产tag方面的应用价值。在微藻组学数据较为完备的背景下，本发明所建立的遗传转化体系，对于利用基因工程进行工业微藻性状改良，具有巨大的应用前景。
[0039]
进一步的说本发明转化方法通过提高平板培养的光照强度，可显著缩短克隆的生长时间；通过使用玉米淀粉包埋，增加了对复苏后细胞的支持与保护，从而显著提高了转化效率。
附图说明
[0040]
图1为本发明构建的通用表达载体pxj450的结构图。
[0041]
图2为本发明所构建的转化方法与改进复苏手段前的转化方法在转化效率方面的比较图。
[0042]
图3为本发明所用nodgat2b的基因结构图。
[0043]
图4为本发明构建的含有nodgat2b的重组载体pxj419的结构图。
[0044]
图5为本发明中对pxj419转化株及对照进行pcr的电泳检测结果。
[0045]
图6为本发明中由pxj450构建的nodgat2b过表达株与对照组在nodgat2b转录水平方面的比较结果图。
[0046]
图7为本发明中由pxj450构建的nodgat2b过表达株与对照组在tag含量方面的比较结果图。
具体实施方式
[0047]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0048]
本发明方法通过构建表达载体、优化转化方法，并最终在微拟球藻工业藻株imet1(即，海洋微拟球藻(nannochloropsis oceanica)imet1由美国马里兰大学馈赠获得，并可向公众用于研究方向发放该菌株)中超表达一个内源二脂酰甘油酰基转移酶基因nodgat2b，来实现提高tag含量之目的。本发明分离出nodgat2b基因的全长cdna序列，并利
用优化的微拟球藻遗传转化体系，对其进行超表达，实验证明，过表达上述基因能显著提高微拟球藻的tag含量。所公开的全长基因及氨基酸序列为微拟球藻中的首次报道，丰富了dgat基因家族的成员；过表达上述基因能够显著提高微拟球藻合成tag之能力，证明了其在利用基因工程手段提高生物体生产tag方面的应用价值。
[0049]
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件、分子克隆(molecular cloning:a laboratory manual,3
rd ed.)中所述的条件、或按照制造厂商所建议的条件。
[0050]
实施例1：微拟球藻通用表达载体的构建
[0051]
设计两条引物，并在引物的两端引入需要的酶切位点，交由上海生工合成：
[0052]
引物1)
[0053]5’
tatggcatgcgtcgacccgcggacgcgtgctagcggcgccaagcttctgcagcccgggggatcccatcatcaccatcaccatcaccattaag3’；
[0054]
引物2)
[0055]5’
ttaagaattaccactaccactaccactactaccctagggggcccgacgtcttcgaaccgcggcgatcgtgcgcaggcgcccagctgcgtacggt 3’。
[0056]
利用上述两条引物的退火结合，获得一条长度为86bp的带有黏性末端的dna片段(两端分别含有ndei和ecori酶切位点)，该片段共含有8个有效酶切位点(图1)和编码连续8个组氨酸的标签(用于后续的表达检测)。利用ndei和ecori酶切位点将该片段定向克隆至载体pxj004(wang et al,2016)中，该载体被命名为pre-pxj450。然后将pre-pxj450中包含的β-tublin启动子、克隆序列和psba终止子的片段亚克隆至载体pxj015(wang et al,2016)中，得到通用表达载体pxj450(图1),参见序列表seq id no 2所示序列。
[0057]
通用表达载体pxj450继承了pxj004和pxj015的高效表达特性，而且由于对上述两个载体进行集成，加之引入了多克隆位点和表达标签，而后只需一步引入待表达基因即可，从而大大提高了后续构建效率。
[0058]
实施例2：
[0059]
(一)nodgat2b基因的克隆
[0060]
利用pcr技术从微拟球藻imet1的gdna和cdna中克隆nodgat2b基因及其侧翼序列，所用引物自行设计，并在引物的两端引入需要的酶切位点，交由上海生工合成，引物具体为：
[0061]
1)nodgat2b-for：
[0062]5’
ggtaccacataatgacgcaggtc 3’；
[0063]
2)nodgat2b-rev：
[0064]5’
gaattctcacttaataagcagcttcttg 3’。
[0065]
所用pcr仪为eppendorf公司的mastercycler，反应体系50μl，包括4μl dntp(2.5mm each，takara)，正反向引物各2μl(10μm)，5μl 10
×
buffer(mg2

plus，takara)，0.4μl rtaq酶(5u/μl，takara)，1μl野生imet1cdna模板(50ng/μl)，以及超纯水35.6μl。反应体系如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1-2min，30个循环，最后72℃反应7min。
[0066]
反应结束后，取5μl pcr产物与1μl 6
×
loading buffer(takara)混匀，点入1％
(w/v)的琼脂糖(biowest)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120v电泳25min后，使用uvp公司的uv凝胶成像仪bi℃hemihr进行观察、拍照。用omega公司的cycle-pure kit或gel extraction kit从pcr产物中纯化并回收目的片段，其操作完全按照说明书进行。
