用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用的制作方法

技术特征：
1.一种可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物为选自seq id no.1～seq id no.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自seq id no.1～seq id no.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自seq id no.1～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或为选自seq id no.1～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。2.根据权利要求1所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物或其组合包括seq id no.8所示序列，或包括seq id no.8的完全互补序列，或包括seq id no.8所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括seq id no.8所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。3.根据权利要求2所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物或其组合包括seq id no.8所示序列或其完全互补序列，或seq id no.8所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括seq id no.8所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列；和seq id no.1～seq id no.7以及seq id no.9～seq id no.21所示序列或其互补序列中的至少一种，或seq id no.1～seq id no.7以及seq id no.9～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段中至少一种，或seq id no.1～seq id no.7以及seq id no.9～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中至少一种。4.根据权利要求3所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合为包括seq id no.8和seq id no.9的序列；或为包括seq id no.8和seq id no.9的完全互补序列；或为包括seq id no.8和seq id no.9所示序列全长的至少55％的连续片段，或为包括选自seq id no.8和seq id no.9所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。5.根据权利要求2-4任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合还包括选自seq id no.6、seq id no.7、seq id no.15、seq id no.16所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或为选自seq id no.6、seq id no.7、seq id no.15、seq id no.16所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或包括选自seq id no.6、seq id no.7、seq id no.15、seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或包括选自seq id no.6、seq id no.7、seq id no.15、seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。6.根据权利要求2-5任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合还包括选自seq id no.1、seq id no.10、seq id no.14、seq id no.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或还包括选自seq id no.1、seq id no.10、seq id no.14、seq id no.21所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或包括选自seq id no.1、seq id no.10、seq id no.14、seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合，或包括选自seq id no.1、seq id no.10、seq id no.14、seq id no.21所示序列全长的至少
55％的连续片段的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。7.根据权利要求2-5任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合还包括seq id no.15和seq id no.16所示序列或其互补序列，或还包括seq id no.15和seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段中，或包括seq id no.15和seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。8.根据权利要求7所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合包括seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16所示序列；或包括seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16所示序列的完全互补序列；或包括seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括选自seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。9.根据权利要求7所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合包括seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16的序列；或包括seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16的完全互补序列；或为包括seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段，或包括选自seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.15和seq id no.16所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。10.根据权利要求2-9任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合还包括选自seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所示序列中的任意一种或两种以上的组合；或还包括选自seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所示序列的完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合；或为还包括选自seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所示序列全长的至少55％的连续片段，或为还包括选自seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.17、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。11.根据权利要求1所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物的组合为seq id no.1～seq id no.21所示序列；或为seq id no.1～seq id no.21所示序列的完全互补序列；或为所述dna甲基化分子标记物为seq id no.1～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段；或为seq id no.1～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段的完全互补序列。
