一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法与流程

1.本发明涉及医疗领域，特别提供一种脐带间充质干细胞的培养方法。


背景技术：

2.近年来随着生命科学与医学的快速发展，国内外创新性生物治疗技术进展迅速，细胞治疗已发展成为药物治疗和手术治疗后的第三次医疗革命，在恶性肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、抗衰老、再生医学等多个领域显示出巨大的应用潜力。细胞治疗包括免疫细胞治疗和干细胞治疗，干细胞治疗包括胚胎干细胞（esc）、组织特异性前体干细胞（tspsc）、间充质干细胞（msc）、脐带干细胞（ucsc）、骨髓干细胞（bmsc）和诱导多潜能干细胞（ipsc）等。目前，干细胞在重大慢性疾病、严重创伤修复的再生医学领域，已经成为弥补传统治疗不可或缺的有效手段。
3.间充质干细胞（msc）因在特定环境下可分化为软骨、骨、支付和肌肉等间质而得名。广泛存在于脐带、胎盘、脂肪、肺、心脏及骨髓等组织中。其特点包括贴壁生长，表达细胞表面标志cd105、cd73、cd90，低表达cd45、cd34、cd14、cd79、cd19及hla-dr。既往传统的细胞生物学制备方法，制备出的干细胞因细胞表型不合格被器用，浪费了大量的人力物力，本发明一定程度上解决了该问题。
4.本发明公开用于临床研究所用的、安全可靠的脐带间充质干细胞制备及储存方法。


技术实现要素：

5.为了提供一种高效新型的脐带间充质干细胞培养方法，本发明采用如下的技术方案：一、基质胶包被t75培养瓶：1）包被比例：原代制备包被比例：1：50，每个t75培养瓶加100ul stemcell基质胶（#07130）；4.9 ml pbs；p1、p2传代包被比例：1：75，每个t75培养瓶加5.92 ml pbs，80 ul基质胶（#07130）；pbs为不含镁和钙离子溶液。
6.2）包被时间:轻柔混匀后15-25℃包被时间大于2小时，使用前倒掉基质胶，用pbs或生理盐水轻柔冲次一次；二、脐带的选择和处理：1）新鲜健康脐带，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，0.9%氯化钠注射液浸洗两次去除肉眼可见的污物及残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液浸洗两次,用剪刀剪碎成1mm3大小组织块，应用5ml浓度为2mg/l索莱宝胶原酶消化组织后应用bd公司流式细胞仪检测，细胞表型cd105表达大于95%认定为合格脐带，进行下一步制备；
2）经检测合格的脐带，取5cm长短，同上述处理方法处理为碎成1mm3大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到t75培养瓶中；（t75培养瓶终体积12ml）；6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养；三、培养第5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；四、培养第10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；五、14天处理原代细胞。po细胞传代p1：1）包被基质胶：每个t75培养瓶加5 ml pbs，67 ulstemcell基质胶（#07130）；2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水清洗2次t75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃孵育2-3分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液冲洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；3）加入20mlstem cell干细胞完全培养液，轻柔混匀后计数细胞，调整细胞浓度为：t75cm2 1-1.5*105/瓶，终体积10-12ml；六、干细胞的冻存：干细胞消化清洗步骤同上，计数细胞，台盼蓝染色计数活率，离心清洗后应用bd公司的流式细胞仪（facsvia）测量表型，表型合格细胞用stemcell cs10冻存液(#07959)悬浮细胞，调整细胞浓度为5-10
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106/ml，标记冻存管。使用thermo程序降温仪7451对细胞进行程序降温后储存于thermo液氮高效液氮储存罐（20782183）的摄氏-196度的气相中。
附图说明
7.图1 为脐带横截面示意图；图2 为脐带筛选步骤流式细胞检测cd105；图3 为流式细胞检测阴性对照;图4 为流式细胞检测cd105;图5 为流式细胞检测cd90;图6 为流式细胞检测cd73;图7 为流式细胞检测cd45;图8 为流式细胞检测cd34;图9 为流式细胞检测cd11;图10 为流式细胞检测hla-dr。图11 为分离脐带血干细胞流程图
具体实施方式
8.实施例1 1、包被基质胶：原代制备包被比例：1：50。取4个t75培养瓶每个加100ul stemcell基质胶（#07130）和4.9 ml pbs。轻柔混匀后25℃包被时间3小时。
9.2、脐带的处理：在gmp实验室，上海力申科学仪器有限公司生物安全柜（hfsafe1200lc）中进行操作，新鲜健康脐带，总长度25cm，取1cm长，用75%酒精冲洗一次，
0.9%氯化钠注射液冲洗两次去除残留血液；沿脐静脉剪开脐带，用止血钳及剪刀剔去1根脐静脉、2根脐动脉，用0.9%氯化钠注射液冲洗两次,用剪刀剪碎成1mm3大小组织块，应用5ml浓度为2mg/l索莱宝胶原酶消化组织后应用bd公司流式细胞仪检测，cd105表达98%认定为合格脐带，进行下一步制备；2）上述脐带取5cm长短，同上处理为碎成1mm3大小组织块，用stem cell干细胞完全培养液悬浮组织块，平均分配到4个t75培养瓶中；（t75培养瓶终体积12ml）；6）将培养瓶放入37℃、5%二氧化碳培养箱中；三、培养5天进行半量换液，取出5ml培养液，加入5ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；四、培养10天进行全量换液，加入12ml预温的培养液，避免碰到贴壁组织块；五、14天处理原代细胞。细胞传代：1）包被基质胶：每个t75培养瓶加5 ml pbs，67 ulstemcell基质胶（#07130）；2）收集原代培养液及组织块，用生理盐水清洗2次t75培养瓶后，加入3ml stemcell酶解液（#05427），37℃孵育2分钟，加入3ml 酶抑制液（#05428），加入10ml完全培养液冲洗细胞，收集至50ml离心管，离心285g，10分钟；3）加入20mlstem cell干细胞完全培养液，轻柔混匀后计数细胞，调整细胞浓度为：t75cm2 1.5*105/瓶，终体积12ml；六、干细胞的冻存：干细胞消化清洗步骤同上，计数细胞共4.47
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107/l，台盼蓝染色计数活率99.8%，离心清洗后应用bd公司的流式细胞仪（facsvia）测量表型:cd105 98.5%；cd90 99.9%；cd73 98.3%；cd45 3.7%；cd34 2.4%；cd11 4.1%；hla-dr 4.2%。
10.用stemcell cs10冻存液(#07959)6毫升悬浮细胞，调整细胞浓度为1.1
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107/ml，标记冻存管。使用thermo程序降温仪7451对细胞进行程序降温后储存于thermo液氮高效液氮储存罐（20782183）的摄氏-196度的气相中。