[0067]
将得到的纯化片段连入takara公司的pmd18-t载体中，并使用热激转化的方式将其转入全式金公司的大肠杆菌感受态细胞trans 5α中，阳性克隆送至invitrogen公司测序，得到了nodgat2b基因的全长编码区序列，参见序列表seq id no1所示序列。此外，通过与基因组序列的比对，得到了nodgat2b的基因结构，其包括5’侧翼片段、2段外显子、1段内含子和3’侧翼片段。参见图3。
[0068]
(二)nodgat2b在海洋微拟球藻imet1中的超表达，内源过表达载体的构建
[0069]
构建载体的具体方法如下：通过pcr方法(与实施例2的pcr条件相同)，以nodgat2b的pmd18-t载体为模板，利用实施例2步骤(一)中的引物组合1)和2)和体系条件进行扩增获得nodgat2b的全长orf片段。
[0070]
将pcr扩增得到nodgat2b的全长orf片段的产物利用ndei和bamhi酶切位点将所得片段按照常规技术以及下述引物组合定向克隆至上述通用表达载体pxj450，得到重组载体pxj419(图4)。
[0071]
所采用的引物为了构建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上ndei酶切位点和保护碱基，并在其3’端加上bamhi酶切位点，引物序列具体如下：
[0072]
1)nodgat2b-oe-for：
[0073]5’
ggaattccatatgatgacgcaggtctatgcg 3’；
[0074]
2)nodgat2b-oe-rev:
[0075]5’
ggaattccatatgatgacgcaggtctatgcg 3’。
[0076]
(三)微拟球藻转化技术的优化
[0077]
1)取浓度为1-3
×
107cells/ml的对数生长期的微拟球藻藻液(imet1野生)，4℃，4000g离心5min，弃上清，用4℃预冷的375mm山梨醇漂洗2次，然后用4℃预冷的375mm山梨醇调整细胞浓度到2
×
108cells/ml。
[0078]
2)将浓缩藻体分装为200μl的小份，每份加入3μg上述获得重组pxj419线性化载体和1μl鲑鱼精dna(15μg/ml，95℃预变性1min)，混匀后冰置10min。
[0079]
3)将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，50μf，600ω进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml f/2液体培养基，然后于25℃，100rpm条件下避光复苏48h。
[0080]
4)4000g离心5min收集藻体，弃上清，加入1ml玉米淀粉悬液，用移液枪吹打混匀。玉米淀粉悬液的制备方法为：取2g玉米淀粉，用无水乙醇和纯水交替洗4次后，保存于75％乙醇溶液中，使用前用f/2液体培养基洗3次，然后用10ml含有0.8％peg8000(w/v)的f/2液体培养基重悬。
[0081]
5)将混合物移到含有5μg/ml zeocin和1.6g/l nahco3的f/2琼脂糖平板上，晃动平板以实现均匀铺布，25℃避光培养3天后，再以25℃，80μmol m-2
s-1
光照培养直至克隆长出(约8-12天)。
[0082]
上述的转化过程与现有的转化方法(wang et al,2016)，相比，本实施例通过提高平板培养的光照强度(之前常用的光照强度为30μmol m-2
s-1
)可将克隆的生长时间从40-50
天缩短至8-12天；并且本实施例通过使用玉米淀粉包埋，增加了对复苏后细胞的支持与保护，从而将转化效率从2-3
×
103cfu/μg dna提升至12-18
×
103cfu/μg dna(图2)。
[0083]
(三)电穿孔法将载体pxj419导入微拟球藻
[0084]
1)取浓度为1-3
×
107cells/ml的对数生长期的微拟球藻藻液(imet1野生)，4℃，4000g离心5min，弃上清，用4℃预冷的375mm山梨醇漂洗2次，然后用4℃预冷的375mm山梨醇调整细胞浓度到2
×
108cells/ml。
[0085]
2)将浓缩藻体分装为200μl的小份，每份加入3μg由saci kpni-hf双酶切上述重组载体pxj419，形成的phsp-ble-tpsba-ptub-nodgat2b-his-tag-tpsba线性化载体(图4)和1μl鲑鱼精dna(15μg/ml，95℃预变性1min)，混匀后冰置10min。
[0086]
3)将混合物转移入2mm电击杯，以2200v(hv)，50μf，600ω进行电击，电击后立即将藻体转移入5ml f/2液体培养基，然后于25℃，100rpm条件下避光复苏48h。
[0087]
4)4000g离心5min收集藻体，弃上清，加入1ml玉米淀粉悬液，用移液枪吹打混匀。玉米淀粉悬液的制备方法为：取2g玉米淀粉，用无水乙醇和纯水交替洗4次后，保存于75％乙醇溶液中，使用前用f/2液体培养基洗3次，然后用10ml含有0.8％peg8000(w/v)的f/2液体培养基重悬。
[0088]
5)将混合物移到含有5μg/ml zeocin和1.6g/l nahco3的f/2琼脂糖平板上，晃动平板以实现均匀铺布，25℃避光培养3天后，再以25℃，80μmol m-2
s-1
光照培养直至克隆长出，获得转化株(微拟球藻nodgat2b超表达转化株)。
[0089]
上述的转化过程与现有的转化方法(wang et al,2016)，相比，本实施例通过提高平板培养的光照强度(之前常用的光照强度为30μmol m-2
s-1