12.根据权利要求1-11任一项所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物为seq id no.1～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：以引物为seq id no.22和seq id no.23、seq id no.25和seq id no.26、seq id no.28和seq id no.29中的任一组所扩增的片段在seq id no.1中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.31和seq id no.32、seq id no.34和seq id no.35、seq id no.37和seq id no.38中的任一组所扩增的片段在seq id no.2中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.40和seq id no.41、seq id no.43和seq id no.44、seq id no.46和seq id no.47中的任一组所扩增的片段在seq id no.3中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.49和seq id no.50、seq id no.52和seq id no.53、seq id no.55和seq id no.56中的任一组所扩增的片段在seq id no.4中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.58和seq id no.59、eq id no.61和seq id no.62、seq id no.64和seq id no.65中的任一组所扩增的片段在seq id no.5中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.67和seq id no.68、seq id no.70和seq id no.71、seq id no.73和seq id no.74中的任一组所扩增的片段在seq id no.6中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.76和seq id no.77、seq id no.79和seq id no.80、seq id no.82和seq id no.83中的任一组所扩增的片段在seq id no.7中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.85和seq id no.86、seq id no.88和seq id no.89、seq id no.91和seq id no.92中的任一组所扩增的片段在seq id no.8中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.94和seq id no.95、seq id no.97和seq id no.98、seq id no.100和seq id no.101中的任一组所扩增的片段在seq id no.9中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.103和seq id no.104、seq id no.106和seq id no.107、seq id no.109和seq id no.110中的任一组所扩增的片段在seq id no.10中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.112和seq id no.113、seq id no.115和seq id no.116、seq id no.118和seq id no.119中的任一组所扩增的片段在seq id no.11中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.121和seq id no.122、seq id no.124和seq id no.125、seq id no.127和seq id no.128中的任一组所扩增的片段在seq id no.12中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.130和seq id no.131、seq id no.133和seq id no.134、seq id no.136和seq id no.137中的任一组所扩增的片段在seq id no.13中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.139和seq id no.140、seq id no.142和seq id no.143、seq id no.145和seq id no.146中的任一组所扩增的片段在seq id no.14中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.148和seq id no.149、seq id no.151和seq id no.152、seq id no.154和seq id no.155中的任一组所扩增的片段在seq id no.15中所对应的序
列；和/或，以引物为seq id no.157和seq id no.158、seq id no.160和seq id no.161、seq id no.163和seq id no.164中的任一组所扩增的片段在seq id no.16中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.166和seq id no.167、seq id no.169和seq id no.170、seq id no.172和seq id no.173中的任一组所扩增的片段在seq id no.17中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.175和seq id no.176、seq id no.178和seq id no.179、seq id no.181和seq id no.182中的任一组所扩增的片段在seq id no.18中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.184和seq id no.185、seq id no.187和seq id no.188、seq id no.190和seq id no.191中的任一组所扩增的片段在seq id no.19中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.193和seq id no.194、seq id no.196和seq id no.197、seq id no.199和seq id no.200中的任一组所扩增的片段在seq id no.20中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.202和seq id no.203、seq id no.205和seq id no.206、seq id no.208和seq id no.209中的任一组所扩增的片段在seq id no.21中所对应的序列。13.根据权利要求12所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物为seq id no.1～seq id no.21所示序列全长的至少55％的连续片段分别为：以引物为seq id no.22和seq id no.23所扩增的片段在seq id no.1中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.34和seq id no.35所扩增的片段在seq id no.2中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.40和seq id no.41所扩增的片段在seq id no.3中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.55和seq id no.56所扩增的片段在seq id no.4中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.58和seq id no.59所扩增的片段在seq id no.5中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.67和seq id no.68所所扩增的片段在seq id no.6中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.76和seq id no.77所扩增的片段在seq id no.7中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.88和seq id no.89所扩增的片段在seq id no.8中所对应的序列；
