用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针的制作方法

技术特征：
1.用于检测样品中靶核酸的方法，其包括：(a)将所述样品分隔成多个分区，以使得大多数分区包含：(i)不超过一个靶核酸分子；(ii)用于扩增所述靶核酸分子的试剂；和(iii)可切割探针，所述探针从5’至3’包含:(1)包含标记物的第一序列区；(2)第二序列区；(3)为所述第二序列区的反向互补的序列；和(4)包含与所述靶核酸的第一链上的区域互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)如果所述分区中存在靶核酸分子，则扩增所述靶核酸分子；(c)在升高或降低所述分区的温度的同时，监测所述分区中来自与所述可切割探针相关的报告基团的信号，以获得所述可切割探针的解链谱；以及(d)如果所述解链谱对应于已被切割的可切割探针的解链谱，则检测到所述靶核酸的存在，或者如果所述解链谱对应于未切割的可切割探针的解链谱，则检测到所述靶核酸不存在。2.用于检测样品中靶核酸的方法，其包括：(a)将所述样品分隔成多个分区，以使得一些分区包含零个靶核酸分子，并且一些分区包含一个或更多个靶核酸分子，其中所述多个分区还包含：(i)用于扩增所述靶核酸分子的试剂；和(ii)可切割探针，所述探针从5’至3’包含:(1)包含标记物的第一序列区；(2)第二序列区；(3)为所述第二序列区的反向互补的序列；和(4)包含与所述靶核酸的第一链上的区域互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)如果所述分区中存在靶核酸分子，则扩增所述靶核酸分子；(c)在升高或降低所述分区的温度的同时，监测所述分区中来自与所述可切割探针相关的报告基团的信号，以获得所述可切割探针的解链谱；以及(d)如果所述解链谱对应于已被切割的可切割探针的解链谱，则检测到所述靶核酸的存在，或者如果所述解链谱对应于未切割的可切割探针的解链谱，则检测到所述靶核酸不存在。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述样品分隔包括将所述样品分隔成非水连续相中的液滴。4.根据权利要求3所述的方法，其中在监测所述分区中来自所述报告基团的信号时，所述液滴分散在表面上的单层中。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述样品分隔包括将所述样品分隔到微孔板中的孔中。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述可切割探针的切割由rna酶h2催化。
7.用于对样品中的靶核酸进行定量的方法，其包括：(a)进行dpcr以对反应混合物中适合进行dpcr的靶核酸区域进行扩增，所述反应混合物各自包含rna酶h2和可切割探针，所述可切割探针从5’至3’包含：i.包含报告基团的第一序列区；ii.第二序列区；iii.为所述第二序列区的反向互补的序列；和iv.包含与所扩增靶核酸的区域互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)确定每个反应混合物中来自所述可切割探针的报告基团的信号，以鉴定含有所述靶核酸的反应混合物；以及(c)使用在所述反应混合物中确定的信号来对所述样品中存在的靶核酸进行定量。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述反应混合物包含由被非水连续相包围的液滴所形成的隔室。9.根据权利要求8所述的方法，其中在确定来自所述报告基团的信号时，所述液滴分散在表面上的单层中。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述反应混合物在微孔板中的独立孔中形成。11.根据权利要求7所述的方法，其中确定每个反应混合物中的信号还包括对反应混合物进行成像以确定所述可切割探针的解链谱，并使用所述解链谱来鉴定所述反应混合物中的靶核酸。12.根据权利要求1、2或7所述的方法，其中所述可切割探针是发夹探针，其包含与所述靶核酸的第一链上的区域互补的1至5个核糖核苷酸。13.根据权利要求1、2或7所述的方法，其中所述报告基团是荧光团。14.根据权利要求1、2或7所述的方法，其中所述报告基团是荧光团与淬灭基团对。

技术总结
本申请涉及用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针。提供了用于检测和定量核酸的方法和组合物。在某些实施方案中，方法涉及使用包含在靶核酸分子的存在下对内切核糖核酸酶(例如，RNA酶H)切割易感的核糖核苷酸位置的可切割探针。实施方案的探针还可以包含与报告基团和/或淬灭部分连接的非天然核苷酸。告基团和/或淬灭部分连接的非天然核苷酸。告基团和/或淬灭部分连接的非天然核苷酸。


技术研发人员：斯科特
受保护的技术使用者：卢米耐克斯公司
技术研发日：2015.08.11
技术公布日：2021/11/14