)可将克隆的生长时间从40-50天缩短至8-12天；并且本实施例通过使用玉米淀粉包埋，增加了对复苏后细胞的支持与保护，从而将转化效率从0.38
×
104cfu/μg dna提升至1.46
×
104cfu/μg dna。(四)微拟球藻超表达转化株nodgat2b表达量分析
[0090]
将上述步骤(三)获得微拟球藻nodgat2b超表达转化克隆2株分别挑至含有5μg/ml zeocin的f/2培养基中进行活化并提取其总dna进行pcr鉴定，所用引物如下：
[0091]
1)ptub-1for-180322：
[0092]5’
ctacaagcccaacctttgctacacc 3’；
[0093]
2)nodgat2b rev-180419:
[0094]5’
tcataagattccccataggcagcac 3’；
[0095]
所用pcr仪为eppendorf公司的mastercycler，反应体系50μl，包括4μl dntp(2.5mm each，takara)，正反向引物各2μl(10μm)，5μl 10
×
buffer(mg2

plus，takara)，0.4μl rtaq酶(5u/μl，takara)，1μl nodgat2b超表达转化株gdna模板(50ng/μl，正、负对照分别加入等浓度、等体积的pxj419质粒和野生imet1的gdna)，以及超纯水35.6μl。反应体系如下：起始95℃预变性1min，然后95℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应5min。反应结束后，取5μl pcr产物与1μl 6
×
loading buffer(takara)混匀，点入1.5％(w/v)的琼脂糖(biowest)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120v电泳25min后，使用uvp公司的uv凝胶成像仪biochemihr进行观察、拍照。(图5)
[0096]
可见转化株oedgat2b-1、oedgat2b-2和正对照在600bp处均有特异条带，表明pxj419已成功转入微拟球藻细胞。(结合上述扩增给出结论，有图解释图，没图文字表述)对
上述两个转化株分别进行表达量分析，通过trizol法从转化株中提取总rna，并使用takara公司的反转录试剂盒获得cdna。随后，使用bio-rad公司的cfx96touch
tm
real-time pcr detection system进行qrt-pcr分析，选取看家基因β-actin作为内参。所用引物如下：
[0097]
3)nodgat2b-qpcr-for：
[0098]5’
atgaaggcgtgtggtggattgtaag 3’；
[0099]
4)nodgat2b-qpcr-rev:
[0100]5’
gtcgaggtactgcttcgccacg 3’；
[0101]
5)noact-qpcr-for：
[0102]5’
gacggcaccaaggtcaaaat 3’；
[0103]
6)noact-qpcr-rev:
[0104]5’
acgacgtggaagaggaggaa 3’；
[0105]
每个反应含有5μl的itaq
tm universalgreen supermix(bio-rad),20ng的oedgat2b-1和oedgat2b-2cdna模板和280nm引物，最终反应体系为10μl。反应体系如下：起始95℃预变性30sec，然后95℃变性5sec，60℃退火30sec，40个循环，最后65-95℃融合。
[0106]
结果分析公式为2
ct(noact)
/2
ct(nodgatb2)
。由图5可见，转化株的mrna丰度相比空白载体转化株均有8-9倍的上调，具有良好的超表达效果。(五)微拟球藻nodgat2b超表达转化株油脂中tag的含量分析
[0107]
油脂提取参考bligh和dyer发明的氯仿-甲醇法(bligh and dyer,1959)。总脂的薄层层析分离及tag获取参考ghosal的方法(ghosal,1994)。用agilent气相色谱-四级杆质谱联用仪(gc-ms)分析tag的流程如下：
[0108]
即，对微拟球藻nodgat2b超表达转化株进行油脂提取，以及总脂的薄层层析分离及tag：
[0109]
总脂薄层层析分离得到的tag用氯仿-甲醇溶解后，将下层氯仿溶液在氮吹仪下吹干后，加入1％硫酸-甲醇溶液(v/v)，并加入50ul正十九烷酸的甲醇溶液(2.25g/l)作为内标，充氮气后用封口膜密封，于70℃烘箱中反应60min进行甲酯化。待冷却后，用正己烷萃取甲酯化产物并用gc-ms分析。
[0110]
各脂肪酸链的量依据其与正十九烷酸的峰面积比值进行估定。由图6可见，过表达株产生的tag含量比空白载体转化株提高62％左右，这证明了微拟球藻nodgat2b在提高生物体的tag含量方面具有重要的应用价值。
[0111]
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
[0112]
seq id no1
[0113]
1041
[0114]
dna
[0115]
微拟球藻(nannochloropsis oceanica imet1)
[0116][0117][0118]
seq id no2
[0119]
6112
[0120]
dna
[0121]
微拟球藻(nannochloropsis oceanica imet1)
[0122]
[0123]
[0124][0125]
seq id no：3
[0126]
346
[0127]
prt
[0128]
微拟球藻(nannochloropsis oceanica imet1)
[0129]