和/或，以引物为seq id no.100和seq id no.101所扩增的片段在seq id no.9中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.109和seq id no.110所扩增的片段在seq id no.10中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.112和seq id no.113所扩增的片段在seq id no.11中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.121和seq id no.122所扩增的片段在seq id no.12中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.130和seq id no.131所扩增的片段在seq id no.13中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.142和seq id no.143所扩增的片段在seq id no.14中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.151和seq id no.152所扩增的片段在seq id no.15中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.160和seq id no.161所扩增的片段在seq id no.16中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.166和seq id no.167所扩增的片段在seq id no.17中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.175和seq id no.176所扩增的片段在seq id no.18中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.184和seq id no.185所扩增的片段在seq id no.19中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.199和seq id no.200所扩增的片段在seq id no.20中所对应的序列；和/或，以引物为seq id no.208和seq id no.209所扩增的片段在seq id no.21中所对应的序列。14.根据权利要求1所述的可用于检测肺结节良恶性的dna甲基化分子标记物或其组合，其特征在于，所述dna甲基化分子标记物为针对呼吸道样本的分子标记物。15.seq id no.1～seq id no.21所示序列中的任意一种或两种以上的组合作为肺癌相关甲基化分子标记物在检测肺结节良恶性、和/或早期肺癌中的应用。16.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1～13任一项所述的dna甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平的试剂。17.根据权利要求16所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括采用pcr扩增法、荧光定量pcr法、数字pcr法、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。18.根据权利要求16所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对dna甲基化分子标记物的荧光定量pcr检测的引物和探针，所述引物和探针为：针对seq id no.1的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.22和seq id no.23所
no.113所示引物，以及seq id no.114所示探针；seq id no.115和seq id no.116所示引物，以及seq id no.117所示探针；seq id no.118和seq id no.119所示引物，以及seq id no.120所示探针；和/或，针对seq id no.12的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.121和seq id no.122所示引物，以及seq id no.123所示探针；seq id no.124和seq id no.125所示引物，以及seq id no.126所示探针；seq id no.127和seq id no.128所示引物，以及seq id no.129所示探针；和/或，针对seq id no.13的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.130和seq id no.131所示引物，以及seq id no.132所示探针；seq id no.133和seq id no.134所示引物，以及seq id no.135所示探针；seq id no.136和seq id no.137所示引物，以及seq id no.138所示探针；和/或，针对seq id no.14的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.139和seq id no.140所示引物，以及seq id no.141所示探针；seq id no.142和seq id no.143所示引物，以及seq id no.144所示探针；seq id no.145和seq id no.146所示引物，以及seq id no.147所示探针；和/或，针对seq id no.15的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.148和seq id no.149所示引物，以及seq id no.150所示探针；seq id no.151和seq id no.152所示引物，以及seq id no.153所示探针；seq id no.154和seq id no.155所示引物，以及seq id no.156所示探针；和/或，针对seq id no.16的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.157和seq id no.158所示引物，以及seq id no.159所示探针；seq id no.160和seq id no.161所示引物，以及seq id no.162所示探针；seq id no.163和seq id no.164所示引物，以及seq id no.165所示探针；和/或，针对seq id no.17的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.166和seq id no.167所示引物，以及seq id no.168所示探针；seq id no.169和seq id no.170所示引物，以及seq id no.171所示探针；seq id no.172和seq id no.173所示引物，以及seq id no.174所示探针；和/或，针对seq id no.18的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.175和seq id no.176所示引物，以及seq id no.177所示探针；seq id no.178和seq id no.179所示引物，以及seq id no.180所示探针；seq id no.181和seq id no.182所示引物，以及seq id no.183所示探针；和/或，针对seq id no.19的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.184和seq id no.185所示引物，以及seq id no.186所示探针；seq id no.187和seq id no.188所示引物，以及seq id no.189所示探针；seq id no.190和seq id no.191所示引物，以及seq id no.192所示探针；和/或，针对seq id no.20的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.193和seq id no.194所示引物，以及seq id no.195所示探针；seq id no.196和seq id no.197所示引物，以及seq id no.198所示探针；seq id no.199和seq id no.200所示引物，以及seq id no.201所示探针；
和/或，针对seq id no.21的引物和探针选自以下至少一组：seq id no.202和seq id no.203所示引物，以及seq id no.204所示探针；seq id no.205和seq id no.206所示引物，以及seq id no.207所示探针；seq id no.208和seq id no.209所示引物，以及seq id no.210所示探针；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。19.根据权利要求18所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针为：针对seq id no.1的引物和探针为：seq id no.22和seq id no.23所示引物，以及seq id no.24所示探针；和/或，针对seq id no.2的引物和探针为：seq id no.34和seq id no.35所示引物，以及seq id no.36所示探针；和/或，针对seq id no.3的引物和探针为：seq id no.40和seq id no.41所示引物，以及seq id no.42所示探针；和/或，针对seq id no.4的引物和探针为：seq id no.55和seq id no.56所示引物，以及seq id no.57所示探针；和/或，针对seq id no.5的引物和探针为：seq id no.58和seq id no.59所示引物，以及seq id no.60所示探针；和/或，针对seq id no.6的引物和探针为：seq id no.67和seq id no.68所示引物，以及seq id no.69所示探针；和/或，针对seq id no.7的引物和探针为：seq id no.76和seq id no.77所示引物，以及seq id no.78所示探针；和/或，针对seq id no.8的引物和探针为：seq id no.88和seq id no.89所示引物，以及seq id no.90所示探针；和/或，针对seq id no.9的引物和探针为：seq id no.100和seq id no.101所示引物，以及seq id no.102所示探针；和/或，针对seq id no.10的引物和探针为：seq id no.109和seq id no.110所示引物，以及seq id no.111所示探针；和/或，针对seq id no.11的引物和探针为：seq id no.112和seq id no.113所示引物，以及seq id no.114所示探针；和/或，针对seq id no.12的引物和探针为：seq id no.121和seq id no.122所示引物，以及seq id no.123所示探针；和/或，针对seq id no.13的引物和探针为：seq id no.130和seq id no.131所示引物，以及seq id no.132所示探针；和/或，针对seq id no.14的引物和探针为：seq id no.142和seq id no.143所示引物，以及seq id no.144所示探针；和/或，针对seq id no.15的引物和探针为：seq id no.151和seq id no.152所示引物，以及seq id no.153所示探针；和/或，针对seq id no.16的引物和探针为：seq id no.160和seq id no.161所示引
物，以及seq id no.162所示探针；和/或，针对seq id no.17的引物和探针为：seq id no.166和seq id no.167所示引物，以及seq id no.168所示探针；和/或，针对seq id no.18的引物和探针为：seq id no.175和seq id no.176所示引物，以及seq id no.177所示探针；和/或，针对seq id no.19的引物和探针为：seq id no.184和seq id no.185所示引物，以及seq id no.186所示探针；和/或，针对seq id no.20的引物和探针为：seq id no.199和seq id no.200所示引物，以及seq id no.201所示探针；和/或，针对seq id no.21的引物和探针为：seq id no.208和seq id no.209所示引物，以及seq id no.210所示探针；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。20.根据权利要求18所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含针对内参基因actb的荧光定量pcr检测的引物和探针。21.根据权利要求20所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述针对内参基因actb所述引物和探针为：seq id no.211和seq id no.212所示引物，以及seq id no.213所示探针。22.根据权利要求16-21任一项所述的用于检测肺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为呼吸道样本。23.权利要求1～13任一项所述的dna甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从待测样本中提取基因组dna；(2)对提取获得的基因组dna进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的dna；(3)用针对权利要求1～13任一项所述的dna甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的dna进行多重pcr扩增，得到多重pcr扩增产物；(4)步骤(3)获得的多重pcr产物用针对权利要求1～13任一项所述的dna甲基化分子标记物的探针进行多重荧光定量pcr检测。

技术总结
本发明提供了用于检测肺结节良恶性的DNA甲基化分子标记物，所述DNA甲基化分子标记物为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合；或为选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示序列的完全互补序列或其全长的至少55％的连续片段中的任意一种或两种以上的组合。其中特别是其中的SEQ ID NO.8具有对肺结节良恶性检测的较高特异性。本发明还提供了上述DNA甲基化分子标记物的检测试剂盒和检测方法。所述DNA甲基化分子标记物与肺癌高度相关，尤其是组合使用，可以进一步提高对肺结节良恶性的检测的灵敏度和特异性，提高恶性肺结节的检出率，降低检出的假阳性率。所述试剂盒中的引物和探针克服了多个引物和探针在进行多重PCR扩增和检测时存在相互干扰的缺点，定量性能与单个区域定量等同。定量性能与单个区域定量等同。定量性能与单个区域定量等同。


技术研发人员：叶竹佳 陶锦胜 陈志伟 范建兵
受保护的技术使用者：广州市基准医疗有限责任公司
技术研发日：2020.04.27
技术公布日：2021/